方法論記事

マウスにおける膝変形性関節症に対する電気鍼治療のマルチモーダル評価

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DOI:

10.3791/71901

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2026年10月6日

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1Department of Acupuncture and Moxibustion, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, 4Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、行動解析とイメージング技術を組み合わせ、電気鍼治療後の変形性関節症モデルマウスを対象としたマルチモーダルかつ縦断的な評価を行い、軟骨染色および国際変形性関節症研究学会（OARSI）スコアリングを含めて検討します。

要約

変形性関節症は、一般的に膝に影響を及ぼし、痛み、腫脹、こわばり、および機能制限を引き起こす慢性的退行性関節疾患である。滑膜炎および関節周囲筋の変化は、疾患の発症と進行に関与している。臨床的エビデンスは、電気鍼治療が局所の炎症を緩和し、軟骨代謝を調節する可能性を示唆している。本研究では、内側半月板の外科的不安定化によりマウスに膝変形性関節症を誘導した。アウトカムは、ロータロッド試験、超音波検査、赤外線サーモグラフィー、磁気共鳴画像法（MRI）、および組織学的染色からなるマルチモーダルプロトコルを用いて評価した。関節腔の体積と皮膚温度を縦断的にモニタリングし、最終時点でのMRIおよびサフラニンO-ファストグリーン染色を用いて、関節周囲筋の信号変化と軟骨病理を評価した。電気鍼治療は、運動機能の改善、関節腫脹の軽減、局所皮膚温度の上昇、MRIにおける関節周囲筋の信号変化の抑制、および軟骨変性スコアの低下に関連していた。これらの知見は、前臨床マウスモデルにおける電気鍼治療に関連するアウトカムを評価するための、本マルチモーダルプロトコルの有用性を支持するものである。

概要

膝変形性関節症（KOA）は、世界で最も有病率の高い骨関節疾患であり、推定2億5,000万人が罹患しています。1その病理学的特徴には、進行性の軟骨変性と滑膜増殖が含まれ、臨床的には疼痛、腫脹、および機能障害を呈します。2,3.

変形性関節症（OA）は長らく非炎症性の関節疾患と考えられてきましたが、現在は炎症成分を持つことが認められており、ほとんどの患者で滑膜炎が検出されます。インターロイキン（IL）-1βやIL-18などの前炎症性サイトカインが、活性酸素種やバイオメカニカルストレスとともに、病理学的プロセスに寄与していると考えられています4。炎症には局所の血流増加が頻繁に併発し、臨床的には発赤、熱感、腫脹として現れます5。炎症は、軟骨変性と機能低下を加速させるだけでなく、特に疾患の初期段階において活性が高くなる可能性があります。したがって、炎症状態を経時的にモニタリングすることで、根底にあるメカニズムを標的とした治療戦略を検討し、病期に応じた管理を行うことが可能になります6,7。マウスの膝関節を用いた超音波（US）スキャンによる先行研究では、脛骨顆と大腿骨顆の間に三角形の領域が特定されました。組織学的解析により、この領域には滑膜、半月板、脂肪体などの軟部組織および滑液で満たされた空間が含まれていることが確認されました。この超音波で検出される領域は、前述の軟部組織領域を包含する関節間体積として定義されています8。

さらに、温度は関節炎症の進行を直接的に反映する重要な物理的パラメータです。局所温度の上昇は炎症の4つの主徴の一つであり、サーモグラフィ画像によってこれらの熱的変化を正確に検出し、定量化することが可能です9。最近の系統的レビューでは、皮膚表面温度と炎症性および変性関節疾患の両方との相関が強調されており10、関節炎の研究および臨床管理における赤外線サーモグラフィ（IRT）の有用性がさらに裏付けられています11。また、IRTは組織灌流および代謝活性に関連する間接的な指標を提供し、治療反応のモニタリングに有用である可能性があります。

本研究では、OAマウスモデルにおける電針（EA）の効果を評価するため、ロタロッドテスト、超音波（US）、赤外線熱画像法（IRT）、および磁気共鳴画像法（MRI）を組み合わせました。このマルチモーダルなアプローチにより、運動能、関節形態、温度変化、および軟組織の炎症を同時に評価することが可能となり、これらは組織学的解析のみでは得られない指標です。重要な点として、このパネルは最小限の追加コストと労力で、複数の生物学的レベルにわたる相補的な情報を提供します。そのため、時間の経過に伴う反復的な非侵襲的モニタリングが必要な前臨床研究、特に調査対象の介入による効果が緩やかであると予想される場合や、反応の経時的プロファイルが不明確な場合に特に適しています。私たちの知る限り、関節腔容積、筋肉の炎症、および局所温度を包括するこれらの手法を組み合わせて、OAに対する電針の治療反応を追跡した研究は本研究が初めてです。ここで記述するプロトコルは実用的かつ再現性があり、同様の実験設定における将来的な縦断的・リアルタイムの有効性評価において、有用なリファレンスになると考えています。

