このレトロスペクティブな症例対照研究では、多嚢胞性卵巣症候群の女性における血清miR-146a、miR-642a、miR-2861および代謝マーカーを評価しました。miRNA、アディポカイン、インスリン抵抗性、炎症、およびテストステロンに協調的な変化が観察され、複合バイオマーカーモデルは個々のマーカーよりも高い識別能を示しました。
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このレトロスペクティブな症例対照研究では、多嚢胞性卵巣症候群の女性における血清miR-146a、miR-642a、miR-2861および代謝マーカーを評価しました。miRNA、アディポカイン、インスリン抵抗性、炎症、およびテストステロンに協調的な変化が観察され、複合バイオマーカーモデルは個々のマーカーよりも高い識別能を示しました。
多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）は、生殖年齢の女性に多く見られる内分泌および代謝異常である。しかし、血中マイクロRNA（miRNA）と栄養関連タンパク質との関係については、まだ十分に解明されていない。本研究では、PCOSにおける血清miR-146a、miR-642a、およびmiR-2861と、代謝および炎症マーカーとの関連を調査した。対象は、PCOS女性62名および健康な対照群71名とした。血清miR-146a、miR-642a、miR-2861を定量リアルタイムPCRで測定し、同時にアディポネクチン（ADPN）、レプチン（LEP）、レチノール結合タンパク質4（RBP4）、インスリン抵抗性定量的に評価する指標（HOMA-IR）、インターロイキン-6（IL-6）、およびテストステロン（T）についても評価した。方法論的な検証では、試料処理条件、アッセイの精度、および分析手法間の整合性を評価した。対照群と比較して、PCOS女性ではmiR-146aの発現が上昇し、miR-642aおよびmiR-2861の発現は低下していた。ADPN値は低下し、一方でLEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6、およびT値は上昇していた。miR-146aはADPNと負の相関を示し、LEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6、およびTと正の相関を示した。miR-642aはRBP4、HOMA-IR、およびIL-6と負の相関を示し、miR-2861はADPNと正の相関を示した。方法論的な検証により、アッセイの安定性、精度、および手法間の整合性は許容範囲内であることが示された。これら3つのmiRNAにADPN、LEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6、およびTを組み合わせたモデルでは、曲線下面積（AUC）0.929、感度82.26%、特異度94.37%を達成した。これらの知見は、PCOSにおいて血中miRNAと代謝マーカーが協調的に変動することを示しており、それらを組み合わせた診断能のさらなる評価を支持するものである。
PCOSは、生殖年齢の女性において最も一般的な内分泌および代謝疾患です。世界的な有病率は6%から20%の間であると推定されています。罹患した女性の約70%にインスリン抵抗性が認められ、半数以上が過体重または肥満です1。PCOSは、排卵機能障害、不妊症、2型糖尿病、心血管疾患、およびその他の長期的合併症を引き起こす可能性があり、それによって生殖健康とクオリティ・オブ・ライフに深刻な影響を及ぼします2。その病態生理は完全には解明されていませんが、一般的にPCOSには、遺伝的感受性、慢性の低グレード炎症、インスリンシグナル伝達経路の異常、および卵巣局所微小環境の破壊を含む複数の要因が関与していると考えられています。このような背景から、疾患の進行を反映する特異的な分子マーカーを特定することは、PCOSの早期診断および精密な介入において明白な価値があります3,4。
