$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
すべての実験と運営は、テキサスA&M大学の機関バイオセーフティ委員会(プロトコルIBC2019-081)の承認を得て実施されました。このプロトコルで使用される試薬、化学物質、工具は 材料表に記載されています。
1. 卵産のためのフライの育成
- 成虫ケージの準備
- インキュベーターチャンバーのサーモスタットを28°Cに設定し、塩化ナトリウム3kgと~5Lの水道水を10Lのパンで混ぜ、塩分の~50%を溶かします。
- この露出した塩水鍋を培養槽の底に置き、湿度を約80%の湿度に保ちます。チャンバーや部屋で16:8の昼夜サイクルを維持してください。
- 昆虫ケージの底(30 x 30 x 30 cmのステンレス/アルミ製メッシュネット付き)に2層のペーパータオルを敷き、その上に45mLの使い捨て調味料カップ(グラニューュレートの食卓用砂糖を入れて)をその上に置きます(図1A)。
注: ペーパータオルはハエの吸収を助け、砂糖は血液供給前の食料源となります。
- 250mLのグリフィンビーカーに室温の水道水約100mLを入れ、20cm×20cmの正方形の黒い綿布(無地の黒い枕カバーやベッドシーツから切り出したもの)を水に詰めて布を湿らせます。黒い布の縁をビーカーの縁から1〜2cm外に伸ばすように調整します(図1B)。
注: この湿った布は、成虫にとって液体の水と産卵面の両方を提供します。成虫が水分源にアクセスできない場合、死は急速に起こり得ます。
- 安定したハエの蛹500〜1,500匹を小さな皿やビーカーに移し、昆虫ケージに入れます。成虫のケージを湿った育成室に入れ(ステップ1.1.1)、毎日巣花の発生を監視してください。成体が出てきたら、毎日クエント入り牛の血で給餌を始めます(セクション1.2)。
- 成虫の餌やり
- 新たに採取した牛の血液に最終濃度10.9 mMのトリソジウムクエン酸二水和物を加えて、シエント化した牛血を調製します。
- 短時間、最小量の脱イオン水に12.8グラムのシトレート塩を懸浮させ、地元の屠殺場で採取した血液4リットルに加えます。
注: 血液容器は蓋がねじでつぶたされているべきです(例:四角い、ワイドマウス、4Lグリップボトル)。使用前に温かい石鹸と水で十分に洗浄してください。屠殺場では、屠殺された牛の最初の~1リットルの血液を採取せず、毛髪、汗、土、その他の凝固物質の汚染を最小限に抑えましょう。
- 200mLのアリコートに冷凍シコトリウム入り牛の血液を凍結し、必要に応じて解凍します。解凍したアリコートは4°Cで最大1週間冷蔵保存します。
- 成虫ケージごとに600匹あたり約40mLの室温血液を供給してください。
- 血液は調味料容器やビーカーに入れられ、折りたたんだ非滅菌の綿のガーゼスポンジを血管に挿入して血液を吸い取る必要があります。芯を綿が完全に湿らせるまでかき混ぜてからケージに差し込みます。
注: 出頭後24時間から毎日血液交換を行うべきです。
- 卵の収集
- 黒い綿布に卵が付着しているのを確認したら、ビーカーから布を取り出し、洗いボトルを使って別の~700mLの浅いプラスチック容器に卵を洗います(図2A)。産卵は通常、ハエが7〜10日齢のときに起こります。
注: また、血液カップに卵がないか確認し、そこに産まれている可能性のある卵も回収してください。
- 真空ろ過 で フィルターペーパーに卵を集めます。これは、黒いフィルターペーパーをブフナー漏斗に入れ、真空をかけてから、 ステップ1.3.1 の卵をセットアップの上に注ぐことで行われます。
- その後、洗浄ボトルを使って目盛りシリンダーまたは目盛り1.7mLのマイクロ遠心分離機チューブに卵を移し、採取した卵の体積を記録します(図2B)。
注: 卵を長時間水に浸すことは避けてください。浸水後~10分で死亡率が上昇し始めます。
- 大量幼虫培地の調製
- 表1に示されたように、バルク幼虫培地(図3A)用の材料を収集します。
- 1000mLのビーカーに子牛プロテインサプリメントと全ての水道水を加えます。室温で一晩再水和させてください。
- 小麦ふすまとバーミキュライトは別の大きな混合容器に加えます。
- 一晩水和した後、再水和した子牛サプリメントをよくかき混ぜて塊をほぐし、その後小麦ふすまとバーミキュライトを容器に注ぎます。均一になるまでよく混ぜ、すべての小麦ふすまが子牛のサプリメントスラリーでコーティングされます。
