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研究記事

Rab27AのN6-メチルデノシン修飾は、卵巣摘出マウスモデルにおける破骨細胞分化に影響を与えることで骨粗鬆症を促進します

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DOI:

10.3791/71964

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2026年8月11日

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

YTHDC1はm6A修飾Rab27Aの細胞質からの排出を促進し、IGF2BP2細胞質内のRab27Aを安定化させることで破骨細胞の分化を促進し、骨粗鬆症の進行に寄与します。

要約

骨粗鬆症に対する新規治療法の開発は、ますます注目を集めています。Rab27Aは破骨細胞分化時に上型調節され、N6-メチルアデノシン(m6A)修飾は整形外科疾患における重要なエピジェネティック調節因子として浮上しています。バイオインフォマティクス解析により、Rab27Aは複数のm6A修飾部位を含み、複数のm6A関連タンパク質と相互作用することが予測されました。ノックダウン実験は、卵巣摘出(OVX)マウスモデルを用いて破骨細胞分化および骨粗鬆症におけるRab27Aの役割を評価するために実施されました。Rab27Aの枯渇は骨粗鬆症を減緩し、OVXマウスの骨形成率を14.73%から28.13%(P < 0.05)に増加させました。ウェスタンブロット法と定量PCRにより、Rab27Aのノックダウンが破骨細胞マーカーであるTRAP、NFATc1、c-FOSのタンパク質およびmRNAの発現を抑制し、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および核因子κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)によって誘導される骨髄由来マクロファージ(BMM)の破骨細胞分化を抑制することが示されました。さらに、TRAP染色はM-CSFおよびRANKL誘導後のRab27A枯渇によりTRAP活性を24.1%から12.9%(P < 0.01)に有意に低下させることを示しました。RNA免疫沈殿アッセイにより、Rab27Aとm6Aリーダータンパク質YTHDC1およびIGF2BP2間の相互作用が確認されました。核および細胞質の分別により、YTHDC1がm6A修飾Rab27Aの細胞質からの排出を促進することが示されました。さらに、q-PCRおよびウェスタンブロット解析により、YTHDC1またはIGF2BP2のノックダウンはRab27Aの発現を減少させ、TRAP、NFATc1、c-FOSの発現を減少させ、M-CSFおよびRANKLによって誘発される破骨細胞分化を抑制することが示されました。これらの結果は、YTHDC1媒介の細胞質排出およびIGF2BP2媒介によるm6A修飾Rab27Aの安定化が破骨細胞の分化を促進し、OVXマウスモデルにおける骨の損失に寄与していることを示しています。

概要

骨粗鬆症(OP)は、骨の微細構造の劣化と骨密度の低下を特徴とする一般的な骨格疾患であり、これにより世界的な骨折リスクが増加します(1,2,3)。骨粗鬆症骨折は前腕、上腕骨、股関節、脊椎に最も多く発生し、特に高齢者に多く見られます。これらの骨折は生活の質を著しく損ない、患者やその家族、医療システムに身体的、心理的、社会経済的にも大きな負担を強います。3.したがって、骨粗鬆症の予防、管理、治療は依然として臨床および公衆衛生の主要な優先事項です。

骨粗鬆症にはさまざまな治療戦略が開発されており、一般的に骨形成剤と抗吸収療法の2つのカテゴリーに分類できます。従来の抗吸収薬にはビスホスホネート、ラロキシフェン、ストロンチウムラネレートがありますが、新しい薬剤にはデノスマブ、オダナカティブ、サラカチニブなどがあります。骨形成療法には副甲状腺ホルモン(PTH 1–84)があり、さらにMK-5442、AMG 785、BHQ 880など複数の候補が臨床開発中です5。これらの治療法は効果的である可能性がありますが、多くは重大な副作用、限定的な長期有効性、または長期使用の制限を伴うこともあります。例えば、アミノビスホスホネートやデノスホナートの長期投与は正常な骨の再構築を損なう可能性があります。したがって、より安全で効果的な治療標的を特定することは骨粗鬆症研究において重要な目標であり続けています。

Rabタンパク質は細胞内小胞輸送と細胞シグナル伝達の主要な調節因子であり、ウイルス感染、オートファジー、細胞骨格組織など多様な生物学的プロセスに関与します10。近年、骨代謝や骨粗鬆症におけるRabファミリータンパク質の役割に注目が集まっています。Rab44は、核因子κBリガンド(RANKL)処理マクロファージの受容体活性化因子である活性化T細胞1(NFATc1)の細胞内Ca2⁺シグナル伝達および核因子活性化を調節することで破骨細胞分化を調節することが報告されています。破骨細胞はマクロファージ系統の前駆体から派生した多核細胞であり、骨吸収および骨格恒常性に重要な役割を果たします。したがって、破骨細胞分化を支配する分子メカニズムを理解することは、骨粗鬆症の新しい治療法を開発するために極めて重要です。

