研究記事

Rab27AのN6-メチルデノシン修飾は、卵巣摘出マウスモデルにおける破骨細胞分化に影響を与えることで骨粗鬆症を促進します

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DOI：

10.3791/71964

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2026年8月11日

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

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この記事について

サマリー

YTHDC1はm6A修飾Rab27Aの細胞質からの排出を促進し、IGF2BP2細胞質内のRab27Aを安定化させることで破骨細胞の分化を促進し、骨粗鬆症の進行に寄与します。

要約

骨粗鬆症に対する新規治療法の開発は、ますます注目を集めています。Rab27Aは破骨細胞分化時に上型調節され、N6-メチルアデノシン(m6A)修飾は整形外科疾患における重要なエピジェネティック調節因子として浮上しています。バイオインフォマティクス解析により、Rab27Aは複数のm6A修飾部位を含み、複数のm6A関連タンパク質と相互作用することが予測されました。ノックダウン実験は、卵巣摘出(OVX)マウスモデルを用いて破骨細胞分化および骨粗鬆症におけるRab27Aの役割を評価するために実施されました。Rab27Aの枯渇は骨粗鬆症を減緩し、OVXマウスの骨形成率を14.73%から28.13%(P < 0.05)に増加させました。ウェスタンブロット法と定量PCRにより、Rab27Aのノックダウンが破骨細胞マーカーであるTRAP、NFATc1、c-FOSのタンパク質およびmRNAの発現を抑制し、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および核因子κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)によって誘導される骨髄由来マクロファージ(BMM)の破骨細胞分化を抑制することが示されました。さらに、TRAP染色はM-CSFおよびRANKL誘導後のRab27A枯渇によりTRAP活性を24.1%から12.9%(P < 0.01)に有意に低下させることを示しました。RNA免疫沈殿アッセイにより、Rab27Aとm6Aリーダータンパク質YTHDC1およびIGF2BP2間の相互作用が確認されました。核および細胞質の分別により、YTHDC1がm6A修飾Rab27Aの細胞質からの排出を促進することが示されました。さらに、q-PCRおよびウェスタンブロット解析により、YTHDC1またはIGF2BP2のノックダウンはRab27Aの発現を減少させ、TRAP、NFATc1、c-FOSの発現を減少させ、M-CSFおよびRANKLによって誘発される破骨細胞分化を抑制することが示されました。これらの結果は、YTHDC1媒介の細胞質排出およびIGF2BP2媒介によるm6A修飾Rab27Aの安定化が破骨細胞の分化を促進し、OVXマウスモデルにおける骨の損失に寄与していることを示しています。

概要

骨粗鬆症(OP)は、骨の微細構造の劣化と骨密度の低下を特徴とする一般的な骨格疾患であり、これにより世界的な骨折リスクが増加します(1,2,3)。骨粗鬆症骨折は前腕、上腕骨、股関節、脊椎に最も多く発生し、特に高齢者に多く見られます。これらの骨折は生活の質を著しく損ない、患者やその家族、医療システムに身体的、心理的、社会経済的にも大きな負担を強います。3.したがって、骨粗鬆症の予防、管理、治療は依然として臨床および公衆衛生の主要な優先事項です。

骨粗鬆症にはさまざまな治療戦略が開発されており、一般的に骨形成剤と抗吸収療法の2つのカテゴリーに分類できます。従来の抗吸収薬にはビスホスホネート、ラロキシフェン、ストロンチウムラネレートがありますが、新しい薬剤にはデノスマブ、オダナカティブ、サラカチニブなどがあります。骨形成療法には副甲状腺ホルモン(PTH 1–84)があり、さらにMK-5442、AMG 785、BHQ 880など複数の候補が臨床開発中です5。これらの治療法は効果的である可能性がありますが、多くは重大な副作用、限定的な長期有効性、または長期使用の制限を伴うこともあります。例えば、アミノビスホスホネートやデノスホナートの長期投与は正常な骨の再構築を損なう可能性があります。したがって、より安全で効果的な治療標的を特定することは骨粗鬆症研究において重要な目標であり続けています。

Rabタンパク質は細胞内小胞輸送と細胞シグナル伝達の主要な調節因子であり、ウイルス感染、オートファジー、細胞骨格組織など多様な生物学的プロセスに関与します10。近年、骨代謝や骨粗鬆症におけるRabファミリータンパク質の役割に注目が集まっています。Rab44は、核因子κBリガンド(RANKL)処理マクロファージの受容体活性化因子である活性化T細胞1(NFATc1)の細胞内Ca2⁺シグナル伝達および核因子活性化を調節することで破骨細胞分化を調節することが報告されています。破骨細胞はマクロファージ系統の前駆体から派生した多核細胞であり、骨吸収および骨格恒常性に重要な役割を果たします。したがって、破骨細胞分化を支配する分子メカニズムを理解することは、骨粗鬆症の新しい治療法を開発するために極めて重要です。