MiRNAは、長さ約22ヌクレオチドの非コードRNAの一種である。これらの分子は、mRNAの分解を促進するか、あるいは翻訳を抑制することによって、転写後の遺伝子発現を調節する。したがって、これらの分子は、細胞増殖、分化、炎症反応、代謝調節を含む多くの細胞プロセスにおいて極めて重要である5,6。先行研究では、PCOS患者の血清においてmiR-146a、miR-642a、およびmiR-2861の特徴的な調節不全が示されている。miR-146aの上昇は、TLR4/NF-κB経路の標的調節を通じて慢性炎症反応を媒介する可能性があり7、一方でmiR-642aおよびmiR-2861の発現低下は、インスリン抵抗性や卵巣顆粒膜細胞機能の低下と密接に関連している8,9。栄養に関連するタンパク質であるADPN、LEP、およびRBP4は、代謝バランスの調節において重要な役割を果たす。これらのレベルの変化は、脂質の処理方法、体のインスリン感受性、および炎症状態に直接影響を及ぼす。これは、PCOSに見られる代謝問題の分子基盤の主要な部分であると考えられている10,11。しかし、発表されている研究のほとんどは、PCOSに関連してmiRNAまたは栄養関連タンパク質のいずれかを個別に検討しており12,13、両者の分子的な関係はまだ体系的に解明されていない。
本研究では、PCOS患者における3種類のmiRNAおよび6つのコアバイオマーカーの発現レベルを測定し、これらのマーカー間の相関および臨床生化学的指標との関連性を分析しました。さらに、栄養関連タンパク質との関連を通じて、miRNAがPCOSの病理学的プロセスに関与している可能性について検討しました。本研究の知見は、PCOSの分子基盤に関する現在の理解を深め、栄養および代謝調節を目的とした治療の潜在的な標的を提供し、PCOSの早期スクリーニング、有効性モニタリング、および個別化管理のための実験的根拠となる可能性があります。
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倫理声明
本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、贛州中医医院医学倫理委員会の承認を得た（承認番号：GZSZYYKYLL20240092、日付：2024-12-20）。
本プロトコルで使用したすべての材料、試薬、アッセイキット、および機器は、材料表に記載されています。
研究デザイン
本レトロスペクティブ・ケースコントロール研究では、2024年6月から2025年8月の間に赣州中医医院の婦人科外来で診断されたPCOS患者62名と、同期間に同院の健康管理センターで受診した生殖年齢の健康な女性71名を対象とした。対照群は年齢においてグループレベルの比較可能性を確保するように選定した。BMIはマッチング変数として使用せず、ベースライン特性として評価した。
被験者
組み入れ基準：PCOS群の組み入れ基準は以下の通りとした：(1) 年齢 >18歳以上であること。（2）2023年国際エビデンスベースドガイドラインで承認された修正ロッテルダム基準によるPCOS（多嚢胞性卵巣症候群）の診断を受けていること。具体的には、関連疾患を除外した後、以下の3つの特徴のうち少なくとも2つを満たす必要がある：(1) 希発排卵または無排卵（月経周期が35日より長い、あるいは年間周期が8回未満と定義される）、(2) 臨床的高アンドロゲン血症および／または生化学的高アンドロゲン血症（生化学的高アンドロゲン血症は、血清総テストステロン濃度が測定法固有の上限基準値を超えていることと定義される）、(3) 多嚢胞性卵巣形態（片側卵巣に20個以上の卵胞が認められること、または完全な卵胞計数が不可能な場合は卵巣体積が10 mL以上であることと定義される）。14(3) 電子カルテが完備していること、(4) 過去3か月間にホルモン補充療法、血糖降下剤、または免疫抑制剤の投与がないこと、(5) 登録時に採取され施設バイオバンクに保存された空腹時血清検体があること。
対照群の組み入れ基準は以下の通りとした：(1) 同期間に健康診断を受診していること、(2) 月経周期が規則的であること、(3) 経膣超音波検査における卵巣形態が正常であること、(4) 内分泌疾患、婦人科疾患、不妊症、または臨床的に有意な肝機能または腎機能障害の既往がないこと、(5) 検査当日に採取され、施設内のバイオバンクに保存された空腹時血清検体があること。
除外基準は以下の通りとした：(1) 子宮内膜症、子宮筋腫、卵巣腫瘍、骨盤内炎症性疾患、またはその他の婦人科疾患。(2) 甲状腺機能異常、クッシング症候群、高プロラクチン血症、先天性副腎皮質過形成、または排卵障害や高アンドロゲン血症の原因となり得るその他の内分泌疾患。(3) 重度の心機能、肝機能、腎機能、または肺機能障害、悪性腫瘍、自己免疫疾患、または血液疾患。(4) 過去6か月以内の妊娠、出産、または流産。(5) 過去3か月以内のグルココルチコイド、経口避妊薬、または糖・脂質代謝に影響を及ぼすその他の薬剤の使用。(6) 精神疾患または認知機能障害。(7) 主要な臨床情報の欠損。(8) 重度の血清溶血（ヘモグロビン濃度 >2.0 g/Lと定義）、乳糜血、黄疸、1回を超える凍結融解サイクルの繰り返し、または検体保存の中断。甲状腺機能異常、高プロラクチン血症、および非典型的先天性副腎皮質過形成は、それぞれ甲状腺刺激ホルモン、血清プロラクチン、および17-ヒドロキシプロゲステロンの測定を用いて除外した。必要に応じて卵胞刺激ホルモンを確認し、臨床的に適応がある場合にはクッシング症候群または副腎腫瘍について調査した。すべての臨床検体に同一の分析前処置を適用し、一次解析に含まれた検体で、凍結融解サイクルを1回より多く繰り返したものはなかった。
