安定バエStomoxys calcitransの遺伝子改変のための効率的な飼育およびマイクロ注入プロトコル

サマリー

このプロトコルは、安定ハエゲノムに異物遺伝物質を統合するための信頼性の高い胚マイクロ注入法、注射後の胚発生を監視するための蛍光スクリーニングシステム、そしてエ スケリキア・コリ を接種した活性炭補給卵黄寒天からなる幼虫育成基質を記述し、卵から成虫への発育を支援します。

要約

安定ハエは家畜、伴侶動物、人間の血を吸う害虫で、南極大陸を除くすべての大陸で見られます。雄雌の成獣の痛みを伴う咬傷は家畜にストレス関連の行動を引き起こし、生産者にとって体重減少や大きな経済的損失をもたらします。オス・メスの安定バエは義務的な血を吸う者であり、これは不妊の昆虫処理やオスの大量放出を必要とする害虫管理戦略にとって課題となっています。現在の安定したハエ害虫管理戦略は、しばしばハエの個体数を十分に制御できていません。蚊、 ショウジョウバエ、その他のモデル昆虫群に対して、外因性遺伝物質の導入や遺伝子ノックアウト誘導のための多くの遺伝子操作法が開発されていますが、安定したハエの遺伝子変換の方法は依然として限られています。本プロトコルは、ピギーバックトランスポザーゼの多活性変異体と、胚マイクロ注射後の幼虫回復、孵化、摂食、蛍光スクリーニングを支援する新しい固体幼虫育成培地を用いて、安定ハエに異物遺伝物質を導入する信頼性が高く改良されたアプローチを説明しています。

概要

安定バエ(Stomoxys calcitrans L., 1758)は、^家畜の経済的に重要な害虫および病害媒介者^{であり、世界的}に広範囲に分布しています。統合害虫管理(IPM)戦略は、安定したハエの個体数を十分に制御できず^、米国だけで年間損失が20億ドルを超えると推定されています。³。さらに、ヨーロッパの安定したハエ個体群で殺虫剤耐性が記録されており、^{アメリカ合衆}国でも報告されています。したがって、不妊昆虫技術(SIT)や遺伝子ドライブシステムなどの遺伝子制御アプローチは、従来のIPMプログラムに加えた望ましい要素となっています。

安定バエにおける遺伝子制御法の開発、特にSITの遺伝的性識別株の生成を含むこれまでの試みは、選択的繁殖と放射線誘発性^{転座に依存し}ていました^7,8。これらのアプローチは労力を要し、非遺伝子組み換えに限定されます。その後、O'Brochtaらは⁹はヘルメストランスポザーゼシステムの利用がS. calcitransにトランス遺伝子を統合できることを示しました。しかし、このプロトコルは注入胚の約0.11%でトランスジェニックな子孫を産出し、外因性プロ^{モーター9}の制御下で強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)マーカーの発現も弱く、形転換効率は低くなっていました。

CRISPR-Casシステムを含む他の遺伝子操作手法は、安定したハエ胚の強靭な絨毛膜を通過するのが難しいため、安定ハエにはまだ広く適用されていません。硬い外側絨毛膜は他の筋肉質のバエと同等です^10,11。石英針を使った注射や両面接着テープで絨毛膜を除去しようとした試みは成功せず、酸化性溶液(3%次亜塩素酸塩、NaOCl)による処理が必要となり、卵の孵化率を低下させました。

安定したフライは実験室条件下で長期的に維持でき、未成熟の段階は通常、木片、小麦ふすま、または窒素源(子牛タンパク質サプリメントや魚フレークなど)を補った発酵セルロース基質で育てられます¹²。しかし、これらの基質はマイクロ注入胚の育成に使用される際にいくつかの欠点があります。孵化して基質に潜入した後のGFP陽性幼虫の識別は困難です。さらに、幼虫の生存には一定の細菌存在^{が必要ですが、}発酵培地は予測不能な細菌や真菌群集を導入し、孵化前に胚を損傷または消費する可能性があります。これらの制限により、前述の注入・育^{成法による}形質転換幼虫の回復が困難であり、発育過程を通じて蛍光スクリーニングも可能なより信頼性の高い注入プロトコルの必要性が浮き彫りになりました。

