方法論記事

マウス一次CD8+ T細胞の活性化および分化におけるTCRシグナルの強度と持続時間：標準化されたin vitroアプローチ

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DOI：

10.3791/71979

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2026年8月25日

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、マウス一次ナイーブCD8 T細胞を活性化するための系統的な手法について解説します。+ 段階的なTCR刺激法を用いたT細胞の解析。これにより、CD8陽性T細胞の増殖、活性化、およびサイトカイン産生の包括的な分析が可能となる。+ 異なるTCRシグナル強度におけるT細胞。

要約

T細胞受容体（TCR）のシグナル強度と持続時間は、CD8⁺ T細胞の活性化、増殖、および機能的分化を決定する重要な因子です。しかし、異なるTCRシグナル入力がT細胞の運命をどのように規定するかを体系的に比較できる標準的なin vitroモデルは限られています。本研究では、プレート結合抗CD3抗体と可溶性抗CD28抗体を用い、インターロイキン-2（IL-2）を添加してin vitroで一次マウスT細胞を活性化する再現性のある手法を提示し、抗CD3抗体濃度（シグナル強度）と刺激時間（シグナル持続時間）の調整がT細胞の活性化結果にどのように影響するかを検証します。ここでは、C57BL/6マウスからナイーブT細胞を分離し、その後、さまざまな抗CD3濃度（0.1–10 µg/mL）および刺激時間（6–48 h）で刺激を行うプロトコルを詳述します。フローサイトメトリー解析を行い、mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）活性の指標として細胞内リン酸化S6リボソームタンパク質（p-S6）を介した初期TCR誘導シグナリングを評価し、次に、表面活性化マーカー（CD69、CD25、ICOS、PD-1）、バイオレット増殖追跡染料（CTV）の希釈による細胞増殖、および機能的分化の指標としてのエフェクター分子発現（Granzyme B、TNF-α）を含む下流のイベントを評価しました。本手法は、再現性のあるT細胞刺激を実行するための明確で段階的な視覚的ガイドを提供し、特定のTCRシグナルパラメータがT細胞の運命決定をどのように導くかを解析することを可能にします。このアプローチは、T細胞の活性化と分化に関するメカニズム研究をサポートするだけでなく、養道免疫療法のためのT細胞コンディショニングやin vitroプライミングアッセイを最適化するためのプラットフォームも提供します。ビデオ実演と詳細なプロトコルの解説を統合することで、本プロトコルはT細胞免疫学研究における手法の透明性と再現性を向上させます。

概要

T細胞は、病原体や腫瘍に対する防御的な免疫応答に不可欠である。ナイーブT細胞は、長期的な生存と持続性を維持するために、静止状態で能動的に維持されている1。抗原刺激を受けると、T細胞は静止状態を脱し、クローン増殖とエフェクター分化を起こす2。T細胞受容体（TCR）シグナル伝達は、適応免疫応答を開始し調節するための核心的なプロセスとして機能する3。抗原提示細胞（APC）の表面に提示されたペプチド-主要組織適合性複合体（pMHC）分子を特異的に認識すると、一連のシグナル伝達イベントがトリガーされ、それによってT細胞のクローン増殖と機能的分化が促進される4,5,6。

抗原の親和性、アビディティ、濃度などの主要因によって決定されるTCR刺激の強度は、T細胞活性化の程度、エフェクター機能の獲得、および異なるエフェクターまたはメモリーT細胞サブセットへの分化経路を制御する上で重要な役割を果たします7,8,9。TCR依存的なT細胞活性化を調査するための現在のin vitroモデルでは、主にプレート結合型またはビーズ結合型のanti-CD3およびanti-CD28抗体が用いられており、これらはTCRリガンド結合と共刺激信号を同時に提供します10,11。このようなシステムは広く利用されていますが、通常は単一の（多くの場合、飽和濃度の）anti-CD3抗体のみを使用するため、滴定された刺激勾配で達成可能なTCR信号強度のダイナミックレンジを捉えるのではなく、単なるT細胞活性化のall-or-nothingなバイナリ比較しか行えません12,13。

本プロトコルでは、滴定したanti-CD3濃度勾配（0.1–10 µg/mL）と一定濃度のanti-CD28（1 µg/mL）を用い、段階的なTCRシグナル強度が一次マウスCD8+ T細胞の活性化、増殖、および機能的表現型をどのように調節するかを系統的に評価するための、標準化され再現性の高いin vitroシステムを提供します。このアプローチの中核となるのはマルチパラメーターフローサイトメトリーであり、mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）活性の指標としての細胞内リン酸化S6リボソームタンパク質（p-S6）を介した上流シグナリングと、CTV希釈による増殖、活性化表面マーカー（CD69、CD25、誘導性T細胞共刺激分子 [ICOS]、programmed cell death protein 1 [PD-1]）、およびエフェクター分子の発現（Granzyme B、腫瘍壊死因子アルファ [TNF-α]）を含む下流の細胞結果の両方を、6時間から48時間のタイムコースで捕捉します。

本プロトコルでは、プレート結合抗CD3抗体の濃度勾配を用いて刺激強度を精密に調節し、それによって生理的条件下で観察されるTCR結合アビディティの差異を模倣します。この手法により、TCRの架橋が高効率に達成され、静止期の初代T細胞が強力に活性化されます。標準化されたコーティング手順により、プレート表面への抗体の均一な分布が保証され、同一バッチ内の細胞間で一貫した刺激が得られるため、優れた実験再現性が実現します。この形式は、T細胞活性化のためのコスト効率が高く、操作的に簡便なアプローチを提供します。