プロトコル

すべての実験手順は、Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. 施設動物倫理委員会（倫理承認番号：WTPZ20260209001）によって審査および承認されました。本研究に使用した動物は、商業的サプライヤーから購入した体重約 20 g の 8 週齢 C57BL/6 マウスです（材料表を参照）。実験には 24 匹のマウスが使用されました。1 週間の馴化後、動物をランダムに割り当て、4 つの実験条件に各 6 匹ずつ配置しました。これらの条件は、偽手術、内側半月板不安定化（DMM）、偽鍼治療（SA）、および電気鍼治療（EA）で構成されました。使用した動物数は、事前のサンプルサイズ計算に基づかず、同等の変形性関節症モデルおよびエンドポイントを用いた過去の電気鍼治療研究を参考に、また 3R の原則に従って群サイズを選択しました。

1. 術前ケアおよびモデリング

注：すべてのモデリング procedure は、経験豊富な手術技師によって行われました。動物は、加熱パッドの上で意識を取り戻した後にのみケージに戻してください。

  1. 実験開始の少なくとも7日前から、マウスを実験環境に慣らしておく。
  2. 手術前にすべての手術器具を滅菌する。手術部位を十分に消毒する。
  3. ガス麻酔装置を起動する。マウスを導入チャンバーに入れ、2–3% isofluraneで5分間全身麻酔を導入する。
  4. 麻酔導入後、マウスを手術台に移す。手術が完了するまで、麻酔マスクを通じて1–1.5% isofluraneを継続的に投与し、麻酔を維持する。
  5. 膝関節が上を向くようにマウスを仰臥位にする。体位を安定させ、手術部位が完全に露出していることを確認する。右後肢でDMMモデルを作製する12。Sham群では、同様の部位に切開を加え、その後縫合して閉じる。
    1. DMMの手術手順
      1. 膝関節を露出させるため、内側膝蓋骨傍に1 cmの縦切開を加える。
      2. ステップ1.5.1.1で作製した内側膝蓋骨傍切開を通して、関節包に縦方向の開口部を作る。鉗子を使用して、関節包を周囲の組織から十分に剥離させる。次に、過度な圧力をかけないように左手で後肢の遠位端を保持し、鉗子を用いて膝蓋骨と膝蓋靭帯を外側に移動させ、膝関節を露出させる。この手順全体を通して、損傷を防ぐために後肢を慎重に扱う。
        注：関節包を適切に開放することで、最小限の力で膝蓋骨を移動させることができる。
      3. 術中に滅菌生理食塩水を関節軟骨表面に滴下し、乾燥を防ぐ。
      4. 内側大腿顆と内側脛骨プラトーの間の空間にある内側半月板を特定する。その外側から内側半月脛骨靭帯を辿り、脛骨顆間隆起への付着部を確認する。後肢を手で優しく固定し、内側半月板の下にある軟骨に触れないように注意しながら、No. 10の手術用メスで靭帯を切断する。注：関節軟骨や他の靭帯を損傷しないように注意すること。多くの場合、靭帯を特定するために上層の脂肪組織を牽引する必要があるが、除去はしない。
      5. 膝関節包の端を寄せ、6-0吸収性縫合糸を使用して固定する。
      6. 6-0シルク縫合糸で皮膚を閉じる12。
  6. 術後ケアとして、局所鎮痛のために0.25% bupivacaineを1滴手術部位に投与し、マウスに餌と水を自由に取り込ませて維持する。
    注：麻酔中は、酸素流量を0.5–1 NL/minの範囲に維持する。正位反射の消失、趾つまみ刺激に対する逃避反応の消失、および安定した規則的な呼吸により、麻酔が成功したことを確認した。手術全体を通して、軟骨の水分を維持するために滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を灌流液として使用する。関節包閉鎖用の吸収性縫合糸および皮膚閉鎖用のシルク縫合糸の具体的なサイズと仕様については、材料表に詳述されている。

2. 電気鍼治療

注：SA群およびEA群への介入は、モデル作製から1週間後に開始した（図 1A）。両群ともに、4週間にわたり、1回15分間の処置を週3回、隔日で受けた。Sham群およびDMM群には、刺鍼や電気刺激を行わず、同様のスケジュールで同一の麻酔および固定処置を施した。すべての操作者は、経穴の選択、刺入角度、および刺入深度の一貫性を確保するため、実験前にトレーニングを受けた。

  1. マウスを導入チャンバーに入れ、イソフルランで麻酔を導入した後、取り出す。
  2. 静穏で安定した状態を確保するため、電気鍼治療の全過程を通じて、イソフルラン（100% O₂中で1.5–2.0%）による持続吸入麻酔下でマウスを仰臥位に保持する。
  3. マウスの経穴（ツボ）を正確に特定する。下肢のST36（足三里）およびSP10（血海）に、使い捨て滅菌鍼（0.16 mm × 25 mm）2本を皮膚深度5 mmまで刺入する13（図 1B）。
    ​注：ST36は、脛骨前結節の外側1 mm、腓骨頭の下方3 mm、および膝関節の直下に位置する。SP10は、膝を屈曲させた状態で、大腿内側の大腿四頭筋の内側突出部、膝蓋骨の上内側縁の上方3 mmに位置する。
    1. SA群では、ST36またはSP10ではなく、その隣接する非経穴領域に約1 mmの深度で浅く刺入し、電流を流さずにEAデバイスに接続する14。
      注：したがって、SA群は鍼の刺入位置、刺入深度、および電気刺激の有無においてEA群と異なるが、それ以外のすべての処置パラメータは一致している。DMM群と比較すると、SA群は非経穴への浅い刺鍼と電流を流さないデバイス接続を受けるが、DMM群は麻酔と固定のみを受ける。
  4. 鍼を電子鍼デバイスに接続し、2/100 Hz、2 mAで刺激を与え、緩やかな筋震顫を誘発させる。モデル作製から7日後を開始日として、週3回、1回15分間のEA刺激を4週間継続する。
  5. 処置後、マウスをヒートパッドの上に置き、意識が回復したことを確認してからケージに戻す。

