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このデータベースベースの計算研究は、人間参加者、動物実験、臨床サンプルを含みません。中国の『生命科学および医療研究に関する倫理審査措置』第32条によれば、合法的に取得された公開データを用い、被験者に害を及ぼさず、機密性の高い個人情報を含まず、商業的利益を持たない研究は倫理審査の免除対象となります。したがって、本研究には倫理的承認は必要ありません。
本研究の実験設計および分析パイプラインはフローチャート(図1)に示されています。
図1:研究全体のワークフロー。 フローチャートは、シシェン煮込み(SSD)の有効成分および標的の取得、痛風関連標的の収集、重複標的の特定、薬剤-成分-標的-疾患ネットワークおよびタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析を含む、ネットワーク薬理学および分子ドッキング解析の連続的なワークフローを示しています。 分子ドッキングシミュレーションも行っています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
SSDの有効成分および標的タンパク質の取得
2026年1月2日、SSDを構成する5つの薬草、すなわち黄気、元芝、淮九西、石壺、金音華の有効化学成分が、中医薬体系薬理学(TCMSP)データベース21から取得されました。薬物動態に基づくスクリーニング基準が適用され、経口バイオ利用能(OB)≥30%、薬剤類似性(DL)≥0.1822が適用されました。これらの基準を満たす成分は潜在的な有効成分と見なされました。各コンポーネントに対応するターゲットが収集されました。TCMSPは元志と石壺の完全なデータを持っていなかったため、これら2つのハーブの化学成分は同日にハーブ2.0データベースから追加で取得されました。コンポーネント名を取得した後、TCMSPでコンポーネント名と対応するCAS番号をキーワードとして逆検索を行い、ターゲット情報を取得しました。ハーブデータベースから取得された化合物については、成分名またはCAS番号のいずれかでTCMSPの項目と一致したもののみが保持されました。マッチした化合物は、TCMSPデータを用いて同じ薬剤動態スクリーニング基準(OB≥30%、DL≥0.18)を受け、完全なOBまたはDL情報がない化合物は除外しました。すべての一致・ろ過化合物は、誤認を防ぐため、元のHerb 2.0記録と手作業で照合されました。その後、ハーブデータベースから得られたターゲット情報を他のハーブの情報と統合し、SSDの有効成分ターゲットの完全なセットを生成しました。
回収されたすべての標的タンパク質はUniProtデータベースを用いて公式の遺伝子シンボルに標準化されました。人間審査(Swiss-Prot)エントリーのみを保持し、未査読(TrEMBL)エントリーを除外することで、一対一の対応関係が確立されました。複数のアイソフォームが同じ遺伝子シンボルに対応する場合、標準的なアイソフォームが選ばれました。標準化されたターゲットデータセットは、その後の交差遺伝子解析のために保持されました。
痛風関連標的の収集
2026年1月2日、GeneCardsデータベースおよびOMIMデータベースで「gout」を疾患キーワードとして体系的に検索し、痛風に関連する疾患の標的を特定しました。2つのデータベースから得られた目標はWPSスプレッドシート(バージョン12.1.0)にエクスポートされました。OMIMの遺伝子シンボル列はGeneCardsの遺伝子記号列の隣に配置され、公式遺伝子記号の正確な一致に基づく「重複除去」機能で小文字を区別せずに重複ターゲットを除去しました。その後、2つのデータベースの標的を統合し、痛風に関連する疾患の包括的な標的セットを構築しました。
薬剤と疾患の重複標的の特定
