コルチゾール検出を改善する唾液前処理用の携帯型デバイス

サマリー

このプロトコルは、コルチゾール検出を改善するための迅速な唾液前処理法を説明しています。手持ちのろ過装置を用いて、粘液やその他の干渉物質を除去しつつ、標的分析物を保持します。前処理された唾液は毛細血管の流れを改善し、より一貫性があり再現性の高いアッセイ性能を可能にします。

要約

唾液コルチゾール検出は、血液分析に代わる非侵襲的な代替手段を提供します。しかし、その実用的な実装は唾液の固有粘性と干渉成分の存在によって制限されています。特に、粘液や唾液タンパク質は毛細血管駆動の流れを妨げ、その後の側流アッセイ(LFA)の信頼性を損なうため、効果的かつアクセスしやすい前処理戦略が必要となります。ここでは、SaliFilterと呼ばれる手持ち型唾液前治療装置を紹介します。これは、ポイントオブケアのコルチゾール検出用です。この装置は、高分子量の干渉成分を選択的に除去しつつ、コルチゾールを含む小分子の通過を可能にするろ過機構を採用しています。単純な手動圧力で操作され、外部機器を必要とせずに迅速なサンプル処理(~2分)を実現し、分散型設定に適しています。この装置の性能は濁度測定、タンパク質定量、SDS-PAGEを用いて評価され、ムシンおよび唾液タンパク質の効率的な除去が確認されました。処理された試料は毛細血管の流れが強化され、安定かつ信頼性の高いLFA動作が可能となりました。定量解析によりシグナルの再現性が向上し、臨床的に関連した濃度範囲内で1.47 ng mL⁻¹ の検出限界を達成しました。このプロトコルは、分析対象の完全性を損なうことなく、分析感度と信頼性を向上させる効果的な唾液前処理戦略を確立します。提案されたアプローチは、唾液ベースの診断に実用的かつ携帯可能な解決策を提供し、現場での検査や自己モニタリングにも応用可能である可能性があります。

概要

副腎皮質から分泌されるグルココルチコイドホルモンであるコルチゾールは、生理的ストレスを評価するための重要なバイオマーカーです^1,2。血清、血漿、尿、間質液、唾液など複数の生体液から測定でき、臨床で最も一般的に用いられるのは血液と唾液です³。血液ベースの測定は信頼できる定量的情報を提供しますが、侵襲的な静脈穿刺と訓練を受けた人員を必要とし、頻繁または縦^{断的なモニタリング}の適性が制限されます。これに対し、唾液内コルチゾール測定は非侵襲的で便利な代替手段を提供し、ポイントオブケアや自己^{モニタリングの応用}を可能にします^7,8。特に唾液中のコルチゾールレベルは血中濃度と強く相関しており、唾液を信頼できる代替サンプルとして支持しています^。しかし、唾液の固有粘性と干渉成分の存在は分析性能を著しく妨げるため^{、分析前に}効果的な前処理が必要^{となります。}

これらの課題に対処するために、さまざまな前処理戦略が検討されています。遠心分離は、粘液、タンパク質、細胞の残骸などの大きな成分を除去するために広く使われています。しかし、かさばる実験機器と複数の処理ステップが必要であり、分散型環境での適用性が制限されます^13,14。バッファー溶液による希釈は粘度を下げ、^{サンプル流量を改善する}ことができます。しかし同時に分析物濃度を下げ、解析感度を低下させます。その結果、現行の手法は、ターゲット分析物の迅速かつ機器不要の処理と保存が不可欠なポイント・オブ・ケア用途には依然として不十分です。

これらの制約を克服するために、私たちはポイントオブケアのコルチゾール検出に特化した唾液前治療用の携帯型デバイス「SaliFilter」を開発しました。この装置は、高分子量の干渉物質を選択的に除去しつつ、コルチゾール¹⁶を含む小分子の通過を可能にするろ過機構を採用しています。手動操作により、外部機器を必要とせず、迅速かつ使いやすい処理が可能です。干渉成分を排除することで、このアプローチは側流アッセイにおける毛細管流を改善し、解析信頼性を高めます。このプロトコルは、コルチゾール検出前の迅速な唾液前処理のための装置の製造方法およびラテラルフローアッセイを用いた応用を説明しています。