しかしながら、このアプローチにはいくつかの限界があることを認識しておく必要があります。anti-CD3/CD28抗体による刺激は、in vivoの生理学的状況とは大きく異なります。T細胞の活性化を評価するためにアゴニスト抗CD3抗体および抗CD28抗体のみを用いる実験手法は、活性化の有効なリードアウトを提供できますが、生理的条件下で起こる抗原提示細胞とT細胞との相互作用や、共刺激マイクロ環境を完全に再現することはできません14。

これらの制限はあるものの、本プロトコルは体系的かつ再現可能なプラットフォームを提供しており、TCR信号強度に依存するT細胞応答を調査するための有用でアクセスしやすいツールとなり、より複雑な抗原特異的モデルを補完することができます。

プロトコル

本研究におけるすべての動物実験は、第三軍医大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 試薬およびプレートの調製

  1. 滅菌PBSを用いて、0.1、0.5、1、5、および10 µg/mLのプレート結合用anti-CD3を調製する。
  2. 平底96ウェルプレートの各ウェルに、anti-CD3コーティング溶液を50 µLずつ分注する。
  3. シーリングフィルムでプレートを密封し、4 °Cで一晩インキュベートする。
  4. コーティング溶液を吸引し、細胞を添加する前に各ウェルを200 µLの滅菌PBSで2回洗浄する。

2. マウス脾臓からのナイーブCD8+ T細胞の単離

  1. 6–8週齢の雄性C57BL/6マウス（Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.より購入）を選択し、CO2 吸入および頚椎脱臼により安楽死させる。マウスは、12時間の明暗サイクルおよび餌と水が自由に摂取できる条件下で、特定病原体不在（SPF）環境で飼育する。1回の独立した実験につき、最低3匹のマウスを使用する。
  2. 外科用ハサミで腹膜を慎重に切開して脾臓を露出させ、ピンセットを用いて脾臓を把握して採取し、2%胎児牛血清（FBS）を添加した予冷RPMI 1640（R2）を含む回収ディッシュに入れる。解離させるまでディッシュを氷上に保持する。
    注：すべての動物死骸および細胞培養廃棄物は、指定のバイオハザードバッグに回収し、廃棄前に121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌すること。
  3. 脾臓を回収ディッシュから取り出し、3 mLの1 × 塩化アンモニウム・カリウム（ACK）溶血バッファーを含む60 mmディッシュに移す。
  4. 3 mLシリンジのプランジャーを用いて脾臓を70 µmセルストレーナーで穏やかにすり潰し、単一細胞懸濁液を調製する。
  5. 懸濁液を室温（RT）で1分間インキュベートした後、予冷したR2培地を3 mL加えて塩化アンモニウム・カリウム（ACK）溶血バッファーを中和する。
  6. 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、4 °Cにて500 × gで5分間遠心分離する。
  7. 遠心分離後、上清を吸引除去し、ペレットを10 mLのフローサイトメトリー染色バッファー（2% FBS含有PBS）で再懸濁する。
  8. 懸濁液を70 µmセルストレーナーでろ過して新しい15 mLコニカルチューブに移し、再び4 °Cにて500 × gで5分間遠心分離する。
    注：機能解析のための細胞生存率を維持するため、フローサイトメトリー染色バッファーからアジ化ナトリウムは除外すること。すべてのサンプルは4 °Cで保持し、直ちに解析すること。
  9. 上清を吸引除去し、マウス1匹の脾臓につき200 µLのビオチン化抗体カクテル（anti-CD16/32 (Fc block)、anti-TER-119、anti-CD19、anti-CD4、anti-B220、anti-NK1.1、anti-Ly-6G、anti-CD11b、anti-CD11c、anti-CD49b、anti-CD44、およびanti-F4/80を含む）で細胞ペレットを再懸濁する。
  10. 氷上で25分間インキュベートし、十分に混合させるため5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させる。
  11. 大量のフローサイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄し、500 × gで5分間遠心分離して上清を捨てる。
  12. ビオチン化抗体カクテルに使用したときと同じ量のフローサイトメトリー染色バッファーでペレットを再懸濁し、その半量のストレプトアビジンコート磁気ビーズを加え、氷上で15分間インキュベートする。この際、5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させて十分に混合させる。
  13. チューブを短時間遠心分離し、磁気スタンドに2–3分間静置して、上清（濃縮されたナイーブCD8+ T細胞）を慎重に新しい15 mLコニカルチューブに移す。
  14. 回収した細胞をフローサイトメトリー染色バッファーで1回洗浄し、再び500 × gで5分間遠心分離する。
  15. 上清を捨て、後続のアプリケーションのために10% FBSを添加したRPMI 1640（R10）でペレットを再懸濁する。

