CD90ベースの蛍光活性化細胞選別を用いた甲状腺機能低下マウスマウスの下垂体甲状腺線索の濃縮

サマリー

このプロトコルは、酵素解離とCD90ベースの蛍光活性化細胞選別を用いて、甲状腺機能低下症成マウス下垂体からの甲状腺増殖を記述し、甲状腺強化細胞群の下流分子解析および短期一次培養を可能にします。

要約

甲状腺線は、甲状腺刺激ホルモン(TSH)を分泌し、甲状腺の活動を調節する前垂体にある特殊な内分泌細胞です。TSH分泌は視床下部の甲状腺促進ホルモンによって正に調節され、循環中の甲状腺ホルモンによって負の調節を受けます。甲状腺は下垂体細胞のごく一部(~5%)に過ぎず、その生理学の単離や研究が困難です。ここでは、甲状腺機能低下症の成マウスから甲状腺線素を分離するための強化アプローチを説明します。甲状腺機能低下症は、前垂体の酵素解離とCD90.2表面抗原を用いた蛍光活性化細胞の選別の前に甲状腺プロプス集団の拡大を誘導した。12匹のマウスから前下垂体を処理したところ、約1.5個×10個^の6 個のCD90.2陽性細胞が Tshb メッセンジャーRNA発現に富む細胞が得られました。CD90.2陽性細胞は前下垂体細胞の約25%を占め、CD90.2陰性細胞に比べて約5倍高い Tshb 発現を示し、甲状腺凝血の濃縮が著しく示唆されました。単離細胞は短期培養でも生存可能であり、トリイオドチロニン治療への反応性も維持しました。このプロトコルにより、マウス甲状腺の濃縮と培養が可能となり、下流の分子解析、トランスクリプト解析、エピゲノム解析、生理解析が可能となります。

概要

下垂体は脳の基部に位置する内分泌器官で、ホルモンの恒常性を階層的に制御しています。その活動は視床下部の信号によって調節され、下垂体ホルモンの産生を刺激または抑制し、さらに末梢の内分泌器官の機能を支配します。腺には幹細胞や前駆細胞、分化したホルモン産^{生細胞を含む}多様で動的な細胞集団が含まれています。生理的ストレスや損傷に対して、下垂体幹細胞/前駆細胞は活性化し、自己更新し、複数のホルモン分泌系統に分化することができます ^2,3。構造的には、下垂体は主に2つの葉に分かれています。後葉は下葉と神経分泌末端で構成され、オキシトシンとバソプレシンを放出します。前葉(AL)は、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、副腎皮質刺激ホルモン、そして性腺刺激ホルモンである卵胞刺激ホルモン(FSH)および黄体形成ホルモン(LH)を分泌する特殊な内分泌細胞を含みます。前下垂体には、S100B陽性の濾胞細胞、内皮細胞、ペリサイトなどの非ホルモン細胞も存在し、これらは内^{分泌機能を支}え^{ています。}齧歯類はまた、下垂体中間葉にメラノトロフを含む^7,8。

下垂体の機能、分化、発生への関心は、成虫の下垂体幹細胞および前駆細胞を齧歯類モデルで単離することを目的とした複数のプロトコルの開発を促進してきました。ラットは、より大きな下垂体を持つことで細胞数が多く、^{組織処理時}の回復を促進するため、下垂体生理学の研究で頻繁に利用されています^4,9。一方で、マウスから下垂体細胞を分離することは技術的に困難であり、標準化されたプロトコルも限られています。成人下垂体幹細胞/前駆細胞集合体を用いた最近のプロトコルは、下垂体の発生と機能をモデル化するための有用なツールを提供しています^。しかし、これらのシステムはまだ特定の内分泌細胞集団を直接分離することはできません。前下垂体のホルモン産生細胞タイプの中で、甲状腺線は視床下部-下垂体-甲状腺(HPT)軸の主要な調節因子であり、哺乳類における甲状腺ホルモン(TH)の合成と分泌を制御します。甲状腺多形体によって産生されるTSHは、共通のαサブユニット(CgaによってコードされFSHおよびLHと共有)と受容体特異性を持つβ共通のサブユニット(Tshbによってコード)からなるヘテロジメリック糖タンパク質です。これらの細胞は、循環中のトリヨードチロニン(T3)およびチロキシン(T4)レベルに非常に敏感です。甲状腺機能低下症の際にT3およびT4のレベルが低いと甲状腺素の集団が増加し、甲状腺機能亢進症では古典的な負のフィードバック機構(^11,12,13)によって縮小します。

生理学的に重要な役割を持ちながらも、甲状腺は前垂体細胞のごく一部(約5%)しか占めず、他の内分泌集団と表現型の特徴を共有しているため、研究が依然として困難です。この希少性と堅牢なin vitroモデルの不在により、甲状腺の調節やHPT軸制御の機構的調査は限られています。 TαT1 腫瘍細胞株は一般的に用いられる甲状腺状モデル¹⁴を表しますが、生理学的反応を完全には反映していません。特に、 TshbのT3 依存的な抑制は、その基底転写レベル¹⁵が非常に低いため評価が難しいことが多いです。そのため、多くの研究はHEK293、COS、CV1、GH3、JEG3などの非甲状腺線細胞株が異なる Tshb 構造を発現させることに依存しています¹⁵。しかし、これらは生理学的でない調節アーチファクトを導入し、内因性転写機構ではなくプラスミド骨格によって駆動される効果を導入することがあります。

