本研究は、エタノール誘発性胃上皮細胞損傷に対する三気白極三の保護効果とPI3K/AKT関連シグナル伝達への関与を評価する in vitroモデル を記述しています。
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本研究は、エタノール誘発性胃上皮細胞損傷に対する三気白極三の保護効果とPI3K/AKT関連シグナル伝達への関与を評価する in vitroモデル を記述しています。
本研究は、エタノール誘発性胃上皮細胞損傷に対する三気白極三(SQBJ)の保護機序を明らかにし、胃潰瘍(GU)への潜在的関連性を探ることを目指しました。ネットワーク薬理学は、SQBJの有効成分(伝統中国医学システム薬理学データベース・分析プラットフォーム[TCMSP]、経口バイオアベイビリティ[OB]≥20%、薬剤類似度[DL]≥0.1)、ターゲットのマッピング(ユニバーサルプロテインリソース[UniProt])、GU関連ターゲット(GeneCards/OMIM/DrugBank)の収集、および遺伝子オントロジー(GO)/京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃密化および分子ドッキングによる重複標的の解析に用いられました。エタノール損傷した胃上皮細胞株1(GES-1)細胞はSQBJまたはPI3K阻害剤LY294002で処理されました。最適なSQBJ濃度を決定するためにCCK-8を用いました。ネットワーク薬理学解析により、PI3K/AKT/MAPK関連カスケード内に濃縮される126の共通標的が特定され、主要なSQBJ成分とPI3K/AKT関連タンパク質間の潜在的な相互作用が示唆されました。エタノール障害細胞では、SQBJは炎症性メディエーターの放出と酸化ストレスを減少させることで細胞損傷を緩和し、細胞内活性酸素種やマロンジアルデヒドレベルの減少が示されました。SQBJはミトコンドリア膜電位とATP含有量を回復し、B細胞リンパ腫-2、切断カスパーゼ-3、Bcl-2関連Xタンパク質レベルのアポトーシス関連変化を減少させました。SQBJはまた、PI3K/AKTおよびMAPKに関連するシグナリングマーカーも変調しました。これらの保護効果はLY294002によって大きく弱まり、PI3K/AKT関連シグナル伝達がSQBJ介在の細胞保護に関与していることを示唆しています。これらの発見は、GUにおけるSQBJの応用の可能性におけるin vitroのメカニズム的基盤を提供しますが、エタノール誘発性胃潰瘍の動物モデルでのさらなる検証が必要です。
胃潰瘍(GU)は、世界的に非常に有病率の高い消化器疾患であり、局所的な炎症、侵食、胃粘膜の潰瘍を特徴とします。2021年のグローバル疾病負担(GBD 2021)分析の推計によると、消化性潰瘍病(PUD)は世界中で何百万人もの患者に依然として大きな臨床的・経済的負担をもたらしています。抗感染薬や酸抑制プロトンポンプ阻害剤(PPI)への臨床的依存が広範かつ広範囲に及ぶにつれて、PUDの全体的な有病率は減少していますが、この減少傾向は停滞し、一部の地域では反発が観察されています。特に、アルコール(エタノール)摂取は ヘリコバクター・ピロリ (H. pylori)感染や非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)使用とは独立した重要な病原性因子です。長期の過剰なアルコール摂取は胃粘膜関門を損傷し、潰瘍の進行を加速させ、さらには胃がんのリスクを高めるため、この状態は深刻な国際的な医療危機となります。発展途上国では、アルコール摂取の増加や生活習慣の変化など複数の要因により、アルコール関連の胃粘膜損傷の発生率が増加しており、効果的かつ安全な予防・治療戦略の緊急性が高まっています。
エタノール誘発性胃粘膜損傷の病理学的メカニズムは多因子的かつ多層的です。胃粘膜に直接接触すると、エタノールは粘液・重炭酸関門を急速に破壊し、細胞内活性酸素(ROS)の制御不能な急増を引き起こします。この酸化的爆発は脂質過酸化(マロンジアルデヒド(MDA)上昇を伴い)、胃の粘膜内の内因性抗酸化物質(スーパーオキシドジムターゼ(SOD)やグルタチオン(GSH)を枯渇させ、最終的にミトコンドリア機能障害を誘発します。蓄積される証拠は、エタノールによって誘導される細胞内ROSは主にミトコンドリア由来であり、内ミトコンドリア膜電位(Δψm)の崩壊およびアデノシン三リン酸(ATP)合成の阻害と密接に関連していることが示されています。一方、酸化ストレスは核因子カッパB(NF-κB)の指令下で炎症促進カスケードをさらに活性化します。この活性化により、主に腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン6(IL-6)、C反応性タンパク質(CRP)などの炎症性メディエーターの大量放出が促進され、「酸化ストレス炎症反応」という悪循環が形成されます5。この基礎に基づき、ミトコンドリアによる内在性アポトーシスカスケードが誘発されます。これは、Bcl-2とBaxの比率の乱退と、システインニルアスパラルターテ異的プロテナーゼ3(カスパーゼ-3)の連続酵素的プロテオリタンス切断によって示されており、最終的に胃粘膜上皮細胞の大量死と潰瘍形成につながります6.したがって、酸化ストレス、炎症反応、アポトーシスという3つの主要な病理的関連を同時に標的化することは、アルコール性胃粘膜損傷の効果的な介入における重要な戦略です。
