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方法論記事

DNA-FISHメタフェーズは、ヒトがん細胞株の染色体外DNAと均一染色領域を区別するために広がります

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DOI:

10.3791/71970

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2026年8月4日

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

私たちは、遺伝子座コピー数とゲノム内の位置を視覚的に検出するDNA-FISHメタフェーズ拡散プロトコルを報告します。このアプローチにより、特に染色体外DNAを含むがん細胞株や均一な染色領域において、増幅状態の単一細胞分解が可能となります。

要約

全ゲノムシーケンシングは塩基対分解能で焦点DNA増幅を特定しますが、増幅配列が染色体外DNA(ecDNA、ダブルミニッツとも呼ばれる)上に存在するのか、染色体的に均質染色領域(HSR)上にあるのかは判別できません。DNA蛍光原混成(DNA-FISH)中期拡散は、単一細胞分解能でこれらの増幅状態を識別するゴールドスタンダードとして今もなお存在しています。ここでは、ヒトがん細胞株を用いたDNA-FISH中期拡散の詳細なプロトコルを提示し、細胞培養、中期停止、低張性治療、固定、染色体拡散、蛍光プローブハイブリダイゼーション、蛍光イメージングを含みます。プロトコルには染色体分散の成功を検証し、中期拡散の質を最適化するための中間品質管理ステップが組み込まれており、専門的な細胞遺伝学の専門知識を持たない研究室でもワークフローが利用可能となっています。結果は、遺伝子座特異的プローブを用いたecDNAおよびHSR増幅状態の明確な可視化を示し、解釈に影響を与える一般的な技術的アーティファクトを示しています。このプロトコルは、がん細胞におけるがん遺伝子増幅の構造的組織を研究するための堅牢かつ再現性の高いアプローチを提供します。

概要

ヒトゲノムは配列だけでなく構造によっても組織されており、配列や構造の変化はがん1,2,3,4を引き起こすことがあります。がん遺伝子増幅は全腫瘍の約40%に存在し、腫瘍の開始、成長、転移、薬剤耐性に寄与します5。場合によっては、増幅されたオンコジーンが染色体外DNA(ecDNAs、別名ダブルミニッツ)に運ばれます。これは線状染色体6,7,8,9の外側に位置する、円形で自己複製可能な二本鎖DNA要素です。ecDNAは数百キロベースからメガベースまで、サイズは10,11です。中心粒が存在しないため、有糸分裂時に非対称に分離し、12,13,14,15,16,17,18の核内に最大100+コピーが存在します。この不均一な分離は娘細胞間でコピー数のばらつきを生み、それが腫瘍の急速な進行と患者の不良化を引き起こします17,19。

ecDNAは均一染色領域(HSR)と動的な関係にあります(図1A)8,18。HSRは、ゲノム内の単一の遺伝子座(8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30)に再統合されることで生じる、局所的な染色体内増幅です。31. これら2つの状態、ecDNAとHSRは相互変換可能であり、がん遺伝子増幅が構造的に可塑であることを示しています 24,25,32,33。このインターコンバージョンは治療に重要であり、ecDNAは薬剤32,33,34,35,36,37,38の存在下でHSR状態に移行できます。このHSR状態への移行を経た細胞は、治療圧下で薬剤に対する耐性を持つ33。HSRは悪性腫瘍で良性腫瘍よりも頻繁に見られるようにも見られます(39)。臨床的関連性があるにもかかわらず、これらの増幅構造を識別する方法が未十分に利用されていないため、FDA承認のHSR状態を標的とした戦略は存在しません。

ecDNA状態とHSR状態は臨床的に異なる結果を持ちますが、現在のシーケンシング手法ではそれらを確実に区別することはできません。全ゲノムシーケンシング(WGS)は現在、塩基対分解能40の増幅領域を同定します。WGSはecDNAおよびHSRの配列組成の定義に有用でしたが、空間分解能を犠牲にしています。従来の細胞遺伝学的アプローチとは異なり、WGS単独では増幅配列がecDNA上に存在するか、HSR 41,42,43として染色体に統合されているかを判別できません。その結果、増幅の空間的文脈を保持する手法は、これらの異なる状態の生物学を理解する上で依然として不可欠です。

