マウス老化モデルにおける薬理学的化合物がミトコンドリア形態に与える影響の測定

サマリー

このプロトコルは、植込み型浸透圧ミニポンプを介して投与された薬剤が老化マウスモデルにおけるミトコンドリア形態に与える影響を測定する方法を説明しています。マウス肝臓の三次元(3D)超分解能共焦点イメージングを実施し、ミトコンドリア構造の無偏断断、分類、定量解析のためのパイプラインを開発します。

要約

加齢に伴う分子損傷の蓄積は、特にエネルギー消費の多い組織において、ミトコンドリア形態の変化や代謝機能障害に寄与することがあります。代謝機能障害を改善し、健康で「若い」ミトコンドリア形態を回復させる薬理学的化合物は、哺乳類において健康寿命(すなわち老化に伴う慢性疾患の負担から解放された寿命)を延ばす効果的な手法となり得ます。本書では、老年マウスにおける皮下浸透圧ポンプの注入を行い、疎水性薬理学的化合物を安定的に送達する方法を記述します。その後、組織を固定し、冷凍解剖し、染色し、超分解能共焦点顕微鏡を用いて画像化します。最後に、ミトコンドリア構造の三次元セグメンテーション、分類、定量的測定のための自動パイプラインを提示します。したがって、これらの手法はマウスの寿命を通じた異なる組織におけるミトコンドリア三次元構造の変化を定量的に評価する際に有用である可能性があります。さらに、これらの技術は加齢に伴う代謝機能障害を軽減する小分子薬物の再現性の同定にも役立つ可能性があります。

概要

ミトコンドリアは、宿主細胞や組織の現在の代謝要求に合わせて時空間的に組織化された二重膜結合小器官です^。内膜の陥没(クリステと呼ばれる)は、カルディオリピンやホスファチジルタノーラミンなどの非二重層内膜リン脂質、クリステ先端のATPシンターゼ二量体列、クリステア上部のダイナミン様GTPase光学萎縮1(OPA1)のカルジオリピン結合オリゴマー、クリステ接合部¹のミトコンドリア接触部位およびクリステ組織化系(MICOS)複合体との動的な協調によって形成・組織化されます.これらの内膜構造はミトコンドリアを個別の^{機能単位に}区画化し、ミトコンドリアの膜貫通ポテンシャル生成呼吸複合体が組み立てられる表面積を増や^します。アポトーシスシグナル伝達³、Ca²⁺および活性酸素種恒常性^3、脂質生合成⁴に関連する二次的な細胞小器官として、ミトコンドリアの形態構造は^{酸素利用可能性}の減少5や小胞体からのCa²⁺放出の増加といった環境変化に非常に敏感^です。

分子損傷の蓄積^は、加齢中のミトコンドリア構造と機能の変化に寄与します。Kühlbrandtグループによる複数のモデル生物を用いた先駆的なクライオ電子断層撮影(cryo-ET)研究では、クリステア密度と呼吸能力の明確な相関、さらに年齢依存的なクリステア密度の減少とATP合成酵素二量体の減少が示されました^9,10。さらに、ミトコンドリア体積の変化は、ミトコンドリア核分裂および融合力学の障害(¹¹)、脂質蓄積の増加(¹²)、腫れの増加(¹³)によってもたらされることがあります。骨格筋において、寿命の強力な予測因子であるVO₂ maxは^14,15で、筋線維室ミトコンドリア断片の度合いやクリスタ密度に基づいて正確に予測^{できます。}

当然のことながら、加減に伴うミトコンドリアの構造的および機能的変化は、いくつかの慢性疾患の病因に寄与することがあります 17,18,19,20。ミトコンドリアの断片化の増加やミトコンドリアの生合成および形態の変化は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の両方に関連しています²⁰。これらの変化は酸化リン酸化錯体に乱れをもたらし、陽子動力の生成を妨げ、活性酸素^種20,21,22の過剰産生を引き起こします。加齢に伴う心機能障害や心不全では、ミトコンドリア断片化の増加、腫れ、液化、クリステア密度の減少がATP産生の減少に寄与します^23,24。これらの構造的変化は、ミトコンドリア^Ca2+の取り扱いの変化やミトコンドリア透過性遷移孔6,7,13,25の活性増加に部分的に関連している可能性があります。ミトファジーの調節因子として、加齢時に透過性移行孔の過剰な開放はむしろ破壊的であり、制御不能な細胞死を引き起こす可能性があります¹³。最後に、ミトコンドリア脂質代謝およびミトファジーの加齢に伴う欠損も非アルコール性脂肪肝疾患の発症に寄与することが知られている²⁶。特に、肝ステアトーシスは酸化ストレスの増加とドーナツ状ミトコンドリア構造の形成増加を伴うことが示されています(^3,27)。

そのため、加減に伴うミトコンドリア機能低下を標的とした治療法の開発に大きな関心が寄せられており、特定の慢性疾患に苦しむ人々の生活の質を向上させることを目指しています。フォルジニティ(エラミプレチド)は脂質相互作用ペプチドで、内膜表面電位²⁸を減衰させ、ミトコンドリアATP生成^29,30を増加させるもので、最近、バルト症候群治療のためのFDA承認初のミトコンドリア標的薬となりました。バルト症候群は、カルジオリピン再構築の欠陥が心筋症、骨格筋の筋力低下、早期死亡に寄与するX連鎖疾患です。³¹。短期治療では老齢マウスの筋肉生物学的年齢の明確な変化は見^{られませんでしたが}、エラミプレチド治療は心臓駆出率や全身縦負荷^32,33、筋肉疲労と力の発生33,34,35、そして虚弱³²などの機能的老化パラメータの繰り返しの改善を示しています。ウロリチンAはミトファジーを誘導する腸由来のエラギタンニンで、³⁶は有酸素筋持久力と筋力の臨床的改善を示し^{ており、さらに}老マウスや誘発心不全のラットモデルにおける心機能障害にも良好な効果を示している³⁹。メトホルミンは複合体^I40と相互作用することが確立された抗糖尿病薬であり、カロリー制限^41,42の部分的な模倣剤として作用することも示唆されています。しかし、過去の^{疫学データ}ではメトホルミン治療ががんリスクの低減や認知機能の遅延と関連^{しているものの}、非糖尿病患者の健康寿命や寿命への影響はまだ未解決^{の課題です}。最後に、NAD+前駆体であるニコチンアミドリボシドによる治療は、ミトコンドリアの生合成とミトコンドリアの展開タンパク質応答をアップレギュレートし、エネルギー生成を改善することができます(46,47,48,49)が、UM-HET3マウスでの長期治療はマウスの中央値および90パーセンタイル寿命に有意な影響を与えませんでした。

ここでは、薬理学的化合物で処理された老年マウスから組織を製製し、ミトコンドリア形態の超分解能共焦点イメージングを行う方法を説明しています。マウスにおける持続的な薬物送達のための浸透圧ミニポンプの成功移植が示され、肝臓は外膜構造に対する治療の影響を解析しています。最後に、ミトコンドリア体積、表面積、球度の無偏かつ再現性の高い定量的測定およびミトコンドリアを異なる構造に分類するための解析パイプラインを提示します。したがって、これらの手法は哺乳類の寿命全体にわたるミトコンドリア形態の変化の研究や、加齢に伴う代謝健康の低下を緩和する可能性のある薬理学的化合物の特定にも応用可能です。

