中国人の臨床コホートにおける非小細胞肺癌でのm6Aリーダータンパク質YTHDC2の発現

サマリー

本研究では、バイオインフォマティクスとqRT-PCRを用いて、非小細胞肺がんにおけるYTHDC2の発現を評価しました。データベース解析では発現低下と予後との関連が示唆されましたが、臨床的な検証では有意な差は認められませんでした。これらの結果は不一致があることを浮き彫りにしており、診断精度が限定的であること、および臨床応用の前にさらなる検証が必要であることを示しています。

要約

非小細胞肺癌（NSCLC）は、世界的に癌関連死亡の主要な原因となっており、早期診断や予後予測に利用可能なバイオマーカーは限られています。N6-メチルアデノシン（m6A）RNA修飾およびYTHDC2などのリーダータンパク質は、遺伝子調節および腫瘍形成において重要な役割を果たしています。本研究は、バイオインフォマティクスおよび定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）を用いて、NSCLC組織におけるYTHDC2の発現プロファイルを評価し、YTHDC2と臨床病理学的特性との関係を検討し、将来の研究に向けた臨床的および生物学的な関連性を探ることを目的としています。予後予測の精度を確認するため、データベースから得られた遺伝子発現および生存データを解析しました。また、中国の臨床コホートにおけるNSCLC組織でYTHDC2の発現量を定量し、臨床病理学的特性を解析しました。公開データベースの解析では、YTHDC2はNSCLC組織で発現が低下しており（p < 0.05）、患者の生存期間と関連していましたが、その予後予測能は低い結果となりました（AUC ≈ 0.5）。19組の腫瘍組織および隣接正常組織を用いたqRT-PCR解析では、癌組織と隣接組織の間でYTHDC2の発現に統計的な有意差は認められませんでした（p = 0.537）。総合すると、公開データベースの解析結果は、YTHDC2がNSCLCにおいて発現低下し、予後に関連している可能性を示唆していますが、我々のコホートによる独立した臨床的検証では、有意な発現差は確認されませんでした。これらの知見は、大規模データセットと実際の臨床コホートとの間に大きな異質性があることを浮き彫りにしており、YTHDC2が単独で信頼性の高い診断または予後バイオマーカーとして機能する可能性は低く、臨床応用のためには他の分子マーカーとの統合が必要であることを示唆しています。

概要

扁平上皮癌および腺癌を含む非小細胞肺癌（NSCLC）は、最も頻繁に診断される肺癌であり、世界的な癌死亡率の主要な原因となっています¹。世界の癌統計によると、肺癌は癌による死亡の主な原因の一つです²。診断、手術、放射線治療、および分子標的療法の最近の進展に関わらず、NSCLCの予後は著しく改善していません。これは、一次診断が進行期に行われることが多く、また、初期段階ではしばしば無症状であるためです³。このことは、NSCLC患者における同定、予後予測、および治療効果の評価を行うための新しいバイオマーカーの必要性を強調しています。

m6Aは真核生物において最初に同定された、かつ最も豊富なRNA修飾であり、RNAの安定性、翻訳、および転写に関与している⁴。m6A修飾は動的かつ可逆的であり、メチルトランスフェラーゼ（ライター）、脱メチル化酵素（イレイザー）、および特異的な結合タンパク質（リーダー）によって制御されている⁵。これらのうち、主要なm6Aリーダータンパク質であるYTHDC2は、RNAの安定性と翻訳速度を調節する⁶。近年の研究では、YTHDC2が細胞増殖や浸潤の抑制、あるいは細胞死の誘導を通じて、複数の癌種の制御に関与していることが示されている⁷。また、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1などの他のm6Aリーダータンパク質が、肺癌の進行、免疫調節、および予後に臨床的な関連を持つことが明らかになっており、独立した患者コホートにおいて個々のm6Aリーダーを系統的に評価することの重要性が強調されている^8,9,10。非小細胞肺癌（NSCLC）ではYTHDC2のレベルが著しく低く、これが高い腫瘍ステージ、リンパ節転移、および患者の不良な予後と関連していることから、抗腫瘍因子である可能性が示唆されている¹¹。in vitroおよびin vivoの実験においても、YTHDC2の高発現が肺癌における細胞増殖と転移を抑制することが明らかになっている⁷。

本研究では、統合的な計算解析およびqRT-PCRによる実験的検証を通じて、NSCLCにおけるYTHDC2の調節について調査した。また、YTHDC2の発現と臨床病理学的特性および患者の予後との関係についても検討した。公共データベースからのエビデンスにより、NSCLCにおけるYTHDC2の調節不全が示唆されつつあるが、既報の研究では、YTHDC2調節不全の程度や臨床的意義に関して一貫性のない結果が報告されており、適切に特性評価された実際の臨床コホート、特にアジア人集団における独立した検証は限定的である。さらに、先行研究の多くは主に公共のトランスクリプトームデータセットや実験モデルに依存しており、バイオインフォマティクスの知見を独立した臨床検証と統合した研究は比較的少ない。本研究では、大規模な公共トランスクリプトーム解析と中国の臨床コホートにおける独立したqRT-PCR検証を組み合わせることで、先行知見の再現性を評価し、公共データベース解析と実際の臨床検体との間のトランスレーショナルなギャップを埋めることを目的とした。したがって、本研究は、統合的なバイオインフォマティクスおよび臨床検証アプローチを用いてYTHDC2の発現を系統的に評価し、NSCLCにおけるその潜在的な生物学的および臨床的な関連性を検討することを目的とした。YTHDC2の発現はNSCLCで調節不全となっており、バイオインフォマティクス解析を独立した臨床検証と統合することで、いずれか単独のアプローチよりも、その診断的および予後的な意義をより信頼性高く評価できるという仮説を立てた。