Rab27AはRab GTPaseファミリーの重要なメンバーであり、分泌細胞および免疫細胞で広く発現しています。小胞輸送、エキソサイトーシス、細胞内シグナル伝達(20,21,22,23,24,25,26,27)において重要な役割を果たします。これまでの研究では、Rab27Aが気道炎症中の好酸球脱顆粒を調節し、活性化マクロファージにおけるNADPH酸化酵素活性に関連する小胞動員を制御することが示されています20.23。特に、蓄積される証拠によれば、破骨細胞分化の際にRab27Aの発現が有意に上調されることが示されています。Shimada-Sugawaraらは、骨髄由来のマクロファージ(BMM)が破骨細胞に分化する過程でRab27Aの発現が増加することを報告しており、破骨形成に関与する可能性を示唆しています28。これらの発見は、Rab27Aが小胞輸送や細胞内シグナル伝達経路を調節することで破骨細胞の形成と機能に影響を与える可能性を示唆しています28,29。

N6-メチルアデノシン(m6A)は、真核生物メッセンジャーRNAおよび非コードRNAにおいて最も豊富な内部RNA修飾であり、RNA代謝と遺伝子発現の重要な調節因子として機能します。哺乳類で最初に特定されたmRNA修飾であるm6Aは、RNAの安定性、スプライシング、輸送、翻訳など多くの生物学的プロセスに関与していることが示唆されています。Wangらは、保存された配列モチーフ内で一般的に起こるm6A修飾がYTHドメインを含むタンパク質によって認識され、mRNAの安定性と代謝の調節に寄与していることを示しました30。さらに、m6A修飾はゲノムの安定性、転写調節、クロマチンの組織、がん進行、免疫応答など多様な生物学的機能に関与していることが示唆されています31。最近の研究では、骨関連疾患や骨粗鬆症におけるm6Aシグナル伝達の重要な役割も強調されています。

m6Aリーダータンパク質の中で、YTHDC1はRNA処理と核輸出を調節する核リーダーとして機能し、一方でインスリン様成長因子2のmRNA結合タンパク質2(IGF2BP2)は細胞質内のm6A修飾転写産物を安定化させます。Chenらは、YTHDC1がm6A修飾されたcircNSUN2の核排出を促進し、これがIGF2BP2と相互作用してHMGA2 mRNAを安定化させ、大腸がん転移を促進することを示しました。これらの発見は、YTHDC1とIGF2BP2による協調的な調節が、m6A修飾転写産物の運命を制御する一般的なメカニズムである可能性を示唆しています。

本研究では、Rab27A mRNA内の予測されるm6A修飾部位を調査し、YTHDC1およびIGF2BP2との相互作用を検討しました。YTHDC1はm6A修飾Rab27A転写体の核輸出を促進することが判明し、IGF2BP2細胞質内のRab27Aと相互作用してその安定性を高めました。この調節機構を通じて、Rab27Aは破骨細胞の分化を促進し、骨粗鬆症の進行に寄与しました。総じて、これらの発見は破骨細胞分化におけるYTHDC1、IGF2BP2、Rab27Aに関与する、これまで認識されていなかったm6A依存性調節経路を特定しました。これらの結果は骨粗鬆症の分子病因に関する新たな知見を提供し、M6Aを媒介したRab27Aの調節を標的とした新しい治療戦略の開発を促進する可能性があります。

プロトコル

すべての動物処置は、サウスウエスト医科大学付属病院の動物保護・利用委員会(承認番号2024-Ethics-042)によって承認されました。すべての実験はARRIVEガイドライン、英国動物(科学的手続き)法1986年および関連ガイドライン、EU指令2010/63/EU、ならびにNIH出版物番号8023、1978年改訂に従って実施されました。マウスは無作為に実験グループに割り当てられ、割り当て順序は研究者には隠されました。組織学的評価、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)画像解析、統計解析を含むすべてのデータ取得および解析は、グループ割り当てを盲検された研究者によって実施されました。分析から動物やサンプルは除外されませんでした。このプロトコルで使用されるすべての試薬、機器、ソフトウェア、その他のリソースは 材料表に記載されています。

1. 卵巣摘出術(OVX)モデルの構築

8週齢の野生型C57BL/6マウス24匹を用いて骨粗鬆症モデルを構築しました。1週間の順応期間の後、マウスは無作為にシャム群またはOVX群に割り当てられました。OVXモデルは、前述の両側卵巣摘出術によって確立されました。34,35。偽手術されたマウスは卵巣の手術を切除せずに曝露しました。