アクティブ成分スクリーニングで得られた薬物ターゲットセットと痛風関連疾患のターゲットセットは同じプロジェクトフォルダ(D:\Venn)に配置されました。Rソフトウェア(バージョン4.4.0)がリリースされ、readxlパッケージを使ってターゲットリストを含むExcel(.xlsx)ファイルをインポートしました。dplyrパッケージは、交差解析前のフィルタリングや列名変更を含むデータ操作に使用されました。2つのターゲットセットは文字ベクトルに変換され、VennDiagramパッケージのcalculate.overlap()関数を使って重複するターゲットを特定しました。VennDiagramパッケージはCRANからinstall.packages("VennDiagram")というコマンドを使ってインストールされ、デフォルトのRライブラリパスに格納されました。パッケージがすでにインストールされていることを示すメッセージが表示された場合、インストールは成功したとみなされます。作業ディレクトリはsetwd("D:\\Venn")というコマンドで設定され、入力ファイルを含むフォルダを指定し出力ディレクトリとして機能しました。その後、Rスクリプトを実行して、薬物ターゲットセットと痛風関連疾患ターゲットセットの交差点を計算しました。その結果、重なり合う標的は痛風治療におけるSSDの潜在的な治療標的として定義されました。
「薬剤成分標的疾患」ネットワークの構築
SSDターゲットと痛風関連ターゲットの重複から特定された交差遺伝子は overlapping_targets.txt ファイルとして保存され、SSDのアクティブコンポーネント情報は drug_components.txt ファイルとして保存されました。両方のファイルはプロジェクトフォルダ(D:\Network)に配置され、解析のための作業ディレクトリとして機能しました。再現性を確保するため、この解析はRを用いて行われました。データの読み込み、フィルタリング、マージ操作は 、read.table()、 write.table()、 merge()などの基本的なR関数と、データフレーム操作用のdplyrパッケージを組み合わせて行いました。 setwd("D:\Network") というコマンドが実行され、作業ディレクトリを明示的に定義しました。
graph_from_data_frame()関数はコア積分関数として使用されました。各行のdrug_components.txt公式遺伝子記号を使って、活性成分を対応する標的遺伝子に結びつけていました。overlapping_targets.txtに存在するターゲットのみが保持され、交差要件を超えた追加のフィルタリングは施されませんでした。得られたネットワークデータセットはエッジリスト形式でnetwork.txtとしてエクスポートされました。各行は2列(node1とnode2)で構成され、node1はSSDの式または活性成分を表し、node2は活性成分またはターゲット遺伝子を表しました。疾患ノード(「痛風」)はSSDの公式に別エッジとして接続されていました。エッジの重みは割り当てられず、すべてのエッジは同じように扱われました(エッジ幅=0.8)。
network.txtファイルはCytoscape(バージョン3.7.2)のネットワーク可視化ソフトウェアにインポートされました。組み込みのNetworkAnalyzerツールは、Tools → Network Analysis → Analyze Networkを通じてアクセスされ、基本的なネットワーク構造が得られ、「Degree Distribution」が解析フレームワークとして選ばれました。ノードの形状と色はノードタイプに応じて割り当てられました。青いダイヤモンドはSSDの式を表し、青い長方形は活性成分を表し、オレンジの楕円は疾患標的遺伝子、赤い八角形は痛風の実体を表しました。ノードサイズはノード次数に比例するように設定されていました(ノードサイズ=30+度×5、最大サイズ=100)。
タンパク質–タンパク質相互作用(PPI)ネットワークの構築
交差する標的遺伝子のフィルタリングセットは、2026年1月2日にSTRINGデータベース(バージョン12.0)にインポートされました。種は ホモ・サピエンスに限定され、最小相互作用信頼度閾値は高い信頼度(0.700)に設定され、切り離されたタンパク質は隠され、相互作用源には利用可能なすべてのエビデンスチャネルが含まれ、その他のパラメータは既知かつ予測されたタンパク質間相互作用を得るためにデフォルト設定で維持されました。得られたネットワークデータは、デフォルトのエクスポートオプションを使ってタブ区切り値(TSV)形式でエクスポートされました。
エクスポートされたネットワークはネットワーク可視化ソフトウェアにインポートされ、可視化およびトポロジカル解析が行われました。ネットワーク特性は組み込みのNetworkAnalyzerツール(Tools → Network Analysis → Analyze Network)を使って計算されました。計算された指標には、度、中間性の中心性、そして近さの中心性が含まれていました。ノードサイズは連続写像関数(ノードサイズ=20+度×3、最大サイズ=80)を用いて次数値にマッピングされました。
