稀弱動物精子症のラットモデルにおけるイソフルラン補助電気鍼治療

サマリー

このプロトコルは、ラットにおけるアデニン誘発のオリゴアステノスエロズエッツ精子症モデルの確立と、その後イソフルラン麻酔下でCV3、CV4、ST36、SP6に電気鍼治療を投与したことを詳述しています。転帰は、数と運動率のコンピュータ支援精子解析、さらに精巣組織学およびヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて検証されました。

要約

オリゴアセノステノズーズエステミアは、男性生殖機能障害の中でも最も一般的な形態の一つです。齧歯類研究では、繰り返しのセッションにわたり一貫して電気鍼治療(EA)を行うことは技術的課題であり、特に腹部の正中線と後肢の経位を組み合わせる場合、安定した電極接触が重要です。中吉(CV3)、観源(CV4)、祖三梨(ST36)、三陰家(SP6)は、これらのポイントが不孕や精液異常の鍼治療で頻繁に用いられ、腹部の正中線と後肢の構成が標準化された電極ペアに適合しているため選ばれました。本報告書は、アデニン誘発ラットによるオリゴアステノズエッツ精子症モデルの確立およびCV3–CV4およびST36–SP6のペア刺激を伴うイソフルラン補助EA投与の実践的なプロトコルを説明しています。オスのスプラグ・ドーリーラットは、生殖障害を誘発するために28日間毎日ガベッジでアデニンを投与しました。その後、EAは吸入麻酔下で28日間毎日投与され、誘発時に3%イソフルラン、マスク維持に1.5%を用いて、針の安定配置と電極ペアリング(CV3–CV4およびST36–SP6)を定義された刺激パラメータ(2 Hz, 1.5 mA, 30分)で行いました。治療効果は、精子数および運動性のコンピュータ支援精液分析を用いて評価し、精巣ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)組織学を補完しました。代表的な結果は、アデニン曝露が精子数と運動性を減少させ、精細管構造を乱した一方で、EAは精液パラメータおよび精巣形態の部分的回復と関連していることを示している。このプロトコルは、稀弱動物精子症のラットモデルにおける一貫したEA投与および精液・組織学的検証を必要とする研究の参考文献を提供します。

概要

男性要因は不孕に大きく寄与し、不妊カップルの約半数を占めています。精子数や運動能力の異常が最も一般的な臨床所見の一つです(^1,2)。精子濃度の低下と運動能力の低下を特徴とするオリゴアステノズエスト精子症は、男性生殖機能障害の最も一般的な形態の一つです(^3,4)。補助生殖技術や実証的な医療療法が利用可能であるにもかかわらず、精液の質を改善する効果的な戦略は限られており、さらなる前臨床研究の必要性が浮き彫り^{になっています。}これらの臨床的および翻訳的ニーズは、管理された条件下で男性生殖障害を研究するための再現可能な実験ワークフローの開発を促しています。

鍼治療介入は、臨床および実験の文脈で精液異常および男性不妊について調査されています。⁸.臨床試験では特定の精液パラメータに対する潜在的な利益が示唆されていますが、その設計、介入プロトコル、アウトカム指標^{は大きく異なります}。電気鍼治療(EA)は、刺激パラメータを制御し、手鍼治療よりも均一な調節を行うため、治療関連の変化を測定可能な生殖アウトカムの評価しやすくするため、特に実験室での研究に適しています(10,11,12)。この手続き上の利点により、EAは男性生殖研究における構造化された前臨床ワークフローに非常に適しています。

動物モデルはこの評価の中心ですが、モデル選択はオリゴアセノスレノズエステミア研究における重要な方法論的課題であり続けています。最近のシステマティックレビューでは、ブスルファン誘導モデリング手法が議論の的であり、評価指標において大きな異質性を示すことが指摘されており、より明確な手順と一貫した表示の必要性が浮き彫りになりました¹³。アデニンベースのモデルは、アデニンガベージがラットの生殖障害を誘発し、精巣組織における精子関連のエンドポイントや組織学的損傷の減少を含むため、実用的な実験的アプローチを提供します^14,15。前回の研究では、アデニン誘導のオリゴアステノスティナズム(動物無精子症)ラットモデルを、Shu-Mu脳腎経路セット(Epangsanxian、BL23、GB25、KI3)でEA治療し、非経位および陽性薬剤対照疾患と共に、ELISA¹⁶で定量化された臓器係数や血清ホルモンレベルを含む拡張アウトカム指標を行った。この実験的基盤を基に、既存のEA研究における経腔選択、対照設計、刺激パラメータ、アウトカム指標の異質性を認識し、本プロトコルは安定したEA投与のための方法論的ワークフローを洗練・拡張することを目的としています。