ここでは、成マウスの下垂体から甲状腺を分離するための段階的なプロトコルを提示します。これは、ラットで確立された方法を応用^{し、マウス}下垂体のより小さいサイズと低い甲状腺含有量に最適化されたものです。Tshb発現細胞の収率向上と信頼性の高い下流解析の確保のために、いくつかの重要な修正が導入されました。このプロトコルは、甲状腺線を豊富に含む表面マーカーである表面抗原CD90の発現を活用しています。CD90(THY1とも呼ばれる)は、インテグリンβ2リガンド(ITGB2)との異型相互作用を通じてユクタクリンのシグナル伝達を媒介するグリコシルホスファチジルイノシトール膜タンパク質^16,17です。CD90は一般的に免疫細胞や神経細胞集団に関連していますが、過去のトランスクリプトミクス研究では甲状腺のThy1富集が確認されました。THY1依存性接触シグナル伝達は造血細胞、T細胞、線維芽細胞、内皮細胞、ニューロンなど多様な細胞タイプで存在し、癒着、移動、アポトーシス、腫瘍抑制、線維化を調節します18,19,20。

重要なのは、ラット前下垂体の単一細胞トランスクリプトプロファイリングにより、Thy1が甲状腺線索5における最も高度に発現した癒着関連遺伝子の一つであることが示^され、THY1が甲状腺線索を豊富に含む表面マーカーであることを示唆しています。さらに、公開されているマウス下垂体単細胞リボ核酸(RNA)シーケンシングデータセットによると、Thy1/CD90の発現は甲状腺トロープに富んでいることが示されています^22,23。しかし、発現はこの系統に限定されるわけではなく、ソマトトロープやラクトトロプを含むPIT1系統細胞のサブセット、さらに前駆細胞様集団でも検出可能です。単細胞トランスクリプトム研究では、PIT1系統の下垂体細胞間で大きな転写重複が認められており、体マトトロープ、ラクトトロプ、甲状腺を生成できる共通のPIT1前駆体集団の同定も^{含まれています。}同様に、Thy1/CD90は甲状腺プロペスト群だけを特定するものではありませんが、マウスの甲状腺形成に用いられます。これらの発見を基に、THY1標的抗体を用いた分離戦略は、甲状腺機能低下症による増殖後の甲状腺線索を濃縮する効果的な方法を提供し、T3に対するホルモン反応の評価を含む機能的研究を可能にします。

プロトコルは、野生型C57BL/6マウスに低ヨウ素食を与え、飲料水中のメチマゾール(MMI)および過塩素酸カリウム(KClO₄)で甲状腺機能を抑制することから始まります²⁵。この治療は1週間以内に著しい甲状腺機能低下症を誘発し、前下垂体におけるTshb発現性甲状腺線素の個体数を増加させます。甲状腺機能低下症下のTSH産生細胞は、過形成、肥大、豊富な空化細胞質、顕著な細胞質突起、リソソームの拡大など、多くの生理学的および形態学的適応を経験し、THフィードバックの欠如への適応を反映しています 26,27,28。したがって、甲状腺機能低下症の誘導は甲状腺プロプス集団を拡大する戦略として用いられます。

甲状腺機能低下症誘導後、マウスはイソフルラン麻酔を受け、Ca²⁺/Mg²⁺フリーHEPESバッファー塩水による心臓灌流を受けて、組織解離中の細胞生存率を最大化します。採取後、前下垂体は穏やかな酵素的消化を受けて単細胞懸濁液を生成し、これをフィコエリスリン・シアニン7共役抗CD90.2抗体と共に培養して蛍光活性化細胞選別(FACS)によって甲状腺を濃縮します。標識された細胞はその後、短期培養用の培地またはRNA抽出用のTRIzolに収集されます。濃縮戦略の検証のために、選別集団で Tshb メッセンジャーRNA発現を測定し、CD90陽性細胞で高度に濃縮していることが確認されました。この手法は、マウスにおける遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトム解析およびエピゲノム解析、ハイスループットアッセイ、一次細胞培養など幅広い応用を支援し、甲状腺の機能とHPT軸の調節の細胞および分子メカニズムの研究に貴重なプラットフォームを提供します。

プロトコル

このプロトコルは、少なくとも1週間の甲状腺機能低下症誘導後に成体マウスから新たに剥離された下垂体から得られた甲状腺のALから甲状腺を分離する方法を記述します。すべての動物処置は、実験動物のケアと使用に関する機関および国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。テキサス大学医療部門の施設動物ケア・利用委員会がすべての動物処置を承認しました。

実験ではオスとメスのマウスをプールさせました。これは、甲状腺線素の収量や下流解析に性別依存的な差が観察されなかったためです。1回の実験で約12匹のマウスが使用されましたが、最大20匹の大規模なコホートは試薬の体積を比例的にスケールすることで処理可能です。

成功する単離は、迅速かつ一貫した灌流、最小の解剖時間、PLの完全な除去、一次細胞の高密度プレート化に依存します。安楽死、灌流、下垂体解離、酵素消化開始までの推奨される最大処理時間は6時間でした。セルは密度2.0–2.5×10個⁵ セル/0.7 cm² (8ウェルガラスチャンバースライドの1つの井戸の表面積)でメッキされました。短期的な甲状腺培養を維持するには最低95%の生存率が必要でした。

単細胞懸濁液生成に用いられるすべての試薬は無菌条件下で調製されました。作業面は70%エタノールで滅菌され、解剖器具は使用前にオートクレーブされ、すべての細胞培養準備工程はバイオセーフティキャビネット内で無菌技術で行われました。このプロトコルは12頭の動物に標準化されました。異なる数のマウスを使う場合は、すべての試薬体積を比例的にスケールしてください。すべての試薬、消耗品、機器については 材料表 を参照してください。