プロトコル

本研究は海南医科大学倫理委員会の承認を得ており（承認番号：HMC1984.24）、ヘルシンキ宣言（2013年改訂版）に準拠して実施されました。

被験者

海南省三亚市中心病院において2017年から2024年の間に診断された肺がん患者50名を対象とした研究を、中国医学会肺がん診療ガイドライン（2024年版）に基づいて実施した。研究間の比較可能性を確保するため、中国人コホートで検証済みの¹²AJCC第8版に準拠したCSCOステージング（2024年）を採用し、一貫性を担保するために2名の独立した腫瘍医によるレビューを行った。患者の選定プロセス、組織の利用可能性、RNA品質評価、およびqRT-PCR分析のための最終的なサンプル組み入れについて、図1にまとめる。

研究データ

本研究では、バイオインフォマティクスを用いて非小細胞肺癌（NSCLC）におけるYTHDC2の発現レベルおよびそれらと臨床病理学的特徴との関係を解析し、潜在的なメカニズムに関する知見を得ました。バイオインフォマティクス解析は、GDCデータポータル（https://portal.gdc.cancer.gov/）を通じてダウンロードした、肺腺癌（LUAD）、肺扁平上皮癌（LUSC）、および対応する正常肺組織サンプルを含む、The Cancer Genome Atlas（TCGA）の公開RNAシーケンシングデータのみを用いて行われました。ダウンロードしたデータセットには、適格なTCGA-LUADおよびTCGA-LUSC症例について、RNAシーケンシング発現データとともに、利用可能な臨床変数（患者識別子、サンプル識別子、年齢、性別、病理学的ステージ、生存状態、および全生存期間）が含まれていました。遺伝子発現または生存情報の欠落しているサンプルは、後続の生存解析およびROC解析から除外されました。本研究で使用したデータセットは、補足ファイル1として提供されています。バイオインフォマティクス解析において、三亜中心医院で収集された臨床検体は使用していません。GEPIA、Kaplan–Meier Plotter、およびsurvivalROC解析の詳細な手順は、後述のバイオインフォマティクス解析のセクションに記載しています。データの取得、前処理、遺伝子発現解析、生存解析、およびROC解析を含むバイオインフォマティクスの全ワークフローを図 2にまとめました。

選択基準および除外基準

患者の組み入れ基準および除外基準を表1に示す。統計的検出力分析ソフトウェアを用いたパワー分析により、中程度の効果量（d = 0.8, α = 0.05, 両側）を検出するために、1群あたり少なくとも26例が必要であることが決定された。肺癌群では当初50ペアの登録を目指したが、組織またはRNAの品質による除外後、最終的なqRT-PCR分析には30個の腫瘍サンプルと19個の正常隣接組織サンプルが含まれた。このサンプル数の減少は、実際の臨床上の制約を反映しており、トランスレーショナル研究におけるRNAの完全性と組織の入手可能性の重要性を強調している。比較におけるn = 19の場合、最小検出可能効果量はd = 1.0（検出力 80%, α = 0.05）となる。したがって、本実験はYTHDC2の発現における大きな差を検出するには十分な検出力を持っていたが、小から中程度の差を検出するには不十分であった。

組織標本および定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）

病理診断は、2名の異なる病理医によって二重盲検法で決定されました。腫瘍の純度は病理医によって推定され（悪性細胞 >70%）、さらにESTIMATE (TCGA) を用いて確認されました。間質によるコンタミネーションを最小限に抑えるため、隣接正常組織のマクロダイセクションを行いました。肺がんの組織型には肺腺がんおよび扁平上皮がんが含まれ、肺腺がんが26例、扁平上皮がんが4例でした。肺がん患者50名の臨床病期診断は、「中国医学会肺がん診療ガイドライン（2024年版）」に記載された病期分類基準に従って行われました。病理学的に確認されたNSCLC検体（n = 50）は、典型的な臨床分布を示していました（表2参照）。最初に登録された50名の患者のうち、30個の腫瘍組織サンプルと19個の対応する隣接正常組織サンプルがRNA品質基準を満たしました。ペア統計解析には同一患者からの対応検体が必要であるため、腫瘍と隣接正常組織の発現比較は、利用可能な19組の対応ペアを用いて行いました。これらの臨床検体は、qRT-PCRによる実験的検証のみに使用され、バイオインフォマティクス解析に使用した公開TCGAデータセットとは独立して分析されました。選択された検体は、病理学的確認後直ちに処理され、RNA抽出前にRNaseフリー条件下で取り扱われました。このサブセットは、十分な組織量と高品質な全RNA（RNA完全性番号、RIN >7.0）の両方を得られた症例を反映しています。逆転写前に全RNAの濃度と純度を測定し、適切なRNA品質（RIN >7.0）を持つサンプルのみをダウンストリーム解析に含めました。定量的PCRの前に、メーカーのプロトコルに従って等量の全RNAを相補的DNA (cDNA) へと逆転写しました。この工程により、解析した遺伝子発現データの妥当性が確保されました。qRT-PCR実験は、プローブを用いた定量的PCRアッセイを用いてリアルタイムPCRサーモサイクラーで実施されました。分析の再現性を確保するため、すべての反応はノーテンプレートコントロールと共に3連（triplicate）で実施されました。PCR増幅は以下のサイクル条件で行われました。まず95°Cで10分間の酵素活性化／変性ステップを行い、続いて95°Cで15秒間の変性と60°Cで60秒間のアニーリング／伸長を40サイクル繰り返しました。蛍光信号は各増幅サイクルの終了時に取得されました。すべての試薬および消耗品は市販のサプライヤーから入手しました（材料表参照）。qRT-PCRに使用したプライマーおよびプローブの配列は、表3に示されています。