3. 増殖追跡のためのバイオレット増殖追跡染料（CTV）による標識

  1. 使用直前に2 × CTV作動溶液（10 µM）を調製する。5 mM CTVストック溶液（ジメチルスルホキシド [DMSO] 溶解）をボルテックスで十分に混合し、滅菌PBSで希釈して最終濃度を10 µMにする。
    注意：DMSOは毒性化合物の皮膚吸収を促進するため、DMSOで調製したCTVストック溶液は、ドラフトチャンバー内でニトリル手袋を着用して扱うこと。吸入および皮膚への接触を避けること。
  2. 単離したナイーブCD8+ T細胞の半分を、あらかじめ冷却したPBSを用いて8 × 107 cells/mLの密度で再懸濁する。
  3. 細胞懸濁液に同量の2 × CTV作動溶液（10 µM）を速やかに加え、ピペッティングでよく混合して、CTVの最終濃度を5 µMにする。
  4. 細胞を室温・暗所で20分間インキュベートし、その間、十分に混合させるため5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させる。
  5. 細胞に5倍量の培地（10%以上のFBSを含む）を加え、氷上で5分間インキュベートして遊離染料を除去する。
  6. 細胞を500 × gで5分間遠心分離し、ペレットを、anti-CD28（最終濃度：1 µg/mL）およびIL-2（最終濃度：10 ng/mL）を添加してあらかじめ加温した完全培地R10で再懸濁する。
  7. あらかじめコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液250 µL（6 × 105 cellsを含む）を分注する。
  8. 細胞を37 °C、5% CO₂条件下で最大48時間培養する。

4. フローサイトメトリーによるCTV検出

  1. 6、36、および48時間後に細胞を96ウェル丸底プレートに回収する。500 × gで5分間遠心分離し、フローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄する。
  2. 表面染色のために、anti-CD8、固定可能な生存率染料（fixable viability dye）、およびanti-CD44を含む抗体カクテル50 µLとともに、細胞を氷上で30分間、暗所でインキュベートする 。
    注意：蛍光標識抗体を含むすべての上清は、除染のために0.5%次亜塩素酸ナトリウムを添加した指定の廃棄容器に回収し、施設のバイオハザード廃棄物プロトコルに従って廃棄すること。
  3. 細胞をフローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄し、フローサイトメーターでの測定用にフローサイトメトリー染色バッファー200 µLで再懸濁する。
  4. 3波長のレーザーを備えたフローサイトメーターでサンプルを測定する。染色した細胞を用いて単色コントロールチューブを調製し、コンペンセーションパラメータを設定する。
  5. 以下のゲーティング戦略を適用する：前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）ゲーティングによりデブリを除去し、シングレットゲーティングによりダブレットを排除し、解析対象として生存（固定可能な生存率染料陰性）CD8+ T細胞を選択する。
  6. サンプルあたり少なくとも1 × 104個のゲート内CD8+ T細胞イベントを収集する。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いてデータを解析し、増殖解析モジュールを用いて1回以上の分裂を経た細胞の割合を算出する。

5. 活性化およびシグナリングに関する表面および細胞内染色

  1. 残りの半分のナイーブ CD8+ T 細胞を、anti-CD28（1 µg/mL）および IL-2（10 ng/mL）を添加した R10 に、2.4 × 106 cells/mL の濃度で再懸濁する。
  2. あらかじめコーティングした 96 ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液 250 µL（6 × 105 cells）を分注する。
  3. 37 °C、5% CO₂ 下で、最大 48 時間培養する。
  4. 指定の時間（6、10、12、24、36 時間）に、細胞を 96 ウェル丸底プレートに回収する。
    注：6 時間では、初期の TCR シグナリング（phospho-S6）および CD69 を捕捉する。CD69 については、その完全なキネティクスを把握するため、12、24、36 時間でも同様に評価する。CD25、PD-1、および ICOS は 10、12、24、36 時間でモニタリングする。48 時間の時点は、増殖（セクション 4）およびサイトカイン検出（セクション 6）のために予約されている。
  5. 500 × g で 1 分間遠心分離し、細胞ペレットを 200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーで再懸濁する。
  6. 500 × g で 1 分間遠心分離し、上清を吸引して除去する。200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーで細胞を 2 回洗浄する。
  7. 表面染色のために、anti-CD69、anti-CD25、anti-CD8、anti-PD-1、anti-ICOS、および固定可能な生存率染料を含む抗体カクテル 50 µL と共に、氷上・暗所で 30 分間インキュベートする。
  8. 未結合の抗体を除去するため、フローサイトメトリー染色バッファーで細胞を 3 回洗浄する。
  9. 細胞ペレットを 200 µL の 1% パラホルムアルデヒドに再懸濁し、室温・暗所で 15 分間固定する。
    注意：蒸気の吸入を防ぐため、パラホルムアルデヒドを使用するすべての工程はドラフトチャンバー内で行うこと。固定液を含むすべての液体廃棄物は、有害化学物質廃棄物用として標記された別容器に回収すること。
  10. 500 × g で 1 分間遠心分離し、フローサイトメトリー染色バッファーで 1 回洗浄する。
  11. 5 × lyse/fix バッファーを室温で予熱し、蒸留水を用いて 1 × ワーキングソリューションを調製する。
  12. 各ウェルに 200 µL のワーキングソリューション（1 × lyse/fix バッファー）を加え、室温・暗所で 30 分間インキュベートする。
  13. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで 2 回洗浄する。ペレットをリン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで再懸濁し、室温・暗所で 10 分間インキュベートする。
  14. 500 × g で 1 分間遠心分離し、上清を捨てる。
  15. 細胞内染色のために、anti-p-S6 を含む抗体カクテル 50 µL と共に、室温・暗所で 60 分間インキュベートする。
  16. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を 3 回洗浄する。
  17. 二次抗体染色のために、anti-rabbit 二次抗体を含む抗体カクテル 50 µL と共に、氷上・暗所で 30 分間インキュベートする。
  18. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を 3 回洗浄し、その後フローサイトメトリー染色バッファーで 1 回洗浄する。
  19. 細胞ペレットを 200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、同一のフローサイトメーターでサンプルを測定する。
  20. セクション 4.5 で述べたものと同じゲーティング戦略を適用し、サンプルあたり少なくとも 1 × 104 個の CD8+ T 細胞を収集する。
  21. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて、各マーカーの平均蛍光強度（MFI）を解析する。