過去40年間、DNA蛍光の現場ハイブリダイゼーション(DNA-FISH)中期拡散はecDNAおよびHSR増幅状態の同定・識別のゴールドスタンダードとして機能してきました(42,44,45,46)。実際、ecDNAとHSRはメタフェーズに基づく細胞遺伝学的解析で初めて同定・特徴付けられました7,47。蛍光プローブが広く使われる以前は、放射性標識DNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションが行われており、ecDNAやHSRの可視化にも用いられてきました48,49。WGSの普及に伴い、DNA-FISHのメタフェーズ拡散は減少しました。ワークフローの多くの側面は細胞遺伝学の文献に散在しており、最適化されたプロトコルは通常、個々の研究グループや細胞遺伝学研究室に留められ、この手法を独自法として扱っています。ここでは、単一細胞レベルで増幅状態を視覚的に分解するためのDNA-FISH中期拡散プロトコルについて説明します。

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プロトコル

すべてのヒト細胞培養手技は機関のガイドラインに従って実施されました。

1. コルセミド(N-メチル-N-デアセチルコルヒチン)を用いた中期細胞の停止

  1. まずは約2.0 ×10 6–2.0 ×107 のがん細胞または他の培養細胞から始めます。細胞が少なすぎると中期の拡散が少なく、細胞が多すぎると固定が不十分になることがあります。
  2. 実験システムに適したコルセミドの培養期間を決定する。培養期間は得られる中期拡大数や染色体長に影響を与え、最適な条件は細胞タイプによって異なります。
    注:培養期間が短いため、採取時に間期で停止する細胞数が少なくなります。潜伏時間が長いほど、より凝縮した染色体と短い腕が生まれ、解析が難しくなります。約24時間の倍増時間を持つがん細胞株では、45分から一晩の潜伏期間が適切な中期拡散をもたらします。倍増時間が遅い細胞の培養時間を最適化しましょう。2時間のインキュベーションで、分析に適した染色体長を持つ十分な数の中期期スプレッドが得られます。
  3. 適切な培養培地で最終濃度10 μL/mLを達成するために必要なコルセミド量を計算します。
    注意:細胞は中期停止の少なくとも24時間前に通過または播種することで対数増殖を維持してください。培養が70%〜90%のコンフルエンスに達したら、コルセミドで細胞を処理します。
  4. コルセミッドのストック溶液を無菌の超純水で1:1で薄めます。適切な量を加え、細胞培養インキュベーターで45分から一晩培養します。

2. 収穫セル

  1. 新鮮なカルノイ固定剤(3:1メタノール:酢酸)を準備します。固定剤は固定処置中ずっと氷に保管してください。
  2. 新鮮な0.075 M KCl溶液を準備し、37°Cの水浴で温めます。
  3. 細胞をペレットとして採取し、細胞数を記録します。この値を用いて最終的なリサスペンション容積を計算します。
    注:トリプシン化によって付着細胞を剥離してください。懸濁細胞を直接15 mLの遠心分離管に移します。コルセミッドおよびコルセミドを含むメディアは、機関の有害廃棄物ガイドラインに従って処分してください。
  4. 細胞をPBSで洗いましょう。
  5. 細胞を温かい0.075 M KClの10 mLに優しく再懸浮させ、やさしい反逆で混合します。この低張性治療により細胞が腫れ、スライド準備中に染色体が破裂して拡散できるようになります。
  6. 細胞を37°Cの水浴で30分間培養します。
  7. ゆっくりと氷のように冷たいカルノイの固定剤2mLを加え、懸濁液を逆さまに混ぜます。
  8. 細胞を5分間置いてください。
  9. 室温(RT)で500 × g の遠心分離機で5分間加熱します。
  10. 上澄液を慎重に吸引するか、ピペットで除去してください。
  11. 氷のように冷たいカルノイ固定剤10mLを0.5mLずつゆっくり加え、各加えた後は優しく混ぜます。
  12. 細胞をRTで10分間放置します。
  13. 遠心分離機で650× g で5分間RTで加熱します。
  14. ステップ2.10–2.13を2回繰り返します
  15. 最終洗浄中は、細胞をカルノイの固定剤に浸したままにしてください。
    一時停止:固定セルサスペンションを−20°Cで保管するか、直ちにセクション3へ進む。
    注意:約3×10個6細胞未満 のサンプルについては、より大きな円錐形チューブではなく1.5 mLのマイクロ遠心分離機管で固定を行うべきです。0.075 M KClとカーノイ固定液の体積を10倍に減らしつつ、すべての培養時間、温度、遠心分離条件を維持します。

