ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生モデル

サマリー

このプロトコルは、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生モデルを記述しています。このアッセイは内皮の発芽やルーメン様構造の形成を直接可視化し、血管新生メカニズムや治療介入の研究に応用可能です。

要約

血管新生は、内皮細胞の活性化、移動、伸長、内腔形成、分岐、吻合を含む多段階の生物学的プロセスです。従来の二次元培養システムは、薬剤、遺伝子、培養条件の予備評価には有用ですが、三次元細胞外マトリックス内での内皮形態形成の空間的組織を十分に再現することはできません。本プロトコルは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いたマイクロキャリアビーズベースの三次元血管新生アッセイを記述しています。HUVECはまず化学的に結合した酸変性豚のタイプIコラーゲンを持つマイクロキャリアビーズにシードされ、その後基底膜マトリックスに埋め込まれます。その後、口腔粘膜線維芽細胞がゲルの上にシードされ、内皮の発芽や血管様構造の形成を支えるパラクリン(副分泌)を提供します。培地は2日ごとに交換され、発芽行動や血管新生の表現型は逆立顕微鏡で監視されます。適切な培養条件下では、数日以内に内皮芽が出現し、その後ルーメン状構造や芽間結合が形成されます。この方法は、内皮形態形成の in vitro 研究に便利かつ再現性の高いプラットフォームを提供し、遺伝子操作、薬理学的介入、疾患モデリングの研究にも応用可能です。

概要

内皮発芽は血管新生における重要な出来事であり、既存の血管構造から内皮細胞が出現、移動、増殖、整列し、その後内腔形成と相互に連結した血管様ネットワークの確立を含みます。^1,2。従来の二次元培養システムやゲルベースのチューブ形成アッセイは技術的には単純ですが、三次元の^微小環境内で内皮細胞の空間的再構築を再現する能力には限界があります^3,4。古典的なマイクロキャリアビーズベースの三次元発芽アッセイは、内皮の発芽、伸長、腔の形成、ネットワークの組み立てなど、血管新生の複数の段階を体外で再現しており、そのため血管新生研究において広く用いられる手法となっています。

本プロトコルでは、正常なヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた三次元マイクロキャリアビーズベースの発芽モデルが確立されています。既に報告された内皮マイクロキャリアビーズ発芽^アッセイ5^、6、7に基づき、この方法はマイクロキャリアビーズに内皮細胞コーティングの基本枠組みを保持し、三次元マトリックスに埋め込み、線維芽細胞オーバーレイ培養を行いながら、従来のフィブリンゲルに基底膜マトリックスを用いて手順を簡素化し、日常的な画像処理を容易にします。基底膜マトリックスは、いくつかの実用的かつ生物学的な理由からこの修正プロトコルで選ばれました。実験的には、迅速なゲル形成、ビーズ埋め込み、フィブリンゲル調製に必要な重合工程を省く便便なルーチン顕微鏡観察を可能にする、即使用可能な三次元マトリックスを提供します。生物学的には、基底膜マトリックスには細胞外マトリックス成分が含まれており、これらは内皮細胞の接着、移動、芽の伸張、ルーメン状構造の形成を支えます。したがって、この修飾は内皮発芽行動の直接的な可視化、血管新生表現型の比較、三次元培養環境における薬理学的または遺伝的介入の評価を必要とする研究に適しています。しかし、基底膜マトリックスはマトリックス組成、機械的特性、分解性、生体活性の手がかりにおいてフィブリンゲルとは異なり、本アッセイは古典的なフィブリンベースのアッセイの直接的な置き換えではなく、修正されたマイクロキャリアビーズベースの発芽モデルとして解釈されるべきです。これらのマトリックス関連の違いは発芽速度、腔の安定性、ネットワーク形態に影響を与える可能性があり、異なる三次元血管新生システム間の結果を比較する際に考慮すべきです。このモデルは三次元で内皮発芽行動の観察に適しており、薬理学的介入、遺伝子操作、血管新生メカニズムの研究にも応用可能です。