ここに紹介するのは、トランスポザーゼ選択、注射方法、スクリーニングおよび育成培地の改良を組み込んだ再現可能なマイクロインジェクションプロトコルです。これらの修飾により、SITの遺伝子セクシング株、遺伝子ドライブ、CRISPR-Casを媒介した遺伝子ノックアウトなどの応用に向けた遺伝子組み換え安定したフライの開発が促進されます。主な改良点には、安定ハエ熱ショックタンパク質(HSP)83プロモーターの制御下での過活性ピギーバックトランスポザーゼ¹⁴ の使用、注射後の卵質損失を最小限に抑えるための胚乾燥、胚注入時の粘着テープやハロカーボン油の除去が含まれます。

注入された胚の回収は、バルク育成培地を大腸菌の芝生で接種した平らで色素入りの栄養寒天プレートに置き換えることでさらに改善されました。この寒天製剤には2つの大きな利点があります。第一に、幼虫の発生に向けた予測可能な単一遺伝子細菌の食物源を提供します。第二に、高コントラストで低自己蛍光の背景を提供し、第一世代(G0)幼虫の形態、発生、GFP発現の観察を容易にします。ハエおよび安定したハエは、大腸菌に接種された卵黄ベースの寒天プレート上で正常に発生し蛹化します^13,15。ここで説明する配合には、活性炭粉末を非反応性で食品安全添加物として組み込み、背景蛍光をさらに低減します。

プロトコル

すべての実験と運営は、テキサスA&M大学の機関バイオセーフティ委員会(プロトコルIBC2019-081)の承認を得て実施されました。このプロトコルで使用される試薬、化学物質、工具は 材料表に記載されています。

