ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生モデル

サマリー

このプロトコルは、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生モデルを記述しています。このアッセイは内皮の発芽やルーメン様構造の形成を直接可視化し、血管新生メカニズムや治療介入の研究に応用可能です。

要約

血管新生は、内皮細胞の活性化、移動、伸長、内腔形成、分岐、吻合を含む多段階の生物学的プロセスです。従来の二次元培養システムは、薬剤、遺伝子、培養条件の予備評価には有用ですが、三次元細胞外マトリックス内での内皮形態形成の空間的組織を十分に再現することはできません。本プロトコルは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生アッセイを記述しています。HUVECはまず化学的に結合した酸変性豚のタイプIコラーゲンを持つマイクロキャリアビーズにシードされ、その後基底膜マトリックスに埋め込まれます。その後、口腔粘膜線維芽細胞がゲルの上にシードされ、内皮の発芽や血管様構造の形成を支えるパラクリン(副分泌)を提供します。培地は2日ごとに交換され、発芽行動や血管新生の表現型は逆立顕微鏡で監視されます。適切な培養条件下では、数日以内に内皮芽が出現し、その後ルーメン状構造や芽間結合が形成されます。この方法は、内皮形態形成の in vitro 研究に便利かつ再現性の高いプラットフォームを提供し、遺伝子操作、薬理学的介入、疾患モデリングの研究にも応用可能です。

概要

内皮発芽は血管新生における重要な出来事であり、既存の血管構造から内皮細胞が出現、移動、増殖、整列し、その後内腔形成と相互に連結した血管様ネットワークの確立を含みます。^1,2。従来の二次元培養システムやゲルベースのチューブ形成アッセイは技術的には単純ですが、三次元の^微小環境内で内皮細胞の空間的再構築を再現する能力には限界があります^3,4。古典的なマイクロキャリアビーズベースの三次元発芽アッセイは、内皮の発芽、伸長、腔の形成、ネットワークの組み立てなど、血管新生の複数の段階を体外で再現しており、そのため血管新生研究において広く用いられる手法となっています。

本プロトコルでは、正常なヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた三次元マイクロキャリアビーズベースの発芽モデルが確立されています。既に報告された内皮マイクロキャリアビーズ発芽^アッセイ5^、6、7に基づき、この方法はマイクロキャリアビーズに内皮細胞コーティングの基本枠組みを保持し、三次元マトリックスに埋め込み、線維芽細胞オーバーレイ培養を行いながら、従来のフィブリンゲルに基底膜マトリックスを用いて手順を簡素化し、日常的な画像処理を容易にします。基底膜マトリックスは、いくつかの実用的かつ生物学的な理由からこの修正プロトコルで選ばれました。実験的には、迅速なゲル形成、ビーズ埋め込み、フィブリンゲル調製に必要な重合工程を省く便便なルーチン顕微鏡観察を可能にする、即使用可能な三次元マトリックスを提供します。生物学的には、基底膜マトリックスには細胞外マトリックス成分が含まれており、これらは内皮細胞の接着、移動、芽の伸張、ルーメン状構造の形成を支えます。したがって、この修飾は内皮発芽行動の直接的な可視化、血管新生表現型の比較、三次元培養環境における薬理学的または遺伝的介入の評価を必要とする研究に適しています。しかし、基底膜マトリックスはマトリックス組成、機械的特性、分解性、生体活性の手がかりにおいてフィブリンゲルとは異なり、本アッセイは古典的なフィブリンベースのアッセイの直接的な置き換えではなく、修正されたマイクロキャリアビーズベースの発芽モデルとして解釈されるべきです。これらのマトリックス関連の違いは発芽速度、腔の安定性、ネットワーク形態に影響を与える可能性があり、異なる三次元血管新生システム間の結果を比較する際に考慮すべきです。このモデルは三次元で内皮発芽行動の観察に適しており、薬理学的介入、遺伝子操作、血管新生メカニズムの研究にも応用可能です。

プロトコル

本プロトコルで使用されたヒト臍帯静脈内皮細胞は、雲南省第一人民病院産科から採取したヒト臍帯組織から分離・培養されました。サンプル採取前に、すべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが取得されました。人由来の物質を用いるすべての処置は、雲南省第一人民病院の医療倫理委員会によって承認されました(承認番号:KHLL2023-KY198)。昆明医科大学付属口腔内科病院の翟潔美博士研究グループにより、ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMFs)が提供されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 細胞の調製

1. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を、胎児用牛血清(FBS)を補足した胎児用牛血清(FBS)を、37°Cの加湿培養盤(CO₂5%)で最終濃度10%まで培養します。アッセイに使用される細胞は汚染がなく、安定した成長を示し、対数成長相にある必要があります。4〜6番目のパッセージに細胞を使用。
2. ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMF)を、37°Cで10%胎児用牛血清(FBS)を補足した高グルコース基底培地で、5%CO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。4〜6番目のパッセージに細胞を使用。
3. マイクロキャリアビーズコーティングの前に、両方の細胞タイプが適切な合流点にあることを確認してください。過剰な培養や過剰な酵素消化は避けてください。これらは発芽に悪影響を及ぼす可能性があります。

2. マイクロキャリアビーズの調製

1. 乾燥マイクロキャリアビーズ0.5gを50mLのPBSに少なくとも3時間水和させます。洗浄後、ビーズを50mLのPBSに再懸濁させ、約3×10⁴ビーズ/mLに相当する10 mg/mLのマイクロキャリアビーズ懸濁液を得ます。
2. 懸濁液をシリコン入りガラス瓶に移し、115°Cでオートクレーブして15分間滅菌し、使用まで4°Cで保存します。
3. 内皮細胞コーティングの前に、貯蔵液を取り除き、ビーズを無菌PBSで洗浄します。ビーズを内皮細胞増殖培地で37°Cで少なくとも30分間平衡させます。
4. 使用直前に平衡ビーズを優しく再懸垂させ、沈殿やビーズの集まりを防ぎます。
5. 細胞コーティングの前に、倒立顕微鏡でビーズ懸濁液の小さなアリコットを調べます。ビーズが完全に水分を含み、均一に懸浮し、目に見える集合体や破片がない状態にしてから作業を進めてください。

3. 内皮細胞をマイクロキャリアビーズにコーティングする

1. トリプシンを使ってHUVECを剥離し、細胞を内皮細胞増殖培地に再懸浮させます。
2. マイクロキャリアビーズは1ビーズあたり1,500セルの密度でコーティングします。1.5 mLの内皮細胞成長培地に6個^のHUVEC を3×10個、6個のマイクロキャリアビーズを混ぜます。
3. 細胞ビーズ混合物をマイクロ遠心分離管に移し、細胞培養インキュベーターで12時間培養します。12時間の潜伏期間中は、細胞とビーズの適切な接触を維持し、均一な内皮細胞の付着を促進するために、20分ごとにチューブを優しく反転させてください。
4. 12時間後、コーティングされたビーズを4mLの内皮細胞増殖培地を含む25^cm2 細胞培養フラスコに移し、一晩培養を続けて内皮細胞がマイクロキャリアビーズ表面にしっかりと付着できるようにします。
5. 埋め込む前に、代表的なコーティングされたビーズを倒立顕微鏡で調べます。検査対象ビーズの80%以上がビーズ表面に連続的かつ比較的均一な内皮細胞層を示し、浮遊細胞が最小限で、明らかな細胞塊がなく、重度のビーズ凝集がない場合のみマトリックス埋め込みを進めます。不均一なコーティング、大きな細胞クラスター、または広範な凝集があるビーズは埋め込みに使用すべきではありません。
6. ビーズがフラスコの底に付着したら、優しく振ってビーズを離してください。ビーズの集まりや細胞剥離を引き起こす可能性のある激しいピペッティングは避けてください。

4. コーティングされたビーズを三次元行列に埋め込む

1. 内皮細胞被覆マイクロキャリアビーズを15mL遠心分離機チューブに移し、重力でビーズを沈降させます。余分な培地を取り除き、適量の新鮮培地を加えます。
2. マイクロキャリアビーズ懸濁液を予冷却された基底膜マトリックスと1:1(v/v)比率で混合し、最終ビーズ濃度500ビーズ/mLを得ます。
3. 24ウェルプレートの各ウェルの中心にマトリックスビーズ懸濁液を100μL加え、混合物がウェル壁に接触することなく単一のドーム状のゲル液滴を形成できるようにします。吐出前にサスペンションを優しく混ぜ、気泡を混ぜないようにしてください。
4. 24ウェルプレートを室温で5分間放置し、初期のゲル化とゲル滴の安定化を待ちます。その後、プレートを37°Cで5%CO₂に15分間直立培養し、その後逆さまの状態でさらに15分間培養して、完全なゲル化と適切なゲル形成を確保します。
5. ゲルが完全に固まったら、直ちに線維芽細胞オーバーレイ培養に進みます。