3. EA efficacyの動的評価

注：すべての評価（ロータロッド試験、超音波検査、赤外線体温計、MRI、およびOARSIスコアリング）は、グループ割り当てを知らされていない研究者によって行われ、グループの正体はすべてのデータ解析が完了するまで秘匿されました。画像取得とデータ解析は別々の担当者が行い、組織学的評価は治療グループを知らされていない2名の病理学者によって独立して行われました。評価者のいずれも、動物の割り当てや電針治療には関与していません。

  1. ロータロッド疲労試験
    1. 正式な試験の前に、マウスに実験装置を慣れさせるための事前訓練を行う。
    2. 正式な試験では、マウスを1匹ずつロータロッドに乗せ、マウスが落下するまで毎分4回転の速度で加速させます。
    3. 各マウスが棒上に留まった時間を速やかに記録してください。各マウスの試験間には30分間のインターバルを設け、3回繰り返した試験の平均値を算出してください。
      注：OAモデルの作製前およびEA治療の完了後に、ロータロッド試験を用いて運動協調性を評価してください。術後の痛みを最小限に抑えるため、手術後1週間のロータロッドデータの収集は制限してください。
  2. 小動物超音波検査
    ​注：超音波イメージングおよび関節腔の描出に関するステップバイステップの手順は、以下に示されています。 図2.
    1. 正式なデータ取得の前に、マウスを麻酔チャンバーに入れ、運動機能が消失するまで麻酔をかけ、除毛クリームを用いて右膝関節の毛を除去する。マウスの被毛を除去する際は、できるだけ優しく行い、ぬるま湯で丁寧に拭き取ることで、マウスへの刺激を最小限に抑える。
      注：すべての体積測定が完了し、統計解析のために群の情報が公開されるまで、動物コードとタイムポイントのみを表示させることで、解析中の盲検化を維持してください。
    2. 超音波診断装置の電源を入れ、小動物用超音波プローブを取り付け、適切なマウス検査プロトコルを設定します。同時に、マウスをケージに入れ、持続麻酔を行います。
    3. 麻酔が完了したら、マウスをコントロールプラットフォームに移し、ノーズマスクを用いてイソフルラン吸入麻酔を投与する。マウスの頭を操作者とは反対方向に、尾を操作者側に向けて配置する。
    4. 膝関節を屈曲させてマウスを固定し、膝蓋靭帯上の皮膚に超音波用カップリング剤を塗布します。
    5. プローブを調整し、膝関節と平行になるように配置します。
    6. 設定してください スキャン距離 ～へ（または、～まで） 4 mm およびその ステップサイズ 〜へ 0.04 mm解剖学的位置に基づき、画像上で関節腔を特定します。プローブのスキャン中は、動物を動かさないでください。
    7. 画像を撮影する。関節腔を特定する。関節腔とは、大腿骨、脛骨、およびそれらを覆う皮膚および筋肉の間に明確な境界を持つ三角形の領域である。
    8. スキャン結果に名前を付けて保存し、元のフォルダ構造を維持したまま解析用コンピュータにエクスポートします。
    9. ソフトウェアを用いて膝関節腔の体積を解析する。以下を入力する。 研究 モジュールを選択し、[ ]をクリックします。 インポート 機能
    10. データフォルダを参照して選択し、インポートするデータファイルを確認して、ダブルクリックで開きます。
    11. 内 表示 モード、選択 画像処理 | 3Dへの読み込み | 断面図 | 体積測定 | 開始 順次。
    12. マウスホイールまたはスライススライダーを使用して、近位から遠位に向かってスライスをスクロールし、関節腔が最初に現れるスライスを特定します（通常、大腿骨、脛骨、およびその上の皮膚および筋肉組織の間に明確な境界を持つ三角形の領域として現れます）。
    13. 関節腔が最初に現れるスライスでトレースを開始します。左クリックして輪郭の描画を開始してください。
    14. 関節腔の端に沿って一点ずつトレースし、関節腔が完全に消失するまで閉じた輪郭線を描きます。