6. 細胞内サイトカインのブロッキングおよび検出

  1. 回収の5時間前に、PMA (50 ng/mL)、イオノマイシン (1 µg/mL)、タンパク質輸送阻害剤 (monensin) (1:1000)、およびタンパク質輸送阻害剤 (brefeldin Aベース) (1:1000)を添加した新鮮なR10を、1ウェルあたり100 µLずつ加える。緩やかに混ぜ、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻し、サイトカインの分泌を遮断して細胞内に蓄積させる。
  2. 目的の時点で、細胞を96ウェル丸底プレートに回収する。
  3. 500 × gで1分間遠心分離し、細胞ペレットを200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁する。
  4. 500 × gで1分間遠心分離し、上清を吸引除去する。200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄する。
  5. 表面マーカー染色のため、anti-CD44、anti-CD8、および固定可能生存率染料を含む50 µLの抗体カクテルと共に、氷上で暗所にて30分間インキュベートする。
  6. 未結合の抗体を除去するため、フローサイトメトリー染色バッファーで3回洗浄する。
  7. 200 µLの固定・透過化溶液を加え、氷上で暗所にて30分間インキュベートして細胞を透過化させる。
    注意：蒸気の吸引を防ぐため、固定・透過化溶液（パラホルムアルデヒド含有）を使用するすべての工程は、ドラフトチャンバー内で行うこと。固定剤を含むすべての液体廃棄物は、有害化学物質廃棄物用として指定された別の容器に回収すること。
  8. 500 × gで1分間遠心分離し、上清を有害化学物質廃棄物として廃棄する。
  9. 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を3回洗浄する。
  10. 細胞内サイトカイン染色のため、anti-TNF-αおよびanti-Granzyme Bを含む50 µLの抗体カクテルと共に、氷上で暗所にて30分間インキュベートする。
  11. 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を3回洗浄して未結合の抗体を除去し、最後にフローサイトメトリー染色バッファーで1回洗浄を行う。
  12. 細胞ペレットを200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、同一のフローサイトメーターでサンプルを測定する。
  13. セクション4.5で説明したゲート戦略を適用し、サンプルあたり少なくとも1 × 104個のCD8+ T細胞を回収する。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて、各マーカーの陽性率およびMFIを解析する。

結果

異なる抗CD3刺激強度によるT細胞活性化への影響を調べるため、マウス脾細胞を単離し、in vitro培養用にCD8+ T細胞を精製した後、T細胞活性化アッセイおよびフローサイトメトリー解析を実施した。データ解析では、まずFSC-AとSSC-Aを組み合わせてリンパ球をゲートし、次にFSC-HとFSC-Wを用いてシングレットをゲートし、続いてSSC-HとSSC-Wでゲートした。生細胞であるCD8+ T細胞は、後続の解析のために、CD8と固定可能な生存染料を組み合わせてさらにゲートした（図1A）。

プレート結合抗体刺激システムがin vitroでT細胞を効果的に活性化することを検証するため、mTORC1活性の確立された下流リードアウトであり、TCRシグナリングの下流にあるPI3K-mTORおよびMEK-ERK MAPK経路の収束点であるリボソームタンパク質S6のリン酸化（p-S6）を調べました15,16。これらの知見と一致して、抗CD3抗体濃度の増加（0.1–10 µg/mL）に伴い、刺激後6時間におけるp-S6レベルの用量依存的な上昇が観察され（Figure 1B）、プレート結合抗CD3システムが信号強度依存的にTCR-mTORC1-S6軸を活性化することが確認されました。この初期のリン酸化イベントは、その後のT細胞増殖およびエフェクター分化を支持するmTORC1依存的な代謝経路の関与と一致しています。

細胞増殖は、段階的な濃度のanti-CD3（0.1–10 µg/mL）を用いたTCR刺激後、3つの時点（6、36、48 h）において、CTV希釈フローサイトメトリーにより評価した。刺激後早期の6 h時点では、すべての刺激条件下で最小限の増殖希釈しか観察されなかった。36 hまでには、低用量刺激群（0.1 µg/mL）では依然として顕著なクローン増殖が誘導されなかったが、中用量および高用量群（5および10 µg/mL）では十分に分離したCTV希釈ピークが認められ、細胞周期の進行が開始したことが示された。48 hにおいて、刺激濃度による増殖表現型の差が最も顕著となった。弱いTCR刺激（0.1 µg/mL）では、増殖細胞はわずか1.25%であり、希釈されていない単一のCTVピークが得られ、活性化が不十分であることが示された。中程度の刺激（1–5 µg/mL）では、3つの分離した分裂ピークが誘導され、増殖分画は70.8%から84.0%に増加した。強い刺激（10 µg/mL）では、最高の増殖分画（89.5%）に達し、最大数の分裂世代を示し、増殖飽和の検出が実証された（Figure 2）。

次に、早期活性化マーカーであるCD69およびCD25の発現を検討しました。特筆すべき点として、本研究では、中央値蛍光強度（MFI）に基づき、CD69発現の迅速かつ用量依存的な上昇が明らかになりました。中等度および強度の刺激（5および10 µg/mL）下では、CD69は24 hで急速に上昇し、その後24から36 hにかけて徐々に低下しました。一方、弱度の刺激（0.1、0.5、および1 µg/mL）下では、CD69は刺激期間全体を通じて漸増しました。以上のCD69のキネティックな発現プロファイルは、早期T細胞活性化マーカーとしてのその役割と一致しています（Figure 3A）17。興味深いことに、CD25の発現は用量および時間依存的に漸増することが観察されました（Figure 3B）。先行研究と一致して、特に最適な刺激を与えた場合、CD25の上昇はCD69よりも緩やかでした18,19。