大腿内遺伝子送達では、以前報告された36,37例と同様に、SH-Rab27Aまたはsh-NCを発現するレンチウイルスベクターをOVX手術後7日後に注入しました。簡単に、麻酔下で22ゲージの針を使い、膝蓋骨経路から1×106 トランスデューシング単位/mLの濃縮レンチウイルス粒子を注射しました。各マウスには20μLのレンチウイルス懸濁液が投与されました。その後、切開部は縫合され、動物たちは回復期間中ずっとモニタリングされました。

すべての動物実験は特定の病原体のない条件下で行われました。大腿動脈検体は手術後8週間後に採取されました。1グループあたり少なくとも6匹のマウスが組織学的解析およびRNAまたはタンパク質抽出に使用されました。

2。生体内 マイクロCTイメージング

マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)は小梁骨の形態を評価するために実施されました。各マウスの右脛骨は生後14週でOVX手術前に生 体内 でスキャンされました。22週まで毎週フォローアップスキャンが実施されました。各グループにつき少なくとも6匹のマウスがマイクロCT解析に含まれました。

マウスには腹腔内ナトリウムペントバルビタール(体重50 mg/kg)で麻酔されました。足のつまみ反射の消失と呼吸数の継続的なモニタリングにより十分な麻酔が確認され、画像診断中も維持されました。すべての安楽死手続きは、承認された動物プロトコル、施設の動物福祉ガイドライン、および実験動物安楽死に関する国内規則に従って行われました。

生後24週でマウスは深麻酔後の頸椎脱臼により安楽死され、両方の脛骨を同じ画像診断プロトコルで体 外 スキャンのために採取しました。走査パラメータには、ボクセルサイズ10.4μm、電圧55kV、電流145μA、視野角32mm、1回の投影で1500/750サンプル、積分時間100msが含まれていました。

画像は、1200 mg HA/cmの ファントムに対して較正された3次多項式ビーム硬化補正アルゴリズムを用いて処理されました。骨容積分数(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)は、成長板から1.0mm近位に位置する遠位大腿骨幹端で定量化されました。

3. プラスミドトランスフェクション

sh-Rab27Aおよびsh-NCプラスミドが生成され、レンチウイルスの製造に使用されました。レンチバイラル包装プラスミドとshRNA構成体は、製造元の指示に従って共トランスフェクトしてHEK293T細胞に導入されました。ウイルス価は、前述の大腿内投与前に測定されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

4. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色

大腿動脈標本は4%パラホルマルデヒドに24時間固定され、10%EDTAで4週間脱炭素処理、30%ショ糖/PBSでクライオプロテクトされ、パラフィンに埋め込まれ、厚さ5μmで切片されました。組織切片はヘマトキシリンとエオシンで染色され、光学顕微鏡で検査されました。各グループにつき少なくとも6匹のマウスが分析されました。

5. 酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)染色

大腿動脈切片のTRAP染色は製造元の指示に従って行われました。骨髄由来マクロファージ(BMM)におけるTRAP活性はTRAP染色アッセイを用いて評価されました。成熟した破骨細胞は、少なくとも3つの核を含むTRAP陽性の多核細胞と定義されました。3回の独立した生物学的複製が行われ、それぞれに3回の技術的重複が伴いました。

6. q-PCR

全RNAは製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて分離されました。補完DNAは逆転写酵素を用いて合成され、SYBR Green化学を用いた定量リアルタイムPCRを受けました。3回の独立した生物学的複製が行われ、それぞれに3回の技術的重複が伴いました。

プライマー配列は以下の通りです。

Rab27A: F、TTCCTGCTTCTGTTCGACCT;R, GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

トラップ:F、TGTTGACAGGGGTCTCTA;R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1:F、GGTGCTGTCTGGCCATAACT;R, GCGGAAAGGTGTGTATCTCAA

C-FOS:F、戦術戦術、tactaccatccaccga;R, GCTGTCACCGTGGGGAGGATAAA

YTHDC1: F、GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG;R, TTGATCTTTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2:F、GACTACCCCGACCAGAACTG;R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

βアクチン:F、GGGAAATCGTGGTGACATTAAG;R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. ウエスタンブロッティング

細胞や組織はプロテアーゼ阻害剤を補足したRIPAバッファーを使用して溶解されました。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを用いて測定されました。同量のタンパク質(20μg)をSDS-PAGEによって分離し、ポリビニリデンフッ化物(PVDF)またはニトロセルロース膜に移しました。膜は5%無脂肪ミルクで室温で1時間ブロックし、TRAP、NFATc1、c-FOS、Rab27A、YTHDC1、IGF2BP2、またはβアクチンに対する一次抗体とともに4°Cで一晩培養しました。洗浄後、適切な二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。タンパク質バンドは標準的な検出手法を用いて可視化されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