プロトコル

本プロトコルで使用されたヒト臍帯静脈内皮細胞は、雲南省第一人民病院産科から採取したヒト臍帯組織から分離・培養されました。サンプル採取前に、すべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが取得されました。人由来の物質を用いるすべての処置は、雲南省第一人民病院の医療倫理委員会によって承認されました(承認番号:KHLL2023-KY198)。昆明医科大学付属口腔内科病院の翟潔美博士研究グループにより、ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMFs)が提供されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 細胞の調製

1. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を、胎児用牛血清(FBS)を補足した胎児用牛血清(FBS)を、37°Cの加湿培養盤(CO₂5%)で最終濃度10%まで培養します。アッセイに使用される細胞は汚染がなく、安定した成長を示し、対数成長相にある必要があります。4〜6番目のパッセージに細胞を使用。
2. ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMF)を、37°Cで10%胎児用牛血清(FBS)を補足した高グルコース基底培地で、5%CO₂を含む加湿インキュベーターで培養します。4〜6番目のパッセージに細胞を使用。
3. マイクロキャリアビーズコーティングの前に、両方の細胞タイプが適切な合流点にあることを確認してください。過剰な培養や過剰な酵素消化は避けてください。これらは発芽に悪影響を及ぼす可能性があります。

2. マイクロキャリアビーズの調製

1. 乾燥マイクロキャリアビーズ0.5gを50mLのPBSに少なくとも3時間水和させます。洗浄後、ビーズを50mLのPBSに再懸濁させ、約3×10⁴ビーズ/mLに相当する10 mg/mLのマイクロキャリアビーズ懸濁液を得ます。
2. 懸濁液をシリコン入りガラス瓶に移し、115°Cでオートクレーブして15分間滅菌し、使用まで4°Cで保存します。
3. 内皮細胞コーティングの前に、貯蔵液を取り除き、ビーズを無菌PBSで洗浄します。ビーズを内皮細胞増殖培地で37°Cで少なくとも30分間平衡させます。
4. 使用直前に平衡ビーズを優しく再懸垂させ、沈殿やビーズの集まりを防ぎます。
5. 細胞コーティングの前に、倒立顕微鏡でビーズ懸濁液の小さなアリコットを調べます。ビーズが完全に水分を含み、均一に懸浮し、目に見える集合体や破片がない状態にしてから作業を進めてください。

3. 内皮細胞をマイクロキャリアビーズにコーティングする

1. トリプシンを使ってHUVECを剥離し、細胞を内皮細胞増殖培地に再懸浮させます。
2. マイクロキャリアビーズは1ビーズあたり1,500セルの密度でコーティングします。1.5 mLの内皮細胞成長培地に6個^のHUVEC を3×10個、6個のマイクロキャリアビーズを混ぜます。
3. 細胞ビーズ混合物をマイクロ遠心分離管に移し、細胞培養インキュベーターで12時間培養します。12時間の潜伏期間中は、細胞とビーズの適切な接触を維持し、均一な内皮細胞の付着を促進するために、20分ごとにチューブを優しく反転させてください。
4. 12時間後、コーティングされたビーズを4mLの内皮細胞増殖培地を含む25^cm2 細胞培養フラスコに移し、一晩培養を続けて内皮細胞がマイクロキャリアビーズ表面にしっかりと付着できるようにします。
5. 埋め込む前に、代表的なコーティングされたビーズを倒立顕微鏡で調べます。検査対象ビーズの80%以上がビーズ表面に連続的かつ比較的均一な内皮細胞層を示し、浮遊細胞が最小限で、明らかな細胞塊がなく、重度のビーズ凝集がない場合のみマトリックス埋め込みを進めます。不均一なコーティング、大きな細胞クラスター、または広範な凝集があるビーズは埋め込みに使用すべきではありません。
6. ビーズがフラスコの底に付着したら、優しく振ってビーズを離してください。ビーズの集まりや細胞剥離を引き起こす可能性のある激しいピペッティングは避けてください。

