オリゴヌクレオチド送達を評価するモデルとしてのヒト誘導多能性幹細胞由来カルディオイド

サマリー

このプロトコルにより、ヒト誘導多能性幹細胞から自己組織化心筋細胞ベースの心型細胞を生成し、蛍光標識オリゴヌクレオチドの吸収を顕微鏡的に評価することが可能になります。

要約

オリゴヌクレオチドベースの治療薬は、心血管疾患の治療に大きな可能性を持つ急速に進化している薬剤のクラスです。しかし、心臓組織への効率的な投与を達成することは依然として重要で未解決の課題です。主な障害は、オリゴヌクレオチド細胞の取り込みと細胞内分布の定量的評価を支援できる、強固で生理学的に関連性の高いヒトin vitro モデルの入手が限られていることです。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から自己組織化3Dカルディオイドを生成し、それをプラットフォームとして蛍光標識オリゴヌクレオチドの取り込みを評価するための詳細なステップバイステッププロトコルを提示します。このプロトコルは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を時間的に変調することで、懸濁培養における指向性心の分化をユーザーに導き、中胚葉、心臓中胚葉、心筋細胞の前駆体段階を通じてiPSCを順次的に指定できるようにします。このような条件下で、細胞は自発的に自己組み立てを行い、心臓の典型的な心筋細胞マーカーを表現する三次元構造を形成します。その結果生まれたカーディオイドは、オリゴヌクレオチドの取り込み効率を画像診断で評価するための拡張可能で実験的に扱いやすいプラットフォームを提供し、心臓応用のための送達戦略の開発と最適化を支援します。

概要

主にアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)と小さな干渉RNA(siRNA)を含むオリゴヌクレオチドベースの治療薬は、遺伝性および後天性疾患を含む幅広い疾患の治療において、変革的かつ高度に特異的なアプローチとして急速に注目されています。^1,2,3。これらのモダリティは、標的転写産物への配列特異的結合を通じてmRNAレベルで遺伝子発現を直接調節することを可能にします。これにより、従来の小分子治療では得られない疾患関連遺伝子の遺伝子サイレンシングやスプライシング補正が可能^{となります。}したがって、オリゴヌクレオチドベースの遺伝子治療薬は、心血管疾患を含む複数の疾患領域にわたる多様な病原性機構を標的とする多用途なプラットフォーム^{を提供します。}これまでに、ASOs、siRNA、スプライススイッチング薬など複数のオリゴヌクレオチドベースの治療薬が^{臨床利用として}承認されています7。この進展にもかかわらず、前臨床および臨床の両方での治療効果は、非効率な^細胞内送達により制約が続いています。現在の推定では、内部化されたオリゴヌクレオチドのうち1%未満がエンドソーム区画から細胞質に到達し標的RNAに作用し、^{機能活性を}制限^{しています。}この制限は特に心臓組織で顕著で、取り込みや細胞内輸送が十分に理解されていません。

歴史的に、心血管治療薬の前臨床評価は主に動物モデルに依存してきましたが、これらは薬物動態学、生体分布、有効性、生 体内での安全性評価に欠かせません。しかし、心臓生理学、遺伝子調節、細胞応答における重要な種間差異が、ヒトにおける治療効果や毒性の正確な予測能力をしばしば制限しています。これらの制約により、生理学的関連性が向上したヒトベースの in vitro モデルの開発が促進されました。その中でも、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)技術は、心血管疾患モデルに革命をもたらし、心血管系譜に分化可能なほぼ無限の細胞源を提供しました。ヒトiPSC由来心筋細胞(iPSC-CMs)は、ヒト心筋の分子的、構造的、機能的特性の多くを再現しており、疾患メカニズム、薬物反応、新興治療法の研究において広く採用されたプラットフォームとなっています¹¹。しかし、従来の二次元培養によるヒトiPSC-CMには重要な限界があります。ほとんどの分化プロトコルは胎児細胞に似た心筋細胞を生成し、未成熟な構造的、電気生理学的、代謝的、収縮性を示す¹²。