プロトコル

研究動物を対象としたすべての処置は、実験動物使用に関する機関ガイドラインに従って実施され、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびハーバード医科大学の施設動物ケア・利用委員会によって、プロトコル番号2016N000368のもとで承認されました。他国での適用を希望する研究者は、現地の機関や規制機関に相談し、適用される動物福祉規則の遵守を確実にしてください。

1. 皮下浸透圧ポンプの埋め込み

注意:動物の手術は経験豊富で訓練を受けたスタッフのみが行うべきであり、動物のストレスや苦痛を最小限に抑えるために細心の注意が必要です。承認された動物プロトコルに正確に記載された研究動物を用いた処置のみを行うこと。動物を使ったすべての研究は、3R(置き換え、削減、精錬)を厳守すべきです。このプロトコルは、軽度の外科手術に分類される皮下浸透圧ポンプの埋め込みについて詳述しています。腹膜内浸透圧ポンプの埋め込みも可能ですが、これはより複雑な処置であり、主要な外科的手技に分類されます。したがって、腹膜内埋め込みを支持する強い科学的根拠がない限り、皮下手術を行うことが推奨されます。

1. 浸透圧ポンプの充填
   注:薬物溶液の準備および浸透圧ポンプの充填は、無菌技術を用いたバイオセーフティキャビネット内で行うべきです。ポンプモデルは、望ましい貯留層の容積と処理供給期間に基づいて選択すべきです。本研究ではモデル2004(約200μLの貯蔵容量、4週間の処理投与)を用いています。
   1. 浸透圧ポンプと適合する溶媒で薬剤溶液を準備します。参照 https://alzet.com/formulating-the-solution/。注文した浸透圧ポンプのバッチに記載されている流量(μL/h)を用いて、目標の1日投与量を達成するために必要な薬物濃度を決定します。
      注:50% v/v DMSOと50% v/v PEG₃₀₀ の溶液は、疎水性化合物を安定的に溶解し、浸透圧ポンプと互換性があります。可能な限り、すべての化合物および溶媒は医薬品グレードであるべきです。
   2. 0.22μmのシリンジフィルターで薬物溶液を滅菌し、室温で保管します。
   3. 流量減速器をポンプに入れ、マイクロフュージチューブに収まるまで押し下げます。流量モデレーターを最後まで押し込まないでください。
   4. 空のマイクロフュージチューブに分析用天秤を置き、浸透圧ポンプの重量を記録します。
   5. 充填チューブを1 mLの注射器に接続し、ポンプの貯蔵容量の少なくとも1.5倍を抽出します。プランジャーを下に引き、注射器をはじいて、液体が充填チューブの上部に形成されるまで押し上げて気泡を除去します。
   6. ポンプを立てたまま流量減速器を外してください。
   7. ポンプの上部の開口部から充填チューブを挿入し、それ以上は進めなくなるまで続けます。
   8. ポンプを立てたままゆっくりプランジャーを押し下げます。溶液が出口に現れるまで詰め続けてください。その後、充填チューブを取り出し、余分な溶液を繊細な作業用ワイプで拭き取ります。
   9. 流量減速器をキャップがポンプの上部とぴったりになるまで挿入します。
   10. 満たされたポンプをマイクロフュージチューブに戻し、重さを量ります。溶液の重さを決定し、充填体積が貯留層体積の少なくとも90%であること(ミリグラム≈体積(マイクロリットル)であることを確認します。
   11. 15mLの円錐形チューブに5mLの無菌1×リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を充填し、プレ充填されたポンプを追加します。パラフィンフィルムで密封し、37°Cで浸透圧ポンプのモデルで必要な時間まで培養してポンプをプライムします。モデル2004では40時間です。
2. メロキシカムの調製
   注意:これはバイオセーフティキャビネット内で滅菌技術を用いて行うべきです。メロキシカムは非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であり、規制薬物ではありませんが、取得には規制薬物のライセンスが必要になる場合があります。
   1. 27Gの針と3mLのルアーロック注射器を使い、5 mg/mLのメロキシカムストックを5 mLの滅菌ガラスバイアルに無菌PBSを使って1 mg/mLに希釈します。当日に準備し、室温で保存してください。
3. 手術部位の準備
   注意:バイオセーフティキャビネット内で浸透圧ポンプの埋め込みを行う必要はなく、手術中に無菌を維持することも不可能です。しかし、手術現場は厳格な清潔基準と無菌の実践を遵守しなければなりません。手術場所は清潔で散らかりがなく、人通りの人が少ない場所であるべきです。理想的には、準備部位(すなわち髭剃りやこすり洗うための)と手術用の部位(すなわちポンプの埋め込みを行う場所)の両方があるのが望ましいです。
   1. 手術部位を70%エタノールで完全に消毒し、ペーパータオルで拭き取ります。
   2. ガラスビーズ滅菌器を起動し、250°Cに設定します。 15〜30分ほど温めます。
   3. 蒸気発生器を起動し、ヒーターパッドを65%に設定します。動物の体重を設定し、イソフルランパーセントを3.2%に設定します。
   4. 温度プローブの一つを加熱パッドの表面にテープで貼り付けます。ヒーターパッドを35〜37°Cまで温めます。
   5. ヴェポライザーの注射器を外してください。緑のタブを最後まで押し込み、イソフルランのボトルに接続してプランジャーを引いてイソフルランを注ぎます。
   6. 注射器を蒸発器に再接続し、プライミングします。
   7. 回復のために、清潔な動物ケージの下にもう一つの温熱パッドを置いてください。ケージを半分オン、半分オフで温熱パッドに入れます。
4. ポンプの埋め込み
   注意:すべての手術器具は事前に洗浄し、オートクレーブ処理してください。動物同士の外科用器具の滅菌には、ガラスビーズ滅菌器が使用されることがあります。これは最大5頭の動物のバッチにしか使用できません。滅菌パラメータが満たされているかを確認するために、オートクレーブ指示ストリップを必ず同梱してください。適切な個人用防護具(PPE)には、清潔な白衣、外科用マスク、滅菌手術用手袋、毛髪カバーが含まれます。手術を受ける動物は他の動物の視界に入ってはいけません。
   1. ネズミの尾の付け根を掴んで麻酔室に入れます。チューブのクリップを外し、チャンバーへのイソフルラン流(3.2%)を起動します。加熱パッドの上に滅菌されたドレープシートを2枚置きます。
   2. マウスが横向きになるのを待ち、呼吸をモニターします。呼吸が緩やかになり、緩んだら、イソフルランの腔への流れを止めます。チューブをチャンバーにクリップし、使用するノーズコーンからチューブを外します。鼻錐にイソフルラン(2%)の流れを流し始めます。
   3. マウスをチャンバーから取り出し、鼻を加熱パッドのノーズコーンに入れます。両目に眼科軟膏を塗ってください。
   4. マウスを秤で測ってからノーズコーンに戻る。投与するメロキシカム1 mg/mLの量を決定してください。5 mg/kgの用量では、マウスの体重(グラム数)に5を掛けて、投与されるマイクロリットルのメロキシカムが得られます。
   5. 1 mg/mLのメロキシカムのバイアルのキャップに70%エタノールをスプレーし、繊細な作業用ワイプで拭き取ります。その後、0.3mLのインスリン注射器を使って適切な量のメロキシカムを抽出します。注射器からすべての気泡を取り除きましょう。
   6. 片手でネズミを引っかき、頭を下に傾けて固定します。腹部右下の象限に30°〜45°の角度で針を刺し、ベベルを上に向けて刺します。針の正しい位置を確認するために吸引してください。
   7. 吸引液が見られない場合は、プランジャーを滑らかに押し込み、メロキシカムを腹腔内に注射します。
   8. マウスをノーズコーンとヒートパッドに戻してください。手術用クリッパーで、着床部位(背中の中〜上部)周辺の150%を完全に剃ってください。終わったら、優しく掃除機で動物の毛をブラッシングして、最初のドレープシートを処分します。
      注意:無菌手術を行うには清潔な剃り方が必要です。最低限、切開部には動物の毛が一切残っていなければいけません。
   9. マウスの頭を外科医の方に向ける位置にします。コットンチップのアプリケーターを使い、ポビドンヨウ素と70%エタノールを交互にスクラブし、合計3回塗布します。計画した切開の中央から始めて、綿先端のアプリケーターで外側に螺旋状に伸ばすようにしてください。
   10. 動物に無菌の開孔手術用カーテンを布置し、適切な無菌技術で手術用手袋を装着します。
   11. 切開を行う前に、両足を組織鉗子でしっかりとつまんで足の反射をしっかり確認してください。複数回のプレスが終わるまで進まないでください。動きはありません。これは麻酔の外科的平面であることを裏付けています。
   12. 組織鉗子で肩甲骨中間の皮膚をテント状にし、小さな虹彩外科用ハサミで脊椎に垂直に1cmの切開を開けます。まっすぐ切るには、アイリス外科用ハサミでマウスに対して90度の角度で切ります。
   13. 切開部内に小さな止血鉗子を使って皮下組織を広げ、ポンプ用のポケットを作ります。ポンプのポケットは動物の前方から離れ、動物のやや片側に置いてください。止血鉗子を使って切開部の全ての皮膚を緩めます。
   14. 組織鉗子で切開部を開き、止血鉗子でポンプを挿入します。まず流量減速器を挿入したポンプを挿入します。
       注意:ポンプは切開部から十分に離れた位置、つまり切開部の周囲の皮膚に張力がかからないように挿入する必要があります。適切な位置取り方をしないと、傷口の裂け目を引き起こすことがあります。ポンプは動物の回収中に位置が変わることもあります。
   15. 組織鉗子を使って、皮膚を優しくテント状に張り上げ、切開部の両側を互いに揃えて引っ張ります。切開の一端から始め、クリップアプリーを使って切開全体に沿って7mmの巻きクリップを配置します(2〜4枚のクリップが必要かもしれません)。
   16. 切開部の隙間が他の創クリップで収まりきれないほど小さい場合は、滅菌アプリケーターで少量の組織接着剤を塗布します。組織鉗子でつまんでください。
   17. 傷口が閉じているかを確認するために、切開部の皮膚を優しく引っ張って伸ばします。その後、鼻錐へのイソフルラン流を止め、関連するチューブをクリップします。ネズミをヒーターパッドの上にあるリカバリーケージに入れます。
   18. ネズミが目覚めて歩けるようになるまで、完全に監視してください。動物の苦痛や痛みの兆候を頻繁に観察し、回復するまで他のマウスから隔離してください。
   19. 24時間後、腹腔内注射でメロキシカム5mg/kgを再投与します。(任意)動物の回復を助けるために、エレクトロジェルのサプリメントを提供したり、餌をケージの床に置いたりしてください。
   20. 10〜14日後に再びイソフルランで麻酔し、眼軟膏を塗布し、クリップリムーバーでクリップを外します。
       注意:クリップはこの期間までに外す必要があります。傷のクリップに毛が生え戻るのを防ぐためです。また、すべての浸透圧ポンプには定められた持続時間があります。飼育期間終了までにポンプを植え取るか安楽死させるかを必ず行ってください。より長い治療期間では、同じ動物に対して複数のポンプ移植を連続して行うことがあります。