    15. クリック 完了システムが3Dセグメンテーションボリュームを生成し、ボリューム測定結果を出力します。
    16. 目的のファイル形式を選択し、画像をTIFF形式の画像領域ファイル（.tif）としてエクスポートします。
  3. 小動物赤外線サーモグラフィ
    ​注：OA（変形性関節症）モデルマウスにおいて、測定は手術の1日前、手術の7日後、および治療終了時に行った。IRTは、温度管理された室内（22–24 °C）、イメージングの30分前にマウスを環境に順応させた。
    1. 動物を仰臥位にし、後肢を伸展させた状態で、膝が常に露出するようにすべての肢をテープでベンチに固定する。マウスを導入チャンバーに入れ、完全に麻酔がかかるまでイソフルランを連続投与する。
    2. 麻酔をかけたマウスを手術台の上に仰臥位で固定し、周囲温度を一定に維持する。
    3. マウスの後肢をそっと掴んで右膝関節を伸展させ、赤外線サーモグラフィを用いて当該領域の画像撮影および温度測定を行う。
    4. デフォルトの皮膚放射率（0.98）を使用する。深麻酔から3分後に画像を撮影する。膝の関心領域（ROI）を大腿脛骨関節の内側関節線として定義し、足首のROIを距腿関節の背側表面として定義する。これらのランドマークに基づき、トレーニングを受けた1名のオペレーターがすべてのROIを手動で描出する。
    5. デバイスに付属のソフトウェアを用いて画像を解析し、膝関節および周囲の皮膚の温度データを読み取り、温度勾配が減少する足関節および膝関節に測定コントロールポイントを設定します。
  4. 小動物MRI
    ​注：電針（EA）治療後、小動物用MRIを用いて、各群のマウスの膝関節における局所炎症を評価した。
    1. マウスを麻酔箱に入れ、麻酔をかける。運動機能が消失した後、両膝関節に除毛クリームを塗布する。
    2. 1分後、温水で湿らせたガーゼで除毛クリームを拭き取り、両膝関節の除毛を完了させる。
      ​注：マウスの被毛を可能な限り除去し、麻酔下で採取を行ってください。
    3. マウスサイズのガントリーを用いて、適切なプロトコルを設定します。
      1. ポジショニングデバイスに、3平面高速グラディエントエコー法（TR/TE = 50/3 ms、視野（FOV） = 30 cm）を用いること。 × （30 mm、スライス厚 1 mm）で膝関節を画像の中央に配置し、T2強調高速スピンエコー（T2WI）シーケンスを用いてマウスの膝関節をスキャンする。
      2. 以下のスキャンパラメータを使用してください：繰り返し時間（TR）2,500 ms、エコー時間（TE）8 ms、視野（FOV）20 × 20 mm、256のマトリックス × 256、スライス厚0.5 mm、スライス間隔なしとし、大腿骨顆部から脛骨平台までの領域をカバーする10連続スライスで撮影します。1回のスキャン時間は約8分20秒となる見込みです。
      3. 検討する 得られたT2強調画像を用いて、膝関節軟骨、滑膜、関節腔、および周囲の軟組織における形態学的変化を観察し、 評価する 関節液貯留、滑膜肥厚、および局所炎症。
    4. マウスをガントリーの上に置き、マスクを用いてイソフルランによる吸入麻酔を導入し、膝が常に上方を向くように医療用テープで四肢を固定する。
    5. ガントリーをMRIスキャナー内にスライドさせ、撮像を行います。
      1. 3平面ロカライザーで、膝関節腔が冠状面に平行であること、スラブ中心が関節腔と一致していること、および磁化率アーチファクトを避けるために腸管や気腔がFOV外にあることを確認してください。ポジショニングにずれがある場合は、再度ロカライズを行い、再スキャンしてください。
    6. 定性的評価のため、取得したマルチエコーT2強調画像をDICOMまたはNIfTI形式でエクスポートします。
    7. 膝関節内および関節周囲軟部組織における高信号域の信号強度と分布を視覚的に検査してMR画像を評価し、これらの出力画像に基づいて群間での炎症信号を比較する。