3. テーブルトップドロップ

  1. −20°Cからサンプルを回収し、解凍してRTにします。
  2. 800 × g で離心分離機を7分間RTで操作します。
  3. ガラススライドにラベルを貼り、氷の上に置いてください。
  4. 固定前に得られた細胞数を用いて、最終濃度約5 ×10 6 cell/mLでペレットを再懸浮させるために必要なカルノイ固定液の体積を計算します。遠心分離後、ピペットで上澄液を慎重に除去し、計算された固定液の量をペレットの上に残します。
  5. P1000ピペットを使ってカーノイ固定液の固定セルを再懸浮させます。
  6. 約300μLの固定細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
  7. P200ピペットでピペットを何度か上下に繰り返して、サンプルを完全に再懸濁します。
  8. P200ピペットを使って60μLの再懸濁細胞を吸引します。
  9. ピペットの先端をガラススライドの約1m上に持ち、スライドの中央を狙います。
  10. セルの懸流液をゆっくりとスライドに一滴垂らします。
    注意:スライドの端に滴下位置をエタノール耐性マーカーで印をつけ、後のステップで識別しやすくしてください。
  11. 細胞を氷で10分間乾燥させます。
  12. スライドを80°Cのスライドインキュベーターに10分間置きます。
  13. トングでスライドを外し、触って冷ます。
  14. 10×または20×の対物レンズを持つ位相差顕微鏡でスライドを観察します。過度な重複なしに複数のよく分散した中期相拡散の存在を確認しましょう。

4. スライドのプリトリート

  1. 洗浄工程のためにコプリンの瓶を準備しましょう
    1. 各試薬は新鮮に準備してください:70%酢酸(40 mL)、PBS(40 mL)、PBS(45 mL)、70% エタノール(40 mL)、85% エタノール(40 mL)、100% エタノール(40 mL)。
  2. ガラススライドを70%酢酸に2分間浸します。
  3. グラススライドを40mLのPBSに30秒浸します。
  4. ガラススライドをPBS45mLに5分間浸します。
  5. ガラススライドを70%、85%、100%エタノールに順次1分間脱水します。
  6. スライドはRTで10分間自然乾燥させます。

5. プローブの準備

注:このプロトコルは、市販の遺伝子座特異的DNA-FISHプローブを使用し、関心のあるゲノム領域にハイブリダイズします。

  1. 検査対象の増幅遺伝子座を標的としたプローブを選択します。メーカーの指示に従ってプローブとハイブリダイゼーションバッファを解凍してください。使用前にプローブがRTに到達するまで待ちましょう。
  2. 各ガラススライドごとに1μLのプローブと4μLのハイブリダイゼーションバッファーを含むプローブ混合物を準備します。
    注:最適なプローブ濃度はメーカーやプローブによって異なります。ここで指定された濃度は、本研究で使用されたプローブに基づいて最適化されています。ただし、各新しい遺伝子座ごとにプローブ濃度を最適化してください。
  3. ガラススライドの各滴位置の中心にプローブ/ハイブリダイゼーションバッファー混合物5μLを塗布します。
    注意:プローブは光に敏感です。残りの手順では、スライドを暗い引き出しに保管し、他のスライドを処理する際には光の被曝を最小限に抑えます。
  4. サンプルの上にカバースリップを慎重にかけてください。
  5. カバースリップの縁をゴムセメントで密封します。
  6. ガラススライドを湿ったチャンバーに入れます。
  7. メーカーのプロトコルに従ってプローブをハイブリダイズしてください。交雑を一晩(12〜18時間)進めます。

