本プロトコルは、抗結核薬封入リポソームの調製を最適化し、リポソーム製剤の標準化された品質評価システムを確立することを目的としています。
この記事について
サマリー
要約
Mycobacterium tuberculosis (MTB)によって引き起こされる結核（TB）は、依然として世界的な主要な感染性死因となっており、中国においても深刻な疾病負荷となっています。これは、多剤耐性／リファンピシン耐性結核の拡大や、薬剤浸透性の低さ、深刻な全身性毒性、治療コンプライアンスの低さといった従来の化学療法の重大な限界によってさらに悪化しています。リポソーム輸送システムは抗結核療法において独自の利点を提供しますが、その開発は、調製プロセスの不整合、低い薬物封入効率、および標準化された品質評価フレームワークの欠如によって妨げられています。本研究では、薄膜水和法に超音波処理とろ過を組み合わせ、リン脂質とコレステロールの比率を変化させたリファンピシン封入ナノリポソームを調製しました。封入効率と薬物担持量を決定するために、バリデーション済みの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を確立しました。動的光散乱法および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、粒子径、ゼータ電位、および微視的形態を特性評価し、in vitroでの薬物放出プロファイルを溶出試験により分析しました。最適化されたリポソームは、高い封入効率、理想的な薬物担持量、均一なナノスケールの粒子径、良好な保存安定性、および持続的なin vitro薬物放出を示しました。本研究は、抗結核リポソームの開発に向けた標準的な実験方法と包括的な品質評価システムを提供し、結核治療のためのリポソーム輸送システムの臨床応用を支援するものです。
概要
結核（TB）は、Mycobacterium tuberculosis (MTB) によって引き起こされる慢性的感染症であり、単一の病原体に起因する感染症の中で依然として最大の死亡原因となっており、人類の健康および世界的な公衆衛生上の安全保障に対する持続的かつ深刻な脅威となっています。世界保健機関（WHO）の「世界結核報告書 2025」によると、2024年には世界中で推定1,070万人の結核新規患者が発生し、結核関連で約123万人が死亡しました1。そのうち、多剤耐性/リファンピシン耐性結核（MDR/RR-TB）の新規症例は約39万件が報告されており、治療を受けたのは影響を受けた個人のわずか42%にとどまっています。薬剤耐性結核の継続的な伝播は、WHOの世界的戦略である「End TB Strategy」の実施における中心的な障害となっています。
現在、結核の臨床治療においては化学療法が依然として主流である。標準的な一次治療レジメンは、イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド、エタンブトールの併用療法で構成されており、治療期間は6〜9ヶ月と長期にわたる2。MDR/RR-TBに対しては、二次抗結核薬を含める必要があり、治療期間は18〜24ヶ月まで延長されるとともに3、コストの大幅な増加と薬物有害反応の著しい増加を伴う4。近年、ベダクイリン、デラマニド、プレトマニドなどの新規抗結核薬が承認され、薬剤耐性結核に対する新たな治療選択肢が提供されているが5、既存の抗結核療法に固有の根本的なボトルネックを克服するには至っていない6,7。
第一に、M. tuberculosisは、主に宿主の肺胞マクロファージ内に潜伏する典型的な細胞内病原体です。遊離薬物はマクロファージ膜への透過性が低いため、細胞内の薬物濃度が最小発育阻止濃度（MIC）を大幅に下回ることになります8。その結果、細胞内パーシスターを排除できず、これが結核の再発や薬剤耐性の出現の主要な要因となります9。第二に、結核病変には、乾酪性壊死組織や線維性被膜など複数の生物学的バリアが存在し、これらが遊離薬物の病変中心部への浸透を妨げるため、局所的な薬物濃度が不十分となり、殺菌効果が損なわれます10,11。第三に、高用量での長期的な全身投与は、リファンピシンによる肝毒性、アミノグリコシド関連の耳毒性および腎毒性、フルオロキノロンに関連する腱障害や心毒性などの深刻な副作用を引き起こしやすく、これらが治療の中断や患者のコンプライアンス低下の主な原因となります12,13。第四に、単剤療法や逐次投与はM. tuberculosisにおける薬剤耐性変異を選別しやすく、一方で多剤併用療法は累積毒性のリスクをさらに高めるため、持続的な臨床的ジレンマとなっています14。
ナノメディシン配送システムの開発は、前述した抗結核療法のボトルネックを解消するための有望な戦略となります。中でも、リン脂質二重層から自己組織化されるナノスケールの閉鎖小胞キャリアであるリポソームは、優れた生体適合性、生分解性、標的配送能力、および制御された徐放特性を備えているため、抗感染症治療において最も臨床応用の可能性が高いナノキャリアプラットフォームの一つとして登場しました15,16。遊離抗結核薬と比較して、リポソーム配送システムは結核治療において代替不可能な複数の利点を有しています。
第一に、マクロファージにおける標的濃縮が可能になります。リポソームは網内系（RES）の食細胞に優先的に取り込まれるため、肺、肝臓、脾臓などの主要なMTB保持臓器に特異的に蓄積します。さらに、リポソームはマクロファージ膜を効率的に透過し17、細胞内薬物濃度を大幅に上昇させて持続的な細胞内細菌を排除し、それによって結核の再発と薬剤耐性を根本的に減少させます。第二に、結核病変への浸透性が向上します。粒子径、表面電荷、および表面修飾を調整することで、リポソームは結核病変の線維性被膜や乾酪壊死バリアを効果的に通過でき、局所的な薬物濃度を著しく高めて殺菌効率を改善します18。第三に、薬物毒性を顕著に軽減します。リポソームは薬物の生体内分布を変化させ、正常な組織や臓器への曝露を制限するため、抗結核薬の全身毒性を大幅に減少させます。例えば、アミノグリコシド封入リポソームは、蝸牛や腎臓への薬物蓄積を大幅に減少させ、耳毒性および腎毒性のリスクをほぼ排除します19。第四に、長時間作用の持続放出を実現します。リン脂質二重層構造により、薬物の制御された緩徐な放出が可能となり、生体内循環半減期と作用持続時間が延長されるため、投与回数が減少し、患者の服薬アドヒアランスが大幅に向上します20。第五に、複数の薬物の共送が可能です。リポソームは、物理化学的特性が異なる複数の抗結核薬を同時に封入できるため、同期した送達と相乗的な殺菌効果を達成し、薬剤耐性MTB変異株の出現を効果的に抑制します21。