4. コーティングされたビーズを三次元行列に埋め込む

1. 内皮細胞被覆マイクロキャリアビーズを15mL遠心分離機チューブに移し、重力でビーズを沈降させます。余分な培地を取り除き、適量の新鮮培地を加えます。
2. マイクロキャリアビーズ懸濁液を予冷却された基底膜マトリックスと1:1(v/v)比率で混合し、最終ビーズ濃度500ビーズ/mLを得ます。
3. 24ウェルプレートの各ウェルの中心にマトリックスビーズ懸濁液を100μL加え、混合物がウェル壁に接触することなく単一のドーム状のゲル液滴を形成できるようにします。吐出前にサスペンションを優しく混ぜ、気泡を混ぜないようにしてください。
4. 24ウェルプレートを室温で5分間放置し、初期のゲル化とゲル滴の安定化を待ちます。その後、プレートを37°Cで5%CO₂に15分間直立培養し、その後逆さまの状態でさらに15分間培養して、完全なゲル化と適切なゲル形成を確保します。
5. ゲルが完全に固まったら、直ちに線維芽細胞オーバーレイ培養に進みます。

5. 線維芽細胞オーバーレイ培養

1. ヒト口腔粘膜線維芽細胞(HOMFs)3×10⁴を1 mLの内皮細胞増殖培地に再懸浮させ、各ウェルの壁に沿って細胞懸濁液を優しく加え、細胞がゲル表面に分散しつつ、ゲルドームを直接破壊しないようにします。
2. 加湿インキュベーターで5%のCO₂を含み、内皮細胞成長培地で37°Cの培養を続けます。ヒト口内粘膜線維芽細胞は、三次元培養系における内皮芽の伸長、安定化、血管様の再構築を促進するストロマル由来の副分泌信号を提供するため、支持細胞として使用されます。

6. 培養維持と顕微鏡観察

1. 培地は2日に一度交換してください。培地交換中は、使用済み培地をゆっくり吸引し、ゲルを乱さないようにウェルの壁に沿って新鮮な培地を加えます。
2. 明視野または位相コントラストモードを用いて、逆立角顕微鏡で毎日または隔日で培養を観察します。縦断定量解析では、7日目に各井戸で複数の視野を選び、9日目と11日目に同じあらかじめ定義された視野を撮影します。
3. 最適な培養条件下では、4〜6日目に明らかな内皮発芽が観察され、5〜7日目にルーメン様構造が現れ、7日目以降に相互に連結した微小血管様ネットワークが徐々に形成されます。
4. 成功した発芽とは、ビーズ表面から周囲の三次元マトリックスに放射状に成長する複数の内皮拡張の存在と定義します。芽はビーズ表面を明確に越え、ビーズに関連する内皮細胞層と接続している場合にのみカウントされるべきです。
5. ルーメン様構造形成を、中央に透明な空間や管状の形態を持つ細長い内皮構造の出現と定義します。芽間接続とは、隣接する芽同士の間に形成される直接的な接触や連続した構造と定義されます。
6. 広範な細胞死、重度のビーズ凝集、ゲル構造の破壊、豊富な気泡、マトリックス崩壊、または短く不規則な細胞突起のみの培養は最適とは見なさず、定量解析から除外すべきです。

7. 画像取得および定量解析

1. 7日目には各井戸で複数の視野を選び、9日目と11日目には同じあらかじめ定義された視野から画像を取得します。画像は、すべての時刻において同一の倍率、露出設定、撮影条件を用いて収集する必要があります。
2. マイクロキャリアビーズあたりの芽の数と維管束面積を定量化します。
   1. 血管化面積の測定には、オープンソースの画像解析ソフトウェアを使用してください。取得した画像を開き、ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使って血管化領域(ROI)の境界を手動で描画します。選択したROIをROIマネージャーに追加してください。
   2. 可視化には、リタレオス・オブ・インタレスト(興味領域)ビジュアライゼーションプラグインを使って、アウトラインされたROIを表示します。測定設定で面積測定を有効にし、選択したROIを測定して血管化面積を得ます。すべての画像に同じ分析設定を適用してください。
   3. 血管新生率解析では、7日目の血管化領域を基準にし、9日目と11日目の血管化面積の相対的な変化を計算します。
3. 3人の観察者が個別に芽の数を数え、平均値を分析に用いましょう。