8. 細胞培養

骨髄由来のマクロファージ(BMM)は、前述の通り39を単離しました。マウス大腿骨から採取した骨髄細胞は、最低限必要な培地に10%胎児用牛血清、30 ng/mLマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを37°Cで加湿空気(5% CO₂を含む環境)で一α晩培養しました。非接着細胞は30 ng/mL M-CSFを含む間質細胞フリー系で収集・培養されました。3日後、接着細胞をBMMとして採取し、30 ng/mL M-CSFおよび50 ng/mLの核因子κBリガンド受容体活性化剤(RANKL)を72時間培養して破骨細胞分化を誘導しました。

9. RNA干渉(RNAi)

製造元の指示に従い、小さな干渉RNA(siRNA)を合成し、脂質系トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトしました。細胞は6ウェルプレートで1ウェルあたり2×4細胞の 密度でシードされ、その後トランスフェクションを行いました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

ターゲット配列は以下の通りです。

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. 免疫蛍光

細胞は4%パラホルムアルデヒドで20分間固定され、0.1%トリトンX-100で10分間透過化されました。5%牛血清アルブミンで30分間ブロッキングした後、細胞は一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートされました。

洗浄後、蛍光色素結合の二次抗体を室温で30分間適用しました。核はDAPIで染色され、画像は共焦点顕微鏡で取得されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

11. 核および細胞質の分離

核および細胞質の分画は製造元の指示に従って分離されました。細胞は氷で10分間溶解され、4°Cで500 ×g で3分間遠心分離されました。 細胞質成分を含む上清液は収集され、核を含むペレットは別々に洗浄・処理されました。

12. RNA結合タンパク質免疫沈降(RIP)

RNA免疫沈殿(RIP)アッセイは製造元の指示に従って実施されました。短時間、細胞を氷で30分間溶解させました。遠心分離後、上清液は抗体およびプロテインA/Gアガロースビーズとともに一晩培養されました。洗浄後、免疫沈殿タンパク質はウェスタンブロッティングで解析され、共免疫沈殿RNAは定量的リアルタイムPCRで解析されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

13. Rab27A mRNA安定性アッセイ

ノックダウン後の指定された時刻で総RNA IGF2BP2抽出されました。その後、逆転写および定量的リアルタイムPCR検査が実施されました。Rab27A mRNAレベルは0時間で対応するsi-NC群に正規化されました。3つの独立した生物学的複製が実施されました。

14. 統計分析

すべての実験は少なくとも3つの生物学的複製体を用いて独立して実施されました。q-PCR、RNA干渉、TRAP染色、ウェスタンブロッティング、その他の細胞ベースのアッセイでは、特に指定がない限り、各生物学的複製には3つの技術的複製が含まれていました。データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。

統計解析はGraphPad Prismバージョン9.0およびSPSSソフトウェアを使用して実施されました。2つのグループ間の比較は、両側の学生t検定を用いて行われました。複数群間の比較は、双方向分散分析(ANOVA)を用いて分析し、その後Tukeyの多重比較事後検定を用いて複数比較を調整しました。P値は0.05<統計的に有意とされました。

結果

Rab27Aのノックダウンは生 体内で骨粗鬆症を減少させました。

Rab27Aが骨粗鬆症に果たす役割を調査するため、Rab27Aのノックダウンは、既に報告された方法34,40を用いて確立された卵巣摘出(OVX)マウスモデルで実施されました。全体の研究デザインは図1にまとめられています。マイクロコンピュータ断層撮影解析により、OVXマウスの骨密度、骨容積分数(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)がシャム対照群と比較して有意に減少していることが示されました(図2A)。これらの発見により、骨粗鬆症モデルの確立が成功裏に示されました。Rab27Aのノックダウンは測定されたすべての骨構造パラメータを有意に回復させ、OVX誘発性骨減少および微細構造的劣化の減衰を示しました(図2A)。

組織学的検査もこれらの発見をさらに裏付けました。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、OVXマウスではシャム群と比較して著しい小梁骨の損失と小梁構造の乱が確認されました(図2B)。対照的に、Rab27Aの枯渇は小梁の劣化を緩和し、骨の形態を部分的に回復させました(図2B)。Rab27Aが破骨細胞分化に関与していることが示唆されている28番目から、破骨細胞活性は酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)染色によって評価されました。TRAP活性はOVXマウスでSham対照群と比較して著しく上昇し、Rab27Aノックダウン後は有意に低下しました(図2C)。