4. 病理学的および形態学的観察

  1. マウス膝関節の固定および切片作成
    1. マウスから採取した2つの膝関節サンプルを10%パラホルムアルデヒドで48 h固定する。その後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に30 min浸漬し、洗浄する。
    2. 余分な水分を拭き取った後、速やかに新しく調製した脱灰液（pH 7.2–7.4）に移し、3日ごとに溶液を交換する。
    3. 2週間脱灰を継続し、サンプルを流水で洗浄した後、75%エタノールに2 h浸漬する。
    4. 組織処理機を用いて、18 hの自動勾配脱水を行う。
    5. 脱水後、パラフィン埋込機にて、あらかじめ加熱したパラフィンワックスにサンプルを2 h浸漬し、その後、埋込を行う。
    6. 膝関節を矢状面に埋め込む際、内側関節面を下向きにして、この面から先に切片が作成されるように配置する。
    7. 組織ブロックをミクロトームにセットし、4 µmで連続切片を作成する。半月板の中央まで到達した後、21枚の連続切片を回収する。
    8. 切片をセクションスプレッダー上に広げる。ピンセットを用いて水面上で検体を分離し、カバーガラスで回収する。カバーガラス1枚につき2つの検体を回収する。
    9. スライドをスライドドライヤーに平らに置き、1 h以上放置して水分を完全に蒸発させる。スライドを specimen box に入れ、60 °C のオーブンで8 h脱パラフィンを行う。その後、後で使用するまで保管しておく。
      ​注：すべてのパラホルムアルデヒド固定液、脱灰液、およびエタノール洗浄液は有害廃棄物として回収し、施設のガイドラインに従って廃棄すること。
  2. サフラニンO-ファストグリーン染色
    1. 未染色の切片を染色ラックに載せ、オーブンで5 min加熱する。この間に、ドラフトチャンバー内で染色液を調製する。
    2. 切片を室温に戻し、通常の手順で水まで脱パラフィンを行う。
    3. 切片をウェットボックスに移し、新鮮なWeigert溶液（Part A + Part B）で5 min染色する。
    4. 水で3 x 1 s洗浄する。
    5. 1%塩酸エタノール溶液で15 s分染し、その後、蒸留水で10 min洗浄する。
    6. ファストグリーン溶液で4 min 55 s染色する。
    7. 残ったファストグリーンを除くため、1%酢酸溶液で10-15 s迅速に洗浄し、その後、風乾させる。
    8. サフラニン O染色液に4 min 35 s浸漬する。
    9. 95%エタノールで3-5 s迅速に脱水し、続いて無水エタノールで2 x 1 min洗浄する。
    10. キシレンで透徹し、中性樹脂で封入し、キシレンを揮発させるためドラフトチャンバー内に4 h置く。
    11. ホールスライドスキャナーで切片を確認し、スキャンを行う。
      注：キシレン、酸性アルコール、酢酸、パラホルムアルデヒド、および本研究で使用したWeigert溶液、ファストグリーン、サフラニンOを含む染色液は有害物質である。すべての操作は、ニトリル手袋、白衣、保護メガネなどの適切な個人用保護具を着用し、ドラフトチャンバー内で行うこと。使用済みの試薬や洗浄液を含む有害廃棄物は、キシレン廃棄物を水系廃棄物と分けて指定の容器に回収し、施設の規定に従って廃棄しなければならない。

5. 統計解析

  1. 連続データは平均値として報告する ± 特に断りがない限り、標準偏差（SD）で示し、OARSIスコアは中央値（P25, P75）として報告する。
  2. 平均値として報告されたアウトカムについて ± SD（標準偏差）を用い、一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyのポストホックテストを用いて多群間比較を行った。OARSIスコアは、Kruskal-Wallis検定およびそれに続く 事後的に 2群間のペア比較には片側マン・ホイットニー検定を用い、解析を行った。15.
  3. 検討する P 値 < 0.05で統計的に有意な（"ns" （有意差なしを示す）。

結果

ロータロード試験において、EA群はDMM群よりも落下潜時が長いことが示された（P < 0.05）。一方、SA群はDMM群と有意な差は認められなかった（Figure 1CおよびTable 1）。モデリング前、膝関節の縦断超音波スキャン（スキャン距離 4 mm、ステップサイズ 0.04 mm）では、群間に joint cavity volume の有意な差は見られなかった（Figure 3A,BおよびTable 2）。モデリングの1週間後、3次元再構成により、DMM、SA、およびEA群の joint cavity volume はSham群よりも有意に大きいことが示されたが（P < 0.05）、DMM、SA、およびEA群の間に有意な差は認められなかった（P > 0.05）（Figure 3A,C）。4週間のEA治療後、EA群の joint cavity volume はDMM群よりも有意に低く（P < 0.05）（Figure 3A,D）、これは関節腔の腫脹が軽減したことと一致していた。

IRTは、視野内の焦点面温度情報を収集し、表面温度分布を擬似カラー形式で表示するために用いられる手法である16。モデリング前およびモデリング1週間後において、群間の皮膚表面温度に有意差は認められなかった（Figure 4A-CおよびTable 3）。しかし、EA治療後、DMM群の皮膚表面温度はSham群よりも有意に低かった。対照的に、EA群の皮膚表面温度はDMM群よりも有意に高く（Figure 4A,D）、EAはDMMよりも局所の皮膚表面温度を高めることに関連していたが、SAではその効果は見られなかった。

MRI画像では、Sham群では関節周囲筋に視認できる信号異常は認められず、DMM群ではより顕著な信号変化が認められ、EA群では変化がより緩やかであり、SA群とDMM群では同様の変化が認められた（図5A）。電針治療後、右膝関節を採取してパラフィンに埋め込み、矢状面に沿って切断した。 4 µm切片をサフラニンO-ファストグリーンで染色し、OARSI組織病理学的システムを用いてグレード判定を行った。Sham群と比較して、DMM群では関節軟骨の摩耗がより顕著であり、OARSIスコアが高かった。EA群はDMM群よりも軟骨変性が少なく、OARSIスコアが低かった（P < 0.05)であったが、SA群はDMM群と有意な差を示さなかった（図5B,C および 表4).