バイオインフォマティクス解析

YTHDC2遺伝子発現のGEPIAデータベース解析

NSCLCにおけるYTHDC2の発現を分析するために、GEPIAデータベースを使用した。ウェブブラウザを介してGEPIAウェブサーバー（http://gepia.cancer-pku.cn/）にアクセスした。Expression DIYモジュールを選択し、遺伝子シンボル"YTHDC2"を入力し、LUADおよびLUSCデータセットを選択した。正規化パラメータはデフォルトのまま保持し、GEPIAのインターフェースを通じて差分的発現のボックスプロットを直接作成した。統計的有意性はp < 0.05と定義した。

肺がん患者の生存分析のためのKaplan-Meier plotterデータベース

Kaplan-Meier Plotterデータベースを用いて、肺がん患者におけるYTHDC2の発現と予後との関係を分析した。肺がんのデータセットを選択し、遺伝子シンボル"YTHDC2"を入力し、「auto-selected best cutoff（自動選択された最適カットオフ）」オプションを適用した。その後、デフォルトの分析設定を用いて、全生存期間および進行後生存期間のKaplan-Meier曲線を作成した。患者は、Kaplan-Meier Plotterプラットフォームによって決定された最適カットオフに基づき、高発現群と低発現群に自動的に層別化され、プラットフォームのデフォルト設定を用いて、対応する95%信頼区間を伴うハザード比を算出した。

ROC曲線描画のためのRソフトウェアにおけるRパッケージの実行

適格なTCGA-LUADおよびTCGA-LUSC症例のRNA sequencing発現データおよび対応する臨床メタデータをGDC Data Portalからダウンロードした。ダウンロードしたデータセットを患者識別子によって統合し、後続の解析のためにRにインポートした。survivalROCパッケージを用いて、予測期間を1年、3年、5年とした時間依存性ROC曲線を作成し、対応する曲線下面積（AUC）値を算出してYTHDC2発現の予後予測能を評価した。生存ROC解析には、RNA-seq発現データと生存情報の両方が利用可能なTCGA-LUADおよびTCGA-LUSC患者のみを組み込んだ。地域の臨床コホートについては、長期的な追跡データが得られなかったため、生存予測には使用しなかった。

qRT-PCRによる組織におけるYTHDC2の発現解析

遺伝子発現レベルを解析するため、qRT-PCRを実施した。メーカー推奨の反応条件に従い、等量のcDNAを各反応系に添加した。増幅はプローブベースの定量的PCRアッセイを用いて行い、蛍光データは各増幅サイクルの終了時に自動的に収集した。簡潔に述べると、RNA抽出プロセスは、試料調製、脱パラフィン、残液の除去、プロテイナーゼK消化、インキュベーション、遠心分離、DNase処理、DNase I添加、およびエタノール沈殿を含む複数のステップで構成された。その後、試料をシリカベースのRNA精製カラムに結合させ、8,000 × gで30秒間遠心分離した。次に、カラムを洗浄バッファー1、洗浄バッファー2、およびエタノールで希釈した洗浄バッファー2で洗浄し、13,000 × gで2分間乾燥させた。その後、カラムメンブレンの中央に70 µLのRNase-Free Waterを添加し、13,000 × gで1分間遠心分離してRNAを溶出させた。相対的な遺伝子発現量を算出する前に、融解曲線分析により、各プライマーペアが単一の増幅産物を示すことを確認した。試料分析に先立ち、標準曲線を用いてプライマー効率（90–110%）を検証した。融解曲線分析により、単一のアンプリコンの存在とプライマーダイマーの不在を確認した。相対的なYTHDC2発現量は2^-ΔCt法を用いて算出し、Ct値は内在性参照遺伝子であるGAPDHで標準化した。発現値は、校正試料に対する倍率変化ではなく標準化された発現レベルとして提示したため、結果は2^−ΔCt値として報告している。GAPDHをハウスキーピング遺伝子として選択したのは、m6A研究における参照遺伝子の選択基準に基づき、テストした代替候補（ACTB、CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%）と比較して、その発現の変動が極めて小さかったためである（CV < 5%）。

統計解析

統計解析は、グラフやチャートの作成を含め、統計ソフトウェアを用いて行いました。NSCLC患者におけるYTHDC2遺伝子発現の定量的およびカテゴリデータ分析には、バイオインフォマティクス解析およびROC曲線の作成にRソフトウェアを使用しました。生存予測におけるYTHDC2発現の診断性能を評価するため、ROC曲線およびAUCを用いました。回帰ベースの解析では、該当する場合に効果推定値（オッズ比）および対応する95%信頼区間を報告しました。ペアになった腫瘍組織と隣接正常組織サンプル間のYTHDC2発現の比較にはWilcoxon符号付き順位検定を用い、YTHDC2発現と臨床病理学的特徴との関連性の評価にはPearson相関分析を用いました。相関係数（r）および対応するp値を報告しました。qRT-PCRデータは同一患者からのペアの腫瘍組織および隣接正常組織サンプルで構成されており、遺伝子発現データが正規分布していなかったため、ペア組織間のYTHDC2発現レベルの比較にはWilcoxon符号付き順位検定を用いました。この検定はデータの正規性を仮定せず、歪みのある生物学的データに一般的に用いられます。すべての統計検定は両側検定とし、p <0.05を統計的に有意とみなしました。連続変数は、解析前に正規性を評価しました。連続変数は、適宜、平均値 ± 標準偏差または中央値（四分位範囲）として提示しています。