Rab27AはRab GTPaseファミリーの重要なメンバーであり、分泌細胞および免疫細胞で広く発現しています。小胞輸送、エキソサイトーシス、細胞内シグナル伝達(20,21,22,23,24,25,26,27)において重要な役割を果たします。これまでの研究では、Rab27Aが気道炎症中の好酸球脱顆粒を調節し、活性化マクロファージにおけるNADPH酸化酵素活性に関連する小胞動員を制御することが示されています20.23。特に、蓄積される証拠によれば、破骨細胞分化の際にRab27Aの発現が有意に上調されることが示されています。Shimada-Sugawaraらは、骨髄由来のマクロファージ(BMM)が破骨細胞に分化する過程でRab27Aの発現が増加することを報告しており、破骨形成に関与する可能性を示唆しています28。これらの発見は、Rab27Aが小胞輸送や細胞内シグナル伝達経路を調節することで破骨細胞の形成と機能に影響を与える可能性を示唆しています28,29。

N6-メチルアデノシン(m6A)は、真核生物メッセンジャーRNAおよび非コードRNAにおいて最も豊富な内部RNA修飾であり、RNA代謝と遺伝子発現の重要な調節因子として機能します。哺乳類で最初に特定されたmRNA修飾であるm6Aは、RNAの安定性、スプライシング、輸送、翻訳など多くの生物学的プロセスに関与していることが示唆されています。Wangらは、保存された配列モチーフ内で一般的に起こるm6A修飾がYTHドメインを含むタンパク質によって認識され、mRNAの安定性と代謝の調節に寄与していることを示しました30。さらに、m6A修飾はゲノムの安定性、転写調節、クロマチンの組織、がん進行、免疫応答など多様な生物学的機能に関与していることが示唆されています31。最近の研究では、骨関連疾患や骨粗鬆症におけるm6Aシグナル伝達の重要な役割も強調されています。

m6Aリーダータンパク質の中で、YTHDC1はRNA処理と核輸出を調節する核リーダーとして機能し、一方でインスリン様成長因子2のmRNA結合タンパク質2(IGF2BP2)は細胞質内のm6A修飾転写産物を安定化させます。Chenらは、YTHDC1がm6A修飾されたcircNSUN2の核排出を促進し、これがIGF2BP2と相互作用してHMGA2 mRNAを安定化させ、大腸がん転移を促進することを示しました。これらの発見は、YTHDC1とIGF2BP2による協調的な調節が、m6A修飾転写産物の運命を制御する一般的なメカニズムである可能性を示唆しています。

本研究では、Rab27A mRNA内の予測されるm6A修飾部位を調査し、YTHDC1およびIGF2BP2との相互作用を検討しました。YTHDC1はm6A修飾Rab27A転写体の核輸出を促進することが判明し、IGF2BP2細胞質内のRab27Aと相互作用してその安定性を高めました。この調節機構を通じて、Rab27Aは破骨細胞の分化を促進し、骨粗鬆症の進行に寄与しました。総じて、これらの発見は破骨細胞分化におけるYTHDC1、IGF2BP2、Rab27Aに関与する、これまで認識されていなかったm6A依存性調節経路を特定しました。これらの結果は骨粗鬆症の分子病因に関する新たな知見を提供し、M6Aを媒介したRab27Aの調節を標的とした新しい治療戦略の開発を促進する可能性があります。

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プロトコル

すべての動物処置は、サウスウエスト医科大学付属病院の動物保護・利用委員会(承認番号2024-Ethics-042)によって承認されました。すべての実験はARRIVEガイドライン、英国動物(科学的手続き)法1986年および関連ガイドライン、EU指令2010/63/EU、ならびにNIH出版物番号8023、1978年改訂に従って実施されました。マウスは無作為に実験グループに割り当てられ、割り当て順序は研究者には隠されました。組織学的評価、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)画像解析、統計解析を含むすべてのデータ取得および解析は、グループ割り当てを盲検された研究者によって実施されました。分析から動物やサンプルは除外されませんでした。このプロトコルで使用されるすべての試薬、機器、ソフトウェア、その他のリソースは 材料表に記載されています。

1. 卵巣摘出術(OVX)モデルの構築

8週齢の野生型C57BL/6マウス24匹を用いて骨粗鬆症モデルを構築しました。1週間の順応期間の後、マウスは無作為にシャム群またはOVX群に割り当てられました。OVXモデルは、前述の両側卵巣摘出術によって確立されました。34,35。偽手術されたマウスは卵巣の手術を切除せずに曝露しました。