ハブターゲットは、すべてのノードを度数の値から降順にランク付けすることで特定されました。次数値が高いノードはネットワーク内でより中心的と考えられていました。孤立したノード(度=0)は可視化から除外されました。ネットワークのレイアウトは、ノードの接続性に応じて中心から外側へ同心円状に配置され、ノードの色は度数の増加に対応する青からシアンへのグラデーションでマッピングされました。その結果得られたネットワークは、SSDが痛風に対して潜在的な治療効果をもたらすに関与するコアハブ標的を特定するために用いられました。
遺伝子オントロジー(GO)エンリッチメント解析
特定された重複するターゲット遺伝子に基づき、Rを用いてGO機能豊化解析を実施しました。必要なバイオコンダクターパッケージはデフォルトのRライブラリパスにインストールされ、解析環境に読み込まれました。交差遺伝子ファイルはプロジェクトディレクトリ(D:\GO)に保存され、作業ディレクトリはsetwd()関数で定義されました。
遺伝子識別子の変換および注釈はBioconductorパッケージ組織を用いて行われました。Hs.eg.db(バージョン3.20.0)。公式の遺伝子シンボルはclusterProfilerのエンリッチメント解析パッケージ(バージョン4.21.0)内のbitr()関数を使ってEntrez遺伝子IDに変換されました。一対一の独自のマッピングを示す遺伝子のみが下流解析のために保持され、曖昧またはマッピングされていないエントリーは除外されました。
GO濃縮分析は濃縮解析パッケージを用いて実施されました。enrichGO()関数は、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)というオントロジーカテゴリーで使用されました。統計的有意性はベンジャミニ–ホッホバーグ多重検定補正法を用いて決定され、調整済みP値<0.05は有意とみなされました。
各オントロジーカテゴリーごとに、有意に豊か化された用語が豊かさ係数に基づいてランク付けされました。
EF = (遺伝子数 / 全背景遺伝子) ÷ (期数 / 全ゲノム遺伝子)
詳細な分析のために上位10の用語が選ばれました。同一の濃縮因子が発生した場合、調整後のP値が低い項が上位にランク付けされました。
濃縮結果はggplot2(バージョン3.5.1)およびenrichplot(バージョン1.24.0)を用いて可視化されました。バブルプロットや棒グラフはドットプロット()およびバープロット()関数を用いて生成されました。バブルサイズは濃縮遺伝子の数を示し、色は富集有意性(−log10、調整済みP値)に対応しました。全編を通してデフォルトのプロットパラメータが使用されました。
KEGG経路濃縮解析
SSDと痛風の交差標的に対するKEGG経路濃縮解析を、Rおよび先述の濃縮解析パッケージを用いて実施しました。遺伝子シンボルは、エンリッチメント解析パッケージが提供するbitr()関数を使ってKEGG互換識別子に変換され、KEGGは注釈リソースとして機能しました。経路富集解析は、超幾何学的検定に基づくenrichKEGG()関数を用いて実施されました。統計的有意性はベンジャミニ–ホッホバーグ(BH)多重検定補正法を用いて決定され、調整P値<0.05の経路は有意に富んだとみなされました。
エンリッチメントの結果は、openxlsxパッケージ(バージョン4.2.8.1)とwrite.xlsx()機能を使ってMicrosoft Excel互換ワークブックファイルにエクスポートされ、その後のレビューや図の準備に用いられました。
その後、ネットワーク可視化ソフトウェアを用いて多層ターゲット–経路相互作用ネットワークを構築しました。ネットワークデータはファイル→「ファイルからネットワークをインポート」→インポートしてインポートしました。ノードは標的遺伝子ノードと有意に濃縮されたKEGG経路ノードで構成され(BH調整P値<0.05)、一方でエッジは標的遺伝子と濃縮経路の関連性が文書化され、濃縮解析で特定されました。ネットワーク可視化はネットワーク可視化ソフトウェアのスタイルパネルを使用して行われ、ターゲット遺伝子は灰色の楕円で、経路はシアンの長方形で表示されました。追加のプラグインは使用されませんでした。このネットワークは、コアターゲットと有意に濃縮された経路間の関係を可視化するために、濃縮出力表から手動で生成されました。