抗結核療法に向けたリポソーム薬物輸送システムの臨床応用において、大きな進展が見られています。アミカシンリポソーム吸入懸濁液（ALIS）は、Mycobacterium avium complex（MAC）肺疾患の治療薬として米国食品医薬品局（FDA）の承認を受けており22、その後、多くの国で多剤耐性結核（MDR-TB）の治療レジメンに組み込まれました。このことは、結核管理におけるリポソームプラットフォームの臨床的価値と幅広い応用展望を強調するものです23。それにもかかわらず、抗結核リポソームの開発および工業化は、依然としていくつかの重大な技術的ボトルネックに直面しています。それらには、調製プロセスの再現性の低さ、薬物担持量および封入効率の低さ、不均一な粒子径分布、保存中の凝集および薬物漏出、そしてin vitroでの溶出・放出挙動とin vivoでの有効性との相関関係が十分に解明されていないことなどが含まれます。これらの課題は、新規な抗結核リポソーム製剤の研究開発プロセスおよび臨床応用を著しく妨げています24,25。
本研究では、疎水性または弱親油性の低分子薬物（例：rifampicin）をリン脂質二重層内に封入するのに適した、薄膜水和・超音波処理・ろ過法を確立しました。親水性が非常に高い薬物の場合、追加の最適化（例：硫酸アンモニウム勾配負荷）を適用しない限り、従来の薄膜法では封入効率が低くなります。本手順は標準的な設備（エバポレーター、超音波洗浄機、HPLC、DLS、TEM）を使用するため、特殊な装置なしで容易に再現可能です。現在の10 mLのラボスケール設定では、安定した品質と良好なバッチ間一貫性が得られます。工業的なスケールアップには、蒸発真空度、回転速度、超音波出力、およびメンブレン仕様の最適化が必要となります。特筆すべき点として、リポソームは4 °Cで30 日間は安定していますが、60 日後には酸化、凝集、および層形成が認められるため、長期保存には凍結乾燥または処方の変更が必要です。我々は、リン脂質とコレステロールの比率を体系的に最適化し、調製ワークフローを標準化し、封入効率、薬物担持量、粒子径、ゼータ電位、形態、in vitro放出、および保存安定性を網羅する包括的な品質評価システムを構築しました。本プロトコルは、疎水性薬物送達に対する手法の適合性を評価する研究者に明確な指針を提供し、処方の適応、実験設計、および予備的なスケールアップ検討の参照資料となります。
プロトコル
本研究ではヒトまたは動物を対象としておらず、倫理承認は不要でした。
1. リファンピシン封入ナノリポソームの調製
注：すべての製剤を3連（トリプリケート）で調製してください。
- 10万分率分析天秤を用いてリポソーム成分を秤量する。リン脂質とコレステロールの質量比は、それぞれ95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30に設定した（表 1）。
- ロータリーエバポレーターに適した100 mLのナス型フラスコに3つの成分を入れる。すべての脂質成分を6 mLのクロロホルムに溶解させる。水槽（40 kHz, 100 W）で1 分間超音波処理し、透明な溶液を得るまで混合する。
注意：クロロホルムは揮発性有機溶媒であり、吸入または皮膚吸収により有害である。クロロホルムを用いるすべての工程（1.3–1.5）は、認定済みの化学ドラフトチャンバー内で行うこと。ニトリル手袋、白衣、および化学安全ゴーグルを着用すること。 - 以下のパラメータでロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去する：
- 凝縮器の温度を-5 °C以下に設定する。
- 水槽の温度を37 °Cに設定する。
- 回転速度を60 rpmに設定する。
- クロロホルムの沸点を下げるため、真空度を330 mbarに調整する。
注意：ロータリーエバポレーターは必ずドラフトチャンバー内で操作すること。溶媒蒸気が真空ポンプに流入するのを防ぐため、コールドトラップが適切に接続されていることを確認すること。
- 330 mbarで20 分間運転し、その後、真空度を80 mbarに上げてさらに10 分間継続し、残留溶媒を完全に除去して薄い脂質膜を形成させる26。
注：凝縮器で凝縮した蒸発溶媒は、有機ハロゲン系廃棄物として回収すること。すべてのクロロホルム廃棄物は、適切にラベル付けされたハロゲン系有機溶剤容器に廃棄すること。シンクに流さないこと。 - 真空下（≤ 80 mbar）、25 °Cで12 時間、脂質膜を乾燥させる。
注：残留溶媒の放出を防ぐため、乾燥工程はドラフトチャンバー内の真空デシケーター中で行う。 - 乾燥させた膜を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液で水和させる。フラスコをロータリーエバポレーターにセットし（真空なし）、100 rpm、37 °Cで脂質膜が完全に剥離するまで1 時間回転させる。リファンピシンの最終濃度は1 mg/mLとする。
- 水槽（40 kHz, 100 W）を用い、37 °Cで10 分間超音波処理する。水槽の温度が37 °Cに維持されていることを確認する。処理後のサンプル全量は10 mLである。
- 超音波処理した懸濁液を順次ろ過する。0.45 µmのPESシリンジフィルター（直径13 mm）を1 mLのPBSであらかじめ濡らす。10 mLシリンジを用い、10 mLのサンプル全量を0.45 µmフィルターで1回ろ過する。次に、0.22 µmのPESシリンジフィルター（直径13 mm）をあらかじめ濡らし、ろ液をさらに1回ろ過する。リポソームエクストルーダーは使用しない（図 1）。