CD8+ T細胞における抑制性受容体および共刺激分子の発現に対するTCR刺激強度の調節効果をさらに調査するため、PD-1およびICOSの発現レベルを検討しました。PD-1の誘導性発現は、高強度のTCR刺激に依存します。低強度刺激群（0.5–1 µg/mL）では、刺激期間全体を通じてPD-1は低レベルで発現していました。対照的に、中・高強度刺激群（5–10 µg/mL）では、PD-1の発現は10 hから徐々に増加し、36 hでピークに達しました（Figure 4A）。ICOSの発現も刺激強度の増加に伴い上昇し、36 hの5–10 µg/mLにおいて最大レベルに達しました（Figure 4B）。これらの結果は、高強度のTCR刺激がPD-1およびICOSの発現レベルを有意に上昇させることを示唆しています。

最後に、刺激後24時間および48時間において、PMAおよびイオノマイシンによる再刺激を行った際の刺激済みT細胞の機能的能力を検討しました。24時間時点では、TNF-αおよびGranzyme Bの産生量を定量化したところ、TNF-α+、Granzyme B+、およびTNF-α+Granzyme B+細胞の頻度が、anti-CD3の用量依存的に緩やかに上昇していることが観察されました（Figure 5A、B）。これに一致して、TNF-αおよびGranzyme BのMFIも濃度依存的な増加を示し、強刺激（10 µg/mL）下で最大値に達しました（Figure 5C）。これは、段階的なTCRシグナル強度によって誘導される、用量依存的な初期エフェクター分化を反映しています。しかし、48時間時点では、このパターンは顕著に逆転しました。anti-CD3の高濃度条件では、TNF-α+Granzyme B+細胞の割合が有意に減少し、細胞あたりのエフェクター分子の発現レベルがダウンレギュレートされました。

表示されているすべてのデータは、3回の独立した実験の代表的な結果である。統計解析は、Tukeyのポストホックテストを伴う一元配置または二元配置分散分析（ANOVA）を用いて行い、データは平均値 ± SEM で示した。細胞生存率は一貫して90%を超えており、1サンプルあたり最低 1 × 104 個の生存 CD8+ T 細胞イベントを取得した。

フローサイトメトリーデータ：細胞集団のゲーティングダイアグラム、タンパク質定量ヒストグラムおよび棒グラフ。
図1: CD8+ T細胞のin vitro活性化およびフローサイトメトリー解析。(A) マウス脾細胞から精製したCD8+ T細胞を、さまざまな濃度のanti-CD3 (0.1–10 µg/mL) と一定濃度のanti-CD28 (1 µg/mL) を組み合わせてin vitroで6～48時間刺激し、続いて細胞活性化のフローサイトメトリー解析を行った。前方散乱光 (FSC) と側方散乱光 (SSC) によるゲーティングで細胞残渣を除外され、シングレットゲーティングによってダブレットを除外した後、最終的にfixable viability dye陰性のCD8+ T細胞を後続の解析のためにゲートした。(B) 指示された濃度のanti-CD3 (0.1–10 µg/mL) と一定濃度のanti-CD28 (1 µg/mL) で刺激して6時間後のCD8+ T細胞におけるリボソームタンパク質S6のリン酸化 (p-S6)。代表的なヒストグラム (左) およびMFIサマリー (右)。フローサイトメトリープロットは3回の独立した実験の代表例である。データはmean ± SEMで示す。統計解析：Tukeyのポストホックテストを伴う反復測定一元配置分散分析 (repeated-measures one-way ANOVA)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns: 有意差なし。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞増殖アッセイ。時間経過に伴うCTV対増殖率を示すヒストグラムチャート。
図 2: 段階的なTCR刺激下におけるマウス一次CD8+ T細胞の紫色の増殖追跡染料（CTV）を用いた増殖解析。CTVで標識し、0.1–10 µg/mLの勾配濃度のanti-CD3でin vitroにて6～48時間刺激したCD8+ T細胞。細胞増殖は、フローサイトメトリー解析によりCD8+ T細胞におけるCTV蛍光の希釈および減衰に基づいて評価した。ヒストグラムは各濃度群のCTV蛍光分布を示しており、1回以上の分裂を起こした細胞の割合を記載している。フローサイトメトリーのプロットは、3回の独立した実験の代表例である。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

フローサイトメトリー解析、CD69およびCD25の発現、ヒストグラムおよびラインチャート、免疫細胞の活性化。
図 3: anti-CD3刺激後のCD8+ T細胞における早期活性化マーカーCD69およびCD25の発現キネティクス。 ナイーブCD8+ T細胞を、指示された濃度のプレート結合anti-CD3（0.1–10 µg/mL）および一定濃度のanti-CD28（1 µg/mL）で刺激した。CD69を6、12、24、36 hに、CD25を10、12、24、36 hに測定し、フローサイトメトリーで解析した。左パネルは指示された時点での代表的なヒストグラムを示し、右パネルはMFIの経時的な動的変化を示している。（A）CD69。（B）CD25。フローサイトメトリーのプロットは3回の独立した実験の代表例である。データは平均値 ± SEMで示す。統計解析：反復測定二元配置分散分析（repeated-measures two-way ANOVA）およびTukeyのポストホックテスト。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 有意差なし。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

