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方法論記事

マウス一次CD8+ T細胞の活性化および分化におけるTCRシグナルの強度と持続時間：標準化されたin vitroアプローチ

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DOI:

10.3791/71979

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2026年8月25日

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、マウス一次ナイーブCD8 T細胞を活性化するための系統的な手法について解説します。+ 段階的なTCR刺激法を用いたT細胞の解析。これにより、CD8陽性T細胞の増殖、活性化、およびサイトカイン産生の包括的な分析が可能となる。+ 異なるTCRシグナル強度におけるT細胞。

要約

T細胞受容体（TCR）のシグナル強度と持続時間は、CD8⁺ T細胞の活性化、増殖、および機能的分化を決定する重要な因子です。しかし、異なるTCRシグナル入力がT細胞の運命をどのように規定するかを体系的に比較できる標準的なin vitroモデルは限られています。本研究では、プレート結合抗CD3抗体と可溶性抗CD28抗体を用い、インターロイキン-2（IL-2）を添加してin vitroで一次マウスT細胞を活性化する再現性のある手法を提示し、抗CD3抗体濃度（シグナル強度）と刺激時間（シグナル持続時間）の調整がT細胞の活性化結果にどのように影響するかを検証します。ここでは、C57BL/6マウスからナイーブT細胞を分離し、その後、さまざまな抗CD3濃度（0.1–10 µg/mL）および刺激時間（6–48 h）で刺激を行うプロトコルを詳述します。フローサイトメトリー解析を行い、mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）活性の指標として細胞内リン酸化S6リボソームタンパク質（p-S6）を介した初期TCR誘導シグナリングを評価し、次に、表面活性化マーカー（CD69、CD25、ICOS、PD-1）、バイオレット増殖追跡染料（CTV）の希釈による細胞増殖、および機能的分化の指標としてのエフェクター分子発現（Granzyme B、TNF-α）を含む下流のイベントを評価しました。本手法は、再現性のあるT細胞刺激を実行するための明確で段階的な視覚的ガイドを提供し、特定のTCRシグナルパラメータがT細胞の運命決定をどのように導くかを解析することを可能にします。このアプローチは、T細胞の活性化と分化に関するメカニズム研究をサポートするだけでなく、養道免疫療法のためのT細胞コンディショニングやin vitroプライミングアッセイを最適化するためのプラットフォームも提供します。ビデオ実演と詳細なプロトコルの解説を統合することで、本プロトコルはT細胞免疫学研究における手法の透明性と再現性を向上させます。

概要

T細胞は、病原体や腫瘍に対する防御的な免疫応答に不可欠である。ナイーブT細胞は、長期的な生存と持続性を維持するために、静止状態で能動的に維持されている1。抗原刺激を受けると、T細胞は静止状態を脱し、クローン増殖とエフェクター分化を起こす2。T細胞受容体（TCR）シグナル伝達は、適応免疫応答を開始し調節するための核心的なプロセスとして機能する3。抗原提示細胞（APC）の表面に提示されたペプチド-主要組織適合性複合体（pMHC）分子を特異的に認識すると、一連のシグナル伝達イベントがトリガーされ、それによってT細胞のクローン増殖と機能的分化が促進される4,5,6。

抗原の親和性、アビディティ、濃度などの主要因によって決定されるTCR刺激の強度は、T細胞活性化の程度、エフェクター機能の獲得、および異なるエフェクターまたはメモリーT細胞サブセットへの分化経路を制御する上で重要な役割を果たします7,8,9。TCR依存的なT細胞活性化を調査するための現在のin vitroモデルでは、主にプレート結合型またはビーズ結合型のanti-CD3およびanti-CD28抗体が用いられており、これらはTCRリガンド結合と共刺激信号を同時に提供します10,11。このようなシステムは広く利用されていますが、通常は単一の（多くの場合、飽和濃度の）anti-CD3抗体のみを使用するため、滴定された刺激勾配で達成可能なTCR信号強度のダイナミックレンジを捉えるのではなく、単なるT細胞活性化のall-or-nothingなバイナリ比較しか行えません12,13。