さらに、単層培養には三次元(3D)組織構造、多細胞相互作用、細胞外マトリックスの組成が欠けており、 これらは生体内で心筋細胞の機能に影響を与えるものです。これらの課題に対応するため、ますます高度な3D心臓モデル^{が開発されています}。その中でも、iPSC-CMを生体材料の足場に埋め込み機械的・電気的刺激を施すことで生成される人工心臓組織(EHT)は、構造的および機能的成熟を促進し、心筋の生体力学的環境をより忠実に再現します¹³。EHTは疾病モデリングや薬物試験において生理学的に非常に関連性の高いプラットフォームを提供しますが、その生成には通常、専門的なバイオエンジニアリングの専門知識と専用機器が必要です。一方、 生体外 の心臓組織スライスは、ネイティブ組織構造と細胞組成を最も忠実に保存しますが、一次心組織へのアクセスに依存し、培養での生存可能性が限られ、容易に拡張性が低いです。

近年では、心臓オルガノイドが心臓組織の組織構造^や機能の重要な側面を再現するアクセス可能な3Dモデルシステムとして登場しています。心型細胞は、主に心筋細胞から構成される自己組織型の心臓オルガノイドであり、内在的な特化、空間パターン化、形態形成を経て、チャンバー状で空洞を含む構造を形成します(^15,16)。心型細胞形成の方法は、通常、Wntシグナルの初期活性化によって中胚葉の指定を誘導し、その後の抑制によって心臓系統のコミットメントを促進することに依存します。カルディオイドは静的または攪拌された懸濁培養のいずれかで生成可能であり、これによりスケーラブルな生産を支援し、組織の自己組織化を促進します(15,16,17,18,19)。内皮、心外、その他の細胞タイプを含むより複雑な多系統心オルガノイドは生理学的関連性をさらに高めますが、より複雑な分化プロトコル、より長い培養期間、そして広範な最適化が必要です^13,14。

ヒトiPSCから自己組織化心筋細胞ベースの心型細胞を生成し、蛍光標識オリゴヌクレオチドの取り込みを評価するための簡潔で再現性があり効率的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、心血管応用のためのオリゴヌクレオチドの化学および送達戦略の最適化を目指す研究者にとって有益なものとなるはずです。本研究で使用されるすべての材料は 材料表に記載されています。

プロトコル

1. 分化のためのiPSCの培養と調製

注意:細胞および培地のオープン取り扱いは、認定クラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行ってください。白衣と手袋を着用してください。作業面や液体廃棄物は適切な消毒剤で除染してください。

1. iPSCを維持しましょう。
   1. 製造元の指示に従い、適切な基底膜マトリックスを用いた被膜培養プレートを用いてください。
   2. iPSCには定められたフィーダーフリー多能性幹細胞培地を投与し、培地は24時間ごとに交換します。
   3. 培養を過剰結合以下に保ち、細胞が70〜80%の結合に達したら通過します。
      注意:分化を開始する前に、iPSCが高品質で未分化の形態を保持し、マイコプラズマフリーであることを確認してください。
2. 分化前パッシング。
   1. iPSCを解凍し、細胞を拡張してから心の分化を開始します。
   2. 酵素フリー解離法であるPBS-EDTAを用いたパッセージ細胞で、iPSC維持と適合しています。
      一時停止点:iPScは培養中に70〜80%の合流率に達し、自然分化の兆候なしに典型的な形態を保持するまで維持します。