2. 封入効率
注：封入効率（EE）は、物理的保持に基づいて遊離薬物とリポソーム封入薬物を迅速に分離する超ろ過遠心分離法によって決定した。その後、両分画中の薬物量を測定し、封入効率を算出した27。
- 0.5 mLの超遠心ろ過チューブ（3 kDa MWCO）のサンプルリザーバーに、リポソーム懸濁液を正確に200 µL加え、遠心分離して遊離薬物をリポソームから分離させる。
- 固定角ローターを用い、7,000 x g、25 °Cで15 分間遠心分離する。回収チューブにろ液を回収し、これを4〜5サイクル繰り返す。
- すべてのろ液を合わせ、メスフラスコ内でメタノールを用いて10 mLに希釈する。HPLC注入前に、0.22 µmのNylon66シリンジフィルターでろ過する。
- HPLC条件を以下のように設定する：カラム：C18カラム（4.6 mm x 250 mm, 5 µm）；移動相：アセトニトリル：リン酸水溶液 = 45: 55 (V/V)；検出波長：475 nm；流速：1.0 mL/min；カラム温度：40 °C；注入量：20 µL；分析時間：20 min
注意：アセトニトリルは可燃性および毒性がある。移動相の調製および取り扱いはドラフトチャンバー内で行い、適切な個人用保護具（PPE）を着用すること。 - 以下の式を用いて封入効率（EE）を算出する：封入効率 (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
- 以下の式を用いて薬物担持量（DL）を算出する：薬物担持量 (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%
注：Wtotal — 添加したリン脂質、コレステロール、およびリファンピシンの総量；Wrfb — 添加したリファンピシンの量；Wfree — リポソーム中の遊離薬物の量。
3. HPLC法のバリデーション
注意：直線性、精度、再現性、安定性、回収率、および特異性について、以下の通りHPLC法のバリデーションを実施してください。
- 移動相を用いて、1.15、2.3、4.6、9.2、13.8、18.4、および 23.0 µg/mLの各濃度のリファンピシン標準溶液を調製する。それぞれをHPLCで分析してピーク面積を記録し、回帰直線式とR2を算出する。
- 9.2、13.8、および 18.4 µg/mLのリファンピシン溶液のピーク面積を測定する。1日で5回の並行試験を行い、RSDを算出する。
- 9.2 µg/mLのリファンピシン溶液を4検体並行して調製する。HPLCでピーク面積を測定し、本法における併行精度（repeatability）のRSDを算出する。
- 9.2 µg/mLの標準溶液を室温で保存する。0、2、4、6、12、および 24 hに溶液を分析してピーク面積を記録し、安定性のRSDを算出する。
- ブランクのリポソームマトリックスに既知量のリファンピシン標準品を添加する。超ろ過によりサンプルを処理し、HPLCで分析した後、回収率とRSDを算出する。
- クロマトグラムを確認し、リファンピシンの保持時間に干渉ピークがないか検討する。
4. 粒子径およびゼータ電位
- リポソーム懸濁液 20 µLを、超純水（0.22 µmでろ過済み）980 µLにピペッティングする。10 s間ボルテックスした後、ウォーターバスで30 s間超音波処理を行う。
- 希釈した試料を、粒子径測定用のユニバーサルキュベットと、ゼータ電位測定用の折り畳み式キャピラリーセルにそれぞれ移す。
- パラメータを次のように設定する：分散剤 = 水、温度 = 25 °C。
- 少なくとも3回のテクニカルリプリケート（各10～15回のランで構成）を実施する。Z-average（強度加重平均流体力学的直径）および多分散指数（PDI）を記録する。
- キュベットにパラジウム電極を挿入し、同一のパラメータ条件下でゼータ電位を測定する28。
- キュベットを取り出し、装置の電源を切る。
5. 形態学的特性評価（TEM）
- リファンピシン封入リポソーム懸濁液を超純水で50～100倍に希釈し、TEM観察に適した濃度にする。
- 希釈した試料をバスソニケーター（40 kHz, 100 W）を用い、ウォーターバス中で30 s間超音波処理する。
注意：リポソームの破壊を防ぐため、過剰な超音波処理を避けること。 - 300メッシュのカーボンコート銅グリッドを、カーボン面を上にしてフィルターペーパー上に置く。
- 希釈したリポソーム懸濁液10 µLをグリッドの中央にピペットで滴下し、1 min間吸着させる。
- 清潔なフィルターペーパーを用いて、グリッドの端から余分な懸濁液を吸い取る。この際、中央の観察領域に触れないようにする。
- ネガティブ染色：直ちに2% (w/v) ホスホタングスト酸（pH 7.0）10 µLをグリッドに加える。1 min後、端から余分な染色液を吸い取る。
- グリッドを室温で3 h間風乾させる。乾燥したグリッドをTEM試料ホルダーに装着する。
- 加速電圧80～120 kVで観察する。低線量イメージングモード29を使用し、CCDカメラ（例：Gatan OneView）を用いて、公称倍率10,000倍、25,000倍、および40,000倍で画像を撮影する。
- 凝集や染色のアーティファクトがある領域を避け、代表的な視野を選択する。
6. インビトロ薬物放出試験
- 透析膜（MWCO 7 kDa）を適切な長さに切断する。2% (w/v) 重曹および 1 mmol/L EDTA を含み、pH 8.0 に調整した大量の溶液を調製する。
- 透析膜をこの溶液中で 10 分間煮沸する。その後、膜を蒸留水で十分に洗浄する。
- 洗浄した膜を放出媒体（0.01 M PBS）中で 30 分間平衡化させる。リポソーム懸濁液 1 mL を前処理した透析バッグに移し、両端を透析クリップで密封する。
- 37 °C に予熱し、0.1% アスコルビン酸 (w/v) と 0.1 mL Tween 80 を添加した放出媒体 80 mL が入った 100 mL ビーカーに透析バッグを入れる。遮光のため、ビーカーをアルミホイルで覆う。