血清サンプルの採取および保存
空腹時の静脈血（10 mL）を午前中に抗凝固剤不含チューブに採取し、室温で30分間凝固させた後、4 °Cで1,505 x gにて15分間遠心分離した。血清を200 µLずつ分注し、分析まで−80 °Cで保存した。すべての臨床サンプルに同様の分析前処理を適用し、一次分析に含まれるサンプルにおいて、凍結融解サイクルは1回を超えないようにした。
方法論的バリデーションのための検体調製
遠心分離速度（1,505, 3,000, および 4,000 × gで15分）、凍結融解回数（0, 1, 3, および 5サイクル）、保存温度（4 °C, −20 °C, および −80 °Cで7日間）、保存期間（−80 °Cで1, 3, 6, および 12ヶ月）、および溶血（ヘモグロビン濃度が <0.1, 0.1–0.5, および 0.5–2.0 g/L）の影響を評価するため、健康ボランティアから得られた10検体のプール血清サンプルを使用した。
研究室での検査
すべてのラボアッセイは、標準化された環境条件下で、事前に規定された操作手順に従い、同一の訓練を受けた技術者によって実施されました。血清miRNAはqRT-PCRで定量し、ADPN、LEP、およびRBP4はサンドイッチELISAで測定しました。TおよびIL-6は化学発光免疫測定法で測定し、糖代謝変数についてはルーチンの自動分析装置を用いた手法で取得しました。
qRT-PCRによる血清miRNA定量
TRIzol試薬を用いて、200 µLの血清から全RNAを抽出した。保存されていた血清RNA調製物については、分光光度法によるRNA濃度およびA260/A280純度データが得られなかった。そのため、qRT-PCRアッセイの許容性は、単一の特異的な融解曲線ピークの存在および3つのテクニカルリプリケート間の整合性によって評価した。クロロホルムによる相分離、イソプロパノール沈殿、および75%エタノールによる2回の洗浄後、RNAペレットを酵素フリーウォーターに溶解した。20 µLの反応系は、4 µLの5xバッファー、1 µLの逆転写酵素、1 µLの10 µMステムループプライマー、および5 µLのRNAテンプレートで構成した。反応条件は、16 °Cで30分、42 °Cで30分、および85 °Cで5秒とした。逆転写産物は−20 °Cで保存した。定量PCRはTaKaRa SYBR Premix Ex Taq IIキットを用いて実施した。各20 µLの反応には、10 µLの2× SYBR mixture、フォワードおよびリバースプライマー（10 µM）を各0.8 µL、および2 µLのcDNAテンプレートを含めた。増幅はApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステムを用い、以下の条件で行った：95 °Cで30秒のプレデナチュレーション；95 °Cで5秒および60 °Cで30秒を40サイクル；その後、増幅の特異性を確認するために融解曲線分析を行った。U6 snRNAを内部標準遺伝子として用い、miR-146a、miR-642a、およびmiR-2861の相対発現レベルを2-ΔΔCt法を用いて算出した。各サンプルは3連（triplicate）で試験した。本研究で使用したすべてのプライマーの配列を表1に示す。
血清タンパク質マーカーの検出
血清中のADPN、LEP、およびRBP4濃度は、Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit（分析感度：0.891 ng/mL、測定範囲：3.9–250 ng/mL）、Human Leptin Quantikine ELISA Kit（分析感度：7.8 pg/mL、測定範囲：15.6–1,000 pg/mL）、およびHuman RBP4 Quantikine ELISA Kit（分析感度：0.628 ng/mL、測定範囲：1.56–100 ng/mL）を用いた二重抗体サンドイッチELISA法により、それぞれ測定した。各アッセイは対応するヒト分析物に特異的であり、血清サンプルは製造元の指示に従って希釈した。吸光度は450 nmで測定し、4パラメータロジスティック標準曲線を用いて濃度を算出した。アッセイ内またはアッセイ間のCVは、ADPNで2.5%または3.2%、LEPで2.7%または3.4%、RBP4で2.6%または3.3%であった。