2. マイクロウェルプレートにおけるiPSC骨材の製剤

1. iPSCを単細胞懸濁液に解離します。
   1. 培地を吸引し、1×PBS1mLで細胞を洗浄します。
   2. 細胞剥離液(アキュターゼ)を6ウェルプレートのウェルごとに500μL加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。
   3. 1ウェルごとに1.5mLの洗浄培地を加え、優しく再懸浮させて単細胞懸濁液を生成します。
   4. 懸濁液を15mLの円錐形チューブに移し、室温で200× g の遠心分離機で3分間処理します。
   5. 上清液を吸引し、細胞ペレットを給餌者なしiPSC培地に再懸濁し、ROCK阻害剤(最終10μM)を補足します。
      注意:各iPSCラインの解離潜伏時間を調整し、剥離を5分で確認し、必要に応じて短時間で延長してください。
2. セル数を数え、メッキ密度を準備します。
   1. 標準的な細胞計数法を用いて生存可能な細胞を数えます。
   2. 800μmマイクロウェル集体プレート(24ウェル形式、~300マイクロウェル/ウェル)の各ウェルに対して、0.9×10⁶ Cell/mLの単一細胞懸濁液を準備します。
      注意:iPSCラインごとに集合体サイズや分化効率が異なるため、ウェルごとのセル数を最適化してください。
3. マイクロウェルプレートをプライマーし、気泡を取り除きます。
   1. 各ウェルにROCK阻害剤を含むフィーダーフリーiPSC培地(最終10μM)500μLを加えます。
   2. マイクロウェルプレートを室温で300× gで遠心分離し、マイクロウェルの空気泡を取り除きます。
      重要事項:すべての気泡を完全に除去し、各マイクロウェルの底部に均等な細胞沈着を可能にし、効率的な骨材形成を支えること。
4. iPSCをマイクロウェルにシードします。
   1. 各ウェルに1.0 mLの単一細胞懸濁液(0.9 × 10⁶ cells/mL)を加え、1ウェルあたり0.9 × 10⁶ cellsに相当します。
   2. P1000を使って井戸内で3〜5回優しく再懸浮し、気泡の侵入を避けてください。
   3. 200× g で室温で3分間遠心分離し、マイクロウェルにセルをペレット状に注入します。
   4. 細胞がマイクロウェルに沈殿しているか顕微鏡で確認し、プレートを37°Cで5%のCO₂で24時間置く。
      重要な点:遠心分離後はプレートを慎重に扱うこと。プレートをかき混ぜたり揺らしたりしないでください。これにより細胞がマイクロウェルから浮き上がる恐れがあります。

3. マイクロウェルにおけるiPSC集合体の拡張

1. 骨材を乱したり剥がしたりしないまま、慎重に吸引して培地を交換してください。
   1. プレートを傾け、P1000ピペットを使って各ウェルから約1.0mLの培地をゆっくり吸引し、集合体がマイクロウェル内に固定されていることを確認します。
   2. 残りの500μLの培地をP1000ピペットでゆっくり吸引します。
   3. 各ウェルに給餌フリーiPSC培地1.5mLを、血清学ピペットを使ってゆっくりと滴入します。
   4. 37°C、5%のCO₂で培養し、培地の交換を毎日繰り返します。
      重要事項:油井の壁に媒体を供給し、骨材への直接流を避けてください。

4. iPSC集合体の心臓分化(0日目から12日目)