6. ハイブリダイゼーション後のウォッシュ、カウンターステイン、マウント、イメージング

  1. 洗浄工程のためにコプリンの瓶を準備しましょう
    1. 各試薬は新鮮に調製してください:SSC2×(40 mL)、SSC 0.4 ×(40 mL)、エタノール70%(40 mL)、85%エタノール(40 mL)、100%エタノール(40 mL)、PBS(45 mL)。
    2. SSCを20×のストック溶液(3 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0)として準備・保存します。1Lを製製するには、175.3 g NaClと88.2 gのクエン酸ナトリウムを1Lの超純水に溶かします。必要に応じて2×SSCと0.4×SSCの作動溶液を希釈します。
  2. 0.4×SSC溶液を水浴で72°Cまで温めます。
  3. 湿気のあるチャンバーからガラススライドを取り出し、慎重にゴムセメントを除去します。
  4. ガラススライドを2×SSCに2分間RTで置き、カバースリップを慎重に外します。
  5. ガラススライドを予温した0.4× SSCで72°Cで2分間置きます。
  6. グラススライドを2×SSCでRTで1分間置きます。
  7. ガラススライドを70%、85%、100%エタノールに順次1分間脱水します。
  8. RTで暗闇の中で10分間自然乾燥させてください。
  9. PBS中に1 mg/mLのDAPI 1:1000を希釈して最終体積1 mLにします。
    注:このアリコートは4°Cで最大1週間保存可能です。
  10. 希釈したDAPIを10μLピペットで各ガラススライドの指定ドロップ位置に注ぎます。
  11. サンプルにカバースリップを慎重にかけて、DAPI溶液が均等に広がるようにしてください。
  12. スライドは暗闇の中で5〜10分間孵化します。
  13. グラススライドをPBSに30秒置きます。
  14. カバースリップを外してください。
  15. ガラススライドをPBSに2分間置きます。
  16. ガラススライドを70%、85%、100%のエタノールにそれぞれ約10秒ずつ短く浸して脱水します。
  17. RTで暗闇の中で10分間自然乾燥させてください。
  18. 各ガラススライドに15μLのマウントメディウムを加え、その上にカバースリップを敷きます。
  19. メディウムを均一に広げ、余分な部分を優しく拭き取ってください。
  20. カバースリップの端をネイルポリッシュで封印してください。
  21. 暗闇の中でRTで15分間ネイルポリッシュを乾かします。
    一時停止:スライドは長期保存のために4°Cで保存してください。
  22. スライドをイメージしてください。
    注:画像は60×油浸漬対物レンズを用いた逆型蛍光顕微鏡で取得されました。
  23. 各蛍光チャネルに対して複数のzスタックを集め、中間相拡散の全深部にわたって信号を捕捉します。
  24. 最大尤推定アルゴリズムを用いて画像スタックをデコンボルト化し、信号の鮮明さを高め、ピントの合わない蛍光を減らします。
  25. ImageJで最終画像を処理・解析し、各メタフェーズスプレッドに最適な焦点面を選択してから、下流解析を行います。

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結果

このプロトコル(図1B)により、細胞遺伝学解析に適したクリーンで分散した完全な中期染色体が得られ、蛍光顕微鏡で染色体およびDNA-FISHシグナルが明確に観察されます。明視野/位相差顕微鏡を低倍率(10×または20×)で使用することは、核の破裂や染色体の拡散を検証するための重要な品質管理ステップです(図2)。固定とテーブルトップドロップが成功すれば、スライド全体に複数の染色体バーストが目に見える、よく分散した中期拡大が得られるはずです。高品質な中期スプレッドの収率は細胞株に依存し、コルセミド処理の期間にも影響を受けます。一般的なベンチマークとして、成功した調製は20×の対物レンズ52を用いて、視野あたり約3〜5個の細胞がメタフェーズで破裂します。最適でない中期拡散は、細胞の凝集、破裂核の割合の低さ、染色体分散の不十分さを示し、これらはいずれも下流の解釈を妨げます。