figure-results-1
図1: OAマウスにおける実験タイムライン、ツボの配置図、およびロータロッド試験。(A) 実験タイムライン。(B) ツボの配置図。(C) ロータロッド試験。各群 n = 6。各マウスにつき3回の試行を実施。データは平均値 ± SD で表示。### Sham vs DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; ** EA vs DMM, P < 0.01。こちらのリンクをクリックして、本図の拡大版を表示してください。

figure-results-2
図 2: 超音波検査のステップバイステップ手順。(A) マウスを導入チャンバーに入れ、麻酔をかけるところ。 (B) 後肢に除毛クリームを塗布するところ。 (C) クリームを均一に塗布した後、1 min待機するところ。 (D) ガーゼで余分な除毛クリームと毛を拭き取るところ。 (E) 除毛した後肢を確認するところ。 (F) 画像取得前に、マウスを導入チャンバーに戻して麻酔をかけるところ。 (G) 後肢に超音波用カップリング剤を塗布し、プローブを後肢の長軸と平行になるまで回転させるところ。 (H) 超音波画像を取得するところ。 こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。

figure-results-3
図3OAモデルマウスにおける小動物超音波検査の代表的な画像および定量結果。 (A）手術前、術後1週間、および電針治療後の膝関節の3次元超音波再構成像（走査距離 4 mm、ステップサイズ 0.04 mm）。スケールバー = 2 mm。（B）術前の関節腔容積（1群あたり n = 6）。（C) 手術1週間後の関節腔容積（各群 n = 6）。(D) EA介入後の関節腔容量（各群 n = 6）。### Sham群 vs DMM群、P < 0.001; ns, SA 対 DMM, P > 0.05; *** EA対DMM, P < 0.001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4OA（変形性関節症）マウスにおける代表的な赤外線サーモグラムおよび皮膚温度の定量結果。 (A) 手術前、術後1週間、および電気針（EA）治療後の下肢サーモグラム。各サーモグラムは赤外線カメラソフトウェアの自動温度範囲を用いて表示されており、そのためパネル間での色の直接的な比較はできない。定量的な比較はパネルB〜Dの散布図に基づいて行う必要がある。(B–D) 大腿脛骨関節の内側関節線として定義される、膝関節の関心領域（ROI）における皮膚温度の定量分析。B) 手術前の下肢皮膚温度（各群 n = 6）。 (C) 手術1週間後の下肢皮膚温度（各群n = 6）。(D）電気鍼治療介入後の下肢皮膚温（各群n = 6）。データは平均値として提示。 ± SD. ### シャム群 vs DMM群、P < 0.001; 有意差なし、SA 対 DMM、P値 > 0.05; ** EA 対 DMM, P < 0.01. この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

figure-results-5
図5OAマウスにおける関節周囲筋の信号変化の代表的なMRI画像、膝関節の組織切片、および定量結果。 (A) 各群の代表的なMRI画像。(B) 代表的なサフラニンO-ファストグリーン染色膝関節切片。スケールバー = 1 mm。(C) OARSI軟骨病理スコア（n = 各群6）。OARSIスコアは中央値（P25, P75）で表示。### Sham対DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; ** EA 対 DMM, P < 0.01. こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

群N第5週
シャム（偽手術）6101.300 ± 5.416
デジタルマルチメータ670.280 ± 3.363###
SA670.060 ± 7.796
EA684.390 ± 9.504**
注：### シャム手術群 vs DMM（内側半月板切除）群、P値 < 0.001; ** EA対DMM, P < 0.01.

表1：ロータロッド試験（平均 ± 標準偏差；n = 6/群）。 ### Sham 対 DMM、P < 0.001; ** EA 対 DMM、P < 0.01。

群N第0週第1週第5週
シャム（擬似操作）62.029 ± 0.0552.056 ± 0.0712.061 ± 0.079
デジタルマルチメータ62.058 ± 0.0682.591 ± 0.056###2.926 ± 0.088###
SA62.056 ± 0.0452.592 ± 0.0762.915 ± 0.112
電気生理学62.032 ± 0.0592.548 ± 0.0742.177 ± 0.110***
注：### Sham群 vs DMM群、P値 < 0.001; *** EA対DMM, P < 0.001.

表2：関節腔容積（平均 ± SD; 各群 n = 6）。 ### Sham vs DMM, P < 0.001; *** EA vs DMM, P < 0.001。

群N0週目第1週第5週
シャム（擬似）635.517 ± 1.36635.717 ± 0.54635.650 ± 0.701
デジタルマルチメータ635.783 ± 1.29235.033 ± 0.78132.967 ± 1.223###
SA635.583 ± 1.78035.283 ± 0.86133.267 ± 0.501
電気穿孔法635.500 ± 1.51035.417 ± 0.88234.533 ± 0.929**
注：### シャム群 vs DMM群、P値 < 0.001; ** EA 対 DMM, P < 0.01.

表3：皮膚温度（平均値 ± 標準偏差；各群 n = 6）。### Sham群 vs DMM群, P < 0.001; ** EA群 vs DMM群, P < 0.01。

群N第5週中央値
擬似操作60.000 (0.000, 0.250)0
デジタルマルチメータ64.000 (3.000, 4.250)###4
SA64.000 (3.000, 4.250)4
電気穿孔法62.500 (1.750, 3.000)**2.5
注：### シャム群 vs DMM群、P値 < 0.001; ** EA 対 DMM, P < 0.01.