1. 中胚葉誘導(0日目)。
   1. ペース3.1.1–3.1.2に記載されている穏やかな吸引法で培地を除去します。
   2. 基礎培地1ウェルあたり1.5mLを追加し、インスリンを差し引いた2%のB27とWnt/βカテニン経路活性化剤(CHIR99021、最終濃度:11μM)を補足します。
      注意:グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3(GSK-3)の小分子阻害剤であるCHIR99021の10 mMストック溶液を準備してください。最終濃度11 μMを得るには、1.65 μLのストック溶液を1.5 mLの培地に加えます。
2. 誘発分娩後の中間変化(1日目)。
   1. CHIR99021を加えてから24時間後に、各ウェルから培地を優しく吸引します。
   2. 1ウェルあたり1ウェルに新鮮な基礎培地1.5mLを加え、2%のB27からインスリンを差し引いた状態で48時間培養します。
      重要:Wnt変調のタイミングを厳守してください。偏差は微分効率を損なう可能性があります。
      注意:Wnt/βカテニン経路活性化剤への曝露後には、一部の細胞死が予想されます。もし広範な骨材損失が観察された場合は、今後の実験で活性化剤濃度を下げることを検討してください。
3. WNT抑制による心臓コミットメント(3日目)。
   1. 各ウェルから使用済み培地760μLを無菌50mL円錐管に移して調製培地を準備します。
   2. 各ウェルごとに、2%のB27からインスリンを差した新鮮な基礎培地760μLをプールされた培地のチューブに加え、優しく混ぜます。
   3. Wnt経路阻害剤IWP4を混合培地に最終濃度5μMまで加え、チューブを数回優しく反転させて混合します。
   4. 各ウェルから残りの培地を慎重に吸引し、調整培地1ウェルにIWP4を補足して1.5mLを加えます。
   5. 37°Cで5%のCO₂を含んで48時間孵育します。
      注:Wnt経路阻害剤IWP4の1 mMストック溶液を準備してください。最終濃度5μMを得るために、各ウェルごとに1.52mLの総培地(760μLの調整培地+760μLの新鮮基礎培地)に対して7.6μLのストック溶液を加えます。
4. マイクロウェルの中変化(5日目)。
   1. 中質をステップ3.1.1–3.1.2で説明した穏やかな吸引法で置き換えます。
   2. 各ウェルに2%のB27からインスリンを差した基礎培地1.5mLを加え、37°Cで5%のCO₂を含んで48時間培養します。
5. マイクロウェルから6ウェルプレートへの骨材移送(7日目)。
   1. 各井戸から培地を慎重に吸引し、ステップ3.1.1–3.1.2に記載された穏やかな吸引法を用います。
   2. マイクロウェルプレートの各ウェルに、2%のB27をインスリンを補足した基礎培地1.0mLを加えます。P1000ピペットを使い、培地を優しく上下に5回ピペットしながら、ピペットの先端を円を描くようにウェル表面を移動させ、マイクロウェル内の凝集体を外して懸濁液に移します。
   3. 骨材懸濁液を未処理の6ウェル培養プレートの単一ウェルに移します。
   4. マイクロウェルプレートの各ウェルを、残った骨材を回収するために追加で1.0 mLの新鮮培地で2〜3回洗浄し、各リンスを6ウェルプレートの同じウェルに移します。
   5. 37°Cで5%のCO₂を含んで72時間培養します。
      注意:骨材移植後に死んだ細胞や細胞の破片が存在することが予想されます。ほとんどのゴミはその後の培地交換で除去されます。
6. 懸濁培養中の中間変化(10日目)。
   1. 緩く付着した骨材を外すために、板を優しくかき混ぜます。
   2. 板を傾けて骨材が重力で井戸の底に沈殿するようにします。
   3. 使用済みの培地を慎重に吸引し、骨材を乱したり吸引したりしないでください。
   4. 各ウェルに2%のB27をインスリンを補足した新鮮な基礎培地2.0mlを加え、37°Cで5%のCO₂を48〜72時間培養します。
      注:自然発動は通常、約10日目以降に観察されます。
      一時停止点:打動型カルディオイドは、2〜3日ごとに培地を交換することで懸濁培養で長期成熟を維持できます。

5. カルディオイドの顕微鏡的特徴付け

注:この方法は、クリオ切開を用いた心肌の組織学的特徴付けのためのワークフローを提供します。得られた切片は、ヘマトキシリンやエオシン(H&E)染色による組織全体の構造評価や、心筋細胞の同一性を評価する免疫蛍光標識など、さまざまな組織学的解析に利用できます。