結果

三次元HUVECモデルにおける血管新生

成功裏に確立された培養では、内皮細胞はマイクロキャリアビーズの表面に均一に分布しており、明らかなビーズの凝集は観察されません。動的観察により、7日目、9日目、11日目に進行性の内皮芽生と微小血管様ネットワークの形成が認められました(図1A)。定量解析により、このモデルにおける血管新生反応の進行性がさらに確認されました。7日目を基準にすると、7日目に血管新生率を0%に設定し、9日目に66.94%±18.49%、11日目に169.51%±100.83%に達し、培養中の血管形成領域の進行拡大を示しています(図1B)。代表的な明視野画像では、培養7日後に内皮芽がビーズ表面から周囲の三次元マトリックスへ放射状に出ていきました(図1C)。さらに、共焦点顕微鏡は三次元培養システム...

ディスカッション

本プロトコルは、マイクロキャリアビーズに基づく修正された三次元内皮発芽モデルを記述しています。図3は実験ワークフローの概観を示しています。このプロトコルは、NakatsuとHughesによって報告された古典的な血管新生アッセイを基に改良され、^本研究の目的を満たすために最適化^{されました。} 古典系では、内皮細胞がコラーゲン被覆されたマイクロキャリアビーズにコーティングされ、三次元マトリックスに埋め込まれ、線維芽細胞と共培養されて発芽、伸長、腔道形成、血管様吻合を支えます^7,10。本プロトコルでは、フィブリンゲルの代わりに基底膜マトリックスが用いられ、ヒト口腔粘膜線維芽細胞を支持細胞として用い、これにより内皮血管新生挙動のin vitro観察のための便利...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心分離管	Beyotime	FTUB306	クリア、核酸分解酵素フリー
15 mL遠心分離管	Haier	311005	底面円錐形、滅菌済み、バッグパック
24ウェル細胞培養プレート	Haier	612003	底面フラット、組織培養処理済み、個別包装、接着性細胞培養用
自動細胞計数スライド	Countstar	12-0005-50	自動細胞カウンター用使い捨てスライド、1箱50枚入り
CO2細胞培養インキュベーター	Thermo Fisher Scientific	3110	37 °C、5% CO2で細胞培養に使用
Cytodex 3マイクロキャリアー	Cytiva	17048503	乾燥粉末、コラーゲンコーティングデキストランマイクロキャリアービーズ
ドットラインプラグイン	N/A	N/A	対象領域の視覚化プラグイン、血管化領域の輪郭表示に使用
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)、高グルコース	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM基本（1×）、4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、および110 mg/Lナトリウムピルビン酸含有、500 mL
内皮細胞培養液（ECM）	ScienCell Research Laboratories	1001	内皮細胞培養液、使用前にFBSを10%の最終濃度まで追加
胎児牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	認定済み、単回使用形態、オーストラリア原産、500 mL
ヒト口腔粘膜線維芽細胞（HOMFs）	Jiemei Zhai研究グループ、昆明医科大学付属歯科病院	N/A	ヒト口腔粘膜から単離した初代線維芽細胞、他の研究室から提供
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）	自家製	N/A	ヒト臍帯静脈から単離した初代内皮細胞、カタログ番号なし
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所（NIH）	N/A	オープンソースソフトウェア、バージョン1.54p
倒立顕微鏡	オリンパス、日本	N/A	明視野、位相差、および蛍光イメージング用
レーザー走査型共焦点顕微鏡	ニコン、日本	N/A	共焦点イメージング用、モデル未指定
Matrigelベースメントメムブレンマトリックス	Corning	354262	高濃度（HC）、フェノールレッドフリー、LDEVフリー、10 mL
ペニシリン-ストレプトマイシン（Pen-Strep）	Gibco	15140-122	細胞培養用ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100×、100 mL
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	LiJi Bio	AC08L011	1×、滅菌済み、500 mL
T25細胞培養フラスコ	ABCBIO	ABC707008	T25、通気キャップ、組織培養処理済み、接着性細胞培養用
トリプシン-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056	0.25%トリプシン-EDTA溶液、100 mL