本プロトコルでは、滴定したanti-CD3濃度勾配（0.1–10 µg/mL）と一定濃度のanti-CD28（1 µg/mL）を用い、段階的なTCRシグナル強度が一次マウスCD8+ T細胞の活性化、増殖、および機能的表現型をどのように調節するかを系統的に評価するための、標準化され再現性の高いin vitroシステムを提供します。このアプローチの中核となるのはマルチパラメーターフローサイトメトリーであり、mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）活性の指標としての細胞内リン酸化S6リボソームタンパク質（p-S6）を介した上流シグナリングと、CTV希釈による増殖、活性化表面マーカー（CD69、CD25、誘導性T細胞共刺激分子 [ICOS]、programmed cell death protein 1 [PD-1]）、およびエフェクター分子の発現（Granzyme B、腫瘍壊死因子アルファ [TNF-α]）を含む下流の細胞結果の両方を、6時間から48時間のタイムコースで捕捉します。

本プロトコルでは、プレート結合抗CD3抗体の濃度勾配を用いて刺激強度を精密に調節し、それによって生理的条件下で観察されるTCR結合アビディティの差異を模倣します。この手法により、TCRの架橋が高効率に達成され、静止期の初代T細胞が強力に活性化されます。標準化されたコーティング手順により、プレート表面への抗体の均一な分布が保証され、同一バッチ内の細胞間で一貫した刺激が得られるため、優れた実験再現性が実現します。この形式は、T細胞活性化のためのコスト効率が高く、操作的に簡便なアプローチを提供します。

しかしながら、このアプローチにはいくつかの限界があることを認識しておく必要があります。anti-CD3/CD28抗体による刺激は、in vivoの生理学的状況とは大きく異なります。T細胞の活性化を評価するためにアゴニスト抗CD3抗体および抗CD28抗体のみを用いる実験手法は、活性化の有効なリードアウトを提供できますが、生理的条件下で起こる抗原提示細胞とT細胞との相互作用や、共刺激マイクロ環境を完全に再現することはできません14。

これらの制限はあるものの、本プロトコルは体系的かつ再現可能なプラットフォームを提供しており、TCR信号強度に依存するT細胞応答を調査するための有用でアクセスしやすいツールとなり、より複雑な抗原特異的モデルを補完することができます。

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プロトコル

本研究におけるすべての動物実験は、第三軍医大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 試薬およびプレートの調製

  1. 滅菌PBSを用いて、0.1、0.5、1、5、および10 µg/mLのプレート結合用anti-CD3を調製する。
  2. 平底96ウェルプレートの各ウェルに、anti-CD3コーティング溶液を50 µLずつ分注する。
  3. シーリングフィルムでプレートを密封し、4 °Cで一晩インキュベートする。
  4. コーティング溶液を吸引し、細胞を添加する前に各ウェルを200 µLの滅菌PBSで2回洗浄する。