1. 卵産のためのフライの育成

1. 成虫ケージの準備
   1. インキュベーターチャンバーのサーモスタットを28°Cに設定し、塩化ナトリウム3kgと~5Lの水道水を10Lのパンで混ぜ、塩分の~50%を溶かします。
   2. この露出した塩水鍋を培養槽の底に置き、湿度を約80%の湿度に保ちます。チャンバーや部屋で16:8の昼夜サイクルを維持してください。
   3. 昆虫ケージの底(30 x 30 x 30 cmのステンレス/アルミ製メッシュネット付き)に2層のペーパータオルを敷き、その上に45mLの使い捨て調味料カップ(グラニューュレートの食卓用砂糖を入れて)をその上に置きます(図1A)。
      注: ペーパータオルはハエの吸収を助け、砂糖は血液供給前の食料源となります。
   4. 250mLのグリフィンビーカーに室温の水道水約100mLを入れ、20cm×20cmの正方形の黒い綿布(無地の黒い枕カバーやベッドシーツから切り出したもの)を水に詰めて布を湿らせます。黒い布の縁をビーカーの縁から1〜2cm外に伸ばすように調整します(図1B)。
      注: この湿った布は、成虫にとって液体の水と産卵面の両方を提供します。成虫が水分源にアクセスできない場合、死は急速に起こり得ます。
   5. 安定したハエの蛹500〜1,500匹を小さな皿やビーカーに移し、昆虫ケージに入れます。成虫のケージを湿った育成室に入れ(ステップ1.1.1)、毎日巣花の発生を監視してください。成体が出てきたら、毎日クエント入り牛の血で給餌を始めます(セクション1.2)。
2. 成虫の餌やり
   1. 新たに採取した牛の血液に最終濃度10.9 mMのトリソジウムクエン酸二水和物を加えて、シエント化した牛血を調製します。
   2. 短時間、最小量の脱イオン水に12.8グラムのシトレート塩を懸浮させ、地元の屠殺場で採取した血液4リットルに加えます。
      注: 血液容器は蓋がねじでつぶたされているべきです(例:四角い、ワイドマウス、4Lグリップボトル)。使用前に温かい石鹸と水で十分に洗浄してください。屠殺場では、屠殺された牛の最初の~1リットルの血液を採取せず、毛髪、汗、土、その他の凝固物質の汚染を最小限に抑えましょう。
   3. 200mLのアリコートに冷凍シコトリウム入り牛の血液を凍結し、必要に応じて解凍します。解凍したアリコートは4°Cで最大1週間冷蔵保存します。
   4. 成虫ケージごとに600匹あたり約40mLの室温血液を供給してください。
   5. 血液は調味料容器やビーカーに入れられ、折りたたんだ非滅菌の綿のガーゼスポンジを血管に挿入して血液を吸い取る必要があります。芯を綿が完全に湿らせるまでかき混ぜてからケージに差し込みます。
      注: 出頭後24時間から毎日血液交換を行うべきです。
3. 卵の収集
   1. 黒い綿布に卵が付着しているのを確認したら、ビーカーから布を取り出し、洗いボトルを使って別の~700mLの浅いプラスチック容器に卵を洗います(図2A)。産卵は通常、ハエが7〜10日齢のときに起こります。
      注: また、血液カップに卵がないか確認し、そこに産まれている可能性のある卵も回収してください。
   2. 真空ろ過 で フィルターペーパーに卵を集めます。これは、黒いフィルターペーパーをブフナー漏斗に入れ、真空をかけてから、 ステップ1.3.1 の卵をセットアップの上に注ぐことで行われます。
   3. その後、洗浄ボトルを使って目盛りシリンダーまたは目盛り1.7mLのマイクロ遠心分離機チューブに卵を移し、採取した卵の体積を記録します(図2B)。
      注: 卵を長時間水に浸すことは避けてください。浸水後~10分で死亡率が上昇し始めます。
4. 大量幼虫培地の調製
   1. 表1に示されたように、バルク幼虫培地(図3A)用の材料を収集します。
   2. 1000mLのビーカーに子牛プロテインサプリメントと全ての水道水を加えます。室温で一晩再水和させてください。
   3. 小麦ふすまとバーミキュライトは別の大きな混合容器に加えます。
   4. 一晩水和した後、再水和した子牛サプリメントをよくかき混ぜて塊をほぐし、その後小麦ふすまとバーミキュライトを容器に注ぎます。均一になるまでよく混ぜ、すべての小麦ふすまが子牛のサプリメントスラリーでコーティングされます。
   5. バルクメディアをポリプロピレン製食品保存容器に移し、容器底全体を覆う~8cmの層を設けます(図3B)。
   6. 胚を採取することで、約1,000個の胚(2.2Lのバルク培地あたり約0.2mLの卵子)を追加します 。直径90mmの円形フィルター紙に真空ろ過を行い、その後、フィルターシートを裏向きにしてメディアビンの中央に置きます(図3B、C)。
   7. フィルターペーパーには湿度を保持するために~1cmの媒体で覆い(図3C参照)、容器には黒い綿布の大きめの長方形を敷き、容器の縁から5cmの綿布を張り出します。
   8. 食品容器の蓋に大きな穴(直径~12cm)を開けてガス交換を可能にし、蓋をメディアビンにパチッと固定しつつ、容器と蓋の間に黒い綿布を挟みます(図3D)。
      注: これはガスケットの役割を果たし、蓋と容器の間の隙間が1^齢 幼虫を結露の滴に閉じ込めるのを防ぎます。
   9. 完成した培地箱を成虫の育成室に置き、蛹化まで並べ、幼虫の発育を監視します(図4)(蛹化は培地温度や幼虫密度により約10日で行われます)。
      注: 布の被覆は、1齢幼虫が通過しないように十分細かく、かつメディアビンの内壁に結露ができて幼虫を捕らえ溺れさせるのを防ぐために透水性が良い必要があります。
5. 蛹の分離
   1. 蛹箱から布を外し、スプーンやすくいで蛹を集めます。
      注: 安定したハエの蛹は、移動性のない赤褐色の円筒形で、長さは4〜7mmで、移動性の黄白色の幼虫とは対照的です。蛹は通常、容器の外周や媒介容器内の湿った高台に集まり、ハエが幼虫から蛹、成虫へと変態を始める際に発生します。
   2. 500〜1,500個の蛹を皿に層積み、1.1節で説明した通り新しい清潔なケージに入れて次世代を増やします。