フローサイトメトリー解析、PD-1およびICOSの発現、ヒストグラムとグラフ、時間経過に伴う細胞応答。
図4: anti-CD3刺激後のCD8+ T細胞における抑制性受容体PD-1および共刺激分子ICOSの発現キネティクス. ナイーブCD8+ T細胞を、指示された濃度（0.1–10 µg/mL）のプレート結合anti-CD3および一定量のanti-CD28（1 µg/mL）で刺激した。10、12、24、36時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析した。左パネルは指示された時点での代表的なヒストグラムを示し、右パネルは時間経過に伴うMFIの動的変化を示している。（A）PD-1。（B）ICOS。フローサイトメトリーのプロットは、3回の独立した実験の代表例である。データは平均値 ± SEMで示す。統計解析：Tukeyのポストホックテストを用いた反復測定二元配置分散分析（two-way ANOVA）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 有意差なし。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

フローサイトメトリー解析結果、TNF-αおよびグランザイムBの発現、棒グラフおよび散布図、免疫学的研究。
図 5: CD8+ T細胞による細胞内サイトカイン産生はTCR強度に依存する。 ナイーブCD8+ T細胞を、増加させた濃度の抗CD3（0.1–10 µg/mL）および一定濃度の抗CD28（1 µg/mL）で刺激した。刺激後24時間および48時間において、サイトカイン分泌を阻止して細胞内に蓄積させるため、PMAおよびイオノマイシン存在下でタンパク質輸送阻害剤（モノエンスンおよびブレフェルジンA）とともに5時間インキュベートした後、細胞を回収した。（A）コンタープロットは、各指定濃度および時点におけるTNF-α陽性細胞およびグランザイムB陽性細胞の頻度を示している。非刺激細胞を陰性コントロールとした。（B）TNF-α+、グランザイムB+、およびTNF-α+ Granzyme B+細胞の割合。（C）TNF-αおよびグランザイムBのMFI。フローサイトメトリーのプロットは、3回の独立した実験の代表例である。データは平均値 ± SEMで示す。統計解析：Tukeyのポストホック検定を用いた反復測定二元配置分散分析（two-way ANOVA）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 有意差なし。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

本プロトコールでは、TCRシグナル強度に依存したT細胞応答を研究するための、体系的かつ再現可能な手法を提供します。段階的なanti-CD3コーティング戦略を用いることで、刺激強度を精密に制御でき、TCR入力と下流の機能的結果との定量的関係を詳細に解析することが可能になります。手順上の重要なポイントは、ナイーブCD8⁺ T細胞の精製、anti-CD3コーティング濃度の精密なグラジエント制御、およびウェルあたりの細胞数の厳密な標準化です。実験間でのデータの比較可能性を確保するため、一貫した機器設定、補正マトリックス、ゲーティング戦略の使用に加え、可能な限り同一ロットの抗体および固定可能な生存染料バッチを使用することを推奨します。これらの重要なステップの信頼性が、異なるTCR刺激強度がT細胞の表現型ダイナミクスに及ぼす影響を実験結果が正確に反映できるか否かを直接的に決定します。

本プロトコルでは、TCR-CD3複合体を架橋させるために抗CD3抗体を培養プレート表面に直接コーティングする、プレート結合抗体刺激を採用しました。この手法は、費用対効果が高く、抗体が均一に分布し、ウェル間のばらつきが最小限に抑えられるため、優れた再現性が得られます。特に、コーティング抗体濃度を滴定することで刺激強度を精密に段階的に調節できる点にあり、これはリガンド密度が通常飽和レベルで固定されており微細なシグナル調節が制限されるビーズ結合刺激とは異なる特徴です14。ただし、プレート結合刺激は生理的レベルを超える持続的なTCR架橋をもたらし、これは抗原提示細胞上のpMHC複合体によって誘導される一過性で親和性に依存した結合とは根本的に異なります。pMHCベースの刺激はより生理学的に妥当ですが、技術的な難易度が高く、マルチマー作製に専門的な知識が必要であり、大幅にコストが増加します。細胞分離には、簡便で迅速かつ費用対効果の高い陰性免疫磁気選別を用いました。FACSと比較すると純度は低くなりますが、ソートされた細胞の生理状態を損なう可能性のある機械的ストレスや蛍光標識を回避できます20,21。

プロトコルの実施中に発生する可能性のある主な問題として、ソーティング純度の低下、増殖の弱さ、CTVによる細胞毒性、培養後の生存率の低下、および染色の不均一性が挙げられます。純度が低い場合は、細胞とビオチン化抗体カクテルおよびストレプトアビジンコートビーズを十分に混合させ、必要に応じて磁気分離時間を延長し、試薬のロットごとにビーズと抗体の比率を最適化してください。最高濃度のanti-CD3においてさえ増殖が最小限である場合は、単離したナイーブ細胞の生存率と純度（特にCD44hiの混入）を確認し、anti-CD3のコーティング手順（4 °Cでの一晩インキュベーション中はシーリングフィルムでプレートを密閉し、抗体が均一に被覆されていることを確認する）を検証し、T細胞の増殖を維持するために不可欠なIL-2の濃度を検証してください。CTVによる細胞毒性に対しては、分裂ピークの明確な解像度を維持しつつ染色濃度を下げ、残留した遊離色素を除去するために、クエンチングステップを氷上で厳格に5 min間行ってください22,23。培養後の生存率が低い場合は、細胞密度を制御し、十分な培地量を確保し、無菌操作を徹底してください。染色の不均一性やフローサイトメトリーにおける変動が大きい場合は、抗体カクテルをマスターミックスとして調製し、染色後のすべてのサンプルを遮光し、繰り返し実験間では同一ロットの抗体および固定可能生存率染色剤を使用してください。