- バルクメディアをポリプロピレン製食品保存容器に移し、容器底全体を覆う~8cmの層を設けます(図3B)。
- 胚を採取することで、約1,000個の胚(2.2Lのバルク培地あたり約0.2mLの卵子)を追加します 。直径90mmの円形フィルター紙に真空ろ過を行い、その後、フィルターシートを裏向きにしてメディアビンの中央に置きます(図3B、C)。
- フィルターペーパーには湿度を保持するために~1cmの媒体で覆い(図3C参照)、容器には黒い綿布の大きめの長方形を敷き、容器の縁から5cmの綿布を張り出します。
- 食品容器の蓋に大きな穴(直径~12cm)を開けてガス交換を可能にし、蓋をメディアビンにパチッと固定しつつ、容器と蓋の間に黒い綿布を挟みます(図3D)。
注: これはガスケットの役割を果たし、蓋と容器の間の隙間が1齢 幼虫を結露の滴に閉じ込めるのを防ぎます。
- 完成した培地箱を成虫の育成室に置き、蛹化まで並べ、幼虫の発育を監視します(図4)(蛹化は培地温度や幼虫密度により約10日で行われます)。
注: 布の被覆は、1齢幼虫が通過しないように十分細かく、かつメディアビンの内壁に結露ができて幼虫を捕らえ溺れさせるのを防ぐために透水性が良い必要があります。
- 蛹の分離
- 蛹箱から布を外し、スプーンやすくいで蛹を集めます。
注: 安定したハエの蛹は、移動性のない赤褐色の円筒形で、長さは4〜7mmで、移動性の黄白色の幼虫とは対照的です。蛹は通常、容器の外周や媒介容器内の湿った高台に集まり、ハエが幼虫から蛹、成虫へと変態を始める際に発生します。
- 500〜1,500個の蛹を皿に層積み、1.1節で説明した通り新しい清潔なケージに入れて次世代を増やします。
図1:成虫ハエ飼育用材料。 (A) 成虫ハエ飼育ケージ。ショ糖カップ(S)と産卵カップ(O)が示されています。(B)ビーカーの縁を少し越えて伸びた水分を浸した黒い綿布で準備した産卵カップ。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:卵の採取。 (A) 洗浄ボトルを使った産卵布から卵の採取。(B)高コントラストのフィルターペーパー上への真空ろ過による卵の回収。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
| バルク幼虫用メディアの材料 |
| 試薬 | 質量(g) |
| 水 | 900 |
| 小麦ふすま | 230 |
| ふくらはぎのサプリメント | 100 |
| バーミキュライト(A4粗) | 70 |
| 脱絨毛溶液の材料 |
| 解決策 | 作曲 |
| 酸化浴 | 脱イオン水中の次亜塩素酸ナトリウム3% |
| 洗い浴 | トリトンX-100 0.02%の溶液を脱イオン水中に溶かす |
| すすぎ | 脱イオン水 |
| 黒寒天のスクリーニングおよび育成プレートの材料 |
| 試薬 | 質量(g) |
| 水 | 500 |
| 粉状卵黄 | 18 |
| 活性炭 | 4 |
| 塩化ナトリウム | 1 |
表1:バルク幼虫培地用試薬、脱胆液溶液、黒寒天プレート。 コロニー維持のためのバルク幼虫培地の調製に用いられる試薬、安定したハエ胚から絨毛虫を弱め除去するための溶液の組成、さらに500mLの黒寒天スクリーニングおよび育成培地の準備に必要な材料。
図3:バルク幼虫培地の調製。 (A) バルク幼虫培地の調製に使用される材料:子牛タンパク質補給(CM)、小麦ブレ(WB)、バーミキュライト(VM)、保存容器(SC)、蓋(L)、布製ガスケット(FG)。(B) 媒体成分の徹底的な混合。(C) 卵で覆われたろ過紙(EP)をメディア表面に裏向きに置き、乾燥を防ぐために追加のメディアで覆うこと。(D) 容器と蓋の間に綿布製ガスケットを取り付けること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:バルク培地中の幼虫発生。 透明な容器により、幼虫の発達や培地の状態のモニタリングが可能です。幼虫(L)は容器の壁、蓋、培地内に見えます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
2. 注射準備:脱絨毛化と乾燥
- ステップ1.1.4の手順で濡らした黒い綿布をビーカーに入れ、成虫用のケージに移して25分間卵を集めます。卵を洗浄ボトルで106μmのステンレス製ふるいにすすぎます。