図1:成虫ハエ飼育用材料。 (A) 成虫ハエ飼育ケージ。ショ糖カップ(S)と産卵カップ(O)が示されています。(B)ビーカーの縁を少し越えて伸びた水分を浸した黒い綿布で準備した産卵カップ。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:卵の採取。 (A) 洗浄ボトルを使った産卵布から卵の採取。(B)高コントラストのフィルターペーパー上への真空ろ過による卵の回収。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

バルク幼虫用メディアの材料
試薬	質量(g)
水	900
小麦ふすま	230
ふくらはぎのサプリメント	100
バーミキュライト(A4粗)	70
脱絨毛溶液の材料
解決策	作曲
酸化浴	脱イオン水中の次亜塩素酸ナトリウム3%
洗い浴	トリトンX-100 0.02%の溶液を脱イオン水中に溶かす
すすぎ	脱イオン水
黒寒天のスクリーニングおよび育成プレートの材料
試薬	質量(g)
水	500
粉状卵黄	18
活性炭	4
塩化ナトリウム	1

表1:バルク幼虫培地用試薬、脱胆液溶液、黒寒天プレート。 コロニー維持のためのバルク幼虫培地の調製に用いられる試薬、安定したハエ胚から絨毛虫を弱め除去するための溶液の組成、さらに500mLの黒寒天スクリーニングおよび育成培地の準備に必要な材料。

図3:バルク幼虫培地の調製。 (A) バルク幼虫培地の調製に使用される材料:子牛タンパク質補給(CM)、小麦ブレ(WB)、バーミキュライト(VM)、保存容器(SC)、蓋(L)、布製ガスケット(FG)。(B) 媒体成分の徹底的な混合。(C) 卵で覆われたろ過紙(EP)をメディア表面に裏向きに置き、乾燥を防ぐために追加のメディアで覆うこと。(D) 容器と蓋の間に綿布製ガスケットを取り付けること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:バルク培地中の幼虫発生。 透明な容器により、幼虫の発達や培地の状態のモニタリングが可能です。幼虫(L)は容器の壁、蓋、培地内に見えます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. 注射準備:脱絨毛化と乾燥

1. ステップ1.1.4の手順で濡らした黒い綿布をビーカーに入れ、成虫用のケージに移して25分間卵を集めます。卵を洗浄ボトルで106μmのステンレス製ふるいにすすぎます。
   注: 25分の採集期間で通常約400個の卵が採れます。
2. 胚をさらに30分間、ふるいの上で静かに置きます。
3. 胚が老化している間、 表1 (図5)の「脱クロイオン化溶液」セクションに記載されている酸化、洗浄、洗浄液をそれぞれ150mL準備します。胚を覆うほどの十分な量を約1cmの溶液で覆ってください。
4. 胚を含む篩を酸化浴に2分間浸し、パスツールピペットで優しく攪拌します(図6A)。
   注: 繰り返し吸引し溶液を投与して円形の渦を作り出すことで、胚を篩の中心に集中させ、脱毛したばかりの胚がふるい壁に付着するのを防ぎます。
5. 酸化浴からふるいを取り出し、余分な溶液を叩き落とします。篩を洗浄液に移し、吸引して2分間攪拌します。
6. 胚を含むふるいを洗浄液に移し、 ステップ2.4 で説明した通りに2分間攪拌します。すすぎ液からふるいを取り出し、余分な水をタップで抜きます。
7. 滅菌ガラスカバースリップを篩の上に置き、解剖顕微鏡の下で細かいナイロン製のペイントブラシを使って胚(図6B)を篩からカバースリップの端に移します。胚は接触せず近づけ、後方の広い極はカバースリップの端に向かいます。移植中に胚を曲げたり歪めたり、裂いたりしないでください。
8. 乾燥室を準備するには、1リットルのフラスコの底に硫酸カルシウム乾燥剤100mLを詰め、ゴム栓で密封します。
   注: 24時間の平衡後、乾燥室は通常23°Cで相対湿度<5%に達します。
9. カバースリップの余分な水分を取り除き、脱毛膜胚を含むカバースリップを乾燥剤の上に置きます。フラスコをゴム栓で再密封し、胚を8分間乾燥させます。
10. カバースリップを乾燥室から取り出し、顕微鏡ステージに置き、20×の対物レンズの下で顕微注射を行います。