したがって、本プロトコルはデリバリーに焦点を当て、齧歯類における繰り返しEAセッションに不可欠な2つの実用的変数に対応しています。まず、動物の動きやリードワイヤーの牽引による針のずれや断続的な電極接触を防ぐために、刺激中の位置を安定させ、セッションを通じて信頼性の高い電極接触を保証するイソフルラン維持の手順を説明します。これは腹部の正中ポイントと後肢のポイントを組み合わせる際に特に重要です。次に、先行レビューおよび経穴・処方分析^9,17に基づき、不妊および精液異常プロトコルにおける一般的な生殖経位としてCV4、SP6、ST36、CV3を特定し、CV3、CV4、ST36、SP6を選択し、CV3-CV4およびST36-SP6にペア刺激を適用しました。この構成は腹部の正中線と後肢のポイントを組み合わせ、電極接続を標準化し、不安定なリード接続による変動を最小限に抑え、繰り返し治療セッションを通じて再現可能なEA投与をサポートします。プロトコル志向のスコープを維持し、既に報告された内分泌、機構、または陽性コントロールモジュールの重複を避けるため、アウトカム検証は一次精液および精巣の読み取りセットに限定されます。このセットには、コンピュータ支援による精子分析および精巣HE染色が含まれており、このワークフロー内で表現型誘導および治療関連の変化が成功したことを確認するのに十分です。

プロトコル

すべての動物処置は実験動物のケアと使用に関する機関ガイドラインに準拠しており、寧夏医科大学倫理委員会(承認番号)によって承認されました。IACUC-NYLAC-2021-130)。8週齢、体重180〜220gのオスのスプラグ・ドーリーラットは、寧夏医科大学実験動物センター(ライセンス番号)から取得されました。SYXK (Ning) 2020-0001)。動物たちは標準的な実験室環境、22–24°C、相対湿度52%–56%、12時間の光と12時間の暗いサイクルで飼育され、食料と水を自由に利用できました。

1. 動物の調製、グループ割り当て、およびアデニン誘導モデル確立

1. 実験の7日前にラットを慣らし、毎日全体的な状態を監視してください。
2. 順応後、9匹のラットに固有の識別番号を割り当て、コンピューター生成のランダム化シーケンスを用いて1:1:1の比率でランダムに3つのグループに割り当てます:対照群(n = 3)、モデル群(n = 3)、EAグループ(n = 3)。各ラットを実験単位として使用し、あらかじめ定められた除外基準が満たされていない限り、すべての動物とサンプルを最終分析に含めてください。
3. 研究者は、グループ割り当てを盲検にしてコンピュータ支援による精液分析および組織学的評価を行うこと。
   注:EAを行う研究者は、介入が目に見えるグループ特有の手技を伴うため、盲検化はできません。
4. 20 mg/mLのアデニン懸濁液を、0.5%(w/v)アラビア膠を懸浮剤として含み、ガベージ前後に十分に混ぜて沈殿を防ぎます。
5. 対照群には正常生理食塩水を、モデル群およびEA群にはガベージで10 mL/kg(体重1 mL/100 g相当)を1日1回、連続28日間投与します。アデニン用量は200mg/kg/日を使いましょう。
6. モデル期間中、体重と体調を記録すること。
   注: アデニンは懸濁剤として投与され、取り扱い中に沈殿しやすいです。ガベージ中は連続攪拌を維持し、降水が投与の不安定やガベージ針の詰まりを引き起こす可能性があります。詰まった場合は溶液を十分に再懸浮させ、ガベージ針を交換してから続けてください。

2. 電気鍼治療のためのイソフルラン麻酔(図1)

1. 誘導室、鼻マスク、温熱パッドを備えたイソフルラン麻酔システムを準備します。
2. 誘導室内で3%イソフルランを用いて麻酔を誘導し、自然活動が著しく低下するまで続けます。
3. ラットを仰向けで温熱パッドに移し、鼻マスクを通じて1.5%イソフルランで麻酔を持続させてください。
4. 自発的な動きを減らし、まばたき反射を失いながら、適切な麻酔を確実にしつつ、正常な呼吸を維持します。