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ディスカッション

既に確立された利点があるにもかかわらず、DNA-FISHメタフェーズスプレッドはWGS時代にはあまり活用されていません。増幅されたDNAの物理的組織は機能的に重要であり、生物学的行動や治療反応に影響を与える可能性があります(61,62,63,64)。焦点増幅されたオンコジーンはecDNA上やHSR内に存在し得ますが、これら2つの増幅状態は機能的に同値ではありません(14,65,66,67)。例えば、ecDNA上で増幅された遺伝子を標的とした治療は細胞死を誘発する一...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

この研究はNIH R00HG011467およびCPRITがG.S.E.へのRR23004の支援を受けました。このプロジェクトの画像診断は、ベイラー医科大学の統合顕微鏡コアがNIHの資金提供を受けて支援されました(P30 DK056338、P30 CA125123、S10OD030414)。著者たちは、初期の助言に感謝しています。また、著者らはGBM39ecおよびGBM39hsr細胞株を提供してくれたスタンフォード大学のポール・ミシェル博士に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15-mL円錐形遠心分離機どちらでもNA遠心分離。 
15-mL円錐形チューブどちらでもNA細胞収集。
200プルーフエタノールどちらでもNA洗浄ステップ。 
氷酢酸、99.7%Millipore Sigma695092Carnoy固定液とスライド洗浄ステップ。
アンチフェイド実装媒体FisherScientificNC9265087スライド準備完了後のスライド実装
真空出口付き生物安全キャビネットどちらでもNA化学物質の保管。
コルセミド（N-メチル-N-デアセチル-コルヒチン）Millipore Sigma10295892001チューブリンに結合し、細胞を後期に停止させる。
コプリンジャーどちらでもNA洗浄ステップ。 
DAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール）Milipore SigmaD8417-1MG蛍光DNA染色。
EGFR/CON7 FISHプローブ Empire GenomicsEGFR-CHR07遺伝子座特異的蛍光プローブ。 
エルマーのゴムセメントどちらでもNA一晩のプローブハイブリダイゼーション中にカバースライドを所定の位置に保持する。
エタノール耐性永久マーカーどちらでもNAスライドのラベリング。
蛍光顕微鏡どちらでもNAスライドのイメージング。 
ガラスカバースリップ、22 x 22mmThermoFisher50-143-780スライド上のプローブハイブリダイゼーション。
ガラススライド、プレクリーン済みVWR48311-703後期分裂板を落下させ、DNA-FISHを実行するため。
湿式CO2インキュベーターどちらでもNA生きた細胞のインキュベーション。
ハイブリダイゼーションバッファーEmpire GenomicsHyb-Bufferプローブと共に使用するバッファー。 
氷バケットどちらでもNACarnoy固定液を冷たく保つ。 
KCl（2M）ThermoFisherAM9640G固定前の細胞の膨張。 
メタノール、99.9%、HPLCグレードMillipore Sigma1060351000Carnoy固定液用。 
マイクロ遠心分離機どちらでもNA遠心分離。 
マイクロ遠心分離機チューブどちらでもNA固定中の細胞用、およびプローブ準備用。 
MYC / SE 8プローブLeicaKI-10106遺伝子座特異的蛍光プローブ。 
PBS、pH 7.4Gibco10010-023洗浄ステップ。 
位相差顕微鏡どちらでもNA落下直後の後期分裂板のイメージング
ピペットチップどちらでもNAピペッティング。
塩化ナトリウムMillipore SigmaS9888SSCバッファー用。
クエン酸ナトリウムMillipore Sigma567446SSCバッファー用。
滅菌超純水どちらでもNA洗浄ステップ。 
ThermoBriteプログラム可能なスライドインキュベーターどちらでもNAスライドインキュベーション。
トングどちらでもNAスライド洗浄ステップ用。 
水浴どちらでもNAKClインキュベーション用。 

参考文献

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