結果

TCGAデータベースに基づく腫瘍におけるYTHDC2遺伝子の発現

図 3 では、TCGAデータベースのGDCツールを用いて、さまざまな癌におけるYTHDC2の発現レベルを調べることにより、NSCLCとYTHDC2の関連性を示しています。

GEPIAデータベースにおけるNSCLCでのYTHDC2遺伝子の発現

GEPIAデータベースを用いて、肺腺がん（LUAD）および肺扁平上皮がん（LUSC）におけるYTHDC2発現レベルの追加スクリーニングを行い、483例の肺腺がん組織検体、347例の正常肺組織検体、486例の肺扁平上皮がん組織検体、および338例の正常肺組織検体を取得した。統計解析の結果、図4に示すように、肺腺がんおよび肺扁平上皮がんの両組織において、正常肺組織よりもYTHDC2の発現レベルが著しく低いことが判明した（p < 0.05）。

病理学的ステージにおけるYTHDC2発現のGEPIA解析

NSCLCのステージ間におけるYTHDC2の差分的発現を評価するため、GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) データベースを用いてステージプロットを作成した。図5に示すように、NSCLCの病理学的ステージ間において、YTHDC2の発現に統計的に有意な差は認められなかった (p = 0.644)。

YTHDC2と肺がん生存率のカプランマイヤー解析

Kaplan-Meier Plotterデータベースを用いて、YTHDC2遺伝子のカプランマイヤー生存分析を行った。その結果、YTHDC2の発現量が高い患者は、発現量が低い患者よりも全生存期間（OS）が有意に長かった（p < 0.05）。図6A（OS）に示すように、YTHDC2の高発現を示した肺癌患者は予後が良好であり、この差は統計的に有意であった（p < 0.05）。また、図6B（PPS）によれば、増悪後生存期間（PPS）のデータセットにおいて、YTHDC2高発現群は低発現群よりも予後が良好であり、その差は統計的に有意であった（p < 0.05）。

YTHDC2生存率予測モデル

TCGAのRNA-seq発現データおよび生存データに基づく時間依存性ROC分析により、YTHDC2の発現単独ではNSCLCの生存予測能が限定的であることが明らかになりました。AUC値は、1年で0.50 (95% CI: 0.38-0.62)、3年で0.51 (95% CI: 0.39-0.63)、5年で0.52 (95% CI: 0.40-0.64)、8年で0.52 (95% CI: 0.39–0.65)でした (図 7)。すべてのAUC信頼区間が0.5を含んでおり、これはランダムな確率と同等の性能であることを示しています。これらの結果は、YTHDC2の発現単独では生存予測における識別能に欠けており、単独の予後バイオマーカーとして検討すべきではないことを示唆しています。臨床病理学的変数やマルチ遺伝子シグネチャーとの統合により、予測性能が向上する可能性があります。

qRT-PCRによる癌組織と正常組織におけるYTHDC2の発現解析

qRT-PCRを用いて、NSCLC患者の悪性組織および隣接する正常組織の両方におけるYTHDC2遺伝子の発現を調査した。標準化したYTHDC2発現量（2^−ΔCt）は、悪性組織で3.24 ± 2.34、近接する正常組織で3.60 ± 1.70であった。図8に示すように、19組のNSCLC腫瘍組織とその対照となる隣接正常組織の間で、YTHDC2の発現に有意な差は認められなかった（p = 0.537）。大規模データセットのバイオインフォマティクス解析では、NSCLCにおけるYTHDC2の有意なダウンレギュレーションが示唆されていたが、本コホートのqRT-PCRでは有意差が見られず、コホートサイズ、サンプルの不均一性、および技術的変動による乖離の可能性が浮き彫りとなった。さらに、AUCが低い（0.5）ことは、YTHDC2単独では診断的または予後的な精度を欠いていることを示している。

NSCLCにおけるYTHDC2の発現と臨床病理学的特徴

本研究は、非小細胞肺癌（NSCLC）患者50名を対象とした。内訳は男性患者32名（64.00%）、女性患者18名（36.00%）で、平均年齢は63.10 ± 9.85歳、年齢範囲は37歳から86歳であった。患者のうち、25名は過去に喫煙歴があり、25名は非喫煙者であった。病理型は、扁平上皮癌が9例（18.00%）、肺腺癌が41例（82.0%）であった。CSCO臨床病期分類に基づくと、ステージIII–IVが22名（44.00%）、ステージI–IIが28名（56.00%）であった。リンパ節転移のない患者は24名であり、26名（54.00%）にリンパ節転移が認められた。分化度は、低分化癌が9名（18.00%）、高分化から中分化の腫瘍が41名（82.00%）であった。

NSCLC組織における臨床病理学的特性とYTHDC2発現レベルの関連を検討しました。病理学的サブタイプ間およびリンパ節転移の有無に応じて、YTHDC2の発現に差が認められました(p < 0.05)。しかし、扁平上皮癌のサンプルは4例のみであったため、病理学的サブタイプの比較は慎重に解釈し、探索的な結果として考慮すべきです。Figures 9A,Bに示すように、YTHDC2の発現は肺腺癌よりも扁平上皮癌で有意に高く、またリンパ節転移のないNSCLC組織よりもリンパ節転移のある組織で有意に高い値を示しました (5.70 ± 2.53 vs. 3.83 ± 0.91, p = 0.027)。ただし、扁平上皮癌のサンプルが4例しか含まれていなかったため、病理学的サブタイプ間の比較は慎重に解釈し、より大規模なコホートでの検証を待つ探索的なものとすべきです。リンパ節転移を有する患者におけるYTHDC2の高発現は、YTHDC2とリンパ節転移の状態との間に潜在的な関連があることを示唆している可能性がありますが、この知見はサンプルサイズが限られているため慎重に解釈すべきであり、より大規模な独立したコホートでの検証が必要です。一方で、年齢、喫煙歴、CSCO臨床ステージ、および組織学的分化度はYTHDC2の発現に有意な影響を与えませんでした(p > 0.05)。詳細な情報はTable 4、Table 5、およびFigure 9に記載しています。