図5:デコリオン化解。 左から右へ:ステンレスのふるい、酸化液、洗浄液、胚の脱胆液に使われる洗浄液。次亜塩素酸ナトリウムは光から保護された6%のストック溶液として維持され、Triton X-100は使用前に10 ×のストック溶液として保持され、最終濃度0.02%まで希釈されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:胚の脱胆毛化。 (A) 穏やかな吸引と溶液の投与により、胚が篩の中心に集中し、篩壁への接着を減少させる渦が生じます。(B)洗浄後に半透明絨毛から脱胆毛胚が出ること。前極(細い端)は通常、後極より先に現れます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. マイクロインジェクション

1. 表2に記載されたパラメータを用いて、100mmのフィラメントガラス毛細管(内径0.7mm、外径1.0mm)から石英マイクロインジェクション針を抽出します。使用まで針は埃のない場所に保管してください。
   注: 同様の形状のホウケイ酸塩針も使用されることがあります。
2. 注入バッファー(0.1% w/v フェノールレッド、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4)を準備し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過滅菌します。
3. 20μLの注射ミックスを、左と右のピギーバック逆末端繰り返しの間に遺伝的貨物を含むドナープラスミドをそれぞれ10μgずつ混合し、注入バッファー4μLを準備します。ヌクレアーゼフリーの水を用いて最終濃度500 ng/μLまで希釈します。
   注:ヘルパープラスミドは、HSP83の上流にある3.1 kbのHSP83プロモーター配列と、過活性なピギーバックトランスポザーゼコード配列から成ります。スタートコドンと高活性なピギーバックトランスポザーゼコード配列です。
4. 注入ミックスを低容量の0.20μmのPTFEシリンジフィルターに移し、フィルターを0.5mLのマイクロ遠心分離機チューブの開口部に入れます(図7A)。遠心分離機は≥11,000 x gで 10分間、またはすべての注入混合物がフィルターを通過するまで続けます。未使用の注入液は-20°Cで保存してください。
5. マイクロゲルローディングピペットの先端を使って約2μLの注入混合物を石英マイクロインジェル針にバックフィルします(図7B)。装填中に気泡を混入させないようにしましょう。
   注: マイクロインジェクション針を胚の長軸に平行に向き、水平・垂直の角度オフセットをゼロに保ち、裂け目や剪断を最小限に抑えます。
6. 注射液が針先端を通るまで、針先をガラススライドの縁に優しく叩きます(図7C)。
   注: 針先を徐々に折り、注入ミックスの流れを許容する最小かつ鋭い開口部を作ります。
7. 乾燥直後、約700 hPaの注入圧と300 hPaの逆圧で後極から胚を注入します。
8. 胚を優しく貫通し、胚体積の約10分の1に注射混合物を注入します(図7D–F)。
   注: 針の挿入を最小限に抑え、ビテリン膜の乱れを減らし、針抜き時の卵質喪失を防ぎます。
9. 注射後すぐにカバースリップをペトリ皿に移し、無菌で湿らせた90mmの黒いフィルターペーパーを敷き、室温で48時間培養します。
   注: 合胞期の前に、産卵後2時間以内にすべての注射を標的胚に行ってください。
10. 12〜16時間ごとに孵化する胚を調べてください。孵化したばかりの幼虫とガラスカバースリップを、セクション4で説明したように接種・調整された寒天プレートに移します。