- マグネ Tースターを用いて、37 °C、200 rpm で暗所で撹拌する。あらかじめ定めた時間（0.5、1.5、3、5、7、9、12、24、および 48 h）に、放出媒体を 1 mL ずつ分取する。
- ピペットを用いて、予熱した新しい放出媒体（37 °C）1 mL を、ビーカーの壁面に沿わせて静かに加える30（系は密閉されているため、蒸発による補正は不要である）。
- サンプルを 0.22 µm フィルターでろ過し、HPLC で分析する。分析は、セクション 2.4 に記載されているものと同じ HPLC 条件で行う。
- 累積放出率 (%) = (各時間における検出薬物総量 / 初期の薬物充填量) × 100% として算出する。
7. 保存安定性の評価
- 調製したリファンピシン封入リポソーム懸濁液を密閉ガラスバイアルに入れ、4 °Cで遮光保存する。
- 保存後1日、4日、および30日にサンプルを回収する。採取したサンプルは廃棄し、元のバイアルに戻さないこと。
- 各時点におけるリポソームの粒子径、多分散指数、およびゼータ電位を測定する31。
- 外観を記録し、リポソーム懸濁液に沈殿や層分離が生じていないか観察する。
- 60日目にさらにサンプルを回収し、懸濁液の酸化、沈殿、および層分離を視覚的に観察する。
注：すべての測定は3回の並行実験で行った。実験データは平均値 ± 標準偏差で表記した。
結果
リファンピシンの定量のためのバリデート済みHPLC法を確立した。リファンピシン標準溶液の代表的なクロマトグラムを図 2Aに示す。リファンピシンのメインピークは保持時間 14.13 min に現れ、ピーク形状は良好であり、他のピークからの有意な干渉は見られなかった。検量線は 1.15–23 µg/mL の濃度範囲で良好な直線性を示し、回帰直線は Y = 12729.5X-4778.6、決定係数は R2=0.9995 であった。医薬品分析ラボにおける定量分析では、一般に R2 ≥ 0.999 が許容範囲とされる。したがって、得られた 0.9995 という値は、本法が試験範囲全体にわたって高い直線性を有することを証明している。黒い正方形は実測値を、実線は適合させた線形回帰を示す（図 2B）。
3つのリファンピシン濃度（9.2、13.8、18.4 µg/mL）で精密度試験を実施した。ピーク面積の相対標準偏差（RSD）はすべて1%未満であり、高い機器精度が確認された（表2）。併行精度試験（n = 4）ではRSDが0.32%となり、信頼性の高い再現性が示された（表3）。室温で24時間にわたって実施した安定性試験ではRSDが0.59%となり、これらの条件下でリファンピシン溶液が安定に保持されることが実証された（表4）。平均回収率は98.12%であり、リポソーム試料中のリファンピシン分析における本手法の正確性が確認された。以上の結果から、本HPLC法が本研究におけるリファンピシンの定量分析に適していることが総合的に検証された。この厳格なバリデーションにより、その後の封入効率、薬物担持量、および放出プロファイルの測定結果が、異なる実験バッチ間においても信頼でき、再現可能であることが保証される。
遊離薬剤とリポソーム封入薬剤を限外ろ過遠心分離により分離した。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による定量分析の結果、コレステロール含有量が20%のとき、リファンピシン封入リポソームの封入効率は最大68.54%に達した。 ± 2.19であり、薬物担持率は11.42であった ± 0.37 (図3）。コレステロールが過剰な場合、リポソームの封入効率および薬物担持率は著しく低下します（表5）。これらの結果は、膜の剛性と流動性のバランスを最適化し、リファンピシンを脂質二重層内に保持するためには、コレステロール対リン脂質比を20%にすることが最適であることを示している。標準偏差が小さいこと（すべて <EEについては2.2%であり、 <（3回の独立した調製における薬物負荷量（DL）の変動係数が0.4%であり、）本調製プロトコルによって、良好なバッチ間再現性を伴う一貫した製剤品質が得られることが確認された。
最適化された方法で調製したリポソームは、狭い粒度分布（図4）、平均粒子径は185 nmであった。PDI値 <0.3は単分散集団を示す指標として広く認められており、得られた0.153というPDIは、リポソームのサイズが非常に均一であることを裏付けている。絶対ゼータ電位 >30 mVは通常、凝集を防ぐのに十分な静電反発力を提供します。測定値の−38 したがって、mV値は良好なコロイド安定性を予測します。323連サンプル間での標準偏差が低いこと（例：サイズ 185.41 ± 0.72 （コレステロール20%においてnm）であることは、調製手順の高い再現性をさらに実証している。これらの結果は、薄膜水和・超音波処理・ろ過プロトコルによって、狭い粒度分布と適切な表面電荷を持つナノスケールのリポソームが安定して作製され、それによって長期安定性が確保されることを示している。
調製したリポソームは、明らかなチンダル現象を示した。図 5A は、リポソームのチンダル現象を示している33。リファンピシン封入ナノリポソームの形態学的特性を、TEMおよび動的光散乱法（DLS）により評価した。図 4 に示すように、リポソームのDLS強度加重粒径分布曲線は単一で鋭いピークを示し、大きな粒子や凝集物は認められず、調製した製剤が良好な均一性と単分散性を有していることが示された（図 5B）。低倍率では球状のリポソーム小胞が観察されたが、一部に局所的な凝集が認められた（図 5C）。これは、試料調製時の分散不十分や、乾燥過程における小胞同士の融合に起因すると考えられる。高倍率（50,000×、図 5D）では、明確なコントラストの差が観察された。中心の暗い領域は薬剤を含む水相コアに対応し、外周の明るいリングは脂質二重層を表しており、これは陰性染色を施したリポソームに典型的な特徴である34。