T測定
血清Tは、Roche Cobas e601自動免疫分析装置を用いた電気化学発光免疫測定法により測定した。
糖代謝および炎症マーカーの測定
空腹時血漿血糖値、空腹時インスリン値、およびHbA1c値は、miRNAおよび代謝タンパク質アッセイに使用した保存血清分画ではなく、同日の日常的な臨床検査記録から取得した。空腹時血漿血糖値はグルコースオキシダーゼ法で、空腹時インスリン値は免疫濁度法で、HbA1cは高速液体クロマトグラフィーで測定した。HOMA-IRは、[空腹時血漿血糖値 (mmol/L) × 空腹時インスリン値 (mIU/L)]/22.5として算出した。血清IL-6は化学発光免疫測定法で測定した。
方法論的妥当性の検証
代替法の比較は、一次測定値がアッセイプラットフォームに対して堅牢であるかを確認するために実施され、群間における主要な結果の算出には使用されなかった。上述した異なる処理条件下で3種類のmiRNAおよび5つの生化学的マーカーの発現レベルを測定し、各指標の変動係数をCV = (標準偏差/平均) x 100%として算出した。 異なるサンプル処理および保存条件下でのアッセイ結果の安定性を評価する際、CV <15%を許容範囲とした。日内再現性は、同一のプール血清サンプルを1日で10回繰り返し測定することで評価し、日間再現性は、5日間連続して1日1回測定を行うことで決定した。各指標について、平均値、標準偏差、および対応するCVを算出した。分析的一致性の検討では、5つの生化学的分析物（ADPN、LEP、RBP4、IL-6、T）を、一次アッセイおよびRoche社の化学発光免疫測定プラットフォームを用いて検証サンプルで測定した。Bland–Altman分析を用いて95%一致限界を算出した。すべての臨床miRNA測定には一次qRT-PCRアッセイを使用し、分析的一致性実験においてのみ、直交法としてmiScript SYBR Green PCR Kitを使用した。2つのqRT-PCRシステム間でのPearson相関係数を算出した。
統計解析
データ分析は統計ソフトを用いて行った。すべての連続変数について、まずShapiro-Wilk検定により正規性を検討した。正規分布に従うデータは平均値として表記する。 ± 標準偏差。2群間の比較には独立試料t検定を用い、多群間の比較には一元配置分散分析を行った後、ペア比較のためにLSD-t検定を実施した。正規分布に従わないデータは、中央値（四分位範囲）[M (P25, P75)]として提示した。その後、2群間の比較にはMann-Whitney U検定を、多群間の比較にはKruskal-Wallis H検定を用いた。カテゴリデータは頻度と割合で提示した。我々は以下を使用した。 χ2 グループ間の比較には、t検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いた。変数間の相関は、データの分布に応じてピアソン相関分析またはスピアマンの順位相関分析を用いて評価した。探索的解析として、各miRNAと6つの代謝マーカーとのピアソン相関を、非肥満（BMI <28 kg/m2）および肥満（BMI ≥28 kg/m2) PCOSサブグループ。相関係数はフィッシャーのr-z変換を用いて比較し、得られたサブグループ間 p 値はBenjamini–Hochberg偽発見率（FDR）法を用いて補正した。診断性能は、受信者動作特性（ROC）曲線および曲線下面積（AUC）を用いて評価した。さらに、ロジスティック回帰モデルを用いて複合的な検出能を分析した。すべての検定は両側検定とし、 p < 0.05を統計的に有意であるとした。
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研究対象集団のベースライン特性
本研究には、PCOS患者62名と健康対照者71名が組み入れられた。これら2群の間で、年齢、民族構成、およびその他のベースライン特性に有意な差は認められなかった（p > 0.05）。対照的に、月経周期は対照群よりもPCOS群で有意に長く（p < 0.001）、これはPCOSの典型的な臨床像と一致している（表2）。
血清miRNA発現レベル
血清miRNA解析により、PCOS患者と健康対照者の間で発現プロファイルに明確な差があることが明らかになった。PCOS群において、2−ΔΔCt法を用いて算出したmiR-146aの相対発現値は2.15 ± 0.49であり、対照群と比較して35.22%の増加を示した（p < 0.05; 図1A）。 corr...