パラメータ	熱	フィル	ヴェル	デル	引っ張って
価値	825	5	60	150	175

表2: 針引きのパラメータ。 石英マイクロインジェクション針を生成するためのパラメータ。

図7:胚マイクロインジェクション。 (A) 0.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ内に内嵌したシリンジフィルターを用いた注入混合物のろ過。(B) 濾過された注入混合物をゲルローディングピペットの先端を用いてマイクロインジェクション針に充填。(C) 石英マイクロインジェクション針の終端形状。(D) 針が胚の後方極に整列すること。(E) ビテリン膜の乱れを最小限に抑えつつ胚表面への浸透。(F) 胚体積の約10分の1を注射し、その後針を抜く。透明度が上がる場合は、注入混合物による卵質の置換を示します。スケールバー = 400 μm(D–F) この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

4. 処理済みプレート準備

1. 寒天培地製剤
   1. 表1の「黒寒天スクリーニングおよび育成プレート用材料」に記載された培地を準備し、121°Cで15分間オートクレーブします。 寒天は40°Cで注ぐか、室温で保存してから再加熱し、90mmのペトリ皿に分けます。
      注: 固形粒子を再浮遊させるために注ぐ前に激しく回します。
2. プレート接種
   1. K12大 腸 菌を24時間培養してOD600=0.200にLuria-Bertaniブロスに希釈し、冷却した固化した寒天プレートに200μLを投与します。無菌ガラスビーズやガラススプレッダーを使って均等に培菌を広げ、プレートが余分な水分を吸収できるようにします(図8A, B)。
      注: アガープレートは注いでから1ヶ月以内に使用するか、廃棄して細菌や幼虫の安定した成長を確保してください。
3. プレートコンディショニング
   1. 6枚×6cmの黒いフィルター紙を折りたたんで6〜10cmの波形の隆起を作り、焼き菓子やオートクレーブで消毒します。無菌の波形フィルター紙を無菌状態で接種したペトリ皿に置き、数滴の滅菌水で湿らせます(図8C)。
   2. 未処理・未注入の野生型(WT)第一齢幼虫を表面滅菌し、10匹の幼虫を湿らせたフィルターペーパーに移します。
      注: WT胚を10%漂白剤(0.6% NaOCl)に1分間浸し、その後滅菌した脱イオン水で2分間すすぎます。
   3. 蓋とペトリ皿の本体の間に90mmのフィルターペーパーを挟んでガスケットとして使います。
   4. WT幼虫に24時間プレートを調理させた後、注射した胚をガラスカバースリップに挿入します(図8C)。最初の注入胚が孵化した後、WT幼虫を除去します。

図8:寒天プレートの調製および注射後の回収。 (A) 無菌ガラスビーズを用いたOD600=0.2の大 腸菌 培養による寒天プレートの接種。(B) 胚移植前の過剰な表面水分の吸収。(C) ペトリ皿の蓋と本体の間に90mmのフィルターペーパーガスケットを設置すること。(D) 調整された寒天プレート上の蛍光マーカーの幼虫スクリーニング。注入された胚は、逆さまのペトリ皿の蓋に置いた脱イオン水飽和90mmのフィルターペーパーに置かれ、48時間培養されてからスクリーニングプレートに移されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

このプロトコルを用いて、431個の安定したハエ胚を脱胆し、最終濃度500 ng/μLでpiggyBac-Hsp83ドナープラスミドおよびHsp83ヘルパープラスミドを注入しました。注入された431個の胚のうち、18個のZsGreen陽性幼虫(4.2%)と8個のZsGreen陰性幼虫(1.9%)が、黒色炭素寒天プレートでスクリーニングしたところ、注射後48〜76時間で孵化しました(表3)。全体として、431個の注入胚のうち26個(6.0%)が孵化し、26個の孵化した幼虫のうち16個が成虫まで生存しました(61.5%)。