2. マウス脾臓からのナイーブCD8+ T細胞の単離

  1. 6–8週齢の雄性C57BL/6マウス（Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.より購入）を選択し、CO2 吸入および頚椎脱臼により安楽死させる。マウスは、12時間の明暗サイクルおよび餌と水が自由に摂取できる条件下で、特定病原体不在（SPF）環境で飼育する。1回の独立した実験につき、最低3匹のマウスを使用する。
  2. 外科用ハサミで腹膜を慎重に切開して脾臓を露出させ、ピンセットを用いて脾臓を把握して採取し、2%胎児牛血清（FBS）を添加した予冷RPMI 1640（R2）を含む回収ディッシュに入れる。解離させるまでディッシュを氷上に保持する。
    注：すべての動物死骸および細胞培養廃棄物は、指定のバイオハザードバッグに回収し、廃棄前に121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌すること。
  3. 脾臓を回収ディッシュから取り出し、3 mLの1 × 塩化アンモニウム・カリウム（ACK）溶血バッファーを含む60 mmディッシュに移す。
  4. 3 mLシリンジのプランジャーを用いて脾臓を70 µmセルストレーナーで穏やかにすり潰し、単一細胞懸濁液を調製する。
  5. 懸濁液を室温（RT）で1分間インキュベートした後、予冷したR2培地を3 mL加えて塩化アンモニウム・カリウム（ACK）溶血バッファーを中和する。
  6. 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、4 °Cにて500 × gで5分間遠心分離する。
  7. 遠心分離後、上清を吸引除去し、ペレットを10 mLのフローサイトメトリー染色バッファー（2% FBS含有PBS）で再懸濁する。
  8. 懸濁液を70 µmセルストレーナーでろ過して新しい15 mLコニカルチューブに移し、再び4 °Cにて500 × gで5分間遠心分離する。
    注：機能解析のための細胞生存率を維持するため、フローサイトメトリー染色バッファーからアジ化ナトリウムは除外すること。すべてのサンプルは4 °Cで保持し、直ちに解析すること。
  9. 上清を吸引除去し、マウス1匹の脾臓につき200 µLのビオチン化抗体カクテル（anti-CD16/32 (Fc block)、anti-TER-119、anti-CD19、anti-CD4、anti-B220、anti-NK1.1、anti-Ly-6G、anti-CD11b、anti-CD11c、anti-CD49b、anti-CD44、およびanti-F4/80を含む）で細胞ペレットを再懸濁する。
  10. 氷上で25分間インキュベートし、十分に混合させるため5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させる。
  11. 大量のフローサイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄し、500 × gで5分間遠心分離して上清を捨てる。
  12. ビオチン化抗体カクテルに使用したときと同じ量のフローサイトメトリー染色バッファーでペレットを再懸濁し、その半量のストレプトアビジンコート磁気ビーズを加え、氷上で15分間インキュベートする。この際、5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させて十分に混合させる。
  13. チューブを短時間遠心分離し、磁気スタンドに2–3分間静置して、上清（濃縮されたナイーブCD8+ T細胞）を慎重に新しい15 mLコニカルチューブに移す。
  14. 回収した細胞をフローサイトメトリー染色バッファーで1回洗浄し、再び500 × gで5分間遠心分離する。
  15. 上清を捨て、後続のアプリケーションのために10% FBSを添加したRPMI 1640（R10）でペレットを再懸濁する。

3. 増殖追跡のためのバイオレット増殖追跡染料（CTV）による標識

  1. 使用直前に2 × CTV作動溶液（10 µM）を調製する。5 mM CTVストック溶液（ジメチルスルホキシド [DMSO] 溶解）をボルテックスで十分に混合し、滅菌PBSで希釈して最終濃度を10 µMにする。
    注意：DMSOは毒性化合物の皮膚吸収を促進するため、DMSOで調製したCTVストック溶液は、ドラフトチャンバー内でニトリル手袋を着用して扱うこと。吸入および皮膚への接触を避けること。
  2. 単離したナイーブCD8+ T細胞の半分を、あらかじめ冷却したPBSを用いて8 × 107 cells/mLの密度で再懸濁する。
  3. 細胞懸濁液に同量の2 × CTV作動溶液（10 µM）を速やかに加え、ピペッティングでよく混合して、CTVの最終濃度を5 µMにする。
  4. 細胞を室温・暗所で20分間インキュベートし、その間、十分に混合させるため5分ごとにチューブを穏やかに転倒混和させる。
  5. 細胞に5倍量の培地（10%以上のFBSを含む）を加え、氷上で5分間インキュベートして遊離染料を除去する。
  6. 細胞を500 × gで5分間遠心分離し、ペレットを、anti-CD28（最終濃度：1 µg/mL）およびIL-2（最終濃度：10 ng/mL）を添加してあらかじめ加温した完全培地R10で再懸濁する。
  7. あらかじめコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液250 µL（6 × 105 cellsを含む）を分注する。
  8. 細胞を37 °C、5% CO₂条件下で最大48時間培養する。