甲状腺機能低下症の誘導時には、マウスは20°C–24°C、相対湿度40%–60%の特定の病原体のない条件下で飼育され、12時間の光と12時間の暗いサイクルと自由に食物と水へのアクセスを行いました。動物は個別に換気されたケージで(1ケージ最大3匹まで)、標準的な寝床や環境環境の充実、巣材やシェルターを備えた個別の換気ケージに収容されました。甲状腺機能低下症の誘導成功は、肝ヨード甲状腺ロニンデヨジナーゼ(Dio1)発現を測定することで確認されました。 Dio1 メッセンジャーRNA(mRNA)発現が正常甲状腺対照マウスと比較して少なくとも50%減少したことは、甲状腺機能低下症誘導の成功を示すと考えられました。

1. C57BL/6マウスにおける甲状腺機能低下症誘導

注意:この手技は7〜10日間にわたり実施し、ヨウ素欠乏食と甲状腺機能の化学的抑制により生体内で甲状腺機能低下症を誘発します。実験デザインについては 図1A 、甲状腺機能低下症誘発の検証については 図1B を参照してください。

図1。C57BL/6マウスにおける甲状腺機能低下症の誘導。 (A) 成体のC57BL/6マウスにおける甲状腺機能低下症を誘発するために用いられた実験ワークフローの概略図。マウスは、ヨウ素欠乏食と共に7日間、飲料水中で0.05%メチマゾール(MMI)および0.1%過塩素酸カリウム(KClO₄)を摂取し、その後下垂体前方隔離を行いました。(B) 正常甲状腺および甲状腺機能低下症マウスにおける肝臓Dio1メッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現の逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)解析。参照遺伝子としてシクロフィリンA(CyA)が用いられました。データは平均±標準偏差(SD)(グループあたりn=6)で提示されます。統計的有意性はStudentのt検定を用いて決定されました。**P < 0.001。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. MMI/KClO₄の飲料水を準備してください
   1. 1gのMMIと2gのKClO₄を2Lのろ過水に溶かします。
   2. 室温(20°C–25°C)で溶液を1時間かき混ぜて完全に溶けるまで加熱します。
      注意:MMIおよびKClO₄は有害化学物質です。準備や取り扱いの際は手袋、白衣、目の保護具を着用してください。
      注:MMIはヨウ化物の組織化を阻害するのに対し、KClO₄はナトリウム–ヨウ化物シンポ^ーター25を通じたヨウ化物の取り込みを阻害します。適切な用量を維持し、寝具や食べ物の残骸、微生物の増殖による汚染を最小限に抑えるために、2日ごとに飲用液を交換してください。すぐに使用しない場合は、4°Cの密閉された耐光容器で最大14日間保存してください。
2. 誘発性甲状腺機能低下症
   1. 8週間齢のオスまたはメスのC57BL/6マウスを、ヨウ素フリーの飼育環境の下、ケージごとに最大3匹のグループで飼育します。
      注意:マウスは、20°C–24°C、相対湿度40〜60%の特定の病原体なし環境で飼育し、12時間の光と12時間の暗いサイクルで、自由に餌や水を得てください。動物は個別に換気されたケージに、標準的な寝具や環境の充実、巣材やシェルターを備えて飼育してください。治療を開始する前に3日間動物を慣らしてください。オスとメスのマウスを別々に飼育しています。ここで述べた実験では、安性甲状腺群は6人の男性と6人の女性で構成され、それぞれ別のケージに収容されていました。甲状腺機能低下症グループは、別々のケージに6人の男性と6人の女性で構成されていました。細胞調製中に同一処理群内のオスとメスマウスのALをプールしました。これは甲状腺の収量や下流解析に性別依存的な差が観察されなかったためです。
   2. ヨウ素不足の食事を7〜10日間自由に与えてください。
      注意:ヨウ素欠乏食とMMI/KClO₄治療を同時に開始してください。
   3. 治療期間中は、0.05%MMIおよび0.1%KClO₄を含む飲料水を自由に提供してください。
      注意:安楽死まで治療を継続してください。甲状腺機能低下症誘発中は、体重、食事、水分摂取、臨床症状を毎日監視してください。甲状腺機能低下症の誘発に成功すると、体重増加の減少や活動の低下、毛皮の鈍さなどの臨床症状が正常な甲状腺対照群と比較して一般的に見られます。7日間および10日間の誘導期間は、甲状腺凝生の濃縮効率が同等です。