その後、破骨細胞関連マーカーの発現を調べました。ウェスタンブロット解析により、OvXマウスではRab27A、TRAP、NFATc1、c-FOSタンパク質レベルが有意に増加し、Rab27A枯渇後は減少することが示されました(図2D)。転写レベルで一貫した結果が得られ、定量リアルタイムPCR(q-PCR)ではRab27A、TRAP、NFATc1、c-FOS mRNAの発現パターンも類似しています(図2E)。

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図1:破骨細胞分化および骨粗鬆症進行中のm6A修飾Rab27AのYTHDC1およびIGF2BP2媒介調節の実験設計および提案された調節機構の概略。 卵巣摘出(OVX)マウスモデルおよび核因子κBリガンド(RANKL)/マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)誘発性破骨細胞分化モデルを用いて、Rab27Aが破骨形成に果たす役割を調査しました。Rab27Aのノックダウン、核および細胞質の分画、RNA免疫沈降アッセイを用いて破骨細胞分化マーカー(TRAP、NFATc1、c-FOS)、Rab27A発現、細胞内局在を評価しました。YTHDC1はm6A修飾Rab27Aの細胞質輸出を促進し、IGF2BP2細胞質内のRab27Aを安定化させました。これらの協調した調節機構が共に破骨細胞の分化を促進し、OVXモデルにおける骨の減少に寄与しました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:Rab27Aのノックダウンにより、生体内で骨粗鬆症が減少しました。 (A) 小梁骨形態計測解析。骨密度、骨容積分数(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)を定量化しました。**P < 0.01、***P < 0.001。 (B) Rab27A枯渇後の大腿骨小梁骨の組織学的評価。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色を行って、大腿骨の遠位構造変化を評価する。OVXおよびOVX + sh-NC群が対照群として使用されました。スケールバー = 50 μm。***P < 0.001。 (C) 大腿動脈切片のTRAP染色。破骨細胞の活性を評価するためにTRAP活性を評価しました。OVXおよびOVX + sh-NC群が対照群として使用されました。スケールバー = 50 μm。***P < 0.001。 (D–E) Rab27Aの枯渇後のRab27A、TRAP、NFATc1、c-FOSの発現。タンパク質の発現はウェスタンブロッティング(D)で決定され、mRNA発現はq-PCR(E)で決定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。**P < 0.01、***P < 0.001。シャム群は卵巣摘出術なしで卵巣の外科的曝露を受け、OVX群は両側卵巣摘出術を受けました。sh-NC、ネガティブコントロールショートヘアピンRNA。各実験群には6匹のマウスが含まれていました。データは平均±標準差(SD)として表示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

Rab27Aのノックダウンは、M-CSFおよびRANKLによって誘導されるBMMsの破骨細胞分化を抑制しました

破骨細胞形成におけるRab27Aの役割をさらに評価するため、骨髄由来マクロファージ(BMM)をマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および核因子κB配位の受容体活性化因子(RANKL)で刺激し、破骨細胞分化を誘導した。

定量的リアルタイムPCRおよびウェスタンブロット解析により、M-CSFおよびRANKL刺激はRab27A mRNAおよびタンパク質発現を有意に増加させ、一方でsi-Rab27Aを用いたトランスフェクションはRab27A発現を効果的に減少させることが示されました(図3A、B)。TRAP染色はM-CSFおよびRANKL治療後に破骨細胞活性の著しい増加を示しました。Rab27Aのノックダウンは誘導群と比較してTRAP活性を有意に低下させました(図3C)。

その後、破骨細胞分化マーカーの発現を調べました。定量的リアルタイムPCR解析により、破骨細胞誘導後にTRAP、NFATc1、c-FOSのmRNAレベルが有意に増加し、Rab27A枯渇によって減少することが示されました(図3D)。同様の結果は、ウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルでも観察されました(図3E)。

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図3:M-CSFおよびRANKLによって誘導される骨髄由来マクロファージ(BMM)の破骨細胞分化を抑制したRab27Aのノックダウン。 (A–B)破骨細胞誘導後のRab27Aの発現。Rab27A mRNA(A)およびタンパク質(B)レベルは、それぞれq-PCRとウェスタンブロッティングによって決定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。P < 0.001.(C) BMM由来の破骨細胞のTRAP染色。M-CSFおよびRANKLによって誘導されたTRAP活性の増加は、Rab27Aノックダウン後に抑制されました。スケールバー = 50 μm。***P < 0.001。(D–E)Rab27A枯渇後の破骨分化マーカーの発現。TRAP、NFATc1、c-FOS mRNAレベルはq-PCR(D)で決定され、タンパク質レベルはウェスタンブロッティング(E)で決定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。**P < 0.01、***P < 0.001。未処理細胞の対照;si-NC、ネガティブコントロールsiRNA。3つの独立した生物学的複製が実施されました。データは平均標準標準±で示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

m6A修飾Rab27Aの細胞質輸出はYTHDC1によって促進されました

m6A修飾がRab27A調節に関与する可能性を調査するために、バイオインフォマティクス解析が実施されました。Rab27A転写本内に複数の予測されたm6A修飾部位が同定されました(図4A)。さらに、相互作用予測解析では、Rab27Aとm6Aリーダータンパク質YTHDC1およびIGF2BP2との潜在的な関連が示唆されました(図4B)。