非小細胞肺癌（NSCLC）におけるリンパ節転移の二項ロジスティック回帰分析

相関分析の結果と一致して、YTHDC2の発現はリンパ節転移と有意に関連していた（p < 0.05）。NSCLC患者において、リンパ節転移を従属変数とし、年齢、性別、喫煙歴、腫瘍ステージ、病理型、YTHDC2発現レベル、および分化度を独立変数として、二項ロジスティック回帰分析を行った。その結果、NSCLC患者におけるYTHDC2の発現は、リンパ節転移と有意に関連していることが示された（p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748）。

一般的な臨床データにおいて、NSCLC患者の腫瘍ステージはリンパ節転移と統計的に有意な相関を示しました（p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186）。一方で、表6に示す通り、年齢、性別、喫煙歴、病理学的型、および分化度は、NSCLCにおけるリンパ節転移と有意な相関はありませんでした（p > 0.05）。

データ可用性：本研究の結果を裏付けるデータセットは、Zenodoリポジトリ（DOI: 10.5281/zenodo.21409961）で入手可能です。このリポジトリには、バイオインフォマティクス解析に使用したTCGAの臨床メタデータ、サンプルアノテーション、データ取得仕様、および解析マニフェストが含まれています。その他のデータについては、合理的な要求があれば責任著者から提供可能です。

図 1: qRT-PCR分析における患者の選択および組織組み入れのフローチャート。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図2. NSCLCにおけるYTHDC2の発現および予後的意義を評価するために実施したバイオインフォマティクス解析のワークフロー こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図3: TCGAデータベースにおけるYTHDC2遺伝子の発現。 Genomic Data Commons (GDC) データポータルを介してThe Cancer Genome Atlas (TCGA) から取得したRNAシーケンシングデータを用い、肺腺癌 (LUAD) および肺扁平上皮癌 (LUSC) におけるYTHDC2の発現レベルを正常肺組織と比較し、GEPIAウェブプラットフォームを用いて解析した。データはGEPIAプラットフォームを通じて解析した。統計的有意性は p-value < 0.05 として決定した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図4: GEPIAデータベース解析に基づくNSCLCにおけるYTHDC2の差分的発現。 GEPIAプラットフォームを介して、The Cancer Genome Atlas (TCGA)およびGenotype-Tissue Expression (GTEx)プロジェクトのデータを用い、肺腺がん (LUAD)および肺扁平上皮がん (LUSC)におけるYTHDC2の発現レベルを正常肺組織の発現レベルと比較した。ボックスプロットは正規化された遺伝子発現レベルを示す。統計的有意性は p-value < 0.05 として決定された。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図5GEPIAデータベースを用いた非小細胞肺癌（NSCLC）におけるYTHDC2の病期別発現解析。 GEPIAプラットフォームを用いて、非小細胞肺癌（NSCLC）の異なる病理学的ステージ（I〜IV）におけるYTHDC2の発現レベルを解析した。ステージプロットは、腫瘍ステージごとの遺伝子発現の変動を示している。各ステージ間において、YTHDC2の発現に統計学的に有意な差は認められなかった（p = 0.644). こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6NSCLC患者におけるYTHDC2発現のカプラン＝マイヤー生存分析（Kaplan–Meier Plotter） (A全生存期間（OS）：Kaplan–Meier Plotterツールの最適カットオフ設定（「auto-select best cutoff」）を用い、YTHDC2発現レベルによって高発現群（n = 140）と低発現群（n = 364）に層別化した非小細胞肺癌（NSCLC）患者の全生存期間を比較したKaplan–Meier生存曲線。統計的有意性の評価にはログランク検定を用いた（p = 0.0093）。ハザード比（HR） = 0.61、95%信頼区間（CI）：0.42–0.89。YTHDC2の高発現は、全生存期間の有意な改善と関連している。B) 進行後生存期間（PPS）：Kaplan–Meier Plotterツールの最適カットオフ設定（「auto-select best cutoff」）を用い、YTHDC2の発現量によって高発現群（n = 181）と低発現群（n = 296）に層別化した非小細胞肺癌（NSCLC）患者における進行後生存期間を比較したKaplan–Meier生存曲線。統計的比較にはログランク検定を用いた（p = 4.2 × 10⁻⁵）；ハザード比（HR）= 0.63（95%信頼区間：0.51–0.79）。YTHDC2の高発現は、進行後の生存期間の有意な延長と関連している。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 7: YTHDC2 生存率予測モデル。 RNA-seq 発現データおよび生存データが利用可能な TCGA-LUAD および TCGA-LUSC 患者における、1年、3年、5年、および8年の時点での全生存期間に対する YTHDC2 の予測精度を評価した受信者動作特性（ROC）曲線。AUC 値：1年 = 0.50、3年 = 0.51、5年 = 0.52、8年 = 0.52。破線の対角線はランダムな確率（AUC = 0.5）を示す。解析は R の survival ROC パッケージを用いて実施した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図8qRT-PCRにより測定した、非小細胞肺癌（NSCLC）の腫瘍組織および隣接正常組織におけるYTHDC2の発現量。 相対的なYTHDC2発現量は、2^-ΔΔCt法を用いて算出した。^–ΔCt 法を用い、GAPDHで標準化した。発現値は、キャリブレーターサンプルに対する倍率変化ではなく、標準化された発現レベルを示す。統計解析は、ペア比較が可能な19組の腫瘍および隣接正常組織のペアを用いて行った。データは、平均値とともに個別のペア観察値として提示している。 ± 標準偏差。対標本間の差は、ウィルコクソン符号付順位検定を用いて分析した（p = 0.537). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 9: NSCLC患者におけるYTHDC2発現と臨床病理学的特徴との関連。 (A) 異なる病理型におけるYTHDC2発現。腺癌よりも扁平上皮癌で高い発現が認められた (p < 0.05)。 (B) リンパ節転移の状態に応じたYTHDC2発現。転移なしの患者よりも、リンパ節転移のある患者で高い発現が認められた (p < 0.05)。 (C) 異なる組織学的分化度におけるYTHDC2発現。統計的な有意差は認められなかった (p = 0.181)。 (D) CSCO臨床ステージにおけるYTHDC2発現。統計的な有意差は認められなかった (p = 0.08)。YTHDC2発現レベルは定量リアルタイムPCR (qRT-PCR) により測定し、GAPDHで標準化後、2^–ΔCt法を用いて算出した。データは平均値 ± 標準偏差 (SD) で示している。統計的な比較にはWilcoxon順位和検定を用いた。*p < 0.05 を統計的に有意とした。 こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