ホスホイノシチド3-キナーゼ/タンパク質キナーゼB(PI3K/AKT)シグナル伝達経路は、細胞の寿命、増殖、プログラム死を支配する中央調節軸を構成し、胃粘膜恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。活性化後、PI3K/AKTシグナル伝達は複数の下流基質をリン酸化し、プロアポトーシス因子Badの活性を阻害し、細胞破壊性のシトクロムcのミトコンドリア逃逸を妨げ、ΔΨm恒常性を維持し細胞生存を促進します7。さらに、PI3K/AKTカスケードとミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)ネットワークの間には複雑な対照的なクロストークがあります。PI3K/AKTのアップレギュレーション活性化は、p38、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、および細胞外調節タンパク質キナーゼ(ERK)などのストレスキナーゼの活性化を阻害することで、炎症シグナル伝達やアポトーシスカスケード反応を弱めることができます8.複数の研究によれば、PI3K/AKT経路の活性低下は胃粘膜損傷モデルにおける炎症の悪化やアポトーシスの増加と密接に関連しており、この経路の活性の回復は粘膜損傷を著しく改善する可能性があると示されています。しかし、エタノール誘発性胃粘膜損傷におけるPI3K/AKTの正確な調節機構、特にMAPK経路との相乗効果について、体系的な因果的実験的検証は現在不足しています。
現代の薬物療法において、PPIはGUの臨床管理における第一選択薬ですが、長期投与は安全性への懸念を増しています。累積研究では、慢性PPI使用が腎疾患、心血管イベント、骨粗鬆症骨折、栄養不足(鉄、マグネシウム、ビタミンB12)、クロストリジオイデス・ディフィシルなど、さまざまな有害な結果と関連していることが明らかになっています。感染、さらには胃がんのリスク増加まで10。さらに、PPI中止後の胃酸過剰分泌の現象は大規模な薬物監視データによって確認されています11。これらの安全性リスクにより、臨床および基礎研究コミュニティは多標的保護機構、副作用が最小限、長期使用に適した代替療法の積極的な探求を促しています。特に、伝統中国医学(TCM)の天然化合物製剤は、「多成分・多標的・多経路」というホリスティックな治療概念により広く注目を集めています。
三気白極粉(SQBJ)は、 パナックス・ノトギンゼ ンと ブレティヤ・ストライアタ を1:1の質量比で構成した古典的な中医化合物です。 パナックス・ノトギンセン は、血行促進や止血、そして痛みを伴う腫れの緩和効果でよく知られています。その主要な生物活性成分であるノトギンセノサイドR1やジンセノサイド(Rg1、Rb1)は、抗炎症、抗酸化、粘膜修復に重要な効果を発揮します。 紋状 斑点状の色斑点菌は収斂作用で、出血を止め、腫れを抑え、損傷組織の再生を促進します。同時に、主要な有効抽出物である Bletilla striata 多糖(BSP)は、JNK/p38 MAPKカスケードを抑制し、インターロイキン-1β(IL-1β)、TNF-α、IL-6の発現を減少させ、胃粘膜13の抗酸化防御能力を高める効果が確認されています。蓄積された文献証拠により、 Panax notoginseng. saponins(PNS)とBSPの併用がアルコール性胃潰瘍モデルにおいて相乗効果を発揮することが確認されており、SQBJ関連の製剤は逆流食道炎および消化性潰瘍の前臨床研究で粘膜保護効果が顕著であることが示されています15。しかし、SQBJの胃粘膜保護効果の背後にあるシグナル伝達経路のメカニズム、特にPI3K/AKT経路の中核的役割とMAPKとの調節関係について、現在は体系的なin vitro実験的検証は存在しません。一方で、SQBJの重要な成分化学物質と機能的受容体との因果関係はまだ完全には解明されていません。
これらのギャップを埋めるため、本研究はネットワーク薬理学と in vitro 実験検証を組み合わせた統合研究戦略を採用し、エタノール挑戦性GES-1細胞株を実験プラットフォームとして用いて、SQBJの胃上皮保護効果の分子メカニズムを調査する。特に酸化ストレス、炎症反応、アポトーシス過程、PI3K/AKT関連シグナル伝達に重点を置いている。 およびMAPKに関連する変更点。まず、PI3K阻害剤LY294002を用いてPI3K/AKTシグナル伝達の関与を予備的に評価し、この経路の阻害がSQBJの保護効果を弱めることを明らかにし、PI3K/AKT関連シグナル伝達がSQBJ介在性細胞保護に寄与していることを示唆しました。次に、PI3K/AKT関連変化とMAPK経路調節との関連を探り、MAPKシグナル伝達の変化がPI3K/AKT軸の機能応答のSQBJ調節と関連している可能性を示す予備的証拠を提供しました。本研究は総合的に、SQBJがエタノール誘発性胃上皮損傷をどのように軽減するかを評価するためのinin vitro 分子フレームワークを確立し、アルコール性胃粘膜損傷におけるTCM化合物のさらなる探究のための予備的証拠を提供します。しかし、これらの細胞保護効果が in vivo に翻訳可能かどうかを確認するためには、依然として動物実験が必要です。アルコール駆動胃潰瘍の実験モデルにおける治療効果(補足図S1)。