とはいえ、本プロトコルにはいくつかの限界があります。in vitro系であるため、二次リンパ組織の複雑な組織微小環境、細胞間相互作用、またはサイトキン環境を再現することはできません。培養期間は48 hに限定されており、解析は初期の活性化イベントにのみ制限され、後期分化、疲弊、またはメモリー形成の評価は不可能です。さらに、本プロトコルはフローサイトメトリーによる解析に大きく依存しており、独立した実験間で装置の設定、補正マトリクス、およびゲーティング戦略を厳格に標準化する必要があります。加えて、このanti-CD3/CD28ベースのシステムで得られた知見はCD8+ T細胞のみに由来するものであり、活性化閾値、共刺激要求、および下流の分化経路が異なることが知られているCD4+ T細胞に直接的に一般化できるとは限りません12,24,25。さらに、T細胞の基底活性化状態は、共生微生物叢の違いによりマウスのコロニー間で異なる場合があり、これは研究間の結果を解釈する際に考慮すべき、ラボ間のばらつきの潜在的な要因となります。

ここで述べる段階的刺激システムにより、研究者はさまざまなリードアウトで観察される異なる応答パターンに基づいて、特定の実験目的に合わせてTCRシグナル強度を調整することが可能になります。これらのデータは、anti-CD3濃度と回収時間の選択が、直面している生物学的な問いに基づいて決定されるべきであることを明らかにしています。早期活性化マーカーについては、CD69の上昇はすべての濃度において早ければ6–12 hで検出可能ですが、明確なキネティクスを示します。高濃度（5–10 µg/mL）では急速なピークに続いて低下しますが、低濃度（0.5–1 µg/mL）では緩やかで持続的な増加が見られます。増殖アッセイでは、1 µg/mL未満の濃度は最適ではなく、内部陰性コントロールとして利用できる可能性がありますが、5–10 µg/mLは48 h時点のCTV希釈で検出可能な強固なクローン増殖を確実に誘導します。共抑制受容体PD-1および共刺激分子ICOSの発現には高強度の刺激（5–10 µg/mL）が必要であり、36 hでピークに達します。したがって、これらの分子を調査する研究では、より早い時間点や低用量の条件を避けるべきです。エフェクター機能のリードアウト（TNF-αおよびGranzyme B）において、刺激強度とサイトカイン産生との関係は時間依存的であり、特徴的な二相性のパターンに従います。24 h時点では、エフェクター分子の産生はanti-CD3濃度と正の相関を示し、用量が高いほどサイトカイン産量が増加します。しかし、48 hまでには、サイトカイン産生細胞の絶対レベルは24 hと比較してすべての条件で大幅に上昇する一方で、用量反応関係が逆転します。すなわち、低濃度の刺激（0.5–1 µg/mL）の方が、高濃度（5–10 µg/mL）よりもTNF-α⁺ Granzyme B⁺細胞の出現頻度が相対的に高くなります。この逆転は、持続的な強力なTCRシグナルが、初期のエフェクター分化を促進する一方で、細胞あたりのサイトカイン産生能の維持に相対的な制約を課す可能性を示唆しており、これは活性化誘発性の疲弊または低反応性の開始を反映している可能性があります。

これらの経験的な観察結果を総合すると、本プロトコルは、特定のダウンストリームエンドポイントに基づいて刺激条件を事前に選択することを可能にするリファレンスフレームワークとして位置づけられ、それによって実験設計の効率性とデータの解釈可能性を向上させることができます。また、基本的なメカニズム研究にとどまらず、本システムは養子免疫療法のためのT細胞増殖プロトコルの最適化にも寄与し得ます。そこでは、TCRシグナル強度の精密な調節が、好ましいエフェクター表現型またはメモリー表現型への分化を誘導するのに役立つ可能性があります。26,27,28.