YTHDC1とRab27A mRNAの相互作用を検証するために、RNA免疫沈殿法(RIP)アッセイが実施されました。抗YTHDC1抗体で免疫沈殿した複合体では、免疫グロブリンG(IgG)対照群と比較してRab27A mRNAが有意に濃縮されました(図4C)。

YTHDC1はRNA輸出に関与する核m6Aリーダーとして機能するため、核および細胞質の分離アッセイが実施されました。YTHDC1のノックダウンはRab27A mRNAの核保持を有意に増加させつつ、細胞質の存在比を減少させました(図4D)。

YTHDC1がRab27A発現に与える影響はさらに評価されました。定量的なリアルタイムPCR解析により、YTHDC1の除去がRab27A mRNA発現を減少させることが示されました(図4E)。一貫して、ウェスタンブロット解析ではYTHDC1ノックダウン後にRab27Aタンパク質発現が減少することが示されました(図4F)。

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図4:ythdc1によってm6A修飾されたRab27Aの細胞質からの排出が促進されました。(A) SRAMP予測ツールを用いてRab27A内の予測されるm6A修飾部位。 (B) StarBaseを用いてRab27Aとm6Aリーダータンパク質YTHDC1およびIGF2BP2間の予測相互作用を同定した。 (C) YTHDC1とRab27A mRNAの相互作用を示すRNA免疫沈殿(RIP)アッセイ。**P < 0.01。IgGは陰性対照群として機能しました。Rab27Aの濃縮は入力パーセンテージに正規化されました。YTHDC1免疫ブロットバンドは免疫沈殿効率を反映しています。 (D) YTHDC1ノックダウン後のRab27Aの核保持増加を示す核および細胞質分画解析。**P < 0.01、***P < 0.001。 (E–F) YTHDC1ノックダウン後のYTHDC1およびRab27Aの発現。mRNAの発現はq-PCR(E)で決定 され、 タンパク質発現はウェスタンブロッティング(F)で決定 されました。 βアクチンは荷重制御として機能しました。**P < 0.01。si-NC、ネガティブコントロールsiRNA。3つの独立した生物学的複製が実施されました。データは平均標準標準±として示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

IGF2BP2との相互作用によるRab27Aの安定化

IGF2BP2とRab27Aの相互作用はRIPアッセイを用いて調査されました。抗IGF2BP2抗体で免疫沈殿した複合体でRab27A mRNAはIgG対照群と比較して有意に濃縮されており、IGF2BP2とRab27A mRNAの関連を示しました(図5A)。

免疫蛍光解析により、IGF2BP2とRab27Aが主に細胞質内で共局在していることが示されました(図5B)。IGF2BP2がRab27A発現に与える機能的影響を調べるために、IGF2BP2はsiRNAを用いてサイレンシングしました。定量的リアルタイムPCR解析により、IGF2BP2枯渇後にRab27A mRNAレベルが有意に低下していることが示されました(図5C)。これらの結果と一致して、ウェスタンブロット解析ではノックダウン後のRab27Aタンパク質発現IGF2BP2低下が確認されました(図5D)。

その後、IGF2BP2がRab27A mRNAの安定性に与える影響が評価されました。IGF2BP2枯渇はRab27A mRNAの半減期を有意に短縮し、転写本の安定性を低下させました(図5E)。

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図5:IGF2BP2との相互作用によるRab27Aの安定化。 (A) IGF2BP2とRab27A mRNAの関連を示すRNA免疫沈殿アッセイ。IgGは陰性対照群として機能しました。Rab27Aの濃縮は入力パーセンテージに正規化されました。P < 0.001.(B) 細胞質内でRab27AとIGF2BP2の共局在を示す免疫蛍光解析。核はDAPIで染色されました。スケールバー=20μm(C–D)IGF2BP2枯渇後のRab27Aのダウンレギュレーション。Rab27A mRNAレベルはq-PCR(C)で測定され、タンパク質レベルはウェスタンブロッティング(D)で測定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。**P < 0.01、***P < 0.001。(E) ノックダウン後のRab27A mRNAの安定性IGF2BP2Rab27A mRNAレベルは対応するsi-NC基に正規化され、0 h. **P < 0.01でした。si-NC、ネガティブコントロールsiRNA。3つの独立した生物学的複製が実施されました。データは平均標準標準±として示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