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この研究にはヒト参加者、ヒト組織サンプル、臨床標本、動物実験は含まれていません。ネットワーク薬理学解析には公開および匿名化されたデータベース資源が使用され、市販のGES-1細胞はin vitro実験に使用されました。したがって、正式な倫理的承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。主要な試薬、抗体、アッセイキット、機器、製造元、カタログ番号、研究資源識別子(RRID)に関する詳細情報は、該当する場合は材料 表にまとめられています。
SQBJ水抽出物の調製および品質管理
ハーブ材料
パン ナックス・ノトギンゼン (バーク)、F. H. チェン(根と根茎)および ブレティラ・ストライアタの原料。(Thunb. ex A. Murray)Rchb. f.(塊茎)は商業的な伝統中国医学の供給業者から入手され、その後中国薬局書(2025年版)に基づき上級中医薬剤師によって認証されました。バウチャー標本(番号)SQBJ-20240301、番号。PN-20240301、番号。BS-20240301)は当機関の標本館に寄贈されました。2つのハーブは1:1の質量比で砕かれ混ぜられ、SQBJ粉末を製造しました。
SQBJ水抽出物の調製
SQBJパウダーは脱イオン水で1:10(g/mL)の固体と液体の比率で1時間にわたり2回連続で逆流抽出を受けました。その後、採取した抽出物を組み合わせて4層の医療用ガーゼを通して残留物を除去しました。得られたろ液は60°Cの低圧下で相対密度1.05〜1.10まで濃縮され、その後真空凍結乾燥でSQBJ水抽出粉末が得られ、最終抽出率は18.2%±0.6%でした。抽出粉末は−20°Cで密封され保存され、血清不含有のDMEM培地に溶解され、その後細胞実験前に0.22μmの膜フィルターを通して滅菌されました。
SQBJ水抽出物の品質管理
SQBJ水抽出物のバッチごとの一貫性と標準化を評価するため、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)指紋プロファイリングと並行して定量的決定を行いました。 材料表 にはHPLCシステムに関する包括的な技術的パラメータが記載されています。両方の成分ハーブの化学プロファイルに基づき、ノトギンセノサイドR1、ジンセノサイドRg1、ギンセノサイドRb1、ミリタリンの4つの代表的なマーカーを標的化しました。しかし、このHPLCベースの品質管理戦略は主にいくつかの代表的な成分を反映しており、SQBJ内のすべての有効成分の包括的な化学プロファイルを提供しませんでした。
クロマトグラフィー分離は、逆位相C18カラム(4.6 mm × 250 mm、5 μm)によって達成されました。この操作は30°Cのカラム温度で維持され、流量は1.0 mL/min、注入容量は10 μL、検出波長は203 nmでした。移動相の組成はアセトニトリル(A)と0.1%リン酸水溶液(B)で構成され、勾配の洗脱ランは0–15分、19%A;15〜35分、19%〜35%のA;35〜55分、35%〜55% A;55〜60分、55%〜19%A。詳細な計測器およびカラム情報は 材料表に記載されています。
基準物質の製造
定量分析を行うために、ノトギンセノサイドR1、ジンセノサイドRg1、ギンセノサイドRb1、ミリタリンの市販標準を取得し、いずれも純度≥98%でした。個々の基準化学物質は正確に測定され、単一のメタノールストックに溶解され、各成分の最終濃度50 μg/mLの均一な混合基準溶液が得られました。
サンプルの準備:
SQBJ水抽出物の乾燥粉末(50 mg)を正確に測定し、その後分析用メタノール25 mLを用いて溶解しました。この混合物は制御された機器パラメータ(出力:250W、周波数:40kHz)のもとで30分間超音波洗浄を受けました。常温に戻った後、液体は0.22μmの有機フィルター膜を通し、最終的な分析試験溶液を得ました。
コンテンツ判断結果:
SQBJ水抽出物の3回連続バッチにおけるコア特性成分の平均含有量は以下の通りで、ノトギンセノサイドR1 3.12 ± 0.11 mg/g、ジンセノサイド Rg1 8.45 ± 0.23 mg/g、ジンセノサイドRb1 5.26 ± 0.18 mg/g、ミリタリン 2.78 ± 0.09 mg/gで、各成分<含有量のRSDはバッチ間で5%であり、抽出物のバッチごとの良好な一貫性が確認されました。