TEMで観察された粒子径は、DLSで測定された流体力学的直径よりも小さかった。この不一致は、2つの手法の原理が異なることに起因する。TEMは真空条件下で脱水されたコア径を測定するのに対し、DLSは表面の水和層を含む水和直径を検出する。これはリポソームナノ粒子のよく知られた特性である35。
最初の3つのリポソーム群では、明らかなバースト放出は見られなかった（0.5時間時点での累積放出率は <（全群で40%）。バースト放出 <長時間作用型抗結核製剤においては、急性全身毒性のリスクを最小限に抑えるため、最初の1時間以内に40%以下に放出されることが一般的に安全であると考えられています。具体的な放出段階は以下のように区分されます。
急速放出期（0.5–12 h）：薬剤がリポソームの表面層または膜近傍領域から徐々に拡散し、放出速度は比較的速かった。最初の3群の累積放出率は、12 h時点で90%近かった（図6）。
24時間後、リファンピシンが酸化分解および加水分解を起こし、その結果、累積放出率が異常に低下したと考えられた。36コレステロール含有量が30%のとき、0.5時間における累積放出率は >40%であり、徐放性基準を満たさなかった。
したがって、5–15%のコレステロールを含む製剤は許容範囲内であり、20%であってもバースト放出の基準を満たしている。バッチ間のばらつきが小さいこと（図6）から、放出試験法の再現性が確認された。
最初の3つのグループの放出データを、一般的な速度論的モデル（0次、1次、Higuchi、およびRitger-Peppas）に当てはめた（図7）。その結果、1次速度論モデルが最も高い適合度（R2= 0.987）を示し、これは0次（R2= 0.246）、Higuchi（R2= 0.544）、およびRitger-Peppas（R2 = 0.926）モデルよりも有意に優れていた。このことは、リポソームの薬物放出挙動が1次速度論に従うことを示している。放出速度はリポソーム中の残留薬物濃度と正の相関があり、典型的な「初期バースト放出後の持続的放出」という特性を示しており、コレステロールが膜構造を調節することで拡散速度に影響を与えるというメカニズムをさらに検証する結果となった37。
リファンピシン封入リポソームは、以下の条件下での30日間の保存において良好な短期安定性を示した。 4 °C1日、4日、および30日の評価期間を通じて、粒子径はわずかに増加したが、優れたサイズ均一性（PDI < 0.15) および良好なコロイド安定性（絶対ゼータ電位 > 24 mV）に維持された（表6）。60日目には明らかな酸化と凝集塊が観察され、本製剤の長期安定性が低いことが示された。この結果は、長期保存には凍結乾燥または製剤の変更（抗酸化剤や凍結保護剤の添加など）が必要であることを強調しており、本プロトコルを利用する研究者にとって重要な実用的知見となる。
図1薄膜水和法によるリファンピシン封入リポソームの調製。 リファンピシン封入リポソームの調製工程を示す概略図。脂質成分を有機溶媒に溶解し、その後、回転蒸発による薄膜形成、真空乾燥、水和、および超音波処理を行うことで、最終的なリポソーム製剤を作製した。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2リファンピシンのHPLCによる同定および校正。 (A) 定量分析に使用される特徴的なリテンションピークを示すリファンピシンの代表的なHPLCクロマトグラム。（Bリファンピシン濃度（1.15–）に対してピーク面積をプロットして作成した検量線23.0 µg/mL）。回帰方程式および相関係数（R2 （R² = 0.9995）であり、テストした濃度範囲において優れた直線性を示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3リファンピシン封入リポソームの封入効率および薬物充填量。 異なるコレステロール含有量で調製したリポソームの封入効率（EE）および薬物負荷量（DL）。コレステロール含有量20%において最高のEE（68.5%）およびDL（11.4%）が観察され、コレステロール含有量が薬物の封入および負荷に大きな影響を与えることが示された。エラーバーは平均値を表す。 × SD (n = 3)。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4リファンピシン封入リポソームの粒子径分布。 異なるホスホリピッドとコレステロールの比率で調製したリファンピシン封入リポソームの粒子径分布プロファイル。最適化された処方は、Z平均粒子径185 nm、多分散指数（PDI）0.153を示し、狭い粒度分布と良好な均一性を有することが示された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5リファンピシン封入リポソームの物理化学的特性評価。 (Aリファンピシン封入リポソーム懸濁液で観察されたチンダル現象は、ナノスケール粒子の存在を示している。B) 最適化したリポソーム処方の3つの並行反復試料における粒子径分布曲線。 (C) 複数の球状リポソーム小胞を示す透過電子顕微鏡（TEM）像。 (D）個々のリポソーム小胞の代表的な高倍率TEM像。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6リポソームからのリファンピシンのin vitro放出プロファイル。 異なるホスホリピッド対コレステロール比で調製したリポソームからのリファンピシンの研究期間中における累積放出プロファイル。放出挙動はコレステロール含有量によって異なり、薬剤の放出特性に対するコレステロールの影響が示された。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7リポソームからのリファンピシン放出の速度論的モデリング。 最適化された処方（コレステロール20%）の放出データを、(A) ゼロ次、(B) 一次、(C) Higuchi、および (D) Ritger-Peppas の各速度論モデルに適合させた結果。一次モデルが最も高い適合度を示した（R2 = 0.987)であり、実験による放出データと最も良好に一致していることを示している。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| リポソーム構成成分 | レシチン | コレステロール | リファンピシン |