4. フローサイトメトリーによるCTV検出

  1. 6、36、および48時間後に細胞を96ウェル丸底プレートに回収する。500 × gで5分間遠心分離し、フローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄する。
  2. 表面染色のために、anti-CD8、固定可能な生存率染料（fixable viability dye）、およびanti-CD44を含む抗体カクテル50 µLとともに、細胞を氷上で30分間、暗所でインキュベートする 。
    注意：蛍光標識抗体を含むすべての上清は、除染のために0.5%次亜塩素酸ナトリウムを添加した指定の廃棄容器に回収し、施設のバイオハザード廃棄物プロトコルに従って廃棄すること。
  3. 細胞をフローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄し、フローサイトメーターでの測定用にフローサイトメトリー染色バッファー200 µLで再懸濁する。
  4. 3波長のレーザーを備えたフローサイトメーターでサンプルを測定する。染色した細胞を用いて単色コントロールチューブを調製し、コンペンセーションパラメータを設定する。
  5. 以下のゲーティング戦略を適用する：前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）ゲーティングによりデブリを除去し、シングレットゲーティングによりダブレットを排除し、解析対象として生存（固定可能な生存率染料陰性）CD8+ T細胞を選択する。
  6. サンプルあたり少なくとも1 × 104個のゲート内CD8+ T細胞イベントを収集する。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いてデータを解析し、増殖解析モジュールを用いて1回以上の分裂を経た細胞の割合を算出する。

5. 活性化およびシグナリングに関する表面および細胞内染色

  1. 残りの半分のナイーブ CD8+ T 細胞を、anti-CD28（1 µg/mL）および IL-2（10 ng/mL）を添加した R10 に、2.4 × 106 cells/mL の濃度で再懸濁する。
  2. あらかじめコーティングした 96 ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液 250 µL（6 × 105 cells）を分注する。
  3. 37 °C、5% CO₂ 下で、最大 48 時間培養する。
  4. 指定の時間（6、10、12、24、36 時間）に、細胞を 96 ウェル丸底プレートに回収する。
    注：6 時間では、初期の TCR シグナリング（phospho-S6）および CD69 を捕捉する。CD69 については、その完全なキネティクスを把握するため、12、24、36 時間でも同様に評価する。CD25、PD-1、および ICOS は 10、12、24、36 時間でモニタリングする。48 時間の時点は、増殖（セクション 4）およびサイトカイン検出（セクション 6）のために予約されている。
  5. 500 × g で 1 分間遠心分離し、細胞ペレットを 200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーで再懸濁する。
  6. 500 × g で 1 分間遠心分離し、上清を吸引して除去する。200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーで細胞を 2 回洗浄する。
  7. 表面染色のために、anti-CD69、anti-CD25、anti-CD8、anti-PD-1、anti-ICOS、および固定可能な生存率染料を含む抗体カクテル 50 µL と共に、氷上・暗所で 30 分間インキュベートする。
  8. 未結合の抗体を除去するため、フローサイトメトリー染色バッファーで細胞を 3 回洗浄する。
  9. 細胞ペレットを 200 µL の 1% パラホルムアルデヒドに再懸濁し、室温・暗所で 15 分間固定する。
    注意：蒸気の吸入を防ぐため、パラホルムアルデヒドを使用するすべての工程はドラフトチャンバー内で行うこと。固定液を含むすべての液体廃棄物は、有害化学物質廃棄物用として標記された別容器に回収すること。
  10. 500 × g で 1 分間遠心分離し、フローサイトメトリー染色バッファーで 1 回洗浄する。
  11. 5 × lyse/fix バッファーを室温で予熱し、蒸留水を用いて 1 × ワーキングソリューションを調製する。
  12. 各ウェルに 200 µL のワーキングソリューション（1 × lyse/fix バッファー）を加え、室温・暗所で 30 分間インキュベートする。
  13. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで 2 回洗浄する。ペレットをリン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで再懸濁し、室温・暗所で 10 分間インキュベートする。
  14. 500 × g で 1 分間遠心分離し、上清を捨てる。
  15. 細胞内染色のために、anti-p-S6 を含む抗体カクテル 50 µL と共に、室温・暗所で 60 分間インキュベートする。
  16. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を 3 回洗浄する。
  17. 二次抗体染色のために、anti-rabbit 二次抗体を含む抗体カクテル 50 µL と共に、氷上・暗所で 30 分間インキュベートする。
  18. リン酸化エピトープ染色用 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を 3 回洗浄し、その後フローサイトメトリー染色バッファーで 1 回洗浄する。
  19. 細胞ペレットを 200 µL のフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、同一のフローサイトメーターでサンプルを測定する。
  20. セクション 4.5 で述べたものと同じゲーティング戦略を適用し、サンプルあたり少なくとも 1 × 104 個の CD8+ T 細胞を収集する。
  21. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて、各マーカーの平均蛍光強度（MFI）を解析する。