注: 25分の採集期間で通常約400個の卵が採れます。
- 胚をさらに30分間、ふるいの上で静かに置きます。
- 胚が老化している間、 表1 (図5)の「脱クロイオン化溶液」セクションに記載されている酸化、洗浄、洗浄液をそれぞれ150mL準備します。胚を覆うほどの十分な量を約1cmの溶液で覆ってください。
- 胚を含む篩を酸化浴に2分間浸し、パスツールピペットで優しく攪拌します(図6A)。
注: 繰り返し吸引し溶液を投与して円形の渦を作り出すことで、胚を篩の中心に集中させ、脱毛したばかりの胚がふるい壁に付着するのを防ぎます。
- 酸化浴からふるいを取り出し、余分な溶液を叩き落とします。篩を洗浄液に移し、吸引して2分間攪拌します。
- 胚を含むふるいを洗浄液に移し、 ステップ2.4 で説明した通りに2分間攪拌します。すすぎ液からふるいを取り出し、余分な水をタップで抜きます。
- 滅菌ガラスカバースリップを篩の上に置き、解剖顕微鏡の下で細かいナイロン製のペイントブラシを使って胚(図6B)を篩からカバースリップの端に移します。胚は接触せず近づけ、後方の広い極はカバースリップの端に向かいます。移植中に胚を曲げたり歪めたり、裂いたりしないでください。
- 乾燥室を準備するには、1リットルのフラスコの底に硫酸カルシウム乾燥剤100mLを詰め、ゴム栓で密封します。
注: 24時間の平衡後、乾燥室は通常23°Cで相対湿度<5%に達します。
- カバースリップの余分な水分を取り除き、脱毛膜胚を含むカバースリップを乾燥剤の上に置きます。フラスコをゴム栓で再密封し、胚を8分間乾燥させます。
- カバースリップを乾燥室から取り出し、顕微鏡ステージに置き、20×の対物レンズの下で顕微注射を行います。
図5:デコリオン化解。 左から右へ:ステンレスのふるい、酸化液、洗浄液、胚の脱胆液に使われる洗浄液。次亜塩素酸ナトリウムは光から保護された6%のストック溶液として維持され、Triton X-100は使用前に10 ×のストック溶液として保持され、最終濃度0.02%まで希釈されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6:胚の脱胆毛化。 (A) 穏やかな吸引と溶液の投与により、胚が篩の中心に集中し、篩壁への接着を減少させる渦が生じます。(B)洗浄後に半透明絨毛から脱胆毛胚が出ること。前極(細い端)は通常、後極より先に現れます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
3. マイクロインジェクション
- 表2に記載されたパラメータを用いて、100mmのフィラメントガラス毛細管(内径0.7mm、外径1.0mm)から石英マイクロインジェクション針を抽出します。使用まで針は埃のない場所に保管してください。
注: 同様の形状のホウケイ酸塩針も使用されることがあります。
- 注入バッファー(0.1% w/v フェノールレッド、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4)を準備し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過滅菌します。
- 20μLの注射ミックスを、左と右のピギーバック逆末端繰り返しの間に遺伝的貨物を含むドナープラスミドをそれぞれ10μgずつ混合し、注入バッファー4μLを準備します。ヌクレアーゼフリーの水を用いて最終濃度500 ng/μLまで希釈します。
注:ヘルパープラスミドは、HSP83の上流にある3.1 kbのHSP83プロモーター配列と、過活性なピギーバックトランスポザーゼコード配列から成ります。スタートコドンと高活性なピギーバックトランスポザーゼコード配列です。
- 注入ミックスを低容量の0.20μmのPTFEシリンジフィルターに移し、フィルターを0.5mLのマイクロ遠心分離機チューブの開口部に入れます(図7A)。遠心分離機は≥11,000 x gで 10分間、またはすべての注入混合物がフィルターを通過するまで続けます。未使用の注入液は-20°Cで保存してください。
- マイクロゲルローディングピペットの先端を使って約2μLの注入混合物を石英マイクロインジェル針にバックフィルします(図7B)。装填中に気泡を混入させないようにしましょう。
注: マイクロインジェクション針を胚の長軸に平行に向き、水平・垂直の角度オフセットをゼロに保ち、裂け目や剪断を最小限に抑えます。