5. 線維芽細胞オーバーレイ培養

1. ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMFs)3×10⁴を1 mLの内皮細胞増殖培地に再懸浮させ、各ウェルの壁に沿って細胞懸濁液を優しく加え、細胞がゲル表面に分散しつつ、ゲルドームを直接破壊しないようにします。
2. 加湿インキュベーターで5%のCO₂を含み、内皮細胞成長培地で37°Cの培養を続けます。ヒト口内粘膜線維芽細胞は、三次元培養系における内皮芽の伸長、安定化、血管様の再構築を促進するストロマル由来の副分泌信号を提供するため、支持細胞として使用されます。

6. 培養維持と顕微鏡観察

1. 培地は2日に一度交換してください。培地交換中は、使用済み培地をゆっくり吸引し、ゲルを乱さないようにウェルの壁に沿って新鮮な培地を加えます。
2. 明視野または位相コントラストモードを用いて、逆立角顕微鏡で毎日または隔日で培養を観察します。縦断定量解析では、7日目に各井戸で複数の視野を選び、9日目と11日目に同じあらかじめ定義された視野を撮影します。
3. 最適な培養条件下では、4〜6日目に明らかな内皮発芽が観察され、5〜7日目にルーメン様構造が現れ、7日目以降に相互に連結した微小血管様ネットワークが徐々に形成されます。
4. 成功した発芽とは、ビーズ表面から周囲の三次元マトリックスに放射状に成長する複数の内皮拡張の存在と定義します。芽はビーズ表面を明確に越え、ビーズに関連する内皮細胞層と接続している場合にのみカウントされるべきです。
5. ルーメン様構造形成を、中央に透明な空間や管状の形態を持つ細長い内皮構造の出現と定義します。芽間接続とは、隣接する芽同士の間に形成される直接的な接触や連続した構造と定義されます。
6. 広範な細胞死、重度のビーズ凝集、ゲル構造の破壊、豊富な気泡、マトリックス崩壊、または短く不規則な細胞突起のみの培養は最適とは見なさず、定量解析から除外すべきです。

7. 画像取得および定量解析

1. 7日目には各井戸で複数の視野を選び、9日目と11日目には同じあらかじめ定義された視野から画像を取得します。画像は、すべての時刻において同一の倍率、露出設定、撮影条件を用いて収集する必要があります。
2. マイクロキャリアビーズあたりの芽の数と維管束面積を定量化します。
   1. 血管化面積の測定には、オープンソースの画像解析ソフトウェアを使用してください。取得した画像を開き、ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使って血管化領域(ROI)の境界を手動で描画します。選択したROIをROIマネージャーに追加してください。
   2. 可視化には、リタレオス・オブ・インタレスト(興味領域)ビジュアライゼーションプラグインを使って、アウトラインされたROIを表示します。測定設定で面積測定を有効にし、選択したROIを測定して血管化面積を得ます。すべての画像に同じ分析設定を適用してください。
   3. 血管新生率解析では、7日目の血管化領域を基準にし、9日目と11日目の血管化面積の相対的な変化を計算します。
3. 3人の観察者が個別に芽の数を数え、平均値を分析に用いましょう。

結果

三次元HUVECモデルにおける血管新生

成功裏に確立された培養では、内皮細胞はマイクロキャリアビーズの表面に均一に分布しており、明らかなビーズの凝集は観察されません。動的観察により、7日目、9日目、11日目に進行性の内皮芽生と微小血管様ネットワークの形成が認められました(図1A)。定量解析により、このモデルにおける血管新生反応の進行性がさらに確認されました。7日目を基準にすると、7日目に血管新生率を0%に設定し、9日目に66.94%±18.49%、11日目に169.51%±100.83%に達し、培養中の血管形成領域の進行拡大を示しています(図1B)。代表的な明視野画像では、培養7日後に内皮芽がビーズ表面から周囲の三次元マトリックスへ放射状に出ていきました(図1C)。さらに、共焦点顕微鏡は三次元培養システムの大まかな形態と空間的組織の概要を提供しました(図1D)。3人の観測者の独立カウントに基づく、1粒あたり平均31.3個の芽(見た目)でした(図1E)。これらの発見は、モデルが三次元環境下で内皮発芽、伸長、腔様形態、血管様の再構築を支持していることを示しています。