倫理およびコンプライアンス声明
本研究では動物実験やヒト臨床標本、組織生検、生体被験者の納入は含まれていませんでした。ネットワーク薬理学解析は、TCMSP、UniProt、GeneCards、OMIM、DrugBank、STRING、Metascape、PubChem、RCSB PDBなどの公開データベースを用いて実施されました。これらのデータベースから取得されたすべてのデータは公開され匿名化されていました。したがって、バイオインフォマティクスのプロファイリングは正式なインフォームド・コンセントや追加の倫理的監督を義務付ける必要は完全に免除されました。
本研究は、市販のヒト胃粘膜上皮細胞株GES-1を用いてin vitro 実験を行いました。一次ヒト細胞や患者由来の生物材料は使用されませんでした。細胞株は認証済みの細胞リポジトリから取得され、機関のバイオセーフティおよび細胞培養ガイドラインに従って取り扱われました。この研究は確立された細胞株と公開データベースのみを対象としていたため、正式な倫理委員会の承認を免除されました。すべての実験手順は、関連する機関の実験室の安全性および研究コンプライアンス要件に従って実施されました。
ネットワーク薬理学研究
有効成分標的の同定とスクリーニング
SQBJの2つの構成成分である Panax notoginseng と Bletilla striata.の有効成分は、公開されているデータベースから取得されました。本研究で使用されたすべてのデータベース由来情報は公開されており、特定可能な個人情報は含まれていませんでした。植物名をクエリとして用いて、伝統中国医学システム薬理学データベース・分析プラットフォーム(TCMSP)から候補植物化学物質を特定しました。適格なバイオアクティブ分子を特定するために、スクリーニングプロトコルでは経口バイオ利用能(OB)≥20%、薬剤類似度(DL)≥0.1の閾値を適用しました。次に、これらの候補成分に関連する潜在的な下流遺伝子標的を特定し、有効な遺伝子標的と一致しない成分は除外しました。すべてのターゲット遺伝子はUniversal Protein Resource(UniProt)によって注釈・標準化され、参照データベースの検索はホモ・サピエンスに限定され、機能的SQBJ活性成分の最終的なターゲット遺伝子リストが生成されました。
病理関連標的の回収
この疾患に関連する遺伝子を収集するため、私たちは3つの公開データベース、GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)、DrugBankを「gastric ulcer」という検索語で検索しました。その後、クロスプラットフォームデータセットは統合され、冗長なエントリーを削除して胃潰瘍関連標的遺伝子の標準化リストが作成されました。
成分、標的、病原病のネットワーク構築
SQBJ活性成分と胃潰瘍の重複する標的遺伝子を特定しました。その後、ネットワーク可視化ソフトウェアを用いて多層的なインタラクションネットワークが構築されました。ノードの重要度を評価するために、統合トポロジカル評価アルゴリズムは各ノードの位相パラメータ(次数および中間の中心性を含む)を計算しました。これらの計算値に基づき、胃潰瘍治療におけるSQBJの活性成分および主要な機能的標的を特定しました。
タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークのマッピング
SQBJと胃潰瘍の間で共有された合意目標をSTRINGデータベースと照合しました。私たちのクエリはマルチタンパク質解析テンプレートを指定しつつ、分析的背景を ホモ・サピエンス に限定しました。PPIは最小相互作用信頼度閾値(> 0.4)でフィルタリングされました。
得られた機能的接続記録はTSVファイルとしてエクスポートされ、その後PPI解析用の専用ネットワーク可視化ソフトウェアに統合されました。計算された接続トポグラフィーに基づき、ネットワーク内のコア機能ノードを各ノードの特定の次数値をランク付けして評価しました。
下流の機能注釈と経路マッピング
共有交差ノードの生物学的役割を明らかにするため、ウェブ上でアクセス可能なバイオインフォマティック注釈ツールを用いて、遺伝子オントロジー(GO)機能豊化解析および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路強化解析を実施しました。機能分類では、遺伝子は生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)の3つの古典的なカテゴリーに分類されます。オンラインバイオインフォマティクスプロットプラットフォームを用いて、SQBJの胃潰瘍に対する治療効果に関連する主要な生物学的プロセスとシグナル伝達経路をマッピングするために、濃縮結果のためのバブルプロットと棒グラフを作成しました。
計算分子ドッキングシミュレーション