- 注射液が針先端を通るまで、針先をガラススライドの縁に優しく叩きます(図7C)。
注: 針先を徐々に折り、注入ミックスの流れを許容する最小かつ鋭い開口部を作ります。
- 乾燥直後、約700 hPaの注入圧と300 hPaの逆圧で後極から胚を注入します。
- 胚を優しく貫通し、胚体積の約10分の1に注射混合物を注入します(図7D–F)。
注: 針の挿入を最小限に抑え、ビテリン膜の乱れを減らし、針抜き時の卵質喪失を防ぎます。
- 注射後すぐにカバースリップをペトリ皿に移し、無菌で湿らせた90mmの黒いフィルターペーパーを敷き、室温で48時間培養します。
注: 合胞期の前に、産卵後2時間以内にすべての注射を標的胚に行ってください。
- 12〜16時間ごとに孵化する胚を調べてください。孵化したばかりの幼虫とガラスカバースリップを、セクション4で説明したように接種・調整された寒天プレートに移します。
| パラメータ | 熱 | フィル | ヴェル | デル | 引っ張って |
| 価値 | 825 | 5 | 60 | 150 | 175 |
表2: 針引きのパラメータ。 石英マイクロインジェクション針を生成するためのパラメータ。
図7:胚マイクロインジェクション。 (A) 0.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ内に内嵌したシリンジフィルターを用いた注入混合物のろ過。(B) 濾過された注入混合物をゲルローディングピペットの先端を用いてマイクロインジェクション針に充填。(C) 石英マイクロインジェクション針の終端形状。(D) 針が胚の後方極に整列すること。(E) ビテリン膜の乱れを最小限に抑えつつ胚表面への浸透。(F) 胚体積の約10分の1を注射し、その後針を抜く。透明度が上がる場合は、注入混合物による卵質の置換を示します。スケールバー = 400 μm(D–F) この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
4. 処理済みプレート準備
- 寒天培地製剤
- 表1の「黒寒天スクリーニングおよび育成プレート用材料」に記載された培地を準備し、121°Cで15分間オートクレーブします。 寒天は40°Cで注ぐか、室温で保存してから再加熱し、90mmのペトリ皿に分けます。
注: 固形粒子を再浮遊させるために注ぐ前に激しく回します。
- プレート接種
- K12大 腸 菌を24時間培養してOD600=0.200にLuria-Bertaniブロスに希釈し、冷却した固化した寒天プレートに200μLを投与します。無菌ガラスビーズやガラススプレッダーを使って均等に培菌を広げ、プレートが余分な水分を吸収できるようにします(図8A, B)。
注: アガープレートは注いでから1ヶ月以内に使用するか、廃棄して細菌や幼虫の安定した成長を確保してください。
- プレートコンディショニング
- 6枚×6cmの黒いフィルター紙を折りたたんで6〜10cmの波形の隆起を作り、焼き菓子やオートクレーブで消毒します。無菌の波形フィルター紙を無菌状態で接種したペトリ皿に置き、数滴の滅菌水で湿らせます(図8C)。
- 未処理・未注入の野生型(WT)第一齢幼虫を表面滅菌し、10匹の幼虫を湿らせたフィルターペーパーに移します。
注: WT胚を10%漂白剤(0.6% NaOCl)に1分間浸し、その後滅菌した脱イオン水で2分間すすぎます。
- 蓋とペトリ皿の本体の間に90mmのフィルターペーパーを挟んでガスケットとして使います。
- WT幼虫に24時間プレートを調理させた後、注射した胚をガラスカバースリップに挿入します(図8C)。最初の注入胚が孵化した後、WT幼虫を除去します。
図8:寒天プレートの調製および注射後の回収。 (A) 無菌ガラスビーズを用いたOD600=0.2の大 腸菌 培養による寒天プレートの接種。(B) 胚移植前の過剰な表面水分の吸収。(C) ペトリ皿の蓋と本体の間に90mmのフィルターペーパーガスケットを設置すること。(D) 調整された寒天プレート上の蛍光マーカーの幼虫スクリーニング。注入された胚は、逆さまのペトリ皿の蓋に置いた脱イオン水飽和90mmのフィルターペーパーに置かれ、48時間培養されてからスクリーニングプレートに移されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