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標準化された血清生化学分析およびqRT-PCRを用い、本研究ではPCOS患者62名および健康な対照群71名の血清サンプルを分析しました。その結果、PCOSにおけるmiRNAおよび栄養関連タンパク質発現の特異的な調節不全パターンと、両者の間の有意な転写後相関が認められました。すべての実験において厳格な方法論的バリデーションを実施しました。検出システムの精度、安定性、および手法間の整合性はすべて高品質な検査機関に期待される基準を満たしており、本知見の信頼性を裏付けています。
PCOSの生化学的特徴には、慢性の低グレード炎症とインスリン抵抗性が含まれており、この異常な代謝微小環境は、栄養関連タンパク質の発現異常を誘発する重要な要因となります15,16。体内で最大の内分泌器官である脂肪組織は、オートクリン、パラクリン、およびエンドクリン作用を通じて全身の代謝恒常性を調節する栄養関連タンパク質を分泌します17。本研究では、対照群...
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著者らは、利益相反がないことを宣言します。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| -80 °C 超低温冷凍庫 | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | 血清サンプルの長期低温保存 |
| Adiponectin (ADPN) ELISAキット | R&D Systems (USA) | DY1065 | 血清ADPN濃度の定量検出 |
| 自動生化学分析装置 | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | 空腹時血糖値、インスリン、および糖化ヘモグロビンの検出 |
| 自動マイクロプレートリーダー | Tecan (Switzerland) | Infinite M200 Pro | ELISA実験における 450 nm での吸光度測定 |
| 血糖測定キット | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | グルコースオキシダーゼ法による血清空腹時血糖の検出 |
| Cobas e601 化学発光免疫測定分析装置 | Roche (Germany) | Cobas e601 | 電気化学発光法による血清テストステロンおよび IL-6 の検出 |
| 酵素フリー凍結保存チューブ | Axygen (USA) | MCT-150-C | 血清サンプルの分注、-80 °C 超低温保存 |
| Eppendorf Research plus ピペット | Eppendorf (Germany) | Research plus 0.5-1,000 μL | 血清の吸引、RNA/試薬のピペッティング、サンプルの分注 |
| 糖化ヘモグロビン (HbA1c) キット | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | 高速液体クロマトグラフィーによる血清 HbA1c の検出 |
| IL-6 検出キット | Roche (Germany) | 5200057190 | 血清インターロイキン-6 の定量 |
| インスリン検出キット | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | 免疫濁度法による血清空腹時インスリンの検出 |
| Leptin (LEP) ELISAキット | R&D Systems (USA) | DY398 | 血清 LEP 濃度の定量検出 |
| 低温高速遠心機 | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | 指定の遠心力によるサンプルの遠心分離 |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen (Germany) | 218073 | miRNA 検出のメソッド一貫性の検証 |
| PrimeScript RT 逆転写キット | TaKaRa (Japan) | RR036A | cDNA 合成のための miRNA 逆転写 |
| リアルタイム蛍光定量 PCR 装置 | Applied Biosystems (USA) | 7500 | miRNA qRT-PCR 増幅および蛍光検出 |
| Retinol binding protein 4 (RBP4) ELISAキット | R&D Systems (USA) | DY6005 | 血清 RBP4 濃度の定量検出 |
| SPSS 統計ソフト | IBM (USA) | 25 | データの正規性検定、群間比較、相関分析、および ROC 分析 |
| SYBR Premix Ex Taq II Kit | TaKaRa (Japan) | RR420A | miRNA 蛍光定量 PCR 増幅 |
| Testosterone (T) 検出キット | Roche (Germany) | 5200067190 | 血清テストステロン値の定量 |
| TRIzol 総 RNA 抽出試薬 | Invitrogen (USA) | 15596026 | 血清サンプルからの総 RNA 抽出 |
| 抗凝固剤なし真空採血管 | BD Biosciences (USA) | 367812 | 血清分離のための空腹時肘正中静脈血の採取 |
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