開示事項

著者は開示すべき事項がないことを報告します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（No. T2394504, LY）およびLilin Ye首席科学者研究スタートアップ基金（No. R2045, LY）の支援を受けて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL コニカルチューブLabgicCD-002-15A滅菌済み15 mLコニカル遠心チューブ
4% パラホルムアルデヒドBeyotimeP0099染色前の細胞保存用4%水性固定液
60 mmディッシュLabgic1221160 mm細胞培養ディッシュ
70 µm セルストレーナーLabgicBS-70-CS70 µm 単一細胞懸濁液調製用ナイロンメッシュストレーナー
96ウェル丸底プレートBeyotimeFPT016細胞培養および染色のための96ウェル丸底プレート
ACK溶血緩衝液BeyotimeC3702塩化アンモニウムベースの赤血球溶血緩衝液
抗マウスCD25Biolegend101910フローサイトメトリー用 APC標識抗マウスCD25抗体、クローン3C7
抗マウスCD28抗体Bio X CellBE0015-1T細胞共刺激用の精製抗マウスCD28抗体（クローン37.51）
抗マウスCD3Bio X CellBP0001-1精製抗マウスCD3抗体ε T細胞活性化用抗体、クローン145-2C11
抗マウスCD69抗体BD Biosciences553237活性化マーカー染色のためのPE標識抗マウスCD69抗体
抗マウスCD8Invitrogen17-0081-82フローサイトメトリー用 APC標識抗マウス CD8a抗体（クローン 53-6.7）
抗マウスGZMBBioLegend372212細胞内フローサイトメトリー用PerCP/Cyanine5.5標識抗ヒト/マウスグランザイムB抗体、クローンQA16A02
抗マウスICOS抗体BD Biosciences565886フローサイトメトリー用BV421標識抗マウスICOS (CD278) 抗体
抗マウスPD-1Biolegend135220フローサイトメトリー用BV605標識抗マウスPD-1 (CD279) 抗体、クローン 29F.1A12
抗マウスTNF-ααInvitrogen46-7321-82PerCP-eFluor 710標識抗マウスTNF-α抗体α 細胞内フローサイトメトリー用抗体、クローンMP6-XT22
抗マウス/ヒト CD44Biolegend103030フローサイトメトリー用 PE/Cyanine7接合抗マウス/ヒト CD44抗体、クローン IM7
ビオチン標識抗マウスCD11b抗体Biolegend101204リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスCD11b抗体
ビオチン化抗マウスCD11c抗体Biolegend117304リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD11c抗体
ビオチン化抗マウスCD16/32抗体Biolegend156604リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD16/32抗体
ビオチン標識抗マウスCD19抗体Biolegend115504リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD19抗体
ビオチン標識抗マウスCD4抗体BioLegend100508リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD4抗体
ビオチン化抗マウスCD44抗体Biolegend103004リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスCD44抗体
ビオチン標識抗マウスCD45R抗体Biolegend103204系統除去用のビオチン標識抗マウスCD45R/B220抗体
ビオチン化抗マウスCD49b抗体Invitrogen13-5971-85リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD49b抗体
ビオチン標識抗マウスF4/80抗体Biolegend123106リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスF4/80抗体
ビオチン化抗マウスLy6G抗体Biolegend127604リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスLy6G抗体
ビオチン標識抗マウスNK1.1抗体Biolegend108704リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスNK1.1抗体
ビオチン標識抗マウスTER119抗体Biolegend116204リネージ除去用ビオチン標識抗マウスTER-119抗体
C57BL/6マウスSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。6–実験に使用した8週齢の雄マウス
二酸化炭素（CO2インキュベーターThermo Fisher3120加湿CO22 哺乳類細胞培養用インキュベーター
CellTrace Violet染料InvitrogenC34557細胞増殖モニタリング用バイオレット蛍光色素
ジメチルスルホキシドシグマD2650ジメチルスルホキシド；試薬ストック溶液調製用溶媒
ドンキー抗ウサギIgG (H+L) 高度クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa Fluor 488標識ドンキー抗ラビットIgG (H+L) 二次抗体
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500ダルベッコ’洗浄および試薬調製用のリン酸緩衝生理食塩水
ウシ胎児血清 (FBS)GibcoC11995500BT哺乳類細胞培養培地用血清サプリメント
固定可能生存率染料Invitrogen65-0865-14フローサイトメトリーにおける死細胞除外のための固定可能生存率染料
固定・透過化溶液BD Biosciences51-2090KZ細胞内染色のための固定・透過化試薬
平底96ウェルプレートLabgic11510細胞培養および刺激アッセイ用96ウェル平底プレート
フローサイトメーターBD BiosciencesLSRFortessa-3レーザー多色蛍光解析用3レーザーフローサイトメーター
ゴルジプラグBD Biosciences51-2301KZ細胞内サイトカイン染色のためのブレフェルジンAを用いたタンパク質輸送阻害剤
ゴルジ停止BD Biosciences51-2092KZ細胞内サイトカイン染色用モネンシンベースのタンパク質輸送阻害剤
イオノマイシンカルシウム塩シグマI3909-1ML細胞刺激のためにPMAとともに使用されるカルシウムイオノフォア
透過・洗浄バッファーBD Biosciences51-20911KZ細胞内染色用透過化および洗浄バッファー
Phosflow Lyse/Fix バッファーBD Biosciences5580495× 赤血球溶解および白血球固定同時処理用バッファー
Phosflow Perm/Wash バッファー IBD Biosciences557885細胞内リン酸化タンパク質染色のためのメタノールベース透過化バッファー
リン酸化S6リボソームタンパク質 (Ser235/236) (D57.2.2E) ウサギモノクローナル抗体細胞シグナリング4858Sリン酸化S6リボソームタンパク質（Ser235/236）ウサギモノクローナル抗体、クローンD57.2.2E
PMAシグマP1585-1MGホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸塩；ex vivo細胞刺激に使用される活性化剤
組換えマウスインターロイキン-2Gibco200-02-50UGT細胞の培養および増殖のための組換えマウスインターロイキン-2
RPMI 1640ライフラボAC01L064哺乳類細胞培養用Roswell Park Memorial Institute 1640培地
ストレプトアビジン磁気ビーズビーバー22307ビオチン抗体を用いた細胞除去のためのストレプトアビジンコート磁気ビーズ
フローサイトメトリー染色バッファー翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳する英文をご提示ください。翻訳するテキストが指定されていません。翻訳対象のソーステキストをご提示ください。フローサイトメトリー染色バッファー（供給元または調製法は提供されていません）
Parafilm M ラボ用フィルムAmcorPM996プレート、チューブ、および培養容器の封止に用いる柔軟な自己密封型ラボ用フィルム
溶解・固定バッファーBD Biosciences5580495× 赤血球溶解および白血球固定同時処理用バッファー
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1フローサイトメトリーデータ解析用ソフトウェア、バージョン10.8.1

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