| 5% | 47.5 mg | 2.5 mg | 10 mg |
| 10% | 45 mg | 5 mg | 10 mg |
| 15% | 42.5 mg | 7.5 mg | 10 mg |
| 20% | 40 mg | 10 mg | 10 mg |
| 25% | 37.5 mg | 12.5 mg | 10 mg |
| 30% | 35 mg | 15 mg | 10 mg |
| 最終容量 | 10 mL | ||
表 1: リファンピシン封入リポソーム処方の組成。 最終容量を 10 mL に維持しながら、レシチン、コレステロール、およびリファンピシンを用いて、リン脂質とコレステロールの比率が異なるリポソームを調製した。
| 濃度 (µg/mL) | X±S | RSD (%) |
| 9.2 | 114012.75 ± 502.42 | 0.44 |
| 13.8 | 171412.50 ± 493.90 | 0.29 |
| 18.4 | 232334.00 ± 1358.42 | 0.59 |
表2: 異なるリファンピシン濃度におけるHPLC定量精度。 9.2、13.8、および18.4 µg/mL濃度のリファンピシン標準溶液についてピーク面積を測定した。結果は平均値 ± 標準偏差（SD）で示されており、相対標準偏差（RSD）値は高い分析精度を示している。
| いいえ。 | 1 | 2 | 3 | 4 | 相対標準偏差 (%) |
| ピーク面積 | 114503 | 114125 | 113969 | 114539 | 0.32 |
表3: HPLC法の装置精度。 同一のリファンピシン標準溶液を4回連続で注入して精度評価を行った。装置の再現性を評価するため、ピーク面積値と相対標準偏差（RSD）を報告する。
| 時間 (h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 24 | 相対標準偏差 (%) |
| ピーク面積 | 114503 | 114325 | 114516 | 113978 | 113894 | 113638 | 112576 | 0.59% |
表4: リファンピシン標準溶液の安定性室温で保存し、0、2、4、6、8、12、および24時間後に分析した9.2 µg/mLのリファンピシン標準溶液の安定性評価。試験期間中の溶液の安定性を評価するために、ピーク面積値と相対標準偏差（RSD）を報告する。
| コレステロール | 粒子径(nm) | PDI | ゼータ電位 (mV) | 封入効率 (EE, %) | 薬物負荷量 (DL, %) |
| 5% | 206.27±1.14 | 0.240±0.004 | -42.72±0.26 | 64.09±1.30 | 10.68±0.22 |
| 10% | 183.87±2.54 | 0.149±0.004 | -24.80±1.04 | 64.70±0.30 | 10.78±0.05 |
| 15% | 202.06±3.16 | 0.131±0.007 | -27.90±1.04 | 65.11±1.62 | 10.85±0.27 |
| 20% | 185.41±0.72 | 0.164±0.044 | -37.74±1.44 | 68.54±2.19 | 11.42±0.37 |
| 25% | 181.58±1.31 | 0.100±0.008 | -19.96±0.16 | 49.38±2.52 | 8.23±0.42 |
| 30% | 178.78±0.82 | 0.074±0.014 | -40.25±0.33 | 48.24±2.06 | 8.04±0.34 |
表 5: リファンピシン封入リポソームの物理化学的特性。異なるコレステロール含量で調製したリポソームの粒子径、多分散指数 (PDI)、ゼータ電位、封入効率 (EE)、および薬物担持量 (DL)。データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) で示している。
| 1日 | 4日間 | 30日間 | |
| サイズ(nm) | 183.87±2.54 | 212.42±3.12 | 273.57±4.38 |
| ポリ分散指数 | 0.149±0.004 | 0.106±0.002 | 0.126±0.009 |
| ゼータ電位(mV) | -24.80±1.04 | -57.12±1.49 | -55.38±2.50 |
表 6: 4 °Cにおけるリファンピシン封入リポソームの保存安定性。 4 °Cで1日、4日、および30日間保存した後のリファンピシン封入リポソームの粒子径、多分散指数（PDI）、およびゼータ電位の変化。結果を用いて、保存中のリポソーム製剤の物理的安定性を評価した。
ディスカッション
リファンピシンは、抗結核化学療法の第一選択薬として依然として不可欠な薬剤ですが、用量依存的な肝毒性、Mycobacterium tuberculosis (MTB) 含有マクロファージへの不十分な細胞内浸透、および治療下回量の曝露による薬剤耐性の急速な出現により、その臨床的有用性は著しく損なわれています。これらの未充足な臨床ニーズに対処するため、本研究では、超音波処理およびろ過を組み合わせた堅牢な薄膜水和法プロトコルを確立し、リファンピシン封入リポソームの作製を最適化しました。最適化された製剤は、均一なナノスケールの粒子径、完全な小胞形態、高い薬剤封入効率、および持続的なin vitro薬剤放出プロファイルを示しました。また、動的光散乱法 (DLS)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、およびin vitro溶出試験を用いて、包括的な物理化学的特性評価を行いました。