2. 心臓灌流およびALの解離

注意:この処置は、組織の生存率を最大化し、下垂体隔離中の細胞の完全性を保つために、マウス1匹あたり約15分で実施してください。

1. 灌流および収集液の準備
   1. Ca²⁺およびMg²⁺を含まないHEPES緩衝生理食塩水溶液(HBSS)を準備します
      1. 0.9%NaCl667mL、1M HEPES20mL、二重蒸留水(ddH₂O)313mLを組み合わせて、Ca²⁺ およびMg²⁺を含まないカスタム調製HBSS1Lを調製します。
      2. 溶液をオートクレーブし、使用まで4°Cで保存します。
   2. Ca²⁺およびMg²⁺を含まないヘパリン化HBSSを製製します
      1. Ca²⁺ およびMg²⁺を含まないカスタム調製HBSS50 mLに27 μLのエノキサパリンナトリウム(100 mg/mLのストック溶液)を加えます。
   3. 収集培地(CM)を準備する
      1. 440 mLのDulbecco's modified Eagle培地、50 mLの熱不活化胎児用牛血清(FBS)、4 mM L-グルタミン、10 mLの1 M HEPESを組み合わせて、最終的な容量を500 mLにします。
      2. 0.22μmのフィルターを使って溶液をろ過滅菌し、4°Cで最大1か月間保存します。
         注意:保管前にバイオセーフティキャビネットの下で50mLのアリコートを準備し、汚染を最小限に抑えてください。
      3. 使用前にCMを20°C〜25°Cまで温めてください。
   4. 解剖器具を滅菌する
      1. 使用前にハサミ、鉗子、ピンセット、針ホルダー、虹彩鉗子、手術用スプーン、鈍いプローブを75%エタノールで消毒してください。
         注意:組織接触前にエタノール滅菌後、器具を完全に自然乾燥させてください。
2. 心臓灌流を実施
   1. 100%酸素で投与されたイソフルランを使ってマウスを深く麻酔します。5%イソフルランのチャンバーで麻酔を誘導し、3%イソフルランの鼻錐体で持続的な麻酔を維持し、継続的なモニタリングと廃ガスの除去を行います。
      注意:イソフルラン麻酔は施設の安全ガイドラインに従い、吸入曝露を最小限に抑えるために適切なスカベンジングシステムを使用してください。
   2. 足の指をつまんでペダルの離脱反射がないことを確認することで、完全な麻酔を確認しましょう。
   3. 動物に75%エタノールをスプレーし、収集パン内の灌流段階に置きます。
   4. 四肢を固定して腹膜を露出させます。
   5. 主要な臓器や血管の損傷を避けつつ、胸腔を慎重に開けてください。
   6. 肋骨に沿って切って胸のフラップを作り、フラップを頭の上に折りたたみ、止血鉗で固定します。
   7. クランプで心臓を安定させ、左心室の頂点に23ゲージの針を挿入します。
   8. シリコーンチューブを使って針を蠕動ポンプに接続します。
   9. Ca²⁺ およびMg²⁺ を含まないヘパリン化HBSSによる灌流を室温で開始します。
   10. 灌流が始まった直後に右心房を切開し、排膿を可能にしてください。
   11. 3 mL/minの流量で5分間動物を灌流します。
       注意:肝臓の目に見える青白さを観察して灌流の成功を確認してください。
3. ALを孤立させる
   1. 灌流後すぐにネズミの首を切り落とす。
   2. 細かい解離用のハサミと鉗子を使って頭皮と頭骨を切除し、脳を露出させます。
   3. 脳と頭蓋骨の間に手術用スプーンを挿入します。
   4. 脳を優しく持ち上げて視交叉を切ってください。
   5. 細いピンセットで立体顕微鏡で下垂体を覆う薄い髄膜(硬膜)を除去します。
   6. 図2Aに示すようにPLを慎重に分解し、破棄します。
      注意:ALは前縁にある大きなピンク色の組織として特定してください。PLは背側に位置する小さな白く半透明な組織として特定します。
   7. 鈍いプローブで周囲の結合組織や残存髄膜をトリミングし、ALへのアクセスを改善します。
   8. ALを鈍いピンセットで掴み、1.8 mL CM入りの15 mLポリプロピレン管に移します。
      注意:12匹の動物のALを同じ採集チューブにまとめてください。
   9. すべての解剖が完了するまで、サンプルは室温で保管してください。
      注意:細胞の生存能力低下を最小限に抑えるため、組織採取から酵素消化開始まで3時間を超えないようにしてください。
4. 甲状腺機能低下症誘発の確認
   1. 各マウスから約50mgの少量肝臓サンプルを採取します。
   2. 肝臓の Dio1 mRNA発現をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応で定量し、未処理の真甲状腺対照群と比較してください(図1B)。
      注意:甲状腺機能低下症誘導の成功とは、正常甲状腺対照群と比較して肝臓の Dio1 発現が少なくとも50%減少したことと定義します。 Dio1 の発現は循環^中のTHレベルと正の相関を示します。したがって、 Dio1 発現の低下は甲状腺機能低下症の成功を裏付けます。
5. 繰り返し組織採取
   1. ステップ2.2–2.4を繰り返します。12匹のマウスからALが採取されるまで。
   2. すぐにステップ3に進みましょう。

図2。マウス前下垂体からの単細胞懸液の調製。 (A) 前葉(AL)の剥離、酵素解離、蛍光活性化細胞選別(FACS)用の単一細胞懸濁液の準備を示すワークフロー。ワークフローには、後葉の除去、コラーゲン酵素の消化、トリプシン-エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)の消化、そしてFACS分析前のろ過が含まれます。(B) 真甲状腺マウスおよび甲状腺機能低下症マウスの解離した前下垂体細胞の生存性染料染色および自動細胞計数の代表画像。細胞の総収量と生存細胞濃度が示されています。スケールバー = 200μm。(C) 組織解離後の前下垂体細胞径の分布および下流FACS解析準備。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。 