1. 固定と冷凍解剖。
   1. カルジオイドを4%パラホルマルデヒドに4°Cで一晩固定します。
      注意:パラホルマルデヒドは有毒で発がん性の可能性が高いです。適切な個人用防護具を着用し、化学換気フード内で取り扱ってください。すべてのパラホルマルデヒド含有廃棄物(固定剤および洗浄剤)を、アルデヒド/化学有害廃棄物用に明確にラベル表示された容器に収集し、機関の有害廃棄物手順に従って処分してください。
      安全:すべてのパラホルマルデヒド固定および取り扱いは、適切な個人用防護具を着用したまま化学煙幕フード内で行ってください。
   2. PBSで3回洗浄し、固定されたカディオイドをPBSに浸して30%(w/v)のクオースに浸して4°Cで一晩かけます。
   3. カルディオイドをゼラチンに埋め込み、冷凍し、厚さ10μmのクライオセクションを顕微鏡スライドに切断しました。使用まで−20°Cの状態で保存してください。
2. 免疫標識。
   1. 区画を室温で15分間解凍します。
   2. 37°CのPBSで10分間、2回洗います。
   3. 各スライドの関心領域を疎水性ペンで丸で囲み、ブロッキング液と抗体溶液を保持する井戸を作ります。
   4. 切片を2〜3分間、透過バッファー(PB)で再水和します。コプリンの瓶に0.1%のトゥイーン-20を含むPBSです。
   5. スライドをPBから取り出し、余分な溶液を排出してから、湿ったチャンバーにスライドを置きます。
      重要な点:ここからは、断片を乾燥させないことが非常に重要です。
   6. 切片を5%胎児用牛血清(FBS)を含む200〜300μLのPBで、室温の湿度の高いチャンバーで90分間ブロックします。
   7. ブロッキング溶液を除去し、切片を4°Cで一晩インキュベートし、100μLの一次抗体(抗cMYBP-C;1:50)をブロッキング溶液(PB含有1%FBSを含むPB)で希釈しました。
   8. スライドをPBで3回洗浄し、室温で緑色蛍光抗マウス二次抗体(1:200)、遠赤蛍光ファロイジン(1:400)、DAPI(1 μg/mL)と共に2時間インキュベートします。
   9. PBで3回洗い、アンチフェードマウントメディウムで取り付けます。
      注意:蛍光染料を含む溶液(二次抗体、ファロイジン、DAPI染色液および対応する洗浄液)をすべて容器に収集し、機関のガイドラインに従って化学廃棄物として処分してください。
3. 画像取得。
   1. 10×および63×/1.40の油浸注対物レンズを用いた超分解能画像用のアレイ検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を取得します。
   2. 遠赤色蛍光色素、緑色蛍光色素、核染色をそれぞれ4.0%、4.0%、1.0%のレーザー透過率で639 nm、488 nm、405 nmのレーザーラインで励起します。
   3. ピクセルサイズ0.0353×0.0353^μm²、単方向走査、スキャン速度6、ズーム1.7、ライン平均1、ピクセル滞留時間0.935μsの単一光学セクションを取得できます。
   4. 自動ウィーナーフィルタリングを用いたアレイ検出器の超高解像度画像処理を適用します。