SQBJのコアアクティブコンポーネントの空間幾何学ファイルは公開された複合施設データベースからダウンロードされ、その後ファイル処理ソフトウェアを使ってMOL2ファイルとして保存されました。また、Protein Data Bankを問い合わせてコアターゲットタンパク質の三次元結晶構造も取得しました。これらの高分子構造は元の配位子と水分子を除去して前処理され、得られたクリーンなモデルはPDB形式で保存されました。受容体-リガンド結合エネルギーをシミュレートするため、コア活性成分と標的タンパク質のドッキング検証は標準的な計算分子ドッキングソフトウェアで実行されました。ドッキング結果は分子可視化ソフトウェアで最適化・レンダリングされました。
細胞培養
GES-1ヒト由来の胃上皮細胞は、RPMI-1640培地に10%胎児用牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを統合し、37°Cの湿度下で5% CO₂を含む加湿大気のもと培養しました。私たちは、認証済みの細胞リポジトリから初期株を取得し、確立された細胞株としてソース培養を特定しました。観察された80〜90%の合流点で、単分子層はPBSで2回洗浄し、その後0.25%トリプシンEDTAを用いて37°Cで2分間剥離しました。 酵素的切断反応を終わらせるために、同量の完全な培地を導入しました。得られた細胞懸濁液は1,000× g で5分間遠心分離し、その後ペレットを新鮮な完全な培地に再懸浮させ、適切な密度で再播種しました。培養は同じ培養条件に戻されました。伝播期間中、逆位相差顕微鏡を用いて細胞の生存可能性、形態、成長状態を評価し、対数成長段階の細胞は後続解析のために定期的に収集されました。
エタノール誘発性GES-1細胞損傷モデルの確立と治療
対数相のGES-1細胞は、6ウェルプレートに5×10個5セル/ウェル、または96ウェルプレートで1×10個4セル/ウェルでシードされ、一晩培養されて接着しました。エタノール誘発損傷は、補助なしのRPMI-1640に500 mmol/Lのエタノールを4時間曝露することで確立されました。この条件は、予備的な濃度および時間応答実験に基づいて選ばれました。予備アッセイでは、250 mmol/Lエタノールを4時間投与したことで軽度の損傷のみを生じさせ、細胞の生存率は約78.6±5.4%で維持されました。一方、750 mmol/Lのエタノールは生存率を32.8 ± 4.7%に低下させ、過剰な細胞毒性を示しました。500 mmol/Lエタノールに4時間曝露すると細胞生存率は54.7 ± 4.9%に低下し、再発性のある中等度から重度の損傷を生み出しつつ、十分な生存細胞を保持し、その後の介入および機構的アッセイに備えました。したがって、モデル設置のために4時間分のエタノール500 mmol/Lが選ばれました。この状態は、in vitroで急性エタノール誘発性上皮損傷をシミュレートするために用いられ、胃粘膜の生理的曝露パターンを生体内で完全に再現することはできません。
薬理学的介入として、3濃度のSQBJ水抽出物(5、10、50 μg/mL)を選択し、エタノール挑戦直後に投与しました。PI3K阻害群では、細胞はエタノールと最適なSQBJ濃度で共処理する前に、20μmol/LのLY294002前培養液で30分間プレインキュベートされました。陽性対照コホートはエタノール曝露直後に20μmol/Lのオメプラゾールを投与されました。オメプラゾールは用量相当の比較薬ではなく、胃胃保護薬の基準として使用されました。濃度は、予備的な細胞毒性評価および一般的に用いられるin vitro介入範囲に基づいて選定され、細胞保護の薬理学的参照を提供することを意図していました。対照細胞はエタノールや追加剤を使わず、完全培地で維持されました。すべてのインキュベーションは、CO₂5%を含む加湿大気、37°Cで行われました。 各実験群は少なくとも3つのレプリケートウェルで構成され、プロトコル全体は3回独立して実行されました。
CCK-8法による最適SQBJ濃度の決定
ログ相のHGE/GES-1元素は、密度1 ×10 4 セル/ウェルの96ウェルベクターにメッキリングされ、標準条件(37°C、5% CO₂)の完全なRPMI-1640培地で一晩培養され、接着性を確保しました。培養群は4つのグループに無作為に分けられました:車両対照群(完全ミディムのみ)、低用量SQBJ介入(5 μg/mL)、中用量SQBJ介入(10 μg/mL)、高用量SQBJ介入(50 μg/mL);これら3つの濃度は治療スクリーニングに利用され、PBSにSQBJを溶解して調製しました。すべての条件は少なくとも3つの並行井戸で分析され、全体のプロトコルは3つの異なる実験バッチで繰り返されました。指定された処理期間の後、各井戸に10μLのCCK-8試薬が投与され、その後37°Cで2時間の培養期間が設けられました。 450nmでの光学密度(OD)はマイクロプレートリーダーを用いて測定されました。細胞生存率は(absorbance_treatment / absorbance_control)×100%と計算され、後続実験で最も効果的なSQBJ濃度を特定しました。
qPCR