2. 組織の固定、埋め込み、切片

1. 組織の固定
   注意:すべての動物処置は、動物のストレスや苦痛を最小限に抑えるために、経験豊富なスタッフによって実施されるべきです。安楽死室は清掃し、残留二酸化炭素を除去するために各動物の間に物理的に排出されるべきです。ストレスを最小限に抑えるために、可能な限り自宅のケージで安楽死させるべきです。最後に、動物は他のマウスの近くや視界の前で安楽死させてはいけません。生存以外の手術には清潔な手術器具が必要ですが、無菌である必要はありません(すなわちオートクレーブ処理)。
   1. マウスを誘導チャンバーに入れ、レギュレーターを開いて流量計が意図した流量(チャンバー体積の約40%〜70%/分)に達するまで開いてください。
   2. 手術の間ずっとマウスを観察し、ジャンプなどの苦痛の兆候がないか確認してください。呼吸活動の停止を監視し、停止後少なくとも2分間_CO2の流れを維持します。CO2への曝露時間が少なくとも5分以上であることを確認しましょう。
   3. マウスを回収し、頸椎脱臼などの二次安楽死を行います。
   4. 動物の手足をアルミホイルで覆った発泡スチロールに23Gの針で固定します。70%エタノールをスプレーして毛を濡らします。
   5. 腹部の付け根近くに小さな切開を入れ、皮膚を首まで切ります。同じ切開をたどって体腔を開き、肋骨を慎重に切り開いてください。
   6. 腹部の付け根からU字型の切開を開け、23Gの針で皮膚をピンで固定します。
   7. 関連する臓器を切り離し、4%パラホルマルデヒド(PFA)5mLをあらかじめ充填した15 mLの円錐形チューブに入れます。ロティサリーで4°Cで24時間固定します。
      注意:PFA溶液は危険です。皮膚への接触は避けてください。取り扱い時の適切なPPEには、白衣、ニトリル手袋、安全ゴーグルが含まれます。
      注意:組織からの血液灌流が必要な場合、または灌流固定が必要な場合は、^前述の心臓灌流を行います。ここで行われる浸漬固定では、特に大きな組織の塊では固定剤が組織全体に広がるまでに時間がかかることがあります。これによりミトコンドリアの形態が変化する可能性があります。さらに、PFAの固定は組織を縮小させること^{もあります。}
   8. 24時間後にパラホルムアルデヒド溶液を除去し、10mLの1×PBSで組織をすすぎます。室温のロティサリーで合計3回、各10分間行います。
   9. PBSを除去し、30%ショ糖10mLに4°Cのロティサリーで48時間浸します。ショ糖の浸潤は組織が沈むときに完了します。
      注:溶媒が動物に届けられたことを確認するために、ポンプ内の残量を測定してください。
2. 組織の埋め込み
   注意:型内の組織の位置と向きを必ず記録してください。
   1. 発泡スチロールの容器にドライアイスを入れ、その上に金属板を平らに置きます。
   2. 金型を金属板の上に置き、最適切削温度(OCT)化合物(組織埋め込み媒体)で2/3〜3/4の厚さを頂上まで充填します。気泡があれば、細かい鉗子で表面や角に運びます。冷凍速度を上げるために、ドライアイスのペレットを型に直接当てて置いてください。
   3. 計量船に組織埋め込み培地を入れて、その中に組織を混ぜます。ショ糖溶液を持ち帰らせないようにしてください。
   4. 組織埋め込み培地が型の底に完全に凍ったら(完全に不透明であるべき)、組織を型の中に沈め、型のどの側面や表面にも触れないようにします。希望の場所と向きに配置してください。
   5. 組織埋め込み培地が完全に凍結するまで待ってから、型を-80°Cの冷凍庫に移してください。
      注意:(間)埋め込み組織は少なくとも3ヶ月間保存可能です。
3. 組織の断片
   注:バッチごとのセクション厚の変動を減らすために、分析対象のすべての組織を一回のセッションで切開する必要があります。
   1. -80°Cの冷凍庫から埋め込まれた組織を取り出し、ドライアイスを入れた発泡スチロール容器に入れます。
   2. クライオスタットチャンバーの温度と試料ホルダーをそれぞれ-24°Cと-25°Cまで予冷します。
   3. 新しいミクロトームブレードを刃ホルダーに入れ、アンチロールプレートを挿入します。掃除を楽にするために、クライオスタットチャンバーにペーパータオルを敷いてください。
   4. 試料チャックをクライオスタットチャンバーから取り出し、室温まで温めてください。
   5. カミソリの刃でティッシュ型の隅々を丁寧に切ります。優しくこじ開けて、組織埋め込みの培地ブロックを取り除きます。
   6. ティッシュブロックを標本チャックにしっかりと押し込みながら、前後にねじります。しっかり接着したら、標本チャックをクライオスタットチャンバーに数分間置いて凍結します。
      注意:組織ブロックをチャックに適切な向きで置き、組織が望ましい方向に切片されるようにしてください。
   7. ティッシュブロックが標本チャックに完全に凍ったら、チャックをチャックホルダーに入れて締めます。クライオスタットの刃を組織ブロックのすぐ前に動かし、触れないようにしてください。
   8. トリム設定を50μmに設定し、組織の断面全体が露出するまでブロックをトリミングし始めます。
   9. トリム設定を選択し外し、断面厚さを20μmに設定します。この厚さで数枚切り、アンチロールプレートを下げます。区間の約80%〜90%をゆっくりと滑らかに切り裂き、そこで止まります。
   10. アンチロールプレートを持ち上げろ。帯電したガラススライドを取り出し、帯電面を組織切片に所望の位置に押し付けます。
       注意:アンチロールプレートを持ち上げた後にティッシュセクションが巻き上がった場合は、細かいブラシで広げてください。
   11. チャックをチャックホルダーから外してください。チャックをクライオスタットから取り出し、室温まで温めてください。チャックからティッシュブロックを取り出して、型に戻します。
   12. 組織ブロックが型から落ちないようにアルミホイルで包み、-80°Cの冷凍庫に戻します。