プロトコル

本研究では、市販の非識別化された貯水された人間の唾液が使用されました。人間の参加者は採用されず、機関倫理の承認も必要ありませんでした。

1. 唾液サンプルの準備

1. サンプル採取の少なくとも30分前は飲食を控えるよう指示してください。
2. 供給者の指示に従って唾液サンプルを準備してください。
   注:本研究はプロトコルレベルの検証のために市販のプールされたヒト唾液を使用しました。
3. 使用前に唾液サンプルを優しく混ぜて均質を保ちます。
4. 唾液サンプルは4°Cで保存し、供給業者が推奨する保存期間内に使用してください。

2. RBCM被膜の調製(図1A)

1. 以前に報告^{されたプロトコルに従い}、全血からRBCMを分離します。
   1. 市販のヒト全血をK2EDTA抗凝固血のRBCM源として使用してください。
   2. 全血を800× g で5分間遠心分離し、血漿とバフィーコートを除去した後に赤血球の分画を採取します。
   3. 分離した赤血球ペレットを氷のように冷たい1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回、優しく手動で混ぜて洗浄します。
   4. 洗浄した赤血球ペレットを氷のように冷たい0.25×PBSに30分間再懸濁させて溶血を誘発します。
   5. 溶解した懸濁液を20,000 × g で遠心分離して30分間、RBCMペレットを採取して遊離ヘモグロビンを分離します。
   6. 回収したRBCMペレットを0.25×PBSでさらに3回洗浄し、淡いピンク色のRBCMペレットは−80°Cで保存し、使用まで待ちます。
2. 孔径30nm、直径13mmのポリエーテルスルフォン(PES)膜を準備します。
3. PES膜の片側に2%(w/v)RBCM溶液100μLを堆積します。溶液を優しく広げたり、滴り上げたりして膜全体が完全に湿るまで塗ります。
4. 膜を50°Cで30分間孵化し、均一なコーティングと乾燥を確保します。
5. コーティングされた膜は室温で保存し、¹⁷日の準備後15日以内に使用してください。
   注:RBCM被覆PES膜の詳細な特徴付けは、前回の研究¹⁶で記載されています。

3. サリフィルター装置の製造(図1B)

1. RBCMコーティングされた膜を指定されたフィルターホルダーに入れます。
2. インレットとアウトレットの部品をしっかり接続して装置を組み立てます。
3. 1mLの注射器を装置の入口に取り付けます。
   注意:運転中の漏れを防ぐため、すべての部品をしっかりと密閉してください。

4. 唾液の前処理

1. サリフィルター装置に接続された注射器に500μLの唾液を注入します。
2. 唾液サンプルを膜を通して優しく手動で圧をかけます(~2分)。
3. 処理済みの唾液をアウトレットから採取してください。
4. 前処理済みの試料は直ちに使用するか、4°Cで保存してさらなる分析を待つ。

5. 唾液タンパク質のSDS-PAGE解析

1. サンプル15μLとLaemmliサンプルバッファー5μLを混ぜます。
2. 混合物を8%SDS-PAGゲルの別々のウェルにロードします。
3. 150Vで40分間電気泳動を行います。
4. ジェルにクーマッシーブルーで2時間染めます。
5. ジェルを蒸留水で一晩除去してください。
6. スマートフォンや画像診断システムを使ってゲルの画像を撮影してください。

6. ラテラルフローアッセイ(LFA)を用いたコルチゾール検出

1. LFAストリップのサンプルパッドに150μLの前処理唾液を塗布します。
2. サンプルをストリップに沿って10分間移動させます。
3. スマートフォンや画像診断システムを使って検査結果の画像を撮影します。
4. ImageJでLFA画像を開き、Image > Color > Split Channelsを使ってRGBチャンネルを分離してください。
5. テストライン強度解析には緑のチャンネル画像を使用してください。
6. テストラインを覆う100×10ピクセルの長方形の関心領域(ROI)を選択し、すべてのストリップ画像に同じROIサイズを適用します。
7. テストラインROIの平均強度値を測定します。同じROIサイズの隣接するブランク膜領域を選び、背景強度を測定します。
8. 正規化テストライン強度を次のように計算します:正規化強度 = テストライン強度 − バックグラウンド強度。