ログフェーズのGES-1元素は6ウェルプレート(1ウェルあたり5×105 セル)で培養され、5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで37°Cで一晩維持され、付着を確保しました。その後、細胞はあらかじめ決められた最適濃度のSQBJにさらされ、ベースライン(0時間)および処理後6、12、24、48時間後に採取してシグナル伝達分子の動的応答を調べました。時間経過の結果に基づき、24時間間隔が細胞の生存率を保ちつつ最も強いシグナル応答を示したため、その後の機構的アッセイに選ばれました。各時刻は3つの三重井戸で表され、実験全体を独立して3回繰り返しました。
特殊な抽出試薬を用いて全RNAを単離し、分光光度計を用いて濃度と収率の質を評価しました。すべての試料は吸収比A₂₆₀/A₂₈₀で1.8および2.0の範囲を示しました。gDNAワイパーを用いた逆転写キットを用いて、1 μgの総RNAからcDNAを逆転写しました。リアルタイムPCR解析は、PI3K、AKT、p38、JNK、ERK、および参照遺伝子GAPDHのプライマーを用いた定量PCRシステムによって実施されました。PCRシステム、試薬、プライマー合成サービスの詳細は 材料表に記載されています。プライマーは対応するヒト遺伝子の特定の領域に設計されました。qPCRプロトコル:95°Cで30秒間ホットスタート活性化、その後95°Cで5秒間変性40サイクル、60°Cで30秒のアニーリング/拡張。標的遺伝子mRNA発現の計算は、2-ΔΔCt 法を用いた相対定量PCR法に依存していました。
エリサ
上清液は1,200 × g で遠心分離し、4°Cで10分間細胞の残骸除去を行いました。炎症性メディエーター(CRP、IL-6、TNF-α)および酸化ストレス指数(SOD、MDA、GSH)のレベルは、製造元の指示に従い市販ELISAキットを用いて評価されました。これらの標的の濃度プロファイルは、供給者の指示に従い商業アッセイ製剤で検証されました。各実験群は3つの複製ウェルで構成され、実験データの再現性を確認するために3つの別々の細胞培養バッチで手順が実施されました。簡単に、標準物質または精製上清液100μLをあらかじめコーティングされた反応板に投与し、37°Cで90分間インキュベートしました。3回連続の洗浄サイクルの後、各空洞に100μLの特異的検出抗体を37°Cで60分間のインキュベーションで投与し、その後さらに3回の洗浄サイクルを行った。次に基質溶液(100μL)を導入し、試料を15分間光から保護した後、50μLの停止液で酵素反応を遮断しました。450 nmの光学密度はマイクロプレートリーダーで検出されました。濃度は対応する標準曲線から補間されました。細胞数の違いや処理による細胞生存率の変化によるバイアスを最小限に抑えるため、MDA、SOD、GSH、CRP、TNF-α、IL-6プロファイルをBCAアッセイで測定した各分析サンプルのタンパク質含有量と比較し、対照群と比較して相対値として表しました。
DCFH-DA蛍光プローブを用いたGES-1細胞内の細胞内ROS検出
細胞内活性酸素種(ROS)レベルを定量化するために、膜透過性フルオロゲン指標であるDCFH-DAを使用しました。採取した細胞は、10μmol/L DCFH-DAを含む補助なしRPMI-1640に再懸濁され、標準培養条件(37°C、5% CO₂)で暗闇で20分間維持されました。血清フリー培地で3回連続洗浄して非結合プローブをクリアした後、488nm励起、525nm放出のフローサイトメトリーで蛍光強度を監視しました。相対ROSレベルは、各処理群の平均蛍光強度として報告され、CCK-8アッセイを用いて並列ウェルで決定された生存細胞数に正規化され、対応する対照群に対して表されました。
ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の測定
市販のJC-1アッセイキットを用いてミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の変化を評価しました。簡単に言えば、採取した細胞は新たに調製されたJC-1作業液(キットから供給されたJC-1染料と染色バッファーの等量混合液)に再懸浮させられ、最終細胞濃度は1 ×10 6 cells/mLにされました。5%のCO₂を含む加湿環境で37°Cで20分間インキュベートし、漂白を防ぐために光を遮断した後、遠心分離(800 × g、5分)で採取し、氷で冷却したJC-1染色バッファー1 mLで1回洗浄しました。その後、フローサイトメトリーによって蛍光が取得されました。
JC-1集合体(ΔΨmが完全な状態を示す)はFL2チャネルで488 nm励起、590 nm放出波長で監視され、JC-1モノマー(ΔΨm散逸を示す)はFL1チャネルで488 nm励起と525 nm放出設定で追跡されました。ΔΨmは赤色から緑色の蛍光信号比率として表され、値の低下はミトコンドリア脱分極を示します。
細胞内ATPレベルの測定