6. 細胞内サイトカインのブロッキングおよび検出

  1. 回収の5時間前に、PMA (50 ng/mL)、イオノマイシン (1 µg/mL)、タンパク質輸送阻害剤 (monensin) (1:1000)、およびタンパク質輸送阻害剤 (brefeldin Aベース) (1:1000)を添加した新鮮なR10を、1ウェルあたり100 µLずつ加える。緩やかに混ぜ、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻し、サイトカインの分泌を遮断して細胞内に蓄積させる。
  2. 目的の時点で、細胞を96ウェル丸底プレートに回収する。
  3. 500 × gで1分間遠心分離し、細胞ペレットを200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁する。
  4. 500 × gで1分間遠心分離し、上清を吸引除去する。200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーで2回洗浄する。
  5. 表面マーカー染色のため、anti-CD44、anti-CD8、および固定可能生存率染料を含む50 µLの抗体カクテルと共に、氷上で暗所にて30分間インキュベートする。
  6. 未結合の抗体を除去するため、フローサイトメトリー染色バッファーで3回洗浄する。
  7. 200 µLの固定・透過化溶液を加え、氷上で暗所にて30分間インキュベートして細胞を透過化させる。
    注意：蒸気の吸引を防ぐため、固定・透過化溶液（パラホルムアルデヒド含有）を使用するすべての工程は、ドラフトチャンバー内で行うこと。固定剤を含むすべての液体廃棄物は、有害化学物質廃棄物用として指定された別の容器に回収すること。
  8. 500 × gで1分間遠心分離し、上清を有害化学物質廃棄物として廃棄する。
  9. 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を3回洗浄する。
  10. 細胞内サイトカイン染色のため、anti-TNF-αおよびanti-Granzyme Bを含む50 µLの抗体カクテルと共に、氷上で暗所にて30分間インキュベートする。
  11. 1 × 透過化/洗浄バッファーで細胞を3回洗浄して未結合の抗体を除去し、最後にフローサイトメトリー染色バッファーで1回洗浄を行う。
  12. 細胞ペレットを200 µLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、同一のフローサイトメーターでサンプルを測定する。
  13. セクション4.5で説明したゲート戦略を適用し、サンプルあたり少なくとも1 × 104個のCD8+ T細胞を回収する。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて、各マーカーの陽性率およびMFIを解析する。

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結果

異なる抗CD3刺激強度によるT細胞活性化への影響を調べるため、マウス脾細胞を単離し、in vitro培養用にCD8+ T細胞を精製した後、T細胞活性化アッセイおよびフローサイトメトリー解析を実施した。データ解析では、まずFSC-AとSSC-Aを組み合わせてリンパ球をゲートし、次にFSC-HとFSC-Wを用いてシングレットをゲートし、続いてSSC-HとSSC-Wでゲートした。生細胞であるCD8+ T細胞は、後続の解析のために、CD8と固定可能な生存染料を組み合わせてさらにゲートした（図1A）。

プレート結合抗体刺激システムがin vitroでT細胞を効果的に活性化することを検証するため、mTORC1活性の確立された下流リードアウトであり、TCRシグナリングの下流にあるPI3K-mTORおよびMEK-ERK MAPK経路の収束点であるリボソームタンパク質S6のリン酸化（p-S6）を調べました15,