   13. 埋め込んだ組織切片を-20°Cに置きます。
       注意:(一時停止)組織切片は-20°Cの環境で無期限に安全に保存可能です。

3. 免疫蛍光染色

1. クライオセクションを回収し、37°Cでインキュベーターで10分間乾燥させます。
2. スライドを洗って余分な組織埋め込み培地を取り除きます。
   1. 1×PBSを1リットルに、0.1% v/v Triton X-100(PBS-T)を含んで準備します
   2. PBS-Tを3つの染色剤瓶に詰めます。
   3. スライドをスライドラックに置いてください。ステインジャーにスライドを10分間浸します。これを合計3回繰り返します。
3. 組織を塞いで染めます。
   1. 繊細な作業用ワイプで各スライドを優しく叩いて乾かします。スライドをスライドボックスに吊り下げ、ティッシュを上に向けて置きます。
   2. 1×PBS、0.3% v/v Triton X-100、5% w/v 牛血清アルブミン(BSA)を含み、20 mLのブロッキング溶液を準備します。
   3. 各スライドに1mLのブロッキング溶液をピペットで注ぎ、組織が完全に覆われていることを確認してください。
   4. 室温で1時間孵化します。
4. 一次抗体で組織を培養します。
   1. 繊細な作業用ワイプで各スライドを優しく叩いて乾かします。もう一度繊細な作業用ワイプで、組織の間の残った液体を優しく拭き取ってください。
   2. ブロッキング溶液(1枚あたり200μL)で1:200希釈したTom20ウサギαマウス抗体を製製します。
   3. スライドボックスの底にペーパータオルを置き、水で十分湿らせます。
   4. スライドをスライドボックスに吊り下げ、ティッシュを上に向けて置きます。各スライドに200μLの希釈した一次抗体をピペットで注ぎ、組織が完全に覆われるようにします。
   5. カバースリップの大きさにほぼ同じくらいのパラフィンフィルムを切断して使用します。スライドごとにパラフィンフィルムを1枚ずつカットします。
   6. 各スライドにパラフィンフィルムを重ねて、抗体希釈を組織切片全体に広げます。スライドボックスを閉じて、4°Cで一晩培養します。
5. インキュベーション後は一次抗体でスライドを洗浄してください。
   1. PBS-Tを3つの染色剤瓶に詰めます。スライドを取り出し、パラフィンフィルムの断片を除去します。
   2. スライドをスライドラックに置いてください。ステインジャーにスライドを10分間浸します。これを合計3回繰り返します。
6. スライドを二次抗体でインキュベートします。
   注:ミトコンドリアの特異的標識を確認するために、各群から少なくとも1枚のスライドを二次抗体のみで染色して準備してください。
   1. 繊細な作業用ワイプで各スライドを優しく叩いて乾かします。もう一度繊細な作業用ワイプで、組織の間の残った液体を優しく拭き取ってください。
   2. ヤギαウサギのAlexa Fluor 568抗体を1:200希釈し、5 μg/mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)をブロッキング溶液(スライド1枚あたり200 μL)で準備します。
   3. スライドをスライドボックスに吊り下げ、ティッシュを上に向けて置きます。各スライドに希釈した二次抗体200μLをピペットで注ぎ込み、組織が完全に覆われるようにします。
   4. カバースリップの大きさにほぼ同じくらいのパラフィンフィルムを切断して使用します。スライドごとにパラフィンフィルムを1枚ずつカットします。
   5. 各スライドにパラフィルムを置き、抗体希釈を組織切片全体に広げます。スライドボックスを閉じて室温で4時間、または4°Cで一晩培養します。
7. カバースリップを洗いなさい。
   注意:カバースリップを持ち上げて扱うにはプラスチックの鉗子を使ってください
   1. カバースリップを、温かい水道水とガラス製品用の洗剤(例えばContrad 70)を入れたビーカーに入れて、一度に一つずつ入れます。パラフィンフィルムを貼ってカバーします。
   2. ソニックネーションを浴槽で30分間ソニックケーターで処理します。
   3. 熱い水道水で何度かすすいでください。その後、二重蒸留水でさらに数回洗い流します。最後の二重蒸留水のすすぎで15分間ソニック酸を流します。
   4. カバースリップを70%エタノールに浸して保管します。カバースリップを取り付ける準備ができたら、70%エタノールから外し、ファンムフードで自然乾燥させます。
8. 培養後は二次抗体でスライドを洗浄してください。
   1. PBS-Tを3つの染色剤瓶に詰めます。スライドを取り出し、パラフィンフィルムの断片を除去します。
   2. スライドをスライドラックに置いてください。ステインジャーにスライドを10分間浸します。これを合計3回繰り返します。
   3. 繊細な作業用ワイプで各スライドを優しく叩いて乾かします。もう一度繊細な作業用ワイプで、組織の間の残った液体を優しく拭き取ってください。
9. カバースリップを取り付けろ。
   1. スライドの上に均等に散布したアンチフェードマウントを2〜3滴加えます。
   2. 気泡を防ぐために、きれいにした#1.5カバースリップを長軸に沿ってスライドに対して45°の角度で持ってください。カバースリップをゆっくりとスライドに傾けます。これをすべてのスライドで繰り返します。
   3. スライドは室温で18〜60時間、光から守りながら硬化させます。
   4. スライドは光を遮った状態で4°Cで保存します。
      注意:(一時停止点)スライドは硬化期間直後、または4°Cで保存すれば最大1か月間撮影可能です。 端を密閉する必要はありません。#1.5または#1.5Hのカバースリップを使うことを忘れないでください。他の厚さは球面収差を生み出し、画質を低下させる可能性があります。DAPIでは励起および発光スペクトルが広いため、マウンティングメディアは使用しないでください。硬化時間は試料の厚さに依存します。ここは48時間。