分子ドッキング検証
「薬物–成分–標的–疾患」ネットワークにおける標的結合性でランク付けされた上位10の活性成分の3D構造ファイル(MOL2形式)は、TCMSPデータベースからダウンロードされました。ターゲット結合性はノード次数(すなわちネットワーク内の活性成分とターゲット遺伝子間の直接接続数)として定義されました。活性成分は度数に応じて順にランク付けされ、上位10成分が分子ドッキング解析のために選ばれました。
PPIネットワークから特定されたトップ10のハブターゲットタンパク質の結晶構造は、2026年1月23日にRCSBプロテインデータバンク(PDB)から取得されました。この種は ホモ・サピエンスに限定されていました。各標的タンパク質に対して、変異がなく、かつネイティブリガンドまたは阻害剤と共結晶化した結晶学的分解能が最も高い(Å値が最も低い)構造を優先的に選択しました。複数の構造がこれらの条件を満たす場合は、最も高い分解能と最も完全なタンパク質配列カバレッジを持つ構造が選ばれました。使用されたPDB構造は以下の通りです:1GKC(MMP9)、5WHH(BCL2)、2P33(JUN)、1RHJ(CASP3)、1WT5(EGFR)、7APJ(AKT1)、1DU3(TNF)、1T4Q(IL1B)、4NI9(IL6)、9CKJ(TP53)。
分子ドッキングシミュレーションは、AutoDock Vinaをドッキングエンジンとして使用するCB-Dock 2オンラインサーバー(ウェブ版、2026年1月23日アクセス)を使用して実施されました。タンパク質構造はサーバーによって自動的に前処理され、ヘテロアトムの除去や受容体構造の準備も含まれます。配位子はMOL2形式でアップロードされました。テンプレート非依存の空洞検出が用いられ、各タンパク質構造に対して5つの潜在的な結合空洞を自動的に特定しました。ドッキング計算はドッキングエンジンのデフォルトパラメータを用いて行われました:消極性=8、エネルギー範囲=4、最大バインディングモード数=9。
各ターゲット–化合物ペアについては、検出された5つの空洞それぞれ内で独立してドッキングが行われました。ドッキングポーズはドッキングエンジンスコアリング関数を用いて評価され、各キャビティ内で結合エネルギーが最も低いポーズがそのキャビティの代表的なコンフォメーションとして保持されました。代表的な5つの構造の中で、世界的に結合エネルギーが最も低いドッキングポーズが最終的なドッキング結果として選ばれ、その後の解析に用いられました。
各ドッキング結果で得られた最低結合エネルギー値はスプレッドシートに記録され、2026年1月23日アクセスの魏生新オンラインプロットプラットフォームにインポートされ、デフォルトのパラメータでヒートマップが作成されました。ヒートマップは黄色から赤への色のグラデーション、完全連結階層クラスタリング、そしてクラスタリング指標としてユークリッド距離を用いていました。
水素結合相互作用は、幾何学的基準に基づくドッキングサーバー解析モジュールによって自動的に特定されました。水素結合は、ドナー–アクセプター間距離≤3.5 Å、ドナー–水素–受容体角度≥120°との相互作用として定義されました。水素結合は二次元および三次元相互作用図の両方で破線で表示されました。すべてのドッキング組み合わせの中で世界的に結合エネルギーが最も低い標的タンパク質-活性成分ペアが選定され、詳細な相互作用解析が行われました。この選択は個々のドッキングポーズではなく単一のターゲット–複合ペアに基づいており、ネットワーク内で予測される最も強い相互作用を特定することを目的としていました。このターゲット–化合物ペアに対応する最終的な代表的なドッキングポーズが可視化および相互作用解析に用いられました。
3次元および2次元インタラクション図は、それぞれChimeraXバージョン1.5とLigPlot+バージョン2.2を用いて生成されました。ChimeraXでは、タンパク質はデフォルトの漫画表現で表示され、リガンドはスティックモードで表示され、水素結合は破線で表示され、デフォルトのカラースキームが適用されていました。LigPlot+では、HBPLUSアルゴリズムを用いて水素結合同定を行い、ドナー–アクセプター距離の閾値が3.9 Å、角度閾値が90°でした。その他の可視化パラメータはすべてデフォルト設定のまま維持されました。