大腿内遺伝子送達では、以前報告された36,37例と同様に、SH-Rab27Aまたはsh-NCを発現するレンチウイルスベクターをOVX手術後7日後に注入しました。簡単に、麻酔下で22ゲージの針を使い、膝蓋骨経路から1×106 トランスデューシング単位/mLの濃縮レンチウイルス粒子を注射しました。各マウスには20μLのレンチウイルス懸濁液が投与されました。その後、切開部は縫合され、動物たちは回復期間中ずっとモニタリングされました。

すべての動物実験は特定の病原体のない条件下で行われました。大腿動脈検体は手術後8週間後に採取されました。1グループあたり少なくとも6匹のマウスが組織学的解析およびRNAまたはタンパク質抽出に使用されました。

2。生体内 マイクロCTイメージング

マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)は小梁骨の形態を評価するために実施されました。各マウスの右脛骨は生後14週でOVX手術前に生 体内 でスキャンされました。22週まで毎週フォローアップスキャンが実施されました。各グループにつき少なくとも6匹のマウスがマイクロCT解析に含まれました。

マウスには腹腔内ナトリウムペントバルビタール(体重50 mg/kg)で麻酔されました。足のつまみ反射の消失と呼吸数の継続的なモニタリングにより十分な麻酔が確認され、画像診断中も維持されました。すべての安楽死手続きは、承認された動物プロトコル、施設の動物福祉ガイドライン、および実験動物安楽死に関する国内規則に従って行われました。

生後24週でマウスは深麻酔後の頸椎脱臼により安楽死され、両方の脛骨を同じ画像診断プロトコルで体 外 スキャンのために採取しました。走査パラメータには、ボクセルサイズ10.4μm、電圧55kV、電流145μA、視野角32mm、1回の投影で1500/750サンプル、積分時間100msが含まれていました。

画像は、1200 mg HA/cmの ファントムに対して較正された3次多項式ビーム硬化補正アルゴリズムを用いて処理されました。骨容積分数(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)は、成長板から1.0mm近位に位置する遠位大腿骨幹端で定量化されました。

3. プラスミドトランスフェクション

sh-Rab27Aおよびsh-NCプラスミドが生成され、レンチウイルスの製造に使用されました。レンチバイラル包装プラスミドとshRNA構成体は、製造元の指示に従って共トランスフェクトしてHEK293T細胞に導入されました。ウイルス価は、前述の大腿内投与前に測定されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

4. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色

大腿動脈標本は4%パラホルマルデヒドに24時間固定され、10%EDTAで4週間脱炭素処理、30%ショ糖/PBSでクライオプロテクトされ、パラフィンに埋め込まれ、厚さ5μmで切片されました。組織切片はヘマトキシリンとエオシンで染色され、光学顕微鏡で検査されました。各グループにつき少なくとも6匹のマウスが分析されました。

5. 酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)染色

大腿動脈切片のTRAP染色は製造元の指示に従って行われました。骨髄由来マクロファージ(BMM)におけるTRAP活性はTRAP染色アッセイを用いて評価されました。成熟した破骨細胞は、少なくとも3つの核を含むTRAP陽性の多核細胞と定義されました。3回の独立した生物学的複製が行われ、それぞれに3回の技術的重複が伴いました。

6. q-PCR

全RNAは製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて分離されました。補完DNAは逆転写酵素を用いて合成され、SYBR Green化学を用いた定量リアルタイムPCRを受けました。3回の独立した生物学的複製が行われ、それぞれに3回の技術的重複が伴いました。

プライマー配列は以下の通りです。

Rab27A: F、TTCCTGCTTCTGTTCGACCT;R, GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

トラップ:F、TGTTGACAGGGGTCTCTA;R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1:F、GGTGCTGTCTGGCCATAACT;R, GCGGAAAGGTGTGTATCTCAA

C-FOS:F、戦術戦術、tactaccatccaccga;R, GCTGTCACCGTGGGGAGGATAAA

YTHDC1: F、GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG;R, TTGATCTTTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2:F、GACTACCCCGACCAGAACTG;R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

βアクチン:F、GGGAAATCGTGGTGACATTAAG;R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. ウエスタンブロッティング

細胞や組織はプロテアーゼ阻害剤を補足したRIPAバッファーを使用して溶解されました。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを用いて測定されました。同量のタンパク質(20μg)をSDS-PAGEによって分離し、ポリビニリデンフッ化物(PVDF)またはニトロセルロース膜に移しました。膜は5%無脂肪ミルクで室温で1時間ブロックし、TRAP、NFATc1、c-FOS、Rab27A、YTHDC1、IGF2BP2、またはβアクチンに対する一次抗体とともに4°Cで一晩培養しました。洗浄後、適切な二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。タンパク質バンドは標準的な検出手法を用いて可視化されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