3. マウスALからの単細胞懸濁液の調製

注意:この手順は約60分で行い、前下垂体組織から単細胞懸濁液を生成します。

1. 酵素分解液を準備する
   1. 2%コラーゲン酵素溶液を準備します
      1. クロス トリジウム・ヒストリチカム から100 mgのコラーゲナーゼ(>125コラーゲン酵素分解単位/mg固形物)を4.9 mL ddH₂Oに溶かします。
      2. 100μLの1 M HEPESを加えて最終体積5 mLにします。
      3. 0.22μmフィルターを使って溶液を滅菌します。
      4. 溶液を200μLの容量に分割し、−30°Cで最大2か月間保存します。
         注意:繰り返しの凍結解凍サイクルは避けてください。解凍したコラーゲンアリコートは再利用しないでください。
   2. 0.25%トリプシン-エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を製製します
      1. 0.5%トリプシン–EDTA1mLと、Ca²⁺ およびMg²⁺を含まないHBSS1 mLを混ぜます。
      2. 使用まで4°Cで保存してください。
         注意:調合当日には希釈したトリプシン–EDTA溶液を使用してください。希釈されたトリプシン–EDTAを保存または再利用しないでください。
2. コラーゲナーゼ消化を行う
   1. 収集したAL組織に2%コラーゲン酵素溶液200 μLを加えます。
   2. 低保持先端を装着したP1000マイクロピペットでピペットで組織を優しく混ぜます。
   3. 懸濁液を37°Cの水浴で15分間孵化させます。
      注意:培養中はチューブキャップを閉じて汚染を最小限にしてください。
   4. 孵化中は5分ごとにチューブを優しく叩いてください。
3. デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)の消化を行います
   1. 上清液を除去せずに、5 μL DNase I(1 U/μL)を直接懸濁液に加えます。
   2. チューブを10回優しく叩いて溶液を混ぜます。
   3. 懸濁液を37°Cで5分間孵化します。
4. 組織にペレットを塗る
   1. 懸濁液を100× gで室温で5分間遠心分離します。
   2. 1 mLピペットで上清液を慎重に除去します。
      注意:上清液除去時には、細胞損失を最小限に抑えるため、ペレットの上に約50μLの残留液体を残してください。
5. トリプシン消化を行う
   1. ペレットに0.25%トリプシン–EDTAを2 mL加えます。
   2. 懸濁液を37°Cで10〜15分間培養し、完全な組織断片が見えなくなるまで放置します。
      注意:過剰な組織消化や細胞生存率低下を避けるため、15分を超えないようにしてください。
6. 酵素による消化を止め、組織を解離させます
   1. トリプシン化を止めるために2mLのCMを追加してください。
   2. 懸濁液を1mLに設定したマイクロピペットで、組織断片が見えなくなるまで上下にピペットします。
      注意:機械的解離中は低保持型ピペットチップを使用してください。許容される単一細胞懸濁液とは、主に単一細胞で構成され、目に見える集まりや破片が最小限(顕微鏡検査でトリパンブルー排除法による≤5%–10%の塊)を含む均一で低粘度の懸濁液です。
7. 単一セル懸濁液を回収してください
   1. 懸濁液を100× gで室温で5分間遠心分離します。
   2. 上澄液を慎重に除去してください。
   3. すぐにステップ4に進みましょう。
      注意:単一細胞懸濁準備から15分以内に染色を開始し、可能な限り1時間以内に細胞の完全な選別を行ってください。この期間中は細胞を氷上に置いて生存能力低下を最小限に抑えましょう。

4. 蛍光活性化細胞の選別のための染色

注意:この処置は約60分以内に行い、CD90陽性細胞のFACSのために解離した前下垂体細胞を染色します。

1. セルサスペンションの準備を
   1. 細胞ペレットにリン酸塩緩衝塩水(PBS、1×)を含む2%のFBSと0.09%のアジ化ナトリウムを含む350μLの染色バッファーを加えます。
   2. P1000マイクロピペットに低保持チップを装着し、ピペットを上下に10回優しく再懸浮させて単一細胞懸濁液を得ることができます。
   3. 懸濁液を1.5 mLの低結合マイクロ遠心分離機チューブに移します。
2. 細胞濃度と生存率の測定
   1. 細胞数計のために懸濁液から5μLのアリコートを除去します。
   2. アリコートに5μLの生存染料を混ぜます。
   3. 10μLの混合物を自動セルカウンターに注入します。
      注意:細胞の生存率が生存性染料排除によって≥85%となり、残骸や細胞集合体が最小限に観察された時点でFACSに進みます。
   4. 全細胞濃度が約1×10⁷ cells/mL、甲状腺機能低下症サンプルで約×1 10⁷ cells/mLであることを確認してください(図2B)。解離後の細胞サイズ分布は 図2Cに示されています。
3. 補償管理の準備
   1. 細胞懸濁液の50μLを300μLの染色バッファーに移します。
   2. 懸濁液を100μLのアリコートを3つに分け、別々の1.5 mLマイクロ遠心分離機管内に設置します。
   3. 以下の対照を準備します:(i) 染色されていない対照群、(ii) ヨウ化プロピジウム(PI)のみの対照群、(iii) フィコエリスリン-シアンニン7(PE-Cy7) CD90.2のみ対照群。
4. 細胞を染色する
   1. 300μL細胞懸濁液に3μLのPE-Cy7結合抗CD90.2抗体を加えます。
      注:抗体濃度は事前の滴定実験によって決定されました。最終希釈は1:100で、正と陰の集団の最適な分離を実現し、背景染色を最小限に抑えました。
   2. CD90.2補償対照に1μL抗体を加えると、最終的な希釈率は1:100となります。
   3. すべてのサンプルは暗闇の氷上で30分間孵育します。
      注意:培養中は10分ごとに優しく混合し、均一な染色を保ってください。
5. 染色されたセルを洗いましょう
   1. 各チューブに1mLのコールドステインバッファーを加えます。
   2. サンプルを210 × gで室温で5分間遠心分離します。
      注意:可能であれば、減速中のセルペレットの破壊を最小限に抑えるために遠心分離機ブレーキを無効にしてください。
   3. 上澄液を慎重に取り除き捨ててください。
6. 染色セルを再懸垂させる
   1. 主セル懸濁液を300μLの染色バッファーに再懸浮させます。
      注意:選別直前にPIを最終濃度1 μg/mLに加えてください。
   2. 各補正コントロールを100μLの染色バッファーに再懸吊します。
7. セルの懸濁液をろ過してください
   1. 選別直前に、35μmのセルストレーナーを装着したフローサイトメトリーチューブを通して細胞懸濁液をろ過します。
8. 蛍光活性化細胞の選別に進みます
   1. すぐにステップ5に進み、蛍光活性化細胞選別機を使って染色された細胞を選別します。