7. 統計解析

1. 特に記載がない限り、定量的データは平均±標準偏差(SD)として提示してください。誤差バーをSDと定義します。
   注:本研究では、報告されたすべてのN値は、市販のプールされた人間の唾液のアリコットを用いた技術的再現を示しています。
2. コルチゾール濃度0–8 ng mL⁻¹ から得られた正規化テストライン強度値を用いて線形回帰解析を行い、フィットした曲線から決定係数(R²)を算出します。
3. 検出限界(LOD)は次の式を用いて計算します:LOD = 3.3 × SE / |傾き|、ここでSEはy切片の標準誤差、|傾き|は線形回帰方程式から得られる傾きの絶対値です。競合するLFAは負の傾きを生み出すため、傾きの絶対値を用いてください。
   注:本研究では推論的統計検定は行われず、有意基準も適用されませんでした。

結果

効果的な唾液の前処理には、下流の分析性能を損なう粘液やタンパク質などの干渉成分を除去する必要があります。SaliFilterのろ過能力は、まず市販の唾液採取キットで得られた濁度の変化と比較することで評価されました(図2A)。未処理の唾液は濁度が高いのに対し、SaliFilter処理済みのサンプルは透明で、粘液や懸濁成分の効率的な除去が示されました。一方、市販キットで処理されたサンプルでは、透明度の向上は限定的でした。

タンパク質除去は280nmで吸収を定量的に測定し、ろ過後に約69%の吸収減少を示しました(図2B)。この結果はさらに、ブラッドフォードアッセイによって支持され、SaliFilter処理サンプルでは色の強度が著しく低下し(図2C)、総タンパク質濃度が約80%減少したことが示されました(...

ディスカッション

唾液による診断は、血液検査の非侵襲的な代替手段を提供します。しかし、唾液の固有粘性やムシンやタンパク質などの干渉成分の存在により、より広範な採用は制約されてきました。これらの要因は毛細血管駆動の流れを妨げ、LFAを含む単純な分析プラットフォームの性能を損なうため、効果的なサンプル前処理が必要となります。

本研究では、提案された手持ちろ過装置であるSaliFilterが、コルチゾールなどの小さな標的分析対象物質を保存しつつ、高分子量の干渉物質を効果的に除去できることを示しました。RBCMコーティングはPES膜上の生物学的に由来した界面層として機能し、粘液やタンパク質などの高分子量唾液成分の除去に寄与します。流量を妨げる部品を排除することで、複雑な前処理や機器依存の前処理を必要とせず、唾液サンプルをLFAに直接統合することを可能にします。この発見は、生の生物学的サンプルと簡易診断プラットフォームの間のギャップを埋める上で前処理の重要な役割を強調しています。

遠心分...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工唾液	Solarbio、中国	A7990
Bio-Radタンパク質アッセイ染色試薬	Bio-Rad、USA	5000006	Bradfordアッセイ用
クームサジーブルー	Abcam、UK	ab119211	タンパク質バンド可視化用
コルチゾールELISAキット	Abcam、UK	ab154996
コルチゾールLFA	自社製
ホットプレート	Daihan Scientific、大韓民国
ヒドロコルチゾン（コルチゾール）	Sigma-Aldrich、USA	PHR1014
Laemmliサンプルバッファー	GenDEPOT、USA	L1200-001	SDS-PAGE前のタンパク質変性用
メンブレンホルダー	GVS Filter Technology	1220950	13mm径ホルダー
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad、USA	1658000	ゲル電気泳動用
ムチン	Sigma-Aldrich、USA	M2378
NanoDrop 2000分光光度計	Thermo Fisher Scientific、USA		タンパク質アッセイ用
PES膜	STERLITECH、USA	PES00313100	0.03ミクロン、13mm PES膜
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	DUKSAN、大韓民国	LB004
プールされたヒト唾液	Innovative Research Inc.、USA	IRHUSL5ML
RBCM	自社製
PAGE用分離ゲルバッファー	Bio-Rad、USA	1610798	分離ゲル調製用
Salivetteコルチゾール	SARSTEDT、ドイツ	51.1534.500	唾液採取キット
PAGE用スタッキングゲルバッファー	Bio-Rad、USA	1610799	スタッキングゲル調製用
Super•SAL™	Oasis Diagnostics、USA	SSAL-601	唾液採取キット
注射器	koreavaccine、大韓民国		1 mL容量
TEMED	Bio-Rad、USA	1610800	アクリルアミド重合用