ミトコンドリア機能はATPアッセイキットを用いた細胞内ATP定量によって評価されました。ルシフェリン–ルシフェラーゼ生物発光反応を用いてATP含有量を測定し、これはミトコンドリア活性に比例します。簡単に、採取した細胞は氷のように冷たいATP溶解バッファーに再懸浮させ、氷上で5分間の溶解ウィンドウを保持しました。その後、12,000 × g で4°Cで5分間遠心分離を行い、その後、得られた20μLの透明な上清液を96ウェルの白色不透明マイクロプレートに移しました。その後、各キャビティに新たに調製されたATP検出作動液100μL(提供されたプロトコルに従って調製されたルシフェラーゼ試薬とルシフェリン基質の混合液)が導入されました。その結果得られた発光信号は、発光マイクロプレートリーダーで迅速に捕捉されました。相対的なATPレベルを得るために、生の発光値は市販のBCAタンパク質アッセイキットで定量化された個々の上清液総タンパク質濃度に正規化され、細胞数の変化を補正しました。
アネキシンV/PI二重染色による細胞アポトーシスの検出
アポトーシス細胞検出は、製造元が示す商業的なAnnexin V-FITC/PI細胞死アッセイ構成で実施されました。洗浄後、ペレットはAnnexin V-FITC結合バッファーに再懸浮され、細胞密度は1 ×6 cell/mL(サンプルあたり195 μL)にされました。その後、各独立したチューブには5μLのAnnexin V-FITCが投与され、続いて10μLのPI染色溶液が投与されました。サンプルは穏やかに渦巻き、室温の暗闇で15分間培養されました。この過程の後、フローサイトメーターでアポトーシス細胞を監視しました。それぞれの蛍光チャネルは、生存細胞(Annexin V⁻/PI⁻)、初期アポトーシス細胞(Annexin V⁺/PI⁻)、および後期アポトース/壊死細胞(Annexin V⁺/PI⁺)の分化を促進しました。各グループにおけるアポトーシス細胞の割合は、これらのゲートパラメータに従って定量化されました。
ウェスタン・ブロット
膜は4°Cで一晩、Bcl-2、Bax、切断カスパーゼ3、AKT、p38 MAPK、JNK、ERK1/2、GADHに対する一次抗体とともにインキュベートされました。抗体はヒトサンプルおよびウェスタンブロット適用の検証情報に基づいて選択されました。抗体登録簿またはRRIDポータルに記録があるすべての抗体に対してRRIDが追加されました。標的タンパク質レベルはGAPDHに正規化されました。標準的な洗浄プロトコルの後、ブロットは室温で1時間にわたりHRP結合二次抗体に曝露されました。バンドはECL基質溶液を用いて検出されました。ウェスタンブロットのグレーはデジタル画像解析ソフトウェアを用いて評価されました。
免疫蛍光染色
GES-1単分子層は、指示処理前に24ウェルプレート内のガラスカバースリップに確立されました。治療後、4%パラホルムアルデヒドを室温で15分間固定し、その後PBS中の0.3%トリトンX-100を用いた膜透過10分、さらに37°Cで5%牛血清アルブミンを30分間ブロッキングしました。 その後、4°Cで1晩培養するためにカバースリップを移し、一次抗体をAKT、p38、JNK、ERKに標的化しました。3回連続のPBS洗浄後、標本は蛍光結合抗ウサギ二次抗体を照射し、光から保護されて室温で1時間培養されました。核の可視化のために5分間DAPIカウンターステインを施しました。その後、カバースリップにアンチフェード試薬を装着し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて標的タンパク質の細胞内分布を測定しました。すべての免疫蛍光画像は、20×の対物レンズを用いて同じイメージングパラメータで撮影されました。代表的な免疫蛍光画像には50μmに対応するスケールバーが追加されました。
統計解析
定量値は、少なくとも3回の独立した実験実行から得られる平均±標準偏差(SD)として示されており、各サンプルは三重に検証されています。統計解析は専門的な数値解析ツールを用いて実施されました。複数のコホート間で異なる変動を特定するために、グループ間比較には一方向分散分析(ANOVA)とTukeyのポストホック検定を併用しました。Pの両側閾値は0.05の指定統計的有意<。
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胃潰瘍におけるSQBJ媒介機構のバイオインフォマティック解剖
SQBJがGUにどのように薬理学的作用を及ぼすかを探るため、当初はその主要なバイオアクティブ成分に対応する標的を予測しました。Rプログラミングを用いて、これらのバイオアクティブ成分の中から冗長なエントリを抽出・除去し、最終的に411の候補標的を得ました。その後、GUに連結された病理標的をGeneCardsおよびOMIMプラットフォームで検索し、1,643の異なる疾患特異的遺伝子座を分離しました(補足ファイル1)。疾病標的とSQBJの構成要素の標的を交差させることで、126の共通の主要標的が特定されました(図1A)。これらの共有標的を用いて、PPIトポロジー(図1B)とその図示的表現(図1C)の評価により、密に相互接続されたタンパク質のハブモジュールが特定され、SQBJ-GU標的ネットワークに関...