番号	組み入れ基準	除外基準
1	性別を問わず、18歳以上。	その他の悪性腫瘍の診断。
2	中国医学会肺癌診療ガイドライン（2024年版）に基づき、非小細胞肺癌（NSCLC）の診断が確定していること。	慢性呼吸器疾患または心血管疾患（例：COPD、肺性心、心不全）の既往。
3	署名済みのインフォームドコンセントが得られており、人口統計学的詳細、血清腫瘍マーカー、および造影胸部CT画像を含む完全な臨床データが利用可能であること。	腎不全（eGFR <30 ml/min/1.73m²²）または肝硬変。
4	腫瘍標的治療の既往がない治療ナイーブの患者。	妊娠中または授乳中の女性（〜により確認された）を含む特別な集団 β-（該当する場合はhCG検査）。
5	分子解析に適した十分な量の腫瘍および／または隣接組織サンプルの利用可能性。	組織量不足またはRNAの分解（病理医による確認済み）を含む、検体品質の不良。

表1：本研究におけるNSCLC患者の組み入れ基準および除外基準

組織型	分析したペアサンプル数 (n)	相対発現量（平均値 ± 標準偏差 (SD)
腫瘍組織	19	3.24 ± 2.34
対応する隣接正常組織	19	3.60 ± 1.70

表2：非小細胞肺癌（NSCLC）の腫瘍組織および隣接正常組織におけるYTHDC2の発現。YTHDC2の相対的発現量を2^–ΔCt法を用いて測定し、GAPDHで標準化した。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。19組の対応する腫瘍・隣接正常組織ペアの統計的比較は、Wilcoxon符号付き順位検定を用いて行った（p = 0.537）。

標的遺伝子	プライマー/プローブ	シーケンス (5′→3′)
YTHDC2	フォワード (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	リバース（R）	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	プローブ (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	フォワード（F）	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	リバース (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	プローブ (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

表 3: 定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）に使用したプライマーおよびプローブの配列。YTHDC2の発現量は、GAPDHを内部コントロールとしてTaqMan法を用いて定量した。

特性	カテゴリー	n	%
病理学的型	腺がん	41	82
	扁平上皮がん	9	18
CSCOステージ	I–II	28	56
	III–IV	22	44
リンパ節転移	なし	24	48
	あり	26	52
分化度	低分化	9	18
	中–高分化	41	82
年齢	≥60 歳	36	72
	<60 歳	14	28
性別	男性	32	64
	女性	18	36
喫煙歴	あり	25	50
	なし	25	50

表4：NSCLC患者の臨床的および病理学的特性。データは、全研究集団（n = 50）に基づく人数（n）および割合（%）で示されています。

臨床病理学的特徴	群	n	YTHDC2の発現量（平均値 ± SD)	pp値
組織型	腫瘍	30	3.24 ± 2.34	0.537
	隣接正常組織	19	3.60 ± 1.70
病理学的型	腺がん	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	扁平上皮癌	4	7.50 ± 3.41
CSCOステージング	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
リンパ節転移	いいえ	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	はい	11	5.70 ± 2.53
組織学的分化	中〜高分化	25	4.33 ± 1.90	0.181
	低分化の	5	5.18 ± 1.60
年齢	60歳以上	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60年	10	4.16 ± 1.12
喫煙歴	はい	12	4.62 ± 2.40	0.845
	いいえ	18	4.38 ± 1.40

表5：NSCLC患者におけるYTHDC2発現と臨床病理学的特徴との関連。YTHDC2の発現はqRT-PCRにより測定し、GAPDHで標準化した後、2^–ΔCt法を用いて算出した。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。群のサイズ（n）は分析した有効サンプル数である。群間の統計学的比較はWilcoxon順位和検定を用いて行った。*p < 0.05を統計学的に有意とした。

変数	β	Wald	p値	または	95% 信頼区間
年齢（60歳以上 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
性別（女性 vs 男性）	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
喫煙歴（あり vs なし）	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
腫瘍ステージ（III–IV vs I–II）	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
分化度（低分化 vs 中〜高分化）	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
YTHDC2の発現	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