6. 蛍光オリゴヌクレオチド取り込みアッセイ

1. 脂溶性を高めるために、パルミチン酸に共役した蛍光標識オリゴヌクレオチドのストック溶液を準備します。
   1. ヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥蛍光標識オリゴヌクレオチドを最終濃度1 mMに再構成します。一時的に渦を流し、3,000 × g で30秒間遠心分離してチューブの底に溶液を回収します。
   2. 1 mMのストック溶液を使い捨てにアリコートを準備し、光から保護して−20°Cで保存します。
   3. 実験当日、1 mMストック1 μLを1 mLのカルジオイド培養培地に加え、最終オリゴヌクレオチド濃度1 μMを得ます。優しいプレート攪拌で混合します。
2. 蛍光標識オリゴヌクレオチド(最終濃度1μM)を、血清不使用培地37°C、5%のCO₂で24時間培養します。
3. カルジオイドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、細胞外オリゴヌクレオチドを除去します。
4. カルジオイドを4%パラホルムアルデヒドに室温で20分間固定し、PBSで3回洗い、蛍光標識を続けて画像処理を行います。
5. 光から保護された状態で、5 μg/mLの小麦胚細胞凝集素(WGA)と緑色蛍光素と1 μg/mL DAPIを共役したPBS中に、完全な固定カルディオイドを4°Cで一晩インキュベートします。PBSで3回洗い、アンチフェードマウンティングメディウムでマウントします。
   注意:ステップ6.2の標識付きオリゴヌクレオチド培養培地およびWGA/DAPI染色液を含むすべてのオリゴヌクレオチドおよび蛍光染料を含む培地および洗浄液は別の容器に収集し、機関ガイドラインに従って化学・生物有害廃棄物として処分してください。
6. オリゴヌクレオチドの取り込みと分布の共焦点画像を取得します。
   1. 超分解能撮影用のアレイ検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡と40×の水浸式対物レンズを用いて共焦点画像を取得します。画像を8セクションのZスタックとして取得し、zステップサイズは2μm、総深さは16μmをカバーします。
   2. 核染色、膜マーカー、遠赤色蛍光標識オリゴヌクレオチドを、それぞれ0.9%、0.2、3.0%のレーザー透過率で405 nm、488 nm、639 nmレーザーラインを励起します。
   3. ボクセルサイズが0.0449×0.0449×^2μm3、双方向走査、スキャン速度5、ライン平均1、ピクセル停留時間1.51μsの画像を取得します。自動ウィーナーフィルタリングを用いたAiryscan/超解像度画像処理を適用します。
   4. すべてのz位置およびすべての試料で取得設定(レーザー出力、検出器利得、zステップ、ボクセルサイズ)を一定に保ち、条件間のオリゴヌクレオチド信号の有効比較を可能にします。

結果

図1 は分化ワークフローをまとめ、iPSCの凝集から自己組織化心型の形成までプロトコルの各段階で期待される特徴的な形態変化を示しています。サスペンションベースのマイクロウェル集約は、多数のサイズ制御されたカーディオイドを並列生成するためのシンプルかつ標準化されたアプローチを提供します。成功した分化は、均一な大きさの集合体が生成され、その後内部空洞の発生と自然発生的な打動の開始によって特徴づけられ、通常は10日目頃から始まります。これらの形態的特徴は、心型生成の効率性と再現性を評価するための実用的な品質管理チェックポイントを提供します。

心型構造や組織組織は、クライオセクションの組織学的解析によって評価できます。 図2に示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色で成功裏に分化したカルディオイドは、1つ以上の内部空洞を形成し、その周囲にコンパクトな細胞層が入ったよく組織化された三次元組織を明らかにし、チャンバー状の組織と一致します。成功したカルディオイドは通常、壊死領域がなく、構造的断片化も最小限です。対照的に、最適でない分化はしばしば不規則または崩壊した構造を生み出し、識別可能な空洞を欠き、組織自己組織化の障害を示します。

心筋細胞の分化は、クライオセクションの免疫蛍光染色によってさらに評価できます。 図3A–Bに示すように、成功した心型は筋節マーカーcMYBP-Cの広範な発現を示し、筋節特有の高度に秩序ある周期的な条紋に組織されています。これらの条紋状構造は組織全体に広く分布しており、心筋細胞の縦軸に沿って整列していることが多く、効率的な心臓分化を反映しています。対照的に、最適でない心型は弱く、斑点的、または局所的に制限されたサルコメリック染色を示し、しばしば末梢に限定され、検出可能な信号のない広範囲の領域も存在し、心筋細胞の分化が非効率であることを示しています。