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本研究の主な目的は、パ ナックス・ノトギンゼン と ブレティラ・ストライアータからなる古典的なTCM化合物であるSQBJが、GES-1細胞モデルにおいてエタノール誘発の胃粘膜上皮損傷に対して細胞保護活性を持つかどうかを評価することでした。これにはPI3K/AKT関連シグナル伝達の関与、炎症メディエーターの減少、酸化ストレス指標、ミトコンドリア機能障害、アポトーシスイベントが含まれます。本研究の主な成果は以下の通りです。ネットワーク薬理学解析により、PI3K/AKT–MAPK軸がGU治療におけるSQBJの潜在的な機構ハブとして特定されました。エタノール挑戦GES-1細胞では、10 μg/mLのSQBJ抽出物が用量依存的かつ時間依存的に細胞の生存能力を回復し、炎症性および酸化的バイオマーカーを抑制し、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)とATP産生を保持し、Bcl-2/Bax/カスパーゼ-3調節によるアポトーシスを抑制しました。これらの効果はPI3K阻害剤LY294002によって大幅に弱まり、エタノール損傷したGES-1細胞のSQBJ媒介保護に...
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著者には利益相反を主張するものはありません。
本研究は江蘇省中医科学技術開発計画プロジェクト-総合プロジェクト(2023年)、プロジェクト番号:MS2023118の資金提供を受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アポトーシスアッセイ | Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キット | Beyotime | C1062L |
| ATPアッセイ | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| バッファー | PBS | Solarbio | — |
| 細胞消化試薬 | 0.25% トリプシン-EDTA | Gibco | 25200072 |
| 細胞株 | GES-1 ヒト胃粘膜上皮細胞 | 中国科学院細胞銀行 | SCSP-533 |
| 細胞生存能アッセイ | CCK-8 試薬 | — | — |
| 共焦点顕微鏡 | LSM 880 共焦点顕微鏡 | Zeiss | LSM 880 |
| 培養培地 | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISAキット | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISAキット | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISAキット | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| フローサイトメーター | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| 薬草材料 | 白茯苓（Thunb. ex A. Murray）Rchb. f.（塊茎） | 安国中薬市場 | Voucher No. BS-20240301 |
| 薬草材料 | 三七（Burk.）F. H. Chen（根および根茎） | 安国中薬市場 | Voucher No. PN-20240301 |
| 薬草材料 | 三七白芍散粉末 | 自家製 | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| HPLCカラム | ZORBAX SB-C18 カラム | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLCシステム | 1260 Infinity II HPLC システム | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF二次抗体 | Alexa Fluor 594＆ndash;結合抗ウサギIgG | Invitrogen | A11012 |
| 倒立顕微鏡 | CKX41 倒立式対比顕微鏡 | Olympus | CKX41 |
| 発光測定器 | Infinite 200 PRO マイクロプレートリーダー | Tecan | Infinite 200 PRO |
| 膜 | PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 |
| マイクロプレートリーダー | iMark マイクロプレートリーダー | Bio-Rad | iMark |
| ミトコンドリア膜電位キット | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| 核染色 | DAPI | Beyotime | C1002 |
| オンラインプラットフォーム | オンラインバイオインフォマティクスプロットプラットフォーム | バイオインフォマティクスオンライン分析プラットフォーム | オンラインプラットフォーム |
| オンラインプラットフォーム | Webベースの富化分析プラットフォーム | Metascape | オンラインプラットフォーム |
| 酸化ストレスアッセイ | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| 酸化ストレスアッセイ | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| 酸化ストレスアッセイ | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K阻害剤 | LY294002 | MCE | S1105 |
| ポジティブコントロール薬 | オメプラゾール | MCE | HY-B0053 |
| 一次抗体 | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| 一次抗体 | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| 一次抗体 | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| 一次抗体 | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| 一次抗体 | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| 一次抗体 | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| 一次抗体 | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| 一次抗体 | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| 一次抗体 | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 一次抗体 | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| 一次抗体 | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| 一次抗体 | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| 一次抗体 | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| 一次抗体 | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| プライマー | AKT フォワード | — | — |
| プライマー | AKT リバース | — | — |
| プライマー | ERK フォワード | — | — |
| プライマー | ERK リバース | — | — |
| プライマー | GAPDH フォワード | — | — |
| プライマー | GAPDH リバース | — | — |
| プライマー | JNK フォワード | — | — |
| プライマー | JNK リバース | — | — |
| プライマー | p38 フォワード | — | — |
| プライマー | p38 リバース | — | — |
| プライマー | PI3K フォワード: | — | — |
| プライマー | PI3K リバース | — | — |
| プロテアーゼ阻害剤 | PMSF | Beyotime | ST506 |
| タンパク質アッセイ | BCA タンパク質アッセイキット | Beyotime | P0010 |
| タンパク質溶解バッファー | RIPA バッファー | Beyotime | P0013B |
| 公開データベース | DrugBank | DrugBank Online | オンラインデータベース |
| 公開データベース | GeneCards | ワイツマン科学研究所 | オンラインデータベース |
| 公開データベース | Online Mendelian Inheritance in Man | ジョンズ・ホプキンス大学 | オンラインデータベース |
| 公開データベース | PubChem 化合物データベース | 国立生物工学情報センター | オンラインデータベース |
| 公開データベース | RCSB タンパク質データバンク | RCSB PDB | オンラインデータベース |
| 公開データベース | STRING タンパク質相互作用データベース | STRING コンソーシアム | オンラインデータベース |
| 公開データベース |