三次元HUVECモデルにおける最適でない結果

失敗または最適でない培養では、細胞死(図2A)、マイクロキャリアビーズの破裂(図2B)、ビーズ表面での異常な細胞凝集(図2C)、ゲル内の広範な気泡形成(図2D)、マトリックスの局所的な崩壊(図2E)、過剰なビーズ密度(図2F)、マイクロキャリアビーズの不均一な細胞コーティング(図2G)など、いくつかの特徴的な異常が観察されることがあります、ビーズの集まり(図2H)、そして明らかな発芽がないか、または発芽の形成が限定的である(図2I,J)。これらの異常は、モデルの確立が不十分な細胞生存率、細胞コーティングの不備、基底膜マトリックスの温度管理の不備、過剰な再懸濁、または培地置換時のゲルの乱れなどが影響を受けていることを示唆しています。

図1:三次元HUVECモデルにおける血管新生。(A) 7日目、9日目、11日目における三次元HUVECモデルにおける血管新生の動的評価。画像は20×倍率で撮影されました。スケールバー=10μm。(B) 血管新生率の定量的解析。血管新生率は、7日目、9日目、11日目の血管化面積の相対的な変化と定義され、7日目を基準にしました。計算結果は、血管新生率=[(指定された時刻の血管形成面積−7日目の血管化領域)÷7日目の血管化面積]×100%と計算されました。血管新生率データは、3つの独立した実験からの平均±SDとして示されています。(C) 培養7日後のHUVECにおける内皮発芽の代表画像。画像は20×倍率で撮影されました。スケールバー=10μm。(D) 三次元培養システムの粗略形態を示す共焦点概観画像。画像は4×スキャンで取得されました。スケールバー = 500μm。(E) HUVECにおける芽の数の定量解析。芽の数は3人の観察者によって独立して数えられ、平均値を分析に用いました。これらの記述的定量解析については統計的比較は行われていません。この図に示されている内皮発芽構造は、HUVEC被覆されたマイクロキャリアビーズから派生しています。HOMFはオーバーレイ支持セルとして使用され、画像には特例的に標識されていませんでした。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:三次元HUVECモデルにおける最適でない結果。(A) 細胞死。白い矢印が示すように、細胞は点状の破片として現れ、マイクロキャリアビーズの表面は滑らかになります。スケールバー=50μm。(B) 白い矢印で示されるマイクロキャリアビーズの破裂。スケールバー=50μm。(C)マイクロキャリアビーズ表面上のセル集積。白い矢印が示すように、細胞はビーズ状の集まり状の外観を示します。スケールバー=50μm。(D) 白い矢印で示されるように、ゲル内で広範な気泡形成。スケールバー = 100 μm。(E) 白い矢印で示される行列の局所的な収縮。スケールバー=10μm。(F) マイクロキャリアビーズ密度が過度に高い。スケールバー=10μm。(G) マイクロキャリアビードの不均一なセルコーティング。白い矢印が示すように、ビーズ面の片側は滑らかなままです。スケールバー = 50 μm。(H) ビーズ集束。スケールバー=50μm(I,J)明らかな発芽は見られず、発芽も限られている。スケールバー=10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:実験ワークフローの概略図。(A) 化学結合した酸変性豚コラーゲンを含むHUVEC、HOMF、マイクロキャリアビーズを適切な条件下で準備し、アッセイ設定を行うこと。(B) HUVECsを準備されたマイクロキャリアビーズと混合し、内皮細胞のビーズ表面への付着を促進すること。(C)ビーズコーティングインキュベーション(穏やかな逆行)を20分ごとに12時間、均一な内皮細胞付着を促進する。(D) コーティングされたビーズを培養フラスコに移し、さらに培養して内皮細胞をマイクロキャリアビーズ表面にしっかりと付着させること。(E) HUVEC被覆されたマイクロキャリアビーズを基底膜マトリックスに埋め込み、その後ゲルの上にHOMFsをシーディングして、ストロマル由来のパクリン支持を用いて内皮の発芽および血管様再構築を支援すること。(F) 7日目、9日目、11日目における内皮発芽、ルーメン様構造形成、芽間結合、芽の数、血管化領域の顕微鏡観察および定量解析。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