リポソームの品質と再現性は、プロトコルのいくつかの手順に決定的に影響されます。まず、リン脂質とコレステロールの比率が極めて重要です。最適な比率である80:20では、EE = 68.5%、DL = 11.4%となりますが、これを75:25または70:30に変動させると、 >EEが30%消失しています。10万分精度の天秤による精密な計量が必須です。次に、水和（セクション 1.6) 100で回転させる必要がある rpm, 37 °C 1について 真空を用いずにロータリーエバポレーターでh。静置培養または手動での振盪は、再現性の低下を招きます。第三に、超音波処理（セクション 1.7): 40 kHz, 100 W, 10 37℃で〇〇分 °C Z平均値185が得られる nmおよびPDI < 0.2. 短時間の超音波処理（5 分）で得られる >300 nmおよびPDI > 0.3；より長時間の超音波処理（20 分)を超えると、薬剤が分解されるリスクがあります。37℃を維持してください。 °C リファンピシンは熱に不安定であるためです。4つ目に、連続ろ過（0.45 µm その後、0.22 µm）、PBSでフィルターをあらかじめ濡らしてから、ゆっくりと1回だけろ過してください。乾燥したフィルターに無理に押し出したり、小さなシリンジを使用したりすると、ベシクルが破裂する可能性があります。5番目に、EE（セクション 2.1–2.3)：正確に200 µL、7,000rpmで4サイクル × g, 25 °C、各サイクルの後にすべてのろ液を回収し、合わせてください。不完全なサイクルは、抽出効率（EE）を過大評価することになります。6つ目に、TEM（透過型電子顕微鏡）による陰性染色（セクション 5.6): 2%ホスホタングステン酸、pH 7.0、直ちにブロッティングを行う。遅延や不適切なpHは、ベシクルの崩壊を招く。これら6つのステップを一貫して遵守することで、3回の反復試行における標準偏差が低いことから明らかなように、判定基準を満たすリポソームを得ることができる。
コレステロールはリポソーム二重層の重要な構造成分であり、膜の流動性、機械的安定性、および親油性薬物の保持に対して二面的な影響を及ぼすことが十分に立証されています。本研究では、コレステロールのモル比が製剤の性能に与える影響を体系的に評価した結果、コレステロール含有量20%（質量比）において最大の封入効率68.5%が達成されることを見出しました。この最適比は、薬物の漏出を最小限に抑えるためのリン脂質二重層の秩序あるラメラ構造の維持と、親油性分子であるリファンピシンを二重層の疎水性コアに収容させるために十分な膜流動性を維持することとのバランスをとっていると考えられます。逆に、コレステロール含有量が20%を超えると、脂質二重層の過度な剛直化と規則的なラメラ配列の崩壊が起こり、結果として封入効率と薬物担持量の両方が著しく低下しました。これらの知見は、リポソーム膜工学におけるコレステロールの役割に関する既存のメカニズム的理解と一致しています。したがって、高い薬物担持量を達成するためには、正確な脂質の計量（10万分率天秤を使用）と、20%のコレステロール質量比の厳守が不可欠です。
最適化されたリファンピシン封入リポソームは、平均流体力学的直径185 nm、多分散指数（PDI）0.164 ± 0.044を示し、粒子径分布が非常に均一であることが示された。このナノスケールのサイズ（< 200 nm）は、炎症を起こした肺結核病変への受動的標的化を可能にする透過性および滞留性の亢進（EPR）効果と適合するだけでなく、MTBの主要な細胞内ニッチである肺胞マクロファージによる効率的な食作用にとっても最適である。この粒子径設計は、MTB感染マクロファージ内での治療濃度達成が困難であるという、遊離リファンピシンの根本的な限界を解決する可能性を秘めている。最適化された製剤のゼータ電位は−38 mVであり、粒子間に強い静電反発力が働くため、短期間の保存における小胞の凝集、融合、および沈降を効果的に抑制し、優れたコロイド安定性を確保している。特筆すべき点として、TEMで測定されたコア粒子径はDLSで得られた流体力学的直径よりも小さかったが、これはリポソームの特性解析において十分に知られている現象である。すなわち、DLSでは周囲の水和層を含む水和小胞の直径を定量するのに対し、TEM画像では高真空条件下での脱水された脂質コアを捉えるためである。したがって、この差は特性解析における不整合ではなく、物理化学的に合理的であり、予想される結果である。
TEM観察により、最適化されたリポソームの形態学的特性がさらに検証されました。その結果、リポソームは大部分が均一で球形の完全な単層小胞であり、わずかな局所的な凝集は見られたものの、明らかな融合や膜の破裂は認められませんでした。これらの知見は、超音波処理とろ過の組み合わせプロセスにより、リポソーム二重層の構造的完全性を維持しつつ、小胞の形態と層数を精密に制御できることを裏付けています。構造的完全性は、保存中の薬剤保持能、in vivoでの循環安定性、および標的配送能に直接的に相関するため、リポソーム製剤における重要な品質特性となります。加えて、リポソーム懸濁液に顕著なチンダル現象が観察されたことで、ナノスケール小胞分散液のコロイド特性がさらに確認されました。
in vitroでの薬物放出試験により、最適化されたリファンピシン封入リポソームは、最初の0.5 h以内に有意なバースト放出を示さないことが実証されました。これは、遊離リファンピシンの急速な血漿中濃度ピークに伴う急性全身毒性のリスクを軽減させる重要な特性です。薬物放出速度論的モデリングの結果、放出プロファイルは一次速度論モデルに最もよく適合し、リポソーム脂質二重層からのリファンピシンの放出は、脂質マトリックスの浸食よりも主に受動拡散によって支配されていることが示されました。この拡散制御による徐放パターンは、有効な治療薬物濃度を長期的に維持することを可能にし、薬剤耐性の出現を誘発する治療下回りの曝露リスクを低減するため、抗結核療法において非常に望ましいものです。24 h後に累積薬物放出量のわずかな減少が観察されましたが、これは水性放出媒体中における非封入リファンピシンの酸化および加水分解による分解に起因する可能性が高く、この知見は水性環境におけるリファンピシンの安定性に関する既報のデータ38と一致しています。重要な点として、リポソームの脂質二重層が封入された薬物のために保護的な微小環境を提供し、遊離リファンピシンと比較して分解条件への曝露を減少させていることが挙げられます。