表6：非小細胞肺癌（NSCLC）患者におけるリンパ節転移に関連する因子の多変量ロジスティック回帰分析 リンパ節転移を従属変数として、二項ロジスティック回帰分析を行った。オッズ比（OR）および95%信頼区間（CI）を報告する。参照カテゴリー：年齢（<年齢（60歳）、性別（男性）、喫煙歴（なし）、腫瘍ステージ（I〜II）、および分化度（中〜高分化）。*p < 0.05は統計的有意性を示す。

ディスカッション

YTHファミリーの中で最大のN6-メチルアデノシン（m6A）結合タンパク質であるYTHDC2は、ATP依存性RNAヘリカーゼ活性を持つという特異性を有しており、RNA代謝の重要な調節因子として区別されています¹³。他のYTHファミリーメンバーとは異なり、YTHDC2は核と細胞質の両方に存在し、mRNAの翻訳およびRNAの安定性を調節しています¹⁴。これまでの実験的研究により、YTHDC2はADIRFおよびMRPL12のmRNA発現を抑制し、アポトーシスを促進させ、細胞増殖と転移を抑制することで、肺腺癌（LUAD）の進行を抑制することが示されています^15,16。また、YTHDC2はZNRD1-AS1などのlncRNAを安定化させてLUADの増殖を抑制すること、さらにCYLDやSLC7A11などのm6A修飾mRNAを調節することで、NF-κBシグナル経路、システイン取り込み、および抗酸化プロセスを抑制し、フェロトーシスと抗がん活性を促進することが示唆されています^17,18。

本研究では、バイオインフォマティクス解析と実験的検証を組み合わせた統合的アプローチを用いて、非小細胞肺癌（NSCLC）におけるm6Aリーダータンパク質YTHDC2の発現および臨床的意義を検討した。TCGAおよびGEPIAデータベースを用いたバイオインフォマティクス解析の結果、正常肺組織と比較してNSCLCの腫瘍組織ではYTHDC2が有意にダウンレギュレーションされており、YTHDC2の高発現は全生存期間および病勢進行後生存期間の改善と関連していることが明らかになり、潜在的な予後因子としての役割が示唆された。興味深いことに、本コホートで利用可能であった19例の腫瘍および隣接正常組織のペア検体を用いたqRT-PCR実験では、腫瘍組織と隣接正常組織の間でYTHDC2の発現に統計的に有意な差は認められなかった。この不一致は、大規模な公開データセットから得られた知見を独立した臨床コホートに適用することの困難さを浮き彫りにしており、in silico解析の結果を慎重に解釈する必要性を強調している。これらの相違の背後にある理由を理解することは、NSCLCにおけるバイオマーカーおよび治療標的としてのYTHDC2の有用性を正確に評価する上で極めて重要である。本研究がYTHDC2に着目したのは、YTHリーダーの中で唯一のヘリカーゼ活性を持つためである¹⁹が、最近のパンキャンサー解析では、他のファミリーメンバーがコンテキスト依存的な役割を持つことが明らかになっている。例えば、Liらは、YTHDF1/2が多くの癌（LIHC、LUADなど）でアップレギュレーションされており、予後不良と相関することを実証した一方で、YTHDC1/2はKIRCおよびBRCAにおいて腫瘍抑制効果を示すことを示した²⁰。特に、Wnt/β-catenin活性化を介したYTHDF1の腫瘍形成能は、NSCLCにおけるYTHDC2の抗転移機能と対照的であり、サブタイプ特異的なバイオマーカー戦略の必要性が浮き彫りとなっている。確立された予後マーカー（免疫療法の反応性に関するPD-L1など）と比較して、パンキャンサー免疫浸潤解析で示唆されているように、YTHDC2の予測能は他のm6A調節因子（METTL3、YTHDF1など）や免疫チェックポイント遺伝子と組み合わせることで強化される可能性がある。先行研究ではYTHDC2がNF-κB/CYLD経路を制御することが示唆されているが¹²、本研究は免疫組織化学染色やウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルでの検証、および機能的検証が行われていない点に限界があった。今後の研究では、ノックダウンアッセイとm6A-sequencingを組み合わせ、直接的な標的をマッピングすることが求められる。

先行研究の解析により、NSCLC組織においてYTHDC2の発現が低下しており、それが予後不良と相関することが明らかになっている²¹。Kaplan-Meier解析では、YTHDC2の発現が高い患者で生存期間が長いことが示されたが、ROC曲線解析では、生存に対する予測能は限定的であることが示唆された²⁰。本研究における生存ROC解析は、自施設の臨床コホートでは長期的なフォローアップ情報が得られなかったため、TCGAのRNA-seq発現データおよび生存データを用いて実施した。重要な点として、本研究で観察された低いAUC値（~0.5）は、YTHDC2の発現が単独のバイオマーカーとして臨床的に利用するには十分な感度と特異性を欠いていることを示唆している²²。この限界は、NSCLCのような複雑な疾患において単一遺伝子のバイオマーカーでは不十分であることが多いという新たな知見と一致しており、臨床的に意味のある予測性能を達成するためには、マルチオミクスアプローチや統合的なバイオマーカーパネルがますます必要とされている。本コホートでは、リンパ節転移を有するNSCLC組織でより高いYTHDC2発現が観察され、YTHDC2の発現とリンパ節転移状態との間に潜在的な関連があることが示唆された。また、腺がん（adenocarcinoma）と扁平上皮がん（squamous cell carcinoma）の間でもYTHDC2発現に差が認められたが、解析に使用できた扁平上皮がんのサンプルが4例のみであり、このサブグループ比較の統計学的検出力が著しく制限されるため、慎重に解釈されるべきである。臨床ステージ、分化度、年齢、または喫煙歴については有意な差は認められなかったが、これはサンプルサイズや単一施設での設計などの研究上の制限によるものと考えられる。YTHDC2の発現低下とリンパ節転移との間に観察された関連は、NSCLCにおける潜在的な生物学的役割を示唆しているが、判別能の低さ（AUC ~0.5）およびqRT-PCRによる検出の不一致から、単独の臨床マーカーとしての利用は困難である。今後の研究では、YTHDC2を他のm6A関連タンパク質と組み合わせることで予測価値が向上するかを検討する必要がある。