3. 刺激の伝達精度と品質管理

1. 温熱パッドを使ってセッション中ずっと体温を維持し、低体温症による生理的変動を減らしましょう。
2. すべての動物とセッションで一貫した麻酔設定を適用し、誘導時には3%イソフルラン、維持時には1.5%イソフルランを使用します。呼吸を規則正しく維持しつつ、苦しみを防ぐために必要な最小限の麻酔深度に保ちましょう。
3. 選んだ経穴に無菌の使い捨て鍼(0.25mm×13mm)を垂直に挿入します。針をCV3とCV4で約2mm、ST36で7mm、SP6で5mmの深さまで挿入します。
4. 針の挿入と電極接続後、各針が呼吸や四肢の動きによる緩みが見られないことを目視で確認してください。変位が発生した場合は、針を元の深さまで垂直に再挿入し、刺激を再開する前に安定した電極接触を確認します。
5. 針の柄の近位端付近で電極リードをクリップし、引っ張りを最小限に抑えるために配線・固定してください。鉛の重さや引っ張りは剥離の一般的な原因です。
6. 粗い身体の動きなしに経穴で軽い局所的な筋肉震えを観察して効果的な刺激を確認しましょう。震えがなければ、再度電極の接触と針の位置を確認してください。
7. セッションの途中で15分に標準化されたチェックを1回行います。必要に応じて針を再調整し、軽度の局所震えを確認した後、動物間での刺激投与のばらつきを減らすために進めてください。
   注: EAデバイスを接続する際は、ケーブルの重さによる引っ張りを減らすために、針ハンドルの近位端にリードをクリップで留めてください。必要に応じて、リードや針をテープで固定し、セッション中の剥離を防ぎます。

4. 電気鍼治療(図2)

1. 28日間のアデニンガベジ期間の翌日にEAを開始し、28日間連続で1日1回投与してください。
2. イソフルラン麻酔下で下腹部と後肢を露出させ、表面の解剖学的ランドマークを使って仲基(CV3)、関遠(CV4)、祖三梨(ST36)、三陰嬌(SP6)を特定します。
3. 無菌の使い捨て鍼(0.25mm×13mm)を垂直方向に挿入し、CV3およびCV4で2mm、ST36で7mm、SP6で5mmの深さに差し込みます。
4. 1組の電極をCV3とCV4に接続し、もう1組をST36とSP6に接続します。
5. 2 Hzと1.5 mAの電気刺激を30分間行います。これらのパラメータを、アデニン誘発性オリゴアセノスレノ精子症で以前に用いられたものと一致させる。
6. セクション3で示された品質管理チェックを適用し、15分のセッション中段の単一チェックも含まれます。
   注: ヨンタンの『実験鍼灸と灸科学^』第18巻付録II(「実験動物によく使われる鍼灸穴)」と比較解剖学的指標を参考に、ラットの経穴を局所化します。ラットの経穴は固定された幾何学的点ではなく離散的な解剖学的領域を表すため、一貫した体位、固定された解剖学的基準点、そして動物やセッション間でミリメートル単位の表面測定を用いてください。中吉(CV3)は腹側正中線、臍の中心から尾方約33mmの位置に位置します。冠遠(CV4)は腹側正中線、臍の中央から尾方約25mm、腹壁の皮下浅動脈近くに位置します。祖山里(ST36)は膝の後外側側、腓骨頭から約3mm遠位に位置します。三音橋(SP6)は後肢の内側、内側槌骨の先端から約10mm近位に位置します。すべての動物と治療セッションにおいて、同じ位置、体位、挿入角度、挿入深度を一貫して適用してください。

5. サンプル採取

1. 最終EAセッションの後、ラットを24時間断食します。
2. 組織採取前に、2%ペントバルビタールナトリウムを腹膜内注射で2 mL/kg投与して深部麻酔を誘導します。足の引き込み反射や自発的な動きがないことで、深麻酔の確認をしてください。
3. 施設で承認されたプロトコルに従い、深麻酔下で首を切断して安楽死させてください。
4. すぐに生殖器を無菌的に露出させてください。精子分析のために尾部精巣を1つ、精巣を1つ切除して組織学的検査を行います。
5. 組織学的処理の前に、精巣を4%パラホルムアルデヒドに少なくとも24時間固定してください。

6. 精子分析

1. 尾骨の周囲脂肪を取り除き、すぐに組織を37°Cに予温した2 mLの生理食塩水に入れます。
2. 組織を37°Cの水浴で5分間培養し、眼科ハサミで細かく刻み、200メッシュの篩網で懸濁液をろ過し、ろ過液を優しく混ぜます。
3. 10μLの精子懸濁液を予温化されたカウントチャンバーに注入し、コンピュータ支援精液分析(CASA)システムを使って精子数と運動性を分析します。
4. 同じチャンバータイプ、加熱条件、取得設定を、実験内のすべてのサンプルに適用してください。