本研究で開発された最適化リファンピシン封入リポソーム製剤は、従来のリファンピシン化学療法の主要な限界を直接的に解決し、抗結核療法において複数の明確な利点を提供します。第一に、リポソームの二分子層が水性および生物学的環境における薬剤の早期分解に対する保護障壁となり、リファンピシンの抗菌活性を維持します。第二に、持続的な拡散制御放出プロファイルによって薬剤の全身循環半減期が延長されるため、投与回数の削減と患者の治療アドヒアランスの向上が可能になります。これは、長期的な結核化学療法における大きな課題です。第三に、最適化されたナノスケールの粒子径により、EPR効果を介した炎症性結核病変への受動的標的化と、MTB感染肺胞マクロファージによる効率的な取り込みの両方が促進され、遊離リファンピシンでは到達不可能な高い細胞内薬剤濃度を達成できます39,40。最後に、本製剤は生体適合性のある天然由来のリン脂質とコレステロールで構成されており、配送キャリア自体に関連する免疫原性や全身毒性のリスクを最小限に抑えています。
注目すべき点として、本研究には今後の研究で対処すべきいくつかの限界がある。in vitroでの物理化学的特性評価および放出プロファイルは、製剤として有望な性能を示しているが、関連する動物モデルを用いて、リファンピシン封入リポソームの薬物動態挙動、組織分布、抗結核 efficacy、および全身毒性を評価するためのさらなるin vivo研究が必要である。加えて、工業規模の製造に向けた最適化済み調製プロトコルのスケールアップ可能性についても、さらなる検証が必要である。
結論として、本研究ではリファンピシン封入リポソームを作製するための、簡便で再現性が高く、堅牢な薄膜水和ー超音波処理ーろ過プロトコルを確立した。系統的な処方最適化により、封入効率と膜安定性の制御におけるコレステロール含有量の重要な役割が明らかになり、最適化された処方は、理想的な物理化学的特性、高い薬剤封入効率、優れたコロイド安定性、および制御された持続的なin vitro薬剤放出を示した。この標準化されたプロトコルは、リポソーム化抗結核薬送達システムの開発と特性評価のための信頼性の高い手法的な枠組みを提供し、薬剤感受性結核および薬剤耐性結核の両方の治療に向けたリポソーム化リファンピシンのその後の前臨床評価のための強固な基盤を築くものである。
開示事項
著者らに開示すべき利益相反はありません。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（No. 21977019）の助成を受けて実施されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| L-α-ホスファチジルコリン（大豆由来） | RHAWN | R024502 | 純度 ≥90%, 25 g/bottle, CAS: 97281-47-5 |
| 1× PBSバッファー | Solarbio | P1038 | 500 mL, 0.01 mol/L, pH 6.5 |
| 1× PBSバッファー, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific (Gibco) | C10010500BT-1 | 500 mL, pH 7.4 |
| クロロホルム | Guangzhou Brand | GD10-AR-2.5L | ARグレード, 500 mL/bottle, CAS: 67-66-3 |
| コレステロール | Aladdin | C104028-5g | ARグレード, ≥95% (HPLC), 5 g/bottle, CAS 57-88-5 |
| 透析膜 (MD25, 7000 Da) | Solarbio | YA1081-5m | MWCO 7000 Da, 長さ 5 m, 非金属材料 |
| 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) システム, LC-20A | 島津製作所, 日本 | LC-20A | 本システムは、SPD-20A UV検出器、CBM-20A 4元ポンプ、LC-20AT オンライン脱気装置、SIL-20A オートサンプラー、CTO-20A カラムオーブン、および LC-solution ワークステーションソフトウェアを備えている。リファンピシンの定量分析に使用した。 |
| 高速卓上遠心機 | Shanghai Anting Scientific Instrument Factory | TGL-16B | 試料の遠心分離に使用 |
| L-アスコルビン酸 | Macklin | A800296 | 純度 99.99%, 100 g/bottle, CAS: 50-81-7 |
| Omni 粒子径・ゼータ電位解析装置 | Brookhaven Instruments Corporation, USA | 173PI | リポソームの粒子径、多分散指数 (PDI) およびゼータ電位の測定に使用 |
| リファンピシン | Macklin | R817237 | 純度 97%, 250 mg/bottle, CAS: 13292-46-1 |
| 透過型電子顕微鏡 (TEM) | 株式会社日立製作所, 日本 | HT7700 | リポソームの形態観察に使用 |
| Tween 80 | Energy Chemical | E0807391000-A01 | ARグレード, 100 mL/bottle, CAS: 9005-65-6 |
| 超遠心ろ過フィルターユニット (0.5 mL, 3 kDa) | Merck Millipore | UFC500396 | MWCO 3 kDa, 容量 0.5 mL, プラスチック材料 |
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