5. FACSのゲートおよび仕分け戦略

注意:この手技は約60分以内に実施し、FACSによって有効なCD90.2陽性甲状腺線を単離してください。

1. セルソータの設定
   1. セルソーターに100μmノズルを取り付けてください。
   2. シース圧力を20 psiに設定してください。
      注意:室温で保温された無菌PBSベースのシース液を使用してください。
2. 計器の品質管理を行う
   1. サンプル採取前に製造者の指示に従って機器の品質管理手順を実行してください。
      注:代替セルソーターには、メーカー推奨の同等品質管理ワークフローが使用される場合があります。
   2. キャリブレーションビーズを使ってドロップ遅延とストリームの安定性を検証します。
3. 蛍光補償を行う
   1. 単色補正制御を導入してください。
   2. ゲートと選別の前に蛍光補償を行います。
      注意:補償は染色なしおよび単染色対照群を用いて計算してください。必要に応じてソートする前に、補償マトリックスを手動で確認・調整してください。
4. ゲート戦略の定義
   1. 前方散乱および側散乱パラメータを用いてデブリを除外します(図3A,B)。
   2. 前方散乱の高さと前方散乱面積、および側散乱の高さと側散乱面積を用いるゲート単一セル(図3A,B)。
   3. PI陰性細胞をゲート化して死んだ細胞を除外します。
   4. 甲状腺線の強化のためのゲートCD90.2陽性細胞。
      注:CD90.2陽性細胞を、CD90検出チャネルで蛍光強度が10³ を超えるイベントと定義します(図3C–F)。
5. 収集チューブの準備
   1. 下流の用途に応じて収集チューブを準備してください。
      注意:RNA分離用に1mLのQIAzol溶解試薬、または10%炭除去した胎児用牛血清を補足したMedium 199を充填して細胞培養用に準備してください。
6. CD90.2陽性甲状腺線の分類
   1. CD90.2陽性の単細胞を採取チューブに分類します。
   2. RNA解析のための細胞採取
      1. 細胞を直接1mLの溶解試薬に集めます。
      2. チューブを1分間ボルテックスして細胞を溶解させます。
      3. サンプルはすぐにドライアイスで冷凍します。
      4. RNA抽出まで−80°Cの環境でサンプルを保存します。
   3. 一次培養のための細胞採取
      1. 細胞を培養培地に採取し、10%の炭を抜いた胎児用牛血清と1%のペニシリン・ストレプトマイシンを補足します。
      2. 細胞を8ウェルのガラスチャンバースライドに、最終体積200 μLの密度で少なくとも200 μL×10⁵ セル/ウェルにシードします。
      3. 細胞を5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで37°Cで最大72時間培養します。
         注:適切な培養性能は、24時間以内に細胞の付着が目に見えること、付着効率が約60%–80%、72時間後の生存率≥70%–80%)によって示されます。
      4. 必要に応じて培地に100 nM T3を加えます。
         注意:細胞結合後、通常は板付け後24時間以内にT3処理を開始し、72時間のサンプル採取まで処理を継続してください。40 mM NaOHでT3ストック溶液を準備し、同じ最終溶媒濃度で車両処理済みの対照群も含めます。
         注:木炭ストリップド血清はTH枯渇培養環境を維持し、実験的に誘導された T3依存性Tshb 発現抑制の検出を改善します。

図3。FACSゲーティング戦略と甲状腺線骨増強の検証。 (A,B)生存可能な前下垂体細胞を単離するために用いられる逐次ゲーティング戦略。ゲートには、前方散乱面積(FSC-A)および側散乱面積(SSC-A)を用いたデブリ除去、前方散乱高(FSC-H)とFSC-Aおよび側散乱高(SSC-H)とSSC-Aを用いたシングルレット識別、そしてプロピジウムヨウ化物(PI)陽性の死細胞の除外が含まれます。(C–F)フィコエリスリン-シアニン7(PE-Cy7)結合抗CD90.2抗体を用いたCD90.2陽性およびCD90.2陰性細胞群の同定と濃縮を示す代表的なFACSプロット。(G–I)選別細胞集団における甲状腺トロープ濃縮の逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)検証。略称:FSC-A、前方散乱領域;SSC-A、側散乱領域;FSC-H、前方散乱高度;SSC-H、サイド散乱高度;PI、プロピジウムヨウ化物;PE-Cy7、フィコエリスリン・シアニン7;神経発達異常(NT)で治療を受けていない。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. CD90陽性細胞とCD90陰性細胞における Tshb mRNAの遺伝子発現解析(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による解析)