バイオインフォマティクス解析により、NSCLCにおいてYTHDC2の発現が低下しており、それが患者の予後の改善に関連している可能性が示唆されました。リンパ節転移を有する患者においても発現低下が観察され、病理学的サブタイプ間での差異も認められましたが、これらのサブグループにおける知見は、特に扁平上皮癌においてサンプルサイズが限定的であるため、慎重に解釈する必要があります。しかしながら、これらの結果は我々の臨床コホートにおけるqRT-PCR解析では確認されませんでした。これは、コホートの特性、サンプルサイズ、技術的変動、転写後調節の違い、あるいはタンパク質レベルでの検証がなされていないことが反映されている可能性があります。今後の研究では、in vitroおよびin vivoの実験を通じて、他の肺癌サブタイプにおけるYTHDC2のメカニズムを探索すべきです。このような研究により、YTHDC2の生物学的役割がさらに明確になり、単独のバイオマーカーとしてではなく、マルチマーカーアプローチの一環としての臨床的有用性があるかどうかが判断されると考えられます。

制限事項

本研究にはいくつかの制限がある。単一施設でのレトロスペクティブ研究であり、サンプルサイズが比較的小さいため、汎用性が制限される可能性がある。FFPE組織の使用が、RNAの品質およびqRT-PCRの感度に影響を与えた可能性がある。さらに、YTHDC2 mRNAの発現のみを評価しており、免疫組織化学染色（IHC）やウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルでの検証は行わなかった。転写後調節により、mRNAの発現量が高必ずしもタンパク質の量と相関するとは限らないため、これが臨床的所見と公開データベース解析との間の乖離を部分的に説明している可能性がある。また、本研究では長期的な追跡データが不足しており、サブグループ解析（例：扁平上皮癌）の統計的検出力が不十分であった。

今後の展望

今後の研究では、YTHDC2の機能的な役割をより深く理解するために、in vitroおよびin vivo実験を通じてNSCLCにおけるYTHDC2のメカニズムを探索すべきである。知見を検証し、汎用性を高めるためには、より大きなサンプルサイズを用いた多施設共同研究が必要である。加えて、YTHDC2を他のm6A関連調節因子や臨床病理学的変数と統合することで、その予測的および予後的な有用性を向上させることができる可能性がある。YTHDC2の調節異常の根底にある生物学的メカニズムを解明するには、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、エピゲノミクスを含むマルチオミクスアプローチを取り入れたさらなる研究が必要である。また、mRNAとタンパク質発現の整合性を評価するため、免疫組織化学（IHC）またはウェスタンブロッティングによるタンパク質レベルでの検証を行うべきである。再現性と臨床への適用性を確保するためには、サンプル処理および検証手法の標準化も極めて重要となる。

結論

本研究では、バイオインフォマティクス解析と臨床的なqRT-PCRによる検証を統合し、NSCLCにおけるYTHDC2発現の探索的評価を行いました。しかし、解析プラットフォーム間での検出結果に不一致が見られ、診断能も限定的である（AUC ≈0.5）ため、現時点では単独の臨床バイオマーカーとして使用することは困難です。バイオインフォマティクス解析では予後への寄与の可能性が示唆されましたが、独立した臨床検証では、診断または予後予測への適用における信頼性は支持されませんでした。これらの知見は慎重に解釈されるべきであり、臨床応用の検討に先立ち、タンパク質レベルでの解析および機能研究を伴う、より大規模な多施設共同コホートでの検証が必要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カスタムプライマーおよびプローブ	Sangon Biotech Co., Ltd., 上海, 中国	カスタム合成	プライマーおよびプローブ配列は表6に記載
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	ゲノムDNA汚染の除去
ESTIMATEアルゴリズム	Yoshihara et al.	R package (Version 1.0.13)	腫瘍純度の推定
FFPE RNA抽出キット	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	FFPE組織からのRNA抽出
GDCデータポータル	米国国立がん研究所 (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	TCGAデータセットのダウンロード
GEPIAウェブサーバー	北京大学, 中国	http://gepia.cancer-pku.cn	遺伝子発現解析
Kaplan–Meier Plotter	セメルヴェイス大学, ハンガリー	https://kmplot.com	生存解析
マイクロセントリフージ	Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ	5424 R	RNA精製手順
NanoDrop分光光度計	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	RNA定量
プローブベースqPCRマスターミックス	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	定量PCR増幅
R統計ソフトウェア	R Foundation for Statistical Computing, ウィーン, オーストリア	Version 4.4.1	統計解析およびROC解析
リアルタイムPCRシステム	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	定量リアルタイムPCR
逆転写キット	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	cDNA合成
RNA精製カラム	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	HiPure Mini Column I	シリカメンブレンRNA精製カラム
RNaseフリー水	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	RNase-Free Water	RNA溶出
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics Version 27.0	統計解析
survivalROCパッケージ	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Version 1.0.3.1	時間依存性ROC解析
TCGAデータベース	米国国立がん研究所 (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	公開がんゲノムデータベース
洗浄バッファー RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	Buffer RW1	RNA精製用洗浄バッファー
洗浄バッファー RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., 広州, 中国	Buffer RW2	RNA精製用洗浄バッファー