表 4: OARSIスコア [中央値 (P25, P75); 各群 n = 6]。### Sham 対 DMM, P < 0.001; ** EA 対 DMM, P < 0.01。

ディスカッション

膝関節 osteoarthritis (KOA) は進行性の変性疾患であり、現在の治療的介入では根本的な進行を止める効果は限定的です17。筋肉機能の低下と身体能力の低下は、症状の重症度を予測する臨床的に重要な指標となります。したがって、修正可能なリスク要因を積極的に管理することが、KOAの進行を遅らせるために不可欠です18。本研究では、マルチモーダル評価システムを用い、EAがOAモデルマウスにおいて、運動能力の向上、関節腔容積の減少、局所皮膚表面温度の上昇、関節周囲筋のMRI信号変化の抑制、およびOARSIスコアの低下に関連していることを実証しました。

IRTの結果は、この統合的な見解をさらに支持しています。術後1週目において、皮膚温度はSham群を含む各群間で差が見られませんでした。これは、一時的な血管収縮と浅層の浮腫によって皮膚表面からの熱放出が一時的に減少するという、外科的外傷に対する一様な反応を反映していると考えられます。対照的に、治療後に観察された有意な温度差は、EAの抗炎症作用および微小循環作用が即効性ではなく累積的であり、繰り返しのセッション後にのみ顕在化することを示唆しています。これらのアウトカム評価項目は相互に関連している可能性があります。関節腔の腫脹は一般的に滑膜炎症と関節液貯留の程度を反映し、一方で局所の微小循環状態は、炎症時の血管透過性の変化と密接に関連しています19。本実験では、EA投与後の関節容積の減少が局所温度の上昇と一致していました。IRTは血流を直接測定するものではありませんが、これらの変化が同時に起こったことは、局所血流の亢進が炎症メディエーターの除去を促進し、それによって滑膜および周囲の筋肉内への炎症浸潤を減少させた可能性を示唆しています。その後の運動機能の改善は、腫脹の軽減と炎症の緩和という相乗的な効果に起因すると考えられます。総じて、これらのパラメータに認められた変化は、単発的な出来事ではなく、相互に関連した反応であると考えられます。このパターンは、EAが単一のメカニズムを介して作用するのではなく、複数の病理学的プロセスを統合的に調整している可能性を示唆しています20。

従来の終点組織学的評価と比較して、本研究で採用したマルチモーダル動的モニタリングシステムは、明確な実用的利点具有しています。小動物用超音波検査（US）により、放射線曝露なく関節液貯留を縦断的かつ非侵襲的に追跡できるため、終点組織サンプリングに固有の個体間変動を回避することが可能です21。小動物用MRIは、関節周囲筋における信号変化の詳細な可視化を提供することでUSを補完します。これにより、US単独では十分に捉えきれない可能性のある筋肉の炎症を定性的に評価できます。局所皮膚温度をリアルタイムで測定する赤外線サーモグラフィ（IRT）と組み合わせることで、このアプローチは炎症の消退を示す間接的な指標を提供します。これらの画像診断法の利用により、治療過程全体を通じて繰り返し測定を行うことが可能になります。3R原則に準拠しているだけでなく、この縦断的設計により、各個体内で反復的な観察が可能となり、個体間変動の影響を最小限に抑えることができます。我々が知る限り、OAに対する鍼治療を評価した過去の動物研究において、US、MRI、サーモグラフィ、行動テスト、および組織病理学を単一の実験枠組みに統合したものはありません。このマルチレベルアプローチにより、機能的、形態的、組織学的領域にわたる相補的なデータが得られ、単一の終点評価よりも包括的な評価が可能となります。

いくつかの限界を認める必要がある。第一に、本研究は動物実験からの観察データに基づいており、in vitro研究によるメカニズムの根拠に欠けている。EAがNOD様受容体ファミリーピリンドメイン3（NLRP3）/caspase-1/IL-1β経路を関与させるかは不明である。IL-1βおよびIL-18は滑膜および筋肉の炎症の主要な媒介因子であり、それらの成熟にはNLRP3インフラマソームの活性化が必要である22。また、観察された循環の改善が、血管内皮増殖因子（VEGF）または内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）の発現変化と相関しているかどうかを判断することはできない23。第二に、2つのツボ（ST36およびSP10）に対して設定された単一のEAパラメータ（2/100 Hz）を適用した。異なる設定や代替のツボの組み合わせでより優れた結果が得られるかどうかについては、さらなる調査が必要である24。第三に、すべてのイメージングデータは単一のオペレーターによって取得された。このアプローチにより技術的な一貫性は確保されたが、観察者間信頼性は評価されておらず、イメージング所見の一般化可能性を制限している可能性がある。第四に、拘束のみを行う対照群を設けていなかったため、麻酔、固定、およびハンドリングの影響を、EAの治療効果から完全に分離することが困難であった。第五に、SAの手順は、ツボ、深部組織、および電気刺激に特有の影響を軽減するための最小限の対照として設計された。しかし、真の介入とシャム介入との間の刺入深さの違いにより、深さのみの寄与を分離することができない。したがって、我々の知見は、電気刺激のみの厳密な評価ではなく、完全なEAプロトコルと最小限のシャム手順との比較として解釈されるべきである。第六に、カメラの距離、撮影角度、および絶対的なROI面積が正式に記録されておらず、これが技術的な限界となっている。最後の限界は、時間点ごとに個別のANOVAを使用したことであり、これは反復測定の相関および時間と群の相互作用を無視しており、その結果、動的な変化に対する感度が低下している。