注意:この手順は約5時間以内に実施し、選別された細胞集団における Tshb mRNA発現を定量します。

1. RNA抽出のために選別細胞を収集する
   1. CD90陽性細胞と陰性細胞(2.5×10細胞5細胞)を1.5mLの別管に集め、1mL溶解試薬を装填します。
2. 細胞を溶解する
   1. サンプルを1分間激しく巻き、細胞を完全に溶除して氷の上に置きます。
      注意:必要に応じてRNA抽出前に−80°Cで溶解サンプルを保管してください。
3. 全RNA抽出
   1. 製造元のRNA抽出キットに付属する指示に従って、総RNAを抽出してください。
      注意:製造元の指示に従い、RNaseフリーDNase Iを使用してDNaseの消化を行い、浸出前に残留ゲノムのデオキシリボ核酸(DNA)を除去してください。
   2. 分光光度計を使ってRNA濃度を測定します。
      注意:補完的なDNA(cDNA)合成には、A260/A280比率が約1.8–2.1、A260/A230比率が1.8を超えるサンプルを使用してください。
4. cDNA合成
   1. 製造元のファーストストランドcDNA合成キットに付属する指示に従い、総100 ngのRNAからcDNAを合成します。
      注意:cDNA合成時にはオリゴ(dT)プライマーを使用してください。
   2. 表1に従ってテンプレート-プライマー混合物を準備します。
   3. 試薬を優しく混ぜ、短時間遠心分離機でチューブの底からサンプルを採取します。
   4. テンプレートとプライマーの混合物を65°Cで10分間変性させます。
   5. サンプルはすぐに氷で冷やしてください。
   6. 表2に従って逆転写反応混合物を準備し、最終体積20 μLを得ます。
      注意:マスターミックスは、 表2 に記載された試薬体積をサンプル数の総数で掛け、ピペッティングの変動を考慮して余剰体積10%を加えて準備します。
   7. 反応を渦巻かせずに優しく混ぜ、短時間遠心分離機で行います。
   8. 反応を50°Cで60分間培養します。
   9. 反応を85°Cで5分間不活性化します。
   10. サンプルは氷で冷やします。
   11. 直接逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を行うか、cDNAを−30°Cで保存して使用してください。
       注:cDNAはヌクレアーゼフリー条件下で−30°Cで最大6か月間保存可能です。繰り返される凍結と解凍のサイクルは避けましょう。
       注意:蒸発を最小限に抑えるために、加熱蓋付きのサーモサイクラーでcDNA合成の工程を行います。
5. RT-qPCR反応混合物を準備します
   1. 表3に従ってRT-qPCR反応混合物を準備します。
6. RT-qPCRプレートをロードしてください
   1. 96ウェルプレートの各ウェルに9μL RT-qPCR反応混合物を加えます。
   2. 入力された総RNA5 ngから生成された逆転写産物に対応する1 μL cDNAテンプレートを追加します。
   3. サンプルを優しく混ぜ、短時間遠心分離機で動かします。
7. RT-qPCRを実施
   1. SYBRグリーンマスターミックスに付属するメーカーの指示に従ってRT-qPCRを実施してください。
      注意:最初の変性ステップは95°Cで2分間、その後95°Cで5秒、60°Cで30秒の40サイクルを用いてください。各延長ステップの最後に蛍光を獲得します。65°Cから95°Cまでの溶融曲線解析を0.5°C単位で行い、単一生成物の増幅を検証します。
8. Tshb発現を正規化する
   1. ΔCt法を用いて Tshb 発現をシクロフィリンA(CyA)発現に正規化します。
      注:解析前に CyA の安定性を検証し、実験群間でのCtの変動が最小であることを確認しましょう。
9. 相対的な遺伝子発現を計算する
   1. 2^−ΔΔCt法を用いて、CD90陽性細胞とCD90陰性細胞の相対的なTshb発現を計算します。
      注:技術的重複反応で分析された8つの生物学的サンプルを用いてRT-qPCR解析を行います(図3G–I)。

試薬	音量	最終量/濃度
総RNA	可変	100 ng
固定オリゴ(dT)18プライマー(50 pmol/μL)	1 μL	2.5 μM
PCRグレードの水	可変	総体積を13μLに調整してください
合計	13 μL	—

表1:補完的デオキシリボ核酸合成のためのテンプレート–プライマー混合物の調製。 テンプレート–プライマー混合物を補完的デオキシリボ核酸(cDNA)合成のために準備するために用いられる試薬、体積、最終量。各反応には100 ngの総リボ核酸(RNA)、固定されたオリゴ(dT)18プライマー、および最終体積13 μLに調整されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)級水が含まれていました。報告された2.5μM濃度は、逆転写反応成分を加える前の13μLテンプレート–プライマー混合物中のプライマー濃度を指します。

試薬	音量	最終量/濃度
転写母逆転写酵素反応バッファー(5×)	4 μL	1×
プロテクターRNase阻害剤(40 U/μL)	0.5 μL	20 U
デオキシヌクレオチド混合物(10 mM)	2 μL	それぞれ1 mM
トランスクリプトリバーストランスクリプトターゼ(20 U/μL)	0.5 μL	10 U
テンプレート–プライマー混合物(表1)	13 μL	—
合計	20 μL	—

表2:補完的なデオキシリボ核酸合成のための逆転写反応混合物。 第一鎖相補性デオキシリボ核酸(cDNA)合成に使用される試薬、体積、最終濃度。最終反応容積は20μLでした。報告されたデオキシヌクレオチド三リン酸濃度(それぞれ1 mM)は、完全な反応混合物中の最終濃度を指します。

試薬	音量	最終量/濃度
PowerTrack SYBR グリーンマスターミックス(2×)	5 μL	1×
Tshbの順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー(材料表参照)	0.5 μL	400 nM
PCRグレードの水	3.5 μL	反応量を9μLに調整してください
小計反応体積	9 μL	—
cDNAテンプレート	1 μL	5 ng
最終反応体積	10 μL	—

表3:逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応混合物の調製。 Tshbメッセンジャーリボ核酸(mRNA)の逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)増幅に使用される試薬、体積、最終濃度。テンプレート添加前の反応混合物体積は9μLでした。増幅直前に相補性デオキシリボ核酸(cDNA)テンプレートを1μLに加え、最終反応体積は10μLとなりました。