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ディスカッション

本プロトコールでは、TCRシグナル強度に依存したT細胞応答を研究するための、体系的かつ再現可能な手法を提供します。段階的なanti-CD3コーティング戦略を用いることで、刺激強度を精密に制御でき、TCR入力と下流の機能的結果との定量的関係を詳細に解析することが可能になります。手順上の重要なポイントは、ナイーブCD8⁺ T細胞の精製、anti-CD3コーティング濃度の精密なグラジエント制御、およびウェルあたりの細胞数の厳密な標準化です。実験間でのデータの比較可能性を確保するため、一貫した機器設定、補正マトリックス、ゲーティング戦略の使用に加え、可能な限り同一ロットの抗体および固定可能な生存染料バッチを使用することを推奨します。これらの重要なステップの信頼性が、異なるTCR刺激強度がT細胞の表現型ダイナミクスに及ぼす影響を実験結果が正確に反映できるか否かを直接的に決定します。

本プロトコルでは、TCR-CD3複合体を架橋させるために抗CD3抗体を培養プレート表面に直接コーティングする、プレート結合抗体刺激を採用しました。この手法は、費用対効果が高く、抗体が均一に分布し、ウェル間のばらつ...

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開示事項

著者は開示すべき事項がないことを報告します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（No. T2394504, LY）およびLilin Ye首席科学者研究スタートアップ基金（No. R2045, LY）の支援を受けて実施されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL コニカルチューブLabgicCD-002-15A滅菌済み15 mLコニカル遠心チューブ
4% パラホルムアルデヒドBeyotimeP0099染色前の細胞保存用4%水性固定液
60 mmディッシュLabgic1221160 mm細胞培養ディッシュ
70 µm セルストレーナーLabgicBS-70-CS70 µm 単一細胞懸濁液調製用ナイロンメッシュストレーナー
96ウェル丸底プレートBeyotimeFPT016細胞培養および染色のための96ウェル丸底プレート
ACK溶血緩衝液BeyotimeC3702塩化アンモニウムベースの赤血球溶血緩衝液
抗マウスCD25Biolegend101910フローサイトメトリー用 APC標識抗マウスCD25抗体、クローン3C7
抗マウスCD28抗体Bio X CellBE0015-1T細胞共刺激用の精製抗マウスCD28抗体（クローン37.51）
抗マウスCD3Bio X CellBP0001-1精製抗マウスCD3抗体ε T細胞活性化用抗体、クローン145-2C11
抗マウスCD69抗体BD Biosciences553237活性化マーカー染色のためのPE標識抗マウスCD69抗体
抗マウスCD8Invitrogen17-0081-82フローサイトメトリー用 APC標識抗マウス CD8a抗体（クローン 53-6.7）
抗マウスGZMBBioLegend372212細胞内フローサイトメトリー用PerCP/Cyanine5.5標識抗ヒト/マウスグランザイムB抗体、クローンQA16A02
抗マウスICOS抗体BD Biosciences565886フローサイトメトリー用BV421標識抗マウスICOS (CD278) 抗体
抗マウスPD-1Biolegend135220フローサイトメトリー用BV605標識抗マウスPD-1 (CD279) 抗体、クローン 29F.1A12
抗マウスTNF-ααInvitrogen46-7321-82PerCP-eFluor 710標識抗マウスTNF-α抗体α 細胞内フローサイトメトリー用抗体、クローンMP6-XT22
抗マウス/ヒト CD44Biolegend103030フローサイトメトリー用 PE/Cyanine7接合抗マウス/ヒト CD44抗体、クローン IM7
ビオチン標識抗マウスCD11b抗体Biolegend101204リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスCD11b抗体
ビオチン化抗マウスCD11c抗体Biolegend117304リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD11c抗体
ビオチン化抗マウスCD16/32抗体Biolegend156604リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD16/32抗体
ビオチン標識抗マウスCD19抗体Biolegend115504リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD19抗体
ビオチン標識抗マウスCD4抗体BioLegend100508リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD4抗体
ビオチン化抗マウスCD44抗体Biolegend103004リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスCD44抗体