本プロトコルは、マイクロキャリアビーズに基づく修正された三次元内皮発芽モデルを記述しています。図3は実験ワークフローの概観を示しています。このプロトコルは、NakatsuとHughesによって報告された古典的な血管新生アッセイを基に改良され、^本研究の目的を満たすために最適化^{されました。} 古典系では、内皮細胞がコラーゲン被覆されたマイクロキャリアビーズにコーティングされ、三次元マトリックスに埋め込まれ、線維芽細胞と共培養されて発芽、伸長、腔道形成、血管様吻合を支えます^7,10。本プロトコルでは、フィブリンゲルの代わりに基底膜マトリックスが用いられ、ヒト口腔粘膜線維芽細胞を支持細胞として用い、これにより内皮血管新生挙動のin vitro観察のための便利な三次元培養システムが確立されました。代表的な画像に示された発芽構造はHUVEC被覆されたマイクロキャリアビーズから派生しており、ヒト口内粘膜線維芽細胞はオーバーレイ支持細胞としてシードされており、これらの画像では特異的に標識されていません。

このプロトコルの重要な特徴は、従来のフィブリンゲルシステムの代わりに基底膜マトリックスを使用していることです。実験的には、基底膜マトリックスはすぐに使用可能で、温度依存的な迅速なゲル化を経て、別々のフィブリノーゲン、トロンビン、アプロチニン製剤を必要とせずに内皮細胞被覆マイクロキャリアビーズを便利に埋め込むため、アッセイの設定を簡素化します。この機能により、プロトコルは比較的シンプルで、日常的な顕微鏡観察に適しています。しかし、この修飾はアッセイの生物学的微小環境も変化させます。フィブリンゲルとは異なり、基底膜マトリックスには基底膜に関連する細胞外マトリックス成分や生体活性の手がかりが含まれており、内皮の癒着、移動、芽の伸出、ルーメン様形態、ネットワークの再構築に影響を与える可能性があります。さらに、マトリックスの剛性、分解性、配位子組成の違いは発芽速度論やネットワーク形態に影響を与える可能性があります。したがって、この修正アッセイで得られた結果は、元のフィブリンベースのアッセイの直接的な対等品ではなく、基底膜マトリックスベースのマイクロキャリアビーズ発芽モデルの結果として解釈されるべきです。

このモデルの確立にはいくつかの重要なステップがかかっています。マイクロキャリアビーズ表面に均一な内皮細胞コーティングを施すことは、一貫した発芽の開始と伸張に不可欠です。不十分または不均一なコーティングは、芽の数の減少、方向性の低下、再現性の低下を引き起こす可能性があります。安定ゲル形成もアッセイ性能の重要な決定要因です。マトリックス準備および埋め込みの際に、不適切な温度管理は早期ゲル化、不均一なビーズ分布、または気泡形成を引き起こし、これらは内皮発芽を妨げる可能性があります。さらに、支持する線維芽細胞は芽の成長と安定化を促進する持続的な副産信号を提供する必要があります。したがって、これらのステップを慎重に管理することは、安定かつ再現性の高い結果を得るために不可欠です。

いくつかの測定方法がアッセイの一貫性を向上させることができます。 図2 に示される代表的な最適でない結果は、実用的なトラブルシューティングの指標として利用できます。広範な細胞死は、細胞生存能力の低下、細胞剥離時の過剰消化、不適切な通過回数、または培地置換の遅延などが原因となることがあります。したがって、健康な対数相内皮細胞と穏やかな酵素的消化が推奨されます。マイクロキャリアビーズの破裂やビーズ凝集は、激しいピペッティング、過度の機械的攪拌、またはビーズ再懸液の不十分さによって引き起こされることがあり、ビーズ準備やコーティング時の慎重な混合と注意深い取り扱いによって軽減できます。内皮細胞コーティングの不均一やビーズ表面の大きな細胞クラスターは通常、混合不足、細胞密度の過剰、またはコーティング期間中のビーズ細胞接触不足を示します。この場合、セルビーズ懸流は定期的に優しく反転させ、埋め込む前に検査する必要があります。気泡形成や局所マトリックス崩壊は、適切なマトリックスの取り扱いの不適切な、早期のゲル化、または培地の添加や置換時のゲルの乱れに関連しています。使用前にマトリックスを氷の上に保ち、噴出時の気泡を避け、完全なゲル化を許可し、井戸壁に沿って培地をゆっくり加えることで、これらの問題を軽減できます。明らかな発芽が見られない、または発芽形成が限定的な培養は、細胞内皮付着不良、細胞生存率の低さ、線維芽細胞由来の支持不足、または不安定なマトリックス形成を反映している可能性があり、定量解析から除外すべきです。