4. 超分解能イメージング

注:このプロトコルは、ZEISS Axio Observer Z1を中心に構築されたZEISS Airyscan2ポイントスキャンLSM 980共焦点装置を使用し、2本の多アルカリ光電子増倍管(PMT)とGaASP 32チャネルスペクトル検出器、環境エンクロージャー、そしてPlan Apo 63×/1.4オイル差関対比(DIC)III対物レンズを搭載しています。

1. 買収の準備をしてください。
   1. Airyscan SRトラックを1本追加し、適切な蛍光色素を選択します。
   2. 10インチプレートと適切な発光バンドパスフィルターを選択してください。
      注:10インチプレートはこの顕微鏡専用で、赤外線(IR)検出器も搭載されています。
   3. 適切なレーザーを選択してください。ナイキストサンプリング基準をSRをクリックして2に設定してください(ピクセルサイズは0.05μmに調整してください)。
   4. ライブをクリックしてAiryscan検出器をアライメントします(ライブアライメント機能を選択)。検出器アイコンの中央に強度が定着し、検出器が緑になったら停止をクリックします。
      注意:すべてが正しく設定されていれば、ソフトウェアの左側に「Airyscan設定が成功裏に最適化されました」というメッセージが表示されるはずです。
   5. 再度 ライブ を開いて 、レーザーの強度 を調整して、十分な信号は出るけれどピクセルが飽和しないようにしてください(レンジインジケーターをクリックしてください)。最適化が完了したら 停止 をクリックします。
      1. (任意)レーザー出力を調整しずに信号を増幅するには 、ゲインを上げてください。
2. データ収集を行う。
   1. zスタックをクリックしてステップサイズが0.1 μmに設定されているか確認してください(設定されていなければ調整してください)。
   2. ライブをクリックして、zスタックの下限と上限を設定します。
   3. 実験開始をクリックします。
   4. Zスタックが収集されたら、画像の下にある Airyscan タブに行き、「 process 3D」をクリックしてください。ここで使われているノイズ除去ワイナーフィルターのパラメータは、異なるレプリケートや処理グループ間で一貫性を保ちます。
   5. 処理済みのAiryscanのZスタックを保存してください。
      注意:Airyscan SRのトラックを2つ使う場合は、顕微鏡が毎フレームのトラックを切り替えるようにしてください。

5. ミトコンドリア形態を定量化するための自動パイプラインの作成

注:このプロトコルは、ZEISS arivis Pro Software 4.1.2を用いてミトコンドリア形態の3D定量化のための自動画像解析パイプラインの開発を説明しています。