蛍光標識オリゴヌクレオチドの取り込みは、生細胞イメージングまたは固定型カルディオイドの共焦点顕微鏡で評価できます。 図4に示されているように、成功した取り込みは、細胞内オリゴヌクレオチド関連蛍光が離散的なプンクタとして分布しやすく検出されることで特徴づけられ、エンドソームの局在と一致します。WGAは細胞膜を区分し、DAPIは核をカウンター染色することで細胞内オリゴヌクレオチドの局在確認を可能にします。オリゴヌクレオチドの取り込みの定性的可視化に加え、取得した画像スタックは、点あたりの蛍光強度、細胞あたりの点数、オリゴヌクレオチド陽性細胞の割合などの定量解析にも利用できます。 図5A–Cに示されているように、Zスタックイメージングはさらに、三次元組織全体にわたるオリゴヌクレオチド分布の評価を可能にし、表面から心軸内部にかけて複数の光学断片にまたがる蛍光を検出することで、効果的な組織浸透を示しています。

図1:ヒトiPSC由来の心型細胞生成のワークフロー。 ヒト誘導多能性幹細胞(iPSCs)はマイクロウェルプレート(Day−2)に集約され、Wntシグナル伝達の時間的調節による指向性心分化を受けます。中胚葉誘導は、0日目に基礎培地中のWnt経路アクチCHIR99021ベーターをB27-インスリンで補足し、1日目にアクチベーターを除去することで開始されます。心臓スペギーは、Wnt経路阻害剤IWP4による治療で3日目に誘導され、5日目に除去されます。7日目に集合体は6ウェルプレートに移され、インスリンを含むB27を補足した基底培地で維持されます。14日目までに自己組織化カルジオイドが確立され、オリゴヌクレオチド取り込みアッセイなどの下流応用に適しています。この画像は著者がBiorenderを使用して作成しており、必要な著作権ライセンスが付加されています。指定された時刻点で取得された代表的な明視野画像は、均一なサイズのiPSC集合体からキャビテーション型で自己組織化する心型への形態的進行を示しています。スケールバー=500μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2:ヒトiPSC由来のカルディオイドの組織学的特徴付け。 14日目の心電球体の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の冷凍切開で、内部空洞が緻密な細胞層に囲まれており、チャンバー状の組織構造と一致している。画像はイメージング顕微鏡を用いて取得されました。分化アウトカムの定量化では、心型の2.6%±94.0%が自発的な拍動を示し、60.3%±20.6%が1つ以上の目に見える内腔を含んでいました。データは3つの独立した分化から得られる平均±SDとして提示され、各分化ごとに約115の心電素が解析されています。スケールバー=100μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:心筋細胞分化の免疫蛍光特性解析。 14日目の心臓の代表的なクリオセクシング。(A) 細胞核の分布を示すDAPI染色。(B) 免疫蛍光画像で、DAPI(青)で標識された核と、心臓ミオシン結合タンパク質C(cMYBP-C、緑)に対する抗体で標識されたサルコメアを示し、分化した心筋細胞に組織化されたサルコメリック構造が示されました。画像はレーザースキャン共焦点蛍光顕微鏡で取得され、左は10×/0.30の対物レンズ、右は63×/1.40の油浸け物レンズを用いました。スケールバー=10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:カルディオイドによるオリゴヌクレオチド取り込みのイメージング。 14日目のカルディオイドにおける蛍光標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO、黄色)の細胞内局在を示す共焦点画像。細胞膜は蛍光小麦胚凝集素(WGA、マゼンタ)で標識され、核はDAPI(青)で染色されます。ASO関連蛍光は、細胞内の離散的な点(矢印)として検出されます。下部パネルには蛍光ASOでインキュベートされていない陰性対照カルディオイドが示されています。右側のパネルの画像は、左側のパネルのボックス領域の高倍率ビューに対応しています。代表的な画像は、40×の水浸水対物レンズを用いたアレイ検出器超分解能イメージングを用いたレーザー走査共焦点顕微鏡で取得されました。スケールバー=左10μm、右5μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:オリゴヌクレオチドの心電波浸透の評価。 (A) 心型内部の深さが増すにつれて光学断面を取得する図式。この画像は著者がBiorenderを使用して作成しており、必要な著作権ライセンスが付加されています。(B) 組織表面に対して0 μm、6 μm、10 μmのz位置における蛍光標識ASOの分布を示す代表的な共焦点画像。画像設定はすべてのz位置で一定に保たれました。スケールバー=10μm。(C) 各画像深さで少なくとも1つのASO関連点シグナルを含む細胞の割合を定量化すると、組織全体でオリゴヌクレオチドの取り込みがほぼ一致し、0 μm、6 μm、10 μmでそれぞれ83.1 ± 2.5%、84.9 ± 4.5%、84.0 ± 4.5%のASO陽性細胞が示されました。データは3つの心±の平均SDとして提示され、各心電球体あたり3つの光学断片が解析され、合計1,305個の細胞が定量化されています。代表的な画像は、40×の水浸水対物レンズを用いたアレイ検出器超分解能イメージングを用いたレーザー走査共焦点顕微鏡で取得されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ビデオ1:タイムラプスシークエンス。 40フレーム毎秒で撮影された映像は、心電波における自発的な収縮活動を示しています。画像化はsCMOSカメラを搭載した広視野顕微鏡を用いて行われました。このビデオをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