従来の二次元チューブ形成アッセイと比較して、この三次元マイクロキャリアビーズベースのモデルは、細胞外マトリックス内の内皮細胞の空間的挙動をより効果的に再現し、内皮の発芽、伸長、ルーメン状構造形成、ネットワークの組み立てを可視化します。さらに、三次元培養環境は生体内の栄養およびシグナル分布により近い条件を提供します^11,12。技術的に要求が高く高価なマイクロ流体血管チップシステムと比べて、この方法は比較的シンプルで再現性が高くコスト効率が高く、血管新生の定期的なin vitro研究に適しています。

このプロトコルの重要な制約の一つは、従来のフィブリンゲルシステムの代替として基底膜マトリックスが使用されていたことです。このため、本アッセイは、従来のフィブリンベースの方法の直接複製ではなく、先に報告された内皮マイクロキャリアビーズ発芽モデルの修正版とみなすべきです。異なるマトリックスは組成、機械的性質、劣化挙動が異なるため、発芽速度論、腔の安定性、血管ネットワークの形態に影響を与える可能性があります(13,14,15)。したがって、このモデルで得られる結果と従来のフィブリン系システムで生成された結果を比較する際は注意が必要です。

このモデルは基底内皮芽の観察を超えた応用の可能性を持っています。また、薬理学的介入研究、遺伝子過発現やノックダウン実験、シグナル伝達経路解析、疾患関連内皮表現型の研究にも適応される可能性があります^16,17。さらなる最適化により、この三次元発芽アッセイは血管発生のメカニズムや血管新生を標的とした治療戦略を研究するための信頼性の高いin vitroプラットフォームとして機能する可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心分離管	Beyotime	FTUB306	クリア、核酸分解酵素フリー
15 mL遠心分離管	Haier	311005	底面円錐形、滅菌済み、バッグパック
24ウェル細胞培養プレート	Haier	612003	底面フラット、組織培養処理済み、個別包装、接着性細胞培養用
自動細胞計数スライド	Countstar	12-0005-50	自動細胞カウンター用使い捨てスライド、1箱50枚入り
CO2細胞培養インキュベーター	Thermo Fisher Scientific	3110	37 °C、5% CO2で細胞培養に使用
Cytodex 3マイクロキャリアー	Cytiva	17048503	乾燥粉末、コラーゲンコーティングデキストランマイクロキャリアービーズ
ドットラインプラグイン	N/A	N/A	対象領域の視覚化プラグイン、血管化領域の輪郭表示に使用
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)、高グルコース	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM基本（1×）、4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、および110 mg/Lナトリウムピルビン酸含有、500 mL
内皮細胞培養液（ECM）	ScienCell Research Laboratories	1001	内皮細胞培養液、使用前にFBSを10%の最終濃度まで追加
胎児牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	認定済み、単回使用形態、オーストラリア原産、500 mL
ヒト口腔粘膜線維芽細胞（HOMFs）	Jiemei Zhai研究グループ、昆明医科大学付属歯科病院	N/A	ヒト口腔粘膜から単離した初代線維芽細胞、他の研究室から提供
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）	自家製	N/A	ヒト臍帯静脈から単離した初代内皮細胞、カタログ番号なし
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所（NIH）	N/A	オープンソースソフトウェア、バージョン1.54p
倒立顕微鏡	オリンパス、日本	N/A	明視野、位相差、および蛍光イメージング用
レーザー走査型共焦点顕微鏡	ニコン、日本	N/A	共焦点イメージング用、モデル未指定
Matrigelベースメントメムブレンマトリックス	Corning	354262	高濃度（HC）、フェノールレッドフリー、LDEVフリー、10 mL
ペニシリン-ストレプトマイシン（Pen-Strep）	Gibco	15140-122	細胞培養用ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100×、100 mL
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	LiJi Bio	AC08L011	1×、滅菌済み、500 mL
T25細胞培養フラスコ	ABCBIO	ABC707008	T25、通気キャップ、組織培養処理済み、接着性細胞培養用
トリプシン-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056	0.25%トリプシン-EDTA溶液、100 mL