1. Airyscanで処理された.cziファイルを arivis変換ツールを使って.sis形式に変換できます。
   注意:画像全体が大きく、パラメータ最適化中の処理時間が長すぎる場合は、画像の小さく代表的なサブリージョンをトリミングし、設定最適化の参考として活用してください。このトリミング画像には、十分に孤立したミトコンドリアと高密度領域の両方を含めるべきであり、完全な画像フィールドを正確に表現します。トリミング画像で満足のいくセグメンテーションが達成されたら、最適化されたパイプラインを全体の画像セットに適用できます。この方法は時間を大幅に節約し、パイプラインの品質を損なうことなくすべてのパラメータを調整しやすくします。
2. パイプラインの構築と最適化。
   1. ソフトウェア内で代表的な画像(例:コントロールグループからの画像)を開きます。
   2. 分析の入力として Tom20免疫蛍光チャネル を選択します。
   3. セグメンテーションの前にノイズ除去ステップを適用します。ここでは、直径5.42、強度0.5の粒子強化アルゴリズムが用いられました。
      注:粒子強調フィルターは構造を保つノイズ除去アルゴリズムであり、コンパクトでおおよそ球状、または細長い物体を増幅しつつ背景雑音を抑制することを目的としています。これは特定の空間スケール(直径)で局所的な強度を高めることで機能し、暗い背景の中で明るく孤立した粒子や管状に見えるミトコンドリアに特に適しています。直径パラメータの値が小さすぎるとノイズが増し、値が大きくなると隣接する物体同士がぼやけてしまいます。強度パラメータは強調の度合いを制御し、高い値では信号増幅が増加しますが、設定しすぎるとアーティファクトが発生することがあります。デフォルト値から始め、代表的な領域で出力を視覚的に確認しながら調整します。arivis Proにはいくつかのノイズ除去方法があります。ガウス平滑化は高周波ノイズを均一に抑えるシンプルで高速なオプションですが、細かい構造的ディテールをぼかすことがあります。中央のフィルタリングは鋭いエッジを保ちつつ、塩と胡椒のノイズを除去するのに優れています。粒子増強(ここで使用)は、離散的な蛍光物体を検出することを目的とする場合に好まれ、指定されたサイズ範囲に合致する構造からの信号を選択的に増幅します。信号対雑音比が低い画像や背景の異質性が顕著な画像では、より強いノイズ除去パスが必要になることがあります。同じ代表的な画像に対して2つまたは3つの手法をテストし、下流のセグメンテーション品質を比較することが推奨されます。
   4. 3次元空間の物体を検出するブロ ブファインダーアルゴリズムを用いて個々のミトコンドリアを分割します。
   5. オブジェクトのサイズや感度閾値などのセグメンテーションパラメータを調整し、検出されたオブジェクトとノイズ除去画像の重なりを視覚的に検査して正確なセグメンテーションを確保します。ここでは、直径0.244μm、確率閾値25%、スプリット感度22.22%のパラメータが用いられ、正規化は最初の開始点に設定されました。
      注:セグメンテーションパラメータは画像の解像度とボクセルサイズに依存します。この研究では、画像寸法は1354×1354ピクセルで、XYピクセルサイズは0.049μm、ボクセルサイズは0.049×0.049×0.100μm3でした。
3. 特徴抽出と品質管理を行う。
   1. 検出された各物体の形態的パラメータを抽出します。体積(^μm³)、表面積(μm^²)、球面性(ミトコンドリアと同じ体積/表面積を持つ球面の表面積)が含まれます。
   2. 分割されたオブジェクトをTIFFファイルとしてエクスポートして視覚的な検証を行います。
   3. FIJIやarivisでエクスポートしたファイルを開き、元の画像と重ね合わせてセグメンテーションの精度を目視的に確認してください。
   4. 定量測定値を各サンプルごとに個別のスプレッドシートファイルとしてエクスポートしてください。
4. パイプラインを適用してください。
   1. 最適化されたパイプラインを保存してください。例のパイプラインは 補足ファイル1に記載されています。
   2. このパイプラインを研究のすべての実験群の追加画像に適用します。
   3. 必要に応じて、すべての実験群で一貫したパフォーマンスを確保するために、セグメントパラメータを反復的に精緻化します。
   4. 最終決定後、研究内のすべての画像にバッチモードでパイプラインを適用します。
5. データ解析の実施
   1. エクスポートしたデータをRStudio(バージョン4.3.2)にインポートして統計解析を行います。
   2. インストールしていなければ、readxl、dplyr、tidyr、purrr、ggplot2、ggpubr、patchwork、scales、randomForest、caret、umap、factoextra、RColorBrewer、mclust、outliers、tidyverseのパッケージをインストールしてください。
   3. スクリプト(補足ファイル2)をアップロードして、すべてのデータセットを統合し、データをフィルタリングし(下記参照)、体積、表面積、球面度の値をプロットし、サンプルごとのサブタイプ比率で分断されたミトコンドリアを解析します。
   4. (任意)体積に基づく分断ミトコンドリアをフィルタリングし、分断のアーティファクトやノイズを排除します。
      1. 適切なフィルターを決定するには、体積分布を目視で確認してください。
         注:すべてのサンプルは非常に小さい体積(0.0003 μm³未満)で顕著なスパイクが見られ、これは実際のミトコンドリアではなく分割ノイズと一致しています。
      2. 下限を特定するために、候補閾値(0.0009、0.003、0.005、0.007、0.01^{μm 3})をまたいで粒子保持を評価します。粒子数の最も急激な減少は0.003 μm^³以下で発生し、ほとんどのノイズ粒子がその範囲に属していることを示しています。目視検査により、0.003μm^³ がノイズピークの右端に対応していることが確認されました。
      3. 上限については、分布は自然に10μm^³より大きく下回りました。この制限は、過剰に分断されたミトコンドリアネットワークのような大きな人工物を除外するように設定してください。最終ろ過では、0.003から10μm^³の体積を持つ粒子を保持しました。
         注:このスクリプトは検出されたすべてのミトコンドリアのサンプルあたりの中央値値を計算し、これを解析単位として用います。このアプローチは、同じ生物学的サンプル内の個々のミトコンドリアが非独立であることを説明しています。

結果

上記のプロトコルは20か月の雄のUM-HET3マウスで実施されています(図1)。マウスは、モデル2004の浸透圧ミニポンプ⁵³を用いて、ビークル(コントロール)または化学的再プログラミングカクテル(Treated)のいずれかで投与されました。その後、肝臓を切片し、Airyscan2共焦点顕微鏡で画像化し、解析パイプラインを使ってzスタックを処理しました。

3D蛍光画像はZEISS arivis Pro Software 4.1.2を使用して処理・解析されました。ミトコンドリアの分割前に、粒子増強アルゴリズムを用いて画像のノイズ除去や背景光、ピントの合わない光、自己蛍光、非特異的結合に由来する蛍光を除去しました。粒子増強は、一定の直径から信号を選択的に増幅します。ノイズ除去後、個々のミトコンドリアはBlob Finderアルゴリズムを用いて3D分割されました。このアルゴリズムは、定義されたサイズ範囲内の局所的な強度最大値に基づいて物体を検出します。最後に、オブジェクトセグメンテーションは各2次元スライスをバイナリ画像に還元します。

セグメント化のワークフローを示すために、 図2 はコントロールサンプルと処理サンプルの処理パイプライン各段階における代表的な光学スライスを示しています。生の蛍光画像は未処理のTom20信号を示しており、特定のミトコンドリア蛍光と望ましくない背景、ピントの合わない光、自己蛍光の混合物が含まれています。粒子増強ノイズ除去を適用した後、背景信号は大幅に減少し、残りの蛍光は離散的で明確に定義された構造に限定されます(図2)。これにより、ミトコンドリア境界のよりクリーンな表現が得られ、正確なセグメンテーションが可能となります。

Blob Finderの分割の出力は緑色で示されています。zスタックが正確に分割されていることを確認するため、ノイズ除去された2Dスライスと関連する分割されたバイナリ画像を重ね合わせました(図2)。セグメンテーションプロセスが十分に最適化されていれば、ミトコンドリア蛍光が二元対象と強く一貫して共局在することが観察されるはずです。分割過程が過剰分割(すなわち個々のミトコンドリアを複数の対象に分割する)または過分断(複数のミトコンドリアを一つにまとめる)の場合は、分割パラメータを調整します。挿入部の目視検査により高品質なセグメンテーションが確認されました。検出された物体は、ノイズ除去されたTom20蛍光信号と正確に共局所化し、過剰分割、物体の過大、空間的に隣接するミトコンドリアの不適切な単一物体への融合、またはTom20信号のない領域での偽物体生成の証拠はありません。このレベルのセグメンテーション忠実度は対照サンプルと処理済みサンプルの両方で一貫して達成されており、ZEISS arivisソフトウェアで最適化されたパイプラインパラメータが実験群間で堅牢かつ一般化可能であることが示されました。これらの結果は、セグメンテーションアプローチを検証し、そこから導き出される形態学的測定の信頼性を支持しています。

分割された物体は、体積、球度、表面積などのミトコンドリアパラメータを測定できます(図3)。生物学的サンプルあたり検出される多数のミトコンドリアと細胞内の個々の小器官の非独立性を考慮するために、サンプルごとの中央値値を計算し、統計比較の単位として用いられました。グループ差はウィルコクソン検定を用いて評価されました。処理されたサンプルは対照群と比較して有意に高いミトコンドリア体積と表面積を示し、化学的再プログラミングがミトコンドリア形態の大幅な再構築を誘発していることを示しました。

最後に、分節されたミトコンドリアは異なるサブタイプ^54,55に分類できます(図4)。肘法⁵⁶を用いて、k平均クラスタリング^57,58の最適なクラスタ数を決定しました(図4A)。その後、k = 4クラスターを用いて、対照群と処理群のミトコンドリアのランダムサブサンプルを、一様多様近似・射影(UMAP)次元削減(図4B)でプロットし、ミトコンドリアサブタイプ(左)と処理群(右)で色分けしました。最後に、対照群と処理群の各ミトコンドリアサブタイプ(図4C)の割合をプロットしました。治療群では断片化されたミトコンドリアは少なかったものの、ネットワーク型または伸長型ミトコンドリアの割合に有意な変化はありませんでした。