YthdC1またはIGF2BP2の沈黙はM-CSFおよびRANKLによって誘導されるBMMsの破骨細胞分化を抑制します

破骨細胞分化におけるYTHDC1、IGF2BP2、Rab27Aの機能的関係をさらに調査するため、BMMsでノックダウン実験が実施されました。

M-CSFおよびRANKL刺激はRab27A、YTHDC1、およびIGF2BP2のmRNA発現を有意に増加させました(図6A)。これに伴い、破骨細胞誘導後もこれらの分子のタンパク質発現が上昇しました(図6B)。YTHDC1またはIGF2BP2のサイレンシングはRab27Aの発現を有意に減少させた一方、一方の調節因子のノックダウンはもう一方の発現に大きな影響を与えませんでした。

TRAP染色は、YTHDC1またはIGF2BP2の枯渇がM-CSFおよびRANKLによって誘導される破骨細胞活性を有意に抑制することを示しました(図6C)。さらに、YTHDC1またはIGF2BP2ノックダウン後にTRAP、NFATc1、c-FOSの発現が減少することが明らかになりました(図6D)。ウェスタンブロット解析により、タンパク質レベルでの減少が確認されました(図6E)。

これらの発見は総じて、YTHDC1とIGF2BP2がRab27A発現の調節を通じて破骨細胞の分化を促進することを示しています。

figure-results-6
図6:M-CSFおよびRANKLによって誘導されるYTHDC1またはIGF2BP2の沈黙が、BMMsの破骨細胞分化を抑制した。 (A–B)YTHDC1またはIGF2BP2ノックダウン後のRab27Aの発現。Rab27A mRNA(A)およびタンパク質(B)レベルは、それぞれq-PCRとウェスタンブロッティングによって決定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。P < 0.001.(C) YTHDC1またはIGF2BP2枯渇後の破骨細胞活動抑制を示すTRAP染色。スケールバー=50μm。**P < 0.01、***P < 0.001。(D–E)YTHDC1またはIGF2BP2枯渇後の破骨細胞分化マーカーの発現。TRAP、NFATc1、c-FOS mRNAレベルはq-PCR(D)で決定され、タンパク質レベルはウェスタンブロッティング(E)で決定されました。βアクチンは荷重制御として機能しました。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001.未処理細胞の対照;si-NC、ネガティブコントロールsiRNA。3つの独立した生物学的複製が実施されました。データは平均標準標準±で示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

データの利用可能性:

本研究で使用および/または解析されたデータセット(ウェスタンブロットデータ、画像データセット、定量解析、ソースファイルを含む)は 補足ファイル1に掲載されています。

補足ファイル1:本研究のデータセットおよび生データ。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

破骨細胞の分化は骨の再構築、骨吸収、骨折修復、骨格恒常性において重要な役割を果たします。過剰な破骨細胞活動は骨粗鬆症の主な要因であり、破骨細胞分化を制御する調節経路の特定は重要な研究目標となっています。破骨細胞機能を標的とした複数の抗吸収療法が臨床的有効性を示しており、6,44,45。例えば、デノスマブは骨折発生率の低減と良好な安全性プロファイルと関連しており、一方でカテプシンK阻害剤ONO-5334は卵巣摘出された非ヒト霊長類において骨密度および骨強度に有益な効果を示している44。本研究では、YTHDC1、Rab27A、およびIGF2BP2に関与するこれまで認識されていなかったm6A依存性調節機構が、破骨細胞分化と骨粗鬆症の進行を促進することを明らかにしました。これらの発見は、破骨形成の分子制御に新たな洞察をもたらし、骨粗鬆症の治療対象の可能性を示唆しています。

Rab27Aは以前、小胞輸送や細胞内シグナル伝達の調節を通じて破骨細胞分化や骨吸収に関与していることが示されており、また主要な受容体のエンドソーム再循環を通じてRANKL誘発シグナル伝達カスケードに影響を与える可能性もあります28,29。これらの報告と一致して、破骨細胞分化時にRab27Aの発現が著しく増加し、Rab27Aの枯渇はin vitroで破骨細胞分化を抑制し、in vivoで骨粗鬆症関連の骨損失を緩和しました。これらの発見は破骨細胞生物学におけるRab27Aの重要な役割を支持し、Rab27A活性がm6A依存的なメカニズムによって調節されることを示すことで、これまでの観察をさらに拡張しています。総じて、これらの発見はm6A修飾Rab27Aが転写後レベルでこれらのプロセスを調節し、その結果として骨吸収活性に影響を与える可能性を示唆しています。