8. 細胞培養

骨髄由来のマクロファージ(BMM)は、前述の通り39を単離しました。マウス大腿骨から採取した骨髄細胞は、最低限必要な培地に10%胎児用牛血清、30 ng/mLマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを37°Cで加湿空気(5% CO₂を含む環境)で一α晩培養しました。非接着細胞は30 ng/mL M-CSFを含む間質細胞フリー系で収集・培養されました。3日後、接着細胞をBMMとして採取し、30 ng/mL M-CSFおよび50 ng/mLの核因子κBリガンド受容体活性化剤(RANKL)を72時間培養して破骨細胞分化を誘導しました。

9. RNA干渉(RNAi)

製造元の指示に従い、小さな干渉RNA(siRNA)を合成し、脂質系トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトしました。細胞は6ウェルプレートで1ウェルあたり2×4細胞の 密度でシードされ、その後トランスフェクションを行いました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

ターゲット配列は以下の通りです。

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. 免疫蛍光

細胞は4%パラホルムアルデヒドで20分間固定され、0.1%トリトンX-100で10分間透過化されました。5%牛血清アルブミンで30分間ブロッキングした後、細胞は一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートされました。

洗浄後、蛍光色素結合の二次抗体を室温で30分間適用しました。核はDAPIで染色され、画像は共焦点顕微鏡で取得されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

11. 核および細胞質の分離

核および細胞質の分画は製造元の指示に従って分離されました。細胞は氷で10分間溶解され、4°Cで500 ×g で3分間遠心分離されました。 細胞質成分を含む上清液は収集され、核を含むペレットは別々に洗浄・処理されました。

12. RNA結合タンパク質免疫沈降(RIP)

RNA免疫沈殿(RIP)アッセイは製造元の指示に従って実施されました。短時間、細胞を氷で30分間溶解させました。遠心分離後、上清液は抗体およびプロテインA/Gアガロースビーズとともに一晩培養されました。洗浄後、免疫沈殿タンパク質はウェスタンブロッティングで解析され、共免疫沈殿RNAは定量的リアルタイムPCRで解析されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

13. Rab27A mRNA安定性アッセイ

ノックダウン後の指定された時刻で総RNA IGF2BP2抽出されました。その後、逆転写および定量的リアルタイムPCR検査が実施されました。Rab27A mRNAレベルは0時間で対応するsi-NC群に正規化されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

14. 統計分析

すべての実験は少なくとも3つの生物学的複製体を用いて独立して実施されました。q-PCR、RNA干渉、TRAP染色、ウェスタンブロッティング、その他の細胞ベースのアッセイでは、特に指定がない限り、各生物学的複製には3つの技術的複製が含まれていました。データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。

統計解析はGraphPad Prismバージョン9.0およびSPSSソフトウェアを使用して実施されました。2つのグループ間の比較は、両側の学生t検定を用いて行われました。複数群間の比較は、双方向分散分析(ANOVA)を用いて分析し、その後Tukeyの多重比較事後検定を用いて複数比較を調整しました。P値は0.05<統計的に有意とされました。

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結果

Rab27Aのノックダウンは生 体内で骨粗鬆症を減少させました。

Rab27Aが骨粗鬆症に果たす役割を調査するため、Rab27Aのノックダウンは、既に報告された方法34,40を用いて確立された卵巣摘出(OVX)マウスモデルで実施されました。全体の研究デザインは図1にまとめられています。マイクロコンピュータ断層撮影解析により、OVXマウスの骨密度、骨容積分数(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)がシャム対照群と比較して有意に減少していることが示されました(図2A)。これらの発見により、骨粗鬆症モデルの確立が成功裏に示されました。Rab27Aのノックダウンは測定されたすべての骨構造パラメータを有意に回復させ、OVX誘...

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ディスカッション

破骨細胞の分化は骨の再構築、骨吸収、骨折修復、骨格恒常性において重要な役割を果たします。過剰な破骨細胞活動は骨粗鬆症の主な要因であり、破骨細胞分化を制御する調節経路の特定は重要な研究目標となっています。破骨細胞機能を標的とした複数の抗吸収療法が臨床的有効性を示しており、6,44,45。例えば、デノスマブは骨折発生率の低減と良好な安全性プロファイルと関連しており、一方でカテプシンK阻害剤ONO-5334は卵巣摘出された非ヒト霊長類において骨密度および骨強度に...

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開示事項

著者たちは競合する財政的利益や利益相反を一切認めていません。

謝辞

この作業は、彭州人民病院と西南医科大学間の科学技術戦略協力プロジェクト(助成金番号2023PZXNYD01)から連堂への資金援助を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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