図1:プロトコルの概要。マウスは皮下浸透圧ミニポンプ埋め込みを用いて最大6週間薬剤またはビークルで治療されます(1)。処理後、マウス組織は固定され、ショ糖で浸潤され、OCT化合物に埋め込まれ、クライオ切片されます(2)。組織切片はTom20に対する抗体とAlexa Fluor 568で標識された二次抗体で染色されます(3)。超分解能のZスタックはAiryscan2点走査共焦点顕微鏡で収集され(4)、ノイズ除去処理されたZスタックはarivisで分割されてミトコンドリア形態を定量化します(5)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:ミトコンドリア分断および形態解析のための自動パイプライン。
コントロール(上部パネル)および処理済み(下部パネル)サンプルからの代表的な単一光学スライス。Tom20免疫蛍光シグナルは灰色で示されています(左)。ノイズ除去後の同じ画像は灰色で表示され、その後、検出されたミトコンドリア対象を緑色で強調する分割出力が続きます。統合画像は、ノイズ除去信号と分割された物体との重なりを示しています。インセットでは、示された領域の高倍率ビューが示されており、ノイズ除去の効果やセグメンテーションの精度を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:対照群および処理群のミトコンドリア形態。ボックスプロットはサンプルごとの中央値±四分位数間の範囲(グループあたりn=10)を示しています。各点は1つの生物学的サンプルを表し、そのサンプル内で検出されたすべてのミトコンドリアの中央値としてまとめられます。体積と表面積はログ₁₀ スケールで表示されます。グループはウィルコクソンのランク和検定を用いて比較されました。有意水準:ns p ≥ 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:ミトコンドリア亜型の教師なし形態計測分類。 (A) クラスタ数(k)に対するクラスタ内二乗総和(WSS)を示すエルボープロット。これは10,000個のミトコンドリアのランダムサブサンプルで計算されます。転換点は k = 4 で、下流解析のための最適なクラスタ数として選ばれました。(B)(左)割り当てられたサブタイプごとに色分けされたミトコンドリア形態計測的特徴(n = 20,000個のランダムサンプリングミトコンドリア)のUMAP次元削減。形態的に異なる4つの亜型が同定されました:断片型(小さい高球性)、細長い型(長い低い球性)、ネットワーク型(大きく不規則)、中間型です。(右)実験群(対照群と処理済み)ごとに色分けされたUMAP投影で、形態空間における各グループの分布を示します。(C) 各実験群における各ミトコンドリアサブタイプのサンプルあたりの割合。各データポイントは1つの生物学的サンプルを表します(グループごとにn = 10個)。ボックスプロットは四分位数間と中央値を示し、ひげは四分位数の範囲の1.5倍まで伸びています。サブタイプ比率はウィルコクソンランク-和検定を用いてグループ間で比較され、ベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて複数比較のp値は補正されました。NS p ≥ 0.05, ****p < 0.0001. この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足ファイル1:例のarivisパイプライン。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2:ミトコンドリア形態およびサブタイプ集団の定量化用Rスクリプト。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルを成功裏に実施するための最も重要な2つのステップは、(i) 浸透圧ポンプの埋め込み時に切開部を閉じること、(ii) 正確なセグメンテーションです。前者の場合は、ポンプが入るのに十分な大きさでありながら、ポンプが動物の側面を滑り落ちないように皮下ポケットを作ることに特に注意してください。切開部を閉じた際は、周囲の皮膚に張力をかけないよう、ポンプを十分に離して設置し、皮膚が裂けてしまう可能性があります。動物の回収を開始する前に、閉じた切開部の周囲の皮膚を全方向に引っ張り、傷口が十分に閉じているか確認してください。傷クリップは、素早く装着・取り外しできるため利点があります。しかし、切開部を適切に閉じられない場合は、中断縫合が用いられることがあります。後者の場合、正確なセグメンテーションは、十分な画像類似度が得られるまで、ノイズ除去画像とセグメンテーション結果を絶えず比較する必要があります。対照動物と処理済み動物のZスタックは、同じ収集パラメータを用いて、できれば同じ画像診断セッション中に採取する必要があります。同様に、すべての処理ステップは全ての画像に全く同じパラメータで適用しなければなりません。直径セグメンテーションパラメータは検出対象の物体の期待サイズを定義します。良い出発点は、1つの光学スライスで手動検査されたいくつかの物体から測定された平均ミトコンドリア幅です。確率閾値は、対象が受け入れられるために必要な最小検出信頼度を制御します。値が低いほど感度が上がり、より多くの物体を検出できますが、その中には偽物も含まれます。逆に、値が高いほど特異性は向上しますが、信号の低い物体が失われることもあります。推奨される開始範囲は25%〜30%です。最後に、スプリット感度は、接触や重なり合う物体を個別の物体にどれだけ積極的に分けるかを決定します。低い分離感度では、ミトコンドリアが単一の統合オブジェクトとしてクラスタリングされます。一方で、高い分裂感度は細長いまたは分岐したミトコンドリアが断片に過剰に分裂することがあります。典型的なミトコンドリア形態学的研究においては、15%〜30%の値は妥当です。正確なセグメンテーションが依然として難しい場合は、FIJI⁶⁰のミトコンドリアアナライ^ザー59を用いてセグメンテーションを行うことができます。また、Huygens ProfessionalソフトウェアとカスタムPythonスクリプトを用いた細胞および組織におけるミトコンドリア形態の定量化のための半自動化パイプラインも^{最近記述されています}。

一つの制約はAiryscan2共焦点顕微鏡の分解能制限で、XYで~150 nm、Z面で~350 nmです。これにより、個々のクリスタエ間の距離が~40〜120 nm 62,63,64と推定されるため、ミトコンドリアの高解像度イメージングは困難です。一方、刺激放出枯渇(STED)は横方向で約20〜50 nmの解像度限界に達し、個々のミトコンドリアクリステア(^62、63、64)を明確に識別できます。最近、^{生細胞および}固定細胞の両方でミトコンドリア内膜の効果的な染色およびイメージングを可能にする複数のSTED染料が開発^{されています。}クリステの形態の解析はミトコンドリアの生体^{エネルギー健康に関する}洞察をもたらす可能性があるため、このようなデータが求められます。しかし、ミトコンドリアの形態は哺乳類組織と細胞培養で大きく異なり(後述で詳しく説明します)、STED画像診断やクリステア構造解析のために組織の内膜を染色する方法は現在存在しません。