蓄積される証拠は、m6A修飾が骨関連疾患の発症と進行に寄与していることを示しています。バイオインフォマティクス解析により、Rab27A mRNA内に複数の推定されるm6A修飾部位が特定され(図4A)、機能的研究ではYTHDC1およびIGF2BP2がRab27Aの発現および破骨細胞分化を調節することが示されました(図4–6)。これらの発見は、m6A修飾が破骨細胞形成中のRab27A機能を制御する重要な上流の調節機構であることを示唆しています。Rab27A内で複数の予測されたm6A部位が特定されたため、今後の研究でRab27A調節に個別部位または複数の部位の組み合わせが必要かどうかを明らかにすべきです。m6A欠損型Rab27A変異体の構築とその後の救助実験は、この経路におけるm6A修飾の機能的重要性を直接的に示すでしょう。

本研究では、本研究ではYTHDC1がRab27A mRNAと相互作用し、その核輸出を促進することが示されました。細胞質転座後、IGF2BP2はRab27A mRNAと直接結合し、転写本の安定性を高めます。その結果、YTHDC1またはIGF2BP2のいずれかが枯渇するとRab27Aの発現が減少し、破骨細胞分化が抑制されました。これらの発見は、YTHDC1とIGF2BP2がmRNAの輸送と安定性を調整してRab27A発現を維持するために協力するモデルを支持しています。この調節機構は、破骨細胞分化におけるm6A媒介の調節に関する現在の理解を拡大し、この経路の複数の成分を潜在的な治療標的として特定します。

いくつかの制限点を認めておくべきです。まず、Rab27Aは破骨細胞の分化を調節することが示されていますが、その骨芽細胞機能への潜在的な影響はまだ調査されていません。骨恒常性は破骨媒介の骨吸収と骨形成のバランスに依存するため、今後の研究はRab27Aが骨芽細胞の分化や活性にも影響を与えるかどうかを評価するべきです。第二に、本研究は主に機能喪失アプローチに依存していました。Rab27A、YTHDC1、IGF2BP2の補完的な過剰発現と、m6A欠損Rab27A変異体を用いた救済実験は、提案された調節モデルをさらに強化するでしょう。第三に、Rab27A mRNA内の複数の推定されるm6A部位がバイオインフォマティクス手法で予測されましたが、Rab27A機能を調節する特定の部位は未確認であり、実験的検証が必要です。最後に、他のm6Aリーダータンパク質、RNA結合タンパク質、またはシグナル伝達経路が破骨細胞分化中にRab27Aの調節に関与しているかどうかを明らかにするためには、さらなる研究が必要です。

免疫調節は骨粗鬆症の病因の重要な要素として浮上しています46,47。Rab27Aは免疫細胞分泌、細胞毒性顆粒放出、好中球脱顆粒化、組織微小環境の調節(48,49,50,51,52,53,54,55)における機能を確立しています。Rab27A、免疫調節、骨恒常性の関係をさらに調査することで、骨粗鬆症の病因についてさらに新たな洞察が得られる可能性があります。

今後の調査では、いくつかの重要な分野を優先すべきです。まず、Rab27A内の予測されるm6A部位の系統的な変異誘発を行って、YTHDC1およびIGF2BP2媒介の調節に関与する機能的結合部位を特定する必要があります。第二に、Rab27A、YTHDC1、IGF2BP2の過剰発現と、m6A欠損Rab27A変異体を用いた救済実験が、YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2調節軸の直接的な寄与を確立するために不可欠である。第三に、この経路の検証と骨芽細胞におけるRab27A機能の評価が、本研究結果をさらに裏付けるために重要となるでしょう。

結論として、本研究は破骨細胞分化と骨粗鬆症の進行を促進する新規のYTHDC1/Rab27A/IGF2BP2調節軸を特定しました。YTHDC1はm6A修飾Rab27A mRNAの核輸出を促進し、同時に細胞質内のRab27A mRNAの安定性IGF2BP2高めました。これらの協調した調節イベントはRab27Aの発現を促進し、破骨形成を促進しました。これらの発見は、骨粗鬆症におけるm6A介有調節の現在の理解を拡大し、YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2経路を標的とした治療戦略の開発の基盤を提供します。

開示事項

著者たちは競合する財政的利益や利益相反を一切認めていません。

謝辞

この作業は、彭州人民病院と西南医科大学間の科学技術戦略協力プロジェクト(助成金番号2023PZXNYD01)から連堂への資金援助を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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