ビオチン標識抗マウスCD45R抗体Biolegend103204系統除去用のビオチン標識抗マウスCD45R/B220抗体
ビオチン化抗マウスCD49b抗体Invitrogen13-5971-85リネージ除去用ビオチン標識抗マウスCD49b抗体
ビオチン標識抗マウスF4/80抗体Biolegend123106リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスF4/80抗体
ビオチン化抗マウスLy6G抗体Biolegend127604リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスLy6G抗体
ビオチン標識抗マウスNK1.1抗体Biolegend108704リネージ除去のためのビオチン標識抗マウスNK1.1抗体
ビオチン標識抗マウスTER119抗体Biolegend116204リネージ除去用ビオチン標識抗マウスTER-119抗体
C57BL/6マウスSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。6–実験に使用した8週齢の雄マウス
二酸化炭素（CO2インキュベーターThermo Fisher3120加湿CO22 哺乳類細胞培養用インキュベーター
CellTrace Violet染料InvitrogenC34557細胞増殖モニタリング用バイオレット蛍光色素
ジメチルスルホキシドシグマD2650ジメチルスルホキシド；試薬ストック溶液調製用溶媒
ドンキー抗ウサギIgG (H+L) 高度クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa Fluor 488標識ドンキー抗ラビットIgG (H+L) 二次抗体
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500ダルベッコ’洗浄および試薬調製用のリン酸緩衝生理食塩水
ウシ胎児血清 (FBS)GibcoC11995500BT哺乳類細胞培養培地用血清サプリメント
固定可能生存率染料Invitrogen65-0865-14フローサイトメトリーにおける死細胞除外のための固定可能生存率染料
固定・透過化溶液BD Biosciences51-2090KZ細胞内染色のための固定・透過化試薬
平底96ウェルプレートLabgic11510細胞培養および刺激アッセイ用96ウェル平底プレート
フローサイトメーターBD BiosciencesLSRFortessa-3レーザー多色蛍光解析用3レーザーフローサイトメーター
ゴルジプラグBD Biosciences51-2301KZ細胞内サイトカイン染色のためのブレフェルジンAを用いたタンパク質輸送阻害剤
ゴルジ停止BD Biosciences51-2092KZ細胞内サイトカイン染色用モネンシンベースのタンパク質輸送阻害剤
イオノマイシンカルシウム塩シグマI3909-1ML細胞刺激のためにPMAとともに使用されるカルシウムイオノフォア
透過・洗浄バッファーBD Biosciences51-20911KZ細胞内染色用透過化および洗浄バッファー
Phosflow Lyse/Fix バッファーBD Biosciences5580495× 赤血球溶解および白血球固定同時処理用バッファー
Phosflow Perm/Wash バッファー IBD Biosciences557885細胞内リン酸化タンパク質染色のためのメタノールベース透過化バッファー
リン酸化S6リボソームタンパク質 (Ser235/236) (D57.2.2E) ウサギモノクローナル抗体細胞シグナリング4858Sリン酸化S6リボソームタンパク質（Ser235/236）ウサギモノクローナル抗体、クローンD57.2.2E
PMAシグマP1585-1MGホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸塩；ex vivo細胞刺激に使用される活性化剤
組換えマウスインターロイキン-2Gibco200-02-50UGT細胞の培養および増殖のための組換えマウスインターロイキン-2
RPMI 1640ライフラボAC01L064哺乳類細胞培養用Roswell Park Memorial Institute 1640培地
ストレプトアビジン磁気ビーズビーバー22307ビオチン抗体を用いた細胞除去のためのストレプトアビジンコート磁気ビーズ
フローサイトメトリー染色バッファー翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳する英文をご提示ください。翻訳するテキストが指定されていません。翻訳対象のソーステキストをご提示ください。フローサイトメトリー染色バッファー（供給元または調製法は提供されていません）
Parafilm M ラボ用フィルムAmcorPM996プレート、チューブ、および培養容器の封止に用いる柔軟な自己密封型ラボ用フィルム
溶解・固定バッファーBD Biosciences5580495× 赤血球溶解および白血球固定同時処理用バッファー
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1フローサイトメトリーデータ解析用ソフトウェア、バージョン10.8.1

参考文献

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