種	注入の種類	構成要素	# 注射された	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) 蛹	ZsGreen(-)蛹	ZsGreen(+) 成虫	ZsGreen(-) 成虫	# 成虫がZsGreen(+)の子孫を産む
ストモキシス・カルシトランス	トランスポザーゼ挿入	Hsp83:hy-pBac(補助剤、500 ng/uL) Hsp83: zsGreen(ドナー、500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
ストモキシス・カルシトランス	トランスポザーゼ挿入	Hsp83:hy-pBac(補助剤、500 ng/uL) Hsp83: zsGreen(ドナー、500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

表3:注入統計。 胚の顕微注射後の生存率、形変異率および回復率。

18匹のZsGreen陽性G0幼虫のうち、12匹が蛹化まで生き残り(66.7%)、10匹が成虫で閉じました。6個のZsGreen陽性成体(注射胚の1.4%、妊娠可能なG0生存者の60%)がZsGreen陽性の子孫を生み出しました。これらの子孫(図9A–E)は自己交配され、執筆時点で6世代にわたり蛍光を維持していました。

8匹のZsGreen陰性幼虫のうち、6匹が成虫まで生き残りました(75%)。蛍光を発さない成虫は蛍光の子孫を残しませんでした。

図9:トランスジェニックバエの蛍光スクリーニング。 (A) ZsGreen発現F1幼虫とWT幼虫の比較。(B)蛹のキューティクルを通して蛍光が見られることで、蛹期での遺伝子転換スクリーニングが可能となります。(C,D)白色光(C)および蛍光(D)照明下での、3隻のZsGreen発現幼虫と蛹(左)と3隻のWT幼虫および蛹(右)を比較。(E) ZsGreenを発現する成虫のトランスジェニックF1バエ(左)とWT成虫(右)の比較。スケールバー = 1 mm(A)、2 mm(B,E)、3 mm(C,D)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

非モデル昆虫種の遺伝子転換は、節足動物害虫や媒介者の遺伝的防除戦略の開発と評価における大きなボトルネックとなっています。

安定したフライの場合、ここで説明するプロトコルは胚マイクロ注入後のG0フライの注入および飼育にかかる時間、資源、労力、変動性を削減します。さらに、ブラックアガースクリーニングプレートの使用により、ライフサイクル全体にわたる発生を直接観察でき、注入、回収、幼虫育成時に発生する問題の特定と修正を容易にします。本研究で評価されたプラスミド構造体を用いて、プロトコルは^{従来の方法9}よりも少ない注入胚でトランスジェニックな安定フライ系統を生成しました。本方法記事の範囲外ですが、逆PCRやスプランカレットPCRなどの確立された手法を用いて、トランス遺伝子挿入部位の確認と局在化が可能です。

効率的な注入プロトコルは、蛍光リポーターを用いたプロモーター特性解析を含む機能ゲノミクスの将来の研究を促進します。病原体伝播に関連する遺伝子の逆遺伝解析によるベクター能力;安定したハエにおけるCRISPR-Cas9やその他のプログラム可能なヌクレアーゼの評価を含むヌクレアーゼの特性解析、候補抵抗性対立遺伝子の修飾による殺虫剤耐性研究、また、血液供給、交尾、発達に関与する遺伝子を含む基礎生物学の研究も行っています。また、我々のプロトコルは、過去のMusca家庭およびLucilia cuprina piggyBac形質転換文献^16,17に記載されているように、胚の注入後回復のための油浸入胚注射や酸素入り湿度チャンバーの必要性を排除しています。