オリゴヌクレオチドベースの治療薬は、オリゴヌクレオチド化学の数十年にわたる進歩によって支えられ、標的特異性、代謝安定性、免疫原性の容容性が向上した強力な遺伝子標的モダリティのクラスとして登場しました^7,8。臨床的に承認されたRNA治療薬の数が増加しているにもかかわらず、その広範な応用は非効率的な細胞内送達により制限されています^7,8。その大きさ、電荷、親水性のため、オリゴヌクレオチドは細胞膜を受動的に拡散できず、代わりにエンドサイトーシス^{経路を通じて}内部化^{されます。}取り込み後、内部化されたオリゴヌクレオチドの大多数(~99%)はエンドソーム区画内に隔離されたまま^です。エンドソーム輸送は、初期から後期エンドソーム、そして最終的にリソソームへと成熟する過程を経て進みます。しかし、オリゴヌクレオチドが細胞質に逃げ出す正確な区画は完全には解明されておらず、複数のエンドソーム集団が関与している^{可能性があります。}この限定的な細胞質放出は重要な速度制限障壁であり、オリゴヌクレオチドの取り込み、細胞内輸送、エンドソーム逃逸の定量的評価を可能にする生理学的に関連性の高い実験システムの必要性を強調し^{ています。}

ここで説明するプロトコルは、ヒトiPSC由来のカルディオイドと画像診断によるオリゴヌクレオチド取り込みの読み取りを組み合わせることで開発されました。このシステムの堅牢性は、再現性や実験結果に直接影響を与えるいくつかの重要なステップに依存しています。第一に、開始iPSC培養の質が心臓分化の成功を決定づける重要な要素です。著者らは、長期的なゲノム安定性を確保するための定期的な核型解析と、コロニー形態、完全性、成長動態の定期的な評価を推奨しています。高品質な培養は、緻密で明確に定義されたコロニーを持ち、滑らかな境界、最小限の自発分化、そして一貫した増殖が特徴です。不規則なコロニーエッジ、異質な細胞形態、または分化領域を示す培養は、分化を開始する前に廃棄し、低通過凍結ストックに置き換えるべきです。

第二の重要なステップは、マイクロウェルプレートを用いたiPSC集合体の制御形成であり、これにより再現可能な心臓分化に不可欠な均一でサイズ定義された三次元構造の生成を促進