完全な組織におけるミトコンドリア形態の定量化は、細胞培養システムと比べて独自の課題を伴います。培養細胞では、ミトコンドリアは通常、細胞間の重なりが最小限でよく分離されたネットワークで細胞質全体に分布しています。しかし、組織切片やホールマウント製剤では、細胞が密に詰められており、その境界が明確に定義されていません。細胞レベルでの分析が必要な場合は、形質膜を標的とした追加の蛍光ラベルや細胞型特異的マーカーを組み込み、それに対応するセグメント化工程を画像解析パイプラインに組み込み、ミトコンドリア形態の定量前に個々の細胞境界を定義する必要があります。もう一つの重要な違いは、培養細胞ではミトコンドリアが連続的で相互に連結した網様状ネットワークを形成しやすく、容易に視覚化・解釈できることです。組織ではこのパターンはめったに観察されません。例えば、肝切片からのミトコンドリアは、細胞質⁶⁶全体を占める点状、桿体状、束状のパターンを示します。しかし、培養中の肝細胞は明確なネットワーク形成を持つ管状形態を示します⁶⁶。同様に、培養中の平滑組織のミトコンドリアと平滑筋細胞のミトコンドリアを比較すると、形態やネットワークパターンに明確な違いが観察されます⁶⁷。三次元構造と細胞型特異的なミトコンドリア分布の違いが組み合わさることで、これらの組織のミトコンドリアは細長いネットワークではなく、離散的で密集した点状や短い断片のように見えます。したがって、組織と細胞培養の形態的特徴を比較する際は、両者の違いが真の生物学的変異ではなく画像上の文脈に部分的に起因する可能性があるため、データの解釈は慎重であるべきです。

このプロトコルのハイライトは、光学顕微鏡を用いて組織内のミトコンドリア構造を定量的に測定できることです。超高解像度の光学顕微鏡画像からミトコンドリア形態を定量化する他の方法も存在しますが、多くは培養中の細胞にのみ適しています。さらに、他の解析手法とは異なり、ここで紹介するパイプラインは完全自動化されており、ミトコンドリアの寸法とサブタイプ比率の両方を定量化し、成功させるためにコーディング経験はほとんど必要ありません。走査・透過電子顕微鏡(SEM/TEM)およびクライオETは、これまでに組織内のミトコンドリア構造を2次元および3次元でイメージングするために用いられてきました ^10,68,69。しかし、前者については、サンプル固定、脱水、埋め込み後のネイティブ構造の保存に関する懸念^{があります。}さらに、FIJI⁶⁰におけるミトコンドリアパラメータの手動測定は、TEM^画像72の解析方法として好まれることがあり、これは多くの作業を必要とし、サンプルバイアスを引き起こす可能性があります。しかし、TEM画像からミトコンドリア形態を自動定量化するためのディープラーニング手法は最近、^73,74で報告されています。この方法の利点は、分析パイプラインが確立されると、ほとんどユーザーの入力なしで画像をバッチ処理できることです。後者の場合、高圧凍結により組織構造がほぼ原生条件で保存されます⁷⁵。しかし、クライオETサンプルの凍結、区切、ミリング、データ収集、データ処理はすべて広範な訓練と高度な機器を必要とします。一方、超分解能共焦点顕微鏡は比較的アクセスしやすく、成功させるための訓練やリソースも少なくて済みます。

浸透圧ポンプの埋め込みは、加齢マウスで安全に実施され、さまざまな薬理学的化合物が加齢に伴う生理機能の低下に与える影響を評価することができます。さらに、ここで述べる方法は多くの異なる臓器に一般化可能です。加成に伴う代謝機能の低下は疾患に寄与し、老化の特徴の一つであるミトコンドリア機能障害に起因することがよく^{知られています。}さらに、ミトコンドリアの構造がミトコンドリアの生体エネルギー能力および代謝状態に影響を与えることが理解されています^77,78。したがって、ここで述べた方法を用いてマウスの老化過程におけるミトコンドリア構造への影響を定量的に評価することで、人間の健康寿命を延ばす治療法の特定に役立つ可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エアリースキャン2ポイント走査型共焦点顕微鏡	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISSポイント走査型共焦点顕微鏡LSM 980は、ZEISS Axio Observer Z1を基盤とし、2つのマルチアルカリPMTとGaASP 32チャンネルスペクトル検出器、環境エンクロージャ、およびPlan Apo 63×/1.4 Oil DIC III対物レンズを装備しています。この研究で使用されている顕微鏡には、2つの外部NIR検出器と、以下のレーザーラインも装備されています：405、458、488、514、561、594、639、および730 nm。
アルミニウム箔	Essendant	BWK7112
分析用バランス	Mettler Toledo	MR204
防倒ガラスプレート	Gel Company	LGI70
Arivis Proソフトウェア	ZEISS	バージョン4.1.2
バスソニケータ	Branson Ultrasonics	71020-MT
ウシ血清アルブミン	Research Products International	A30075
遠心管、15 mL	CELLTREAT	229411
帯電した顕微鏡スライド	Globe Scientific	1358W
クリップリムーバー	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
コットンチップアプライヤ	Puritan Medical	25-8061WC
クライオスタット	Leica Biosystems	CM3050 S
クライオスタットブレード	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	ddH2Oで5 mg/mLに調製し、アライオットし、-20 °Cで光から保護して保存
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDipスライド染色システム	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
埋め込みモールド、22 mm × 22 mm × 20 mm	Polysciences	18646A-1
エタノール、200プルーフ	Decon Labs	V1001
開窓滅菌ドレープシート	Dukal	20001
ファインフォースプス	Fine Science Tools	11445-12
ガラスビーズ滅菌器	VWR	75999-324
ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
加熱パッド	CVS	215313
止血用フォースプス	World Precision Instruments	501705
イマージョンオイルImmersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
誘導チャンバー	World Precision Instruments	EZ178
インシュリン注射器、0.3 mL	BD	328431
アイリス外科用はさみ	Sklar Surgical Instruments	47-1135
イソフルラン	Patterson Veterinary	07-890-8115
キムワイプ	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL注射器	BD	309628
Luer-Lok 3 mL注射器	BD	309657
Luer-Lok 50 mL注射器	BD	309653
Meloxivet（メロキシカム）	Patterson Veterinary	07-894-8524
マイクロ遠心管、1.5 mL	CELLTREAT	229443
顕微鏡スライドボックス	Heathrow Scientific	15994E
顕微鏡スライドカバーガラス、#1.5、22 mm × 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
非CO2インキュベーター	Benchmark Scientific	H2200-H
非開窓滅菌ドレープシート	Dukal	20-002
OCTコンパウンド	Sakura Finetek USA Inc	4583
眼科用軟膏	Patterson Veterinary	07-888-2572
浸透圧ミニポンプ	Alzet	2004
パラフィルム	Bemis	PM999
パラホルムアルデヒド、4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS、1´	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES注射器フィルター、0.22 μm	CELLTREAT	229747
ポビドンヨウ素10% USPスワブスティック	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
ウサギ抗Tom20抗体	Novus Biologicals	NBP2-67501
剃刀刃、0.22 mm	VWR	55411-050
ローテーター/ロティサリー	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	バージョン4.3.2
スケール	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite低流量麻酔システム	Kent Scientific	SS-01
スチーム滅菌インジケーターストリップ	Crosstex	SIS-250
滅菌ガラスバイアル、5 mL	Thermo Scientific	ST5
滅菌針、0.5インチ、23 G	BD	305145
滅菌針、0.5インチ、27 G	BD	305109
滅菌ポーチ	Cardinal Health	92510
スクロース	Sigma-Aldrich	S9378	1´ PBSで30% w/vの溶液を調製
外科用クリッパー	3M	9680
外科用手袋	Cardinal Health	2D73DP75