7. 精巣組織の組織学的検査

1. 精巣組織を4%パラホルムアルデヒドで最低24時間固定します。ターゲット部分をトリミングし、ラベル付きのカセットに入れます。
2. 試料を段階化されたエタノール系列で脱水し、キシレンでクリアし、パラフィンで浸透させて埋め込み、4μmで切片します。
3. 40°Cの水槽にセクションを浮かせ、スライドに取り付けて60°Cのオーブンで乾燥させます。
4. ヘマトキシリンとエオシンの染色には、切断をキシレンで脱がし、段階エタノールで再水和させ、ヘマトキシリンで5〜10分、エオシンで1〜5分染色し、脱水・透明化してマウントします。
5. すべてのグループにおいて、一貫した拡大率設定下で精細管の組織および精子形成細胞の配列を調べます。

8. モデル確立および治療関連変化の評価

1. 対照群と比較して精子数と運動性の減少、さらに乱れた精細管構造によってモデル確立を確認する。
2. EA群において、モデル群と比較して精子数と運動性の増加、さらに精細管形態の部分的回復による治療関連変化を確認する。
3. 精子処理遅延、チャンバーローディングの失敗、モデリングに関係のない低品質切片など、技術的に損なわれたサンプルを除外基準として事前に定義します。分析時に除外事項を記録してください。

結果

精子分析(図3)
精巣上体の精子懸濁液は、コンピュータ支援精液分析システムを用いて精子数と運動性を定量化するために分析されました。この代表的なデータセットでは、アデニン投与により対照群に対して両パラメータが著しく低下し、モデル確立が成功したことが確認されました。EA介入により、モデル群と比較して精子数と運動性が増加しました(図3)。一方元ANOVAでは、精子数(F = 78.39、 P < 0.001)および精子運動率(F = 374.81、 P < 0.001)に有意な群効果が示されました。ボンフェローニ調整後の比較では、対照群とモデル群、そしてモデル群とEA群の間で有意な差が明らかになりました。

精巣組織学(図4)
ラット精巣の代表的なHE染色断片は 図4に示されており、各グループごとに250μmの概要と代表的な半細管領域の100μm...

ディスカッション

寡軟化動物精子症の多因子病因と利用可能な薬理治療の有効性が限定的であることから、鍼灸とEAは繰り返し可能で非薬物的介入として注目を集めています¹⁹。既存の臨床および前臨床文献は、鍼治療やEAが男性の生殖機能に影響を与えるいくつかのもっともらしいメカニズムを示唆しており、神経内分泌調節の調節、生殖器の微循環の改善、精子形成を妨げる酸化ストレスや炎症反応の減弱などが含まれます.これらの提案されたメカニズムは、精液および精巣組織学を一次指標として用いる対照動物実験におけるEA評価の翻訳的根拠を提供します。

EAは特にプロトコル駆動型の前臨床研究に適しており、頻度、強度、セッション時間、電極ペアリングなどの刺激パラメータを手動針操作よりも一貫して指定・再現^{できるためです。}ラットでは、パラメータ制御されたEAが損傷後の精子生成の回復を促進することが報告されており、定義された実験条件下...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデニン	北京ソーラーバイオ科学技術有限公司	A8330
CASAコンピュータ支援精子分析システム	南寧松景天倫バイオテクノロジー有限公司	VICOS-SPERM
遠心機	サルトリアス	A-14C
分化液	上海碧雲天バイオテクノロジー有限公司	C0163M
使い捨て滅菌鍼	ハンイーブランド		0.25 mm ´ 13 mm
乾燥機	ライカ	HI1220
電気刺激器	常州英迪電子医療機器有限公司	KWD-808I
電子天秤	杭州優恒計量機器有限公司	HLD-6002
エオシンY染色液	ランケバイオテクノロジー	BS248
ヘマトキシリン染色液	珠海貝索バイオテクノロジー有限公司	BA-4041
イソフルラン	RWDライフサイエンス有限公司	R510-22-10
マイクロトーム	ライカ	RM2255
中性バルサム	北京中山金橋バイオテクノロジー有限公司	Zli-9555
パラフィン埋没機	ライカ	HistoCore Arcadia H
SDラット	寧夏医科大学動物センター		8週齢、オス、180-220 g
スライドスキャナー	ライカ	Aperio LV1
小動物麻酔機	RWDライフサイエンス有限公司	R500
渦状振とう器	海門淇林ベル機器製造有限公司	QL-902
温熱パッド	東莞宏達電子有限公司	45W-80X28CM