結果

8週齢のC57BL/6マウス12匹(オス6匹、メス6匹)は、MMIおよびKClO₄を飲料水中で投与し、ヨウ素欠乏食を1週間にわたり行って甲状腺機能低下症を誘発しました(図1A)。肝1型 Dio1 mRNA発現を正常甲状腺および甲状腺機能低下症マウスで定量し、甲状腺機能低下症誘導の成功を確認しました²⁹。甲状腺機能低下症マウスは、正常甲状腺対照群と比較して肝臓 Dio1 mRNA発現が約60%減少し、甲状腺機能低下症誘導の成功を裏付けました(図1B)。

マウスALから単一セルサスペンションを準備するワークフローの概説は図2Aに示されています。12匹のマウスから集めたALから単細胞懸濁液を作製したものは、甲状腺機能低下症状態で約2 × 1...

ディスカッション

ここで述べるCD90ベースのFACSプロトコルは、成マウスの下垂体組織から一次甲状腺素を濃集しつつ、ホルモン応答性を維持できる再現可能な方法を提供します。この方法は、甲状腺線素幼体生物学およびHPT軸調節の研究における長年の技術的制約に対応しています。歴史的に、甲状腺の調節の研究は主にTαT1細胞株に依存してきました。しかし、TαT1細胞は非常に低い基礎Tshb発現を示し、標準的なT3介在性抑制を一貫して示さないため、生理学的関連性が制限されています(14,15,20)。HEK293、COS、GH3、JEG3などの非甲状腺線細胞株におけるTshbレポーター構造体を用いた異質システムは、生理学的でない調節文脈を導入し、非内因性エンハンサー–プロモーター相互作用によるアーティファクトを引き起こす可能性があります¹⁵

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 µm フィルター	Corning	430769	培地滅菌用
0.22 µm シリンジフィルター	Pall Life Sciences	PN4602	コラーゲナーゼ滅菌用
0.5% トリプシン–EDTA	Gibco	15400-054	細胞解離用
1.5 mL ローバインドマイクロ遠心管	Invitrogen	AM12450	FACS 染色用
15 mL ポリプロピレン管	Falcon	352097	前葉収集および細胞解離用
23ゲージ針	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	心臓灌流用
8ウェルガラスチャンバースライド	Millipore	PEZGS0816	FACS 後の培養用
Accudrop ビーズ	BD Biosciences	345249	FACS 中のドロップ遅延校正用
抗マウス PE-Cy7 抗 CD90.2 抗体	Invitrogen	25-0902-82	FACS 染色用
自動細胞カウンター	DeNovix	s-10700	細胞数算定用
チャコール処理胎牛血清	Gibco	12676029	FACS 後のサイロトロープ培養用
Clostridium histolyticum 由来のコラーゲナーゼ	Sigma-Aldrich	C9263	細胞解離用
収集パン	標準的な実験室解剖トレイ	N/A	心臓灌流用
カスタム調製の HEPES 緩衝生理食塩水溶液 (HBSS) 無 Ca2+ および Mg2+	N/A	N/A	灌流および細胞解離用
サイクロフィリン A (CyA) オリゴヌクレオチドプライマー フォワード	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	RT-qPCR 用
サイクロフィリン A (CyA) オリゴヌクレオチドプライマー リバース	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	RT-qPCR 用
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	培地用
DNase I 溶液	Promega	M6101	細胞解離用
エノキサパリンナトリウム注射液	Sandoz	0781-3119-64	灌流用
胎牛血清 (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	培地用
フローサイトメトリー染色バッファー	Invitrogen	00-4222-26	FACS 染色用
止血鉗子	Fine Science Tools	13008-12	胸腔安定化用
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	培地用
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	HBSS 調製用
ヨウ素欠乏食	Envigo	TD.95007	in vivo 甲状腺機能低下症誘導用
虹彩鉗子	Fine Science Tools	11065-07	下垂体解剖用
イソフルラン	Piramal Critical Care	66794-017-25	麻酔用
L-グルタミン	Gibco	35050-061	培地用
Medium 199	Gibco	11150-059	FACS 後の培養用
メチマゾール (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	in vivo 甲状腺機能低下症誘導用
MicroAmp Fast 96ウェル反応プレート	Applied Biosystems	4346907	RT-qPCR 用
ペニシリン–ストレプトマイシン	Gibco	15140122	FACS 後の培養用
蠕動ポンプ	Fisher Scientific	GP1000	心臓灌流用
過塩素酸カリウム (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	in vivo 甲状腺機能低下症誘導用
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	RT-qPCR 用
プロピジウムヨウ化物	eBioscience	00-6990-50	FACS 中の生存率染色用
QIAzol 溶解試薬	Qiagen	79306	RNA 抽出用
シリコーンチューブ	Cole-Parmer	EW-96410-13	心臓灌流用
ステレオ顕微鏡	Nikon	SMZ-745T	前葉解剖用
StepOnePlus リアルタイム PCR システム	Applied Biosystems	4376600	RT-qPCR 用
手術スプーン	Fine Science Tools	10090-13	下垂体露出中の脳リフティング用
Transcriptor First Strand cDNA 合成キット	Roche	4379012001	cDNA 調製用
トリュパンブルー	Thermo Fisher Scientific	T10282	細胞数算定用
Tshb オリゴヌクレオチドプライマー フォワード	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	RT-qPCR 用
Tshb オリゴヌクレオチドプライマー リバース	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	RT-qPCR 用
水浴	Fisher Scientific Isotemp 水浴	15-462-5Q	酵素消化用