トランスジェネシスの成功には、いくつかのパラメータが重要です。胚の乾燥と注射タイミングは特に重要です。なぜなら、細胞化前にプラスミドDNAを導入し、生殖細胞系前駆体細胞への組み込みを確実にするためです。しかし、安定したハエ胚におけるシンシチウム形成の正確な時期は依然として不明です。さらに、胚の発生速度は温度の影響を受け、安定したハエ胚の異なる環境条件下での発生タイムラインは完全には解明されていません。安定した実験室用バエ株の発生率と胚発生に関する今後の研究は、マイクロインジェクションおよび形質転換プロトコルの最適化に洞察をもたらし、効率とプロトコルの再現性をさらに向上させる可能性があります。しかし、それまでは最適な注入ウィンドウの決定は方法論的な制約であり、変換効率に影響を与える可能性があります。生存率が低い場合は、未処理胚、脱毛膜胚、フィルター滅菌PBS注入胚、寒天培養胚のWT胚の孵化生存率と成虫生存率を比較することでトラブルシューティングが可能です。 ムスカ家畜 の形換えを記述した以前の文献では、1,668回の注射のうち14回の統合イベント(注入量の0.84%)が示^{されており、羊}害虫 Lucilia cuprina の形質転換では約900回の胚注射(注射の0.33%)から3つのトランスジェニック系統が確立されました¹⁷。これは、このプロトコルで記述された安定したハエ形質転換プロトコル(431回の注射で6回の統合イベント)が示唆されます。 1.4%の注入量)は、文献上の他の害虫双翅目種と比べて注入効率の向上を示しています。

安定ハエ のhsp83 構成プロモーターは、発生全過程でZsGreenの強健な発現を提供し、早期胚形成時に多活性なピギーバックトランスポザーゼの発現を支持し、これにより、従来の安定したハエ形^{換えプロトコル}9と比較して蛍光マーカーの可視性と形質転換効率を改善しました。本研究で使用された補助プラスミドは、 hsp83 スタートコドンの直上流にある3.1 kbのゲノムDNAをサブクローニングし、超活性なピギーバックトランスポザーゼコード配列の上流にある最小プラスミドベクターに生成しました。ヘルパー対カーゴプラスミド比は質量比1:1で実証的に確立され、研究全体で使用されました。追加のプラスミド比率は評価されませんでしたが、代替比率も効果的である可能性があります。

ここで述べた改良は、他の節足動物の遺伝子移植プロトコルにも応用可能かもしれません。さらに、この寒天ベースのスクリーニングおよび育成システムは現在、ブラックソルジャーバエ(Hermetia illucens)の胚注射およびスクリーニングにも適用されています。このプロトコルは、 Musca domestica や Haematobia irritansなど他のムシドバエ類の遺伝子組み換え研究に特に有用であり、幼虫の生態や分解繊維質基質での発達が似ているためです。大 腸菌感染型寒天プレートの使用は、注射後のモニタリングに実用的なアプローチを提供し、胚発生、幼虫形態、マーカー発現、孵化率、全体的な回復の評価を可能にします。培地の細菌成分を対象種の生物学に適応させることで、この手法のトランスジェネシスプロトコルの開発と最適化の有用性がさらに高まる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	乾燥チャンバー
Bacto Agar	Difco	281230	黒アガープレート用のアガー
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	卵収集カップ用の黒い綿布と幼虫飼育ビンのファブリックガスケット
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	乾燥チャンバー用乾燥剤
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	幼虫培地（大量）
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	注射用顕微鏡
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	黒アガープレートの栄養源
E. coli	New England Biolabs	C2987H	黒アガープレートで使用する細菌
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	マイクロインジェクション圧力供給
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	胚の移動
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	針を引っ張るための毛細管
Forceps	Fine Science tools	11251-20	サンプル処理
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	脱膜中は胚を保持
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	胚膜を除去するための漂白剤溶液
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	幼虫培地コンテナ（大量）
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	胚の収集
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	E.coli培養用のLBブロス
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	胚を動かし、並べるための顕微鏡
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	注射混合物を針にロードするために使用
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	注射用マイクロマニピュレーター
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	注射混合物をフィルタリングするために使用
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	注射バッファー
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	黒アガープレートの色素
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	毛細管から針を引っ張るためのデバイス
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	注射バッファー
Petri plates	VWR	391-0609	アガー黒卵プレート用のペトリ皿
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	注射用染料
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	乾燥チャンバープラグ
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	幼虫培地（大量）
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	マイクロインジェクション用のガラスカバースリップ
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	幼虫のスクリーニング用蛍光ランプとフィルター
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	プレートに細菌を広げる
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	脱膜中に胚を洗う
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	胚を脱膜
Wash bottle	Safetyware	Z423335	表面から胚を洗う