要約すると、DMM誘発KOAマウスモデルにおいて、EAは抗炎症作用および機能的な改善に関連していた。モダリティ間での解像度の差、超音波（US）および赤外線熱画像（IRT）の術者依存性、MRIの高額なコスト、および反復測定による潜在的なストレスといった制限はあるものの、本プロトコルは縦断的なマルチモーダル評価のための実行可能なプラットフォームである。この統合システムは、前臨床評価の枠組みを提供する。今後の研究では、電気的パラメータを最適化し、オルガノイド、オルガン・オン・チップ、およびAIプラットフォームを活用して、メカニズムを解明し、個別の治療へと導くべきである25,26。また、臨床応用を促進させるためには、擬似操作（sham）コントロールの改善、プロトコルの標準化、およびより長期的な追跡調査が必要である。

開示事項

著者らに開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、上海市科学技術イノベーション行動計画（23YF1447900、JMC宛）および中国国家自然科学基金（U23A20508、LQY宛、82575196、HSC宛、U24A6013、HX宛）の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% 酢酸溶液Solarbioカタログ番号 G1371染色のための分染／洗浄液
エタノール中1%塩酸Solarbioカタログ番号 G1371酸アルコール分化液
7T小動物用MRI上海晨光7T MRI NOVAL小動物用磁気共鳴イメージングシステム
鍼針（0.16 mm × 25 mm)Wuxi Jiajian Medical Instrument、中国、無錫ロット番号 491226滅菌済み鍼
親水性スライドガラス江蘇世泰MH0662組織切片用顕微鏡スライド
無水エタノール上海泰坦科技有限公司64-17-5脱水用エタノール
C57BL/6マウス上海赛乐客实验动物有限公司https://www.slaccas.com/実験動物
カバーガラス江蘇世泰翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。組織切片の回収およびマウント
脱灰溶液SerivebioG1105-500ml骨・関節脱灰試薬、pH 7.2-7.4
電気治療器苏州医疗用品厂有限公司SD-Z電気鍼刺激装置
エチレンジアミン四酢酸上海泰坦科技有限公司60-00-4キレート剤
Fiji (ImageJ)アメリカ国立衛生研究所 (NIH)64ビットJava 8を同梱したImageJ。画像解析ソフトウェア
ガーゼWeizhe MedicalタイプA1：標準ガーゼパッド（滅菌済み）除毛および洗浄剤
除毛クリームVEET翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。除毛クリーム
赤外線画像解析ソフトウェアFLIR提供されていません赤外線サーモグラフィに付属するソフトウェア
赤外線サーモグラフィカメラFLIR435-0007-03（初期バッチ）赤外線サーモグラフィシステム
小動物用吸入麻酔システムマトリックス07149小動物用ガス麻酔システム
イソフルラン（吸入麻酔薬）リアルワールドデータ217140901吸入麻酔薬
Naisikang 医療用防水弾性テープ (3.81 cm × 4.57 m)ナイシカング™732MRI用肢位固定材
改良型サフラニンO・ファストグリーン染色キット（骨用）Solarbioカタログ番号 G1371軟骨および骨染色キット
持針器リアルワールドデータ（RWD）F21001-12術中クランプおよび縫合
中性樹脂封入剤バイオシャープ23338664組織学的封入剤
酸素翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。吸入麻酔用の搬送ガス
パラフィン埋め込み装置LEICAEG1150Cパラフィン埋め込みシステム
パラフィンミクロトームライカRM2235回転式ミクロトーム
パラフィンワックスエプレディア151534包埋剤
パラホルムアルデヒドSinopharm Reagents Co., Ltd.80096618組織固定剤
リン酸緩衝生理食塩水ServicebioG0002リン酸緩衝生理食塩水
ロータロッド装置PanlabLE8205ロータロード疲労試験システム
小動物超音波イメージングプラットフォーム富士Vevo 3100小動物用超音波診断装置
水酸化ナトリウムShanghai Titan Technology Co., Ltd.G19852H実験用試薬
実体顕微鏡OlympusSZ61解剖顕微鏡
縫合針および縫合糸（6-0吸収性縫合糸および6-0シルク縫合糸）Ningbo Medical Suture Co., Ltd.美容針 1/2 4X12 40術後縫合
外科用メス刃（10番）杭州诺洋生物科技有限公司20090120内側半月板靭帯の切開
組織脱水装置LEICATP1020自動組織処理装置
組織乾燥機ライカHI1220スライド乾燥機
組織包埋ブロック江蘇省石泰REF31050102W包埋用消耗品
組織開展器LEICAHI1210切片伸展システム
超音波解析ソフトウェア (Vevo Lab 3.1.0)光学バージョン 3.1.03次元超音波解析ソフトウェア
超音波用カップリング剤胡清誉湯YY0299-2008超音波用カップリングジェル
ホールスライドスキャナーOlympusVS200デジタルスライドスキャニングシステム
キシレンSinopharm Reagents Co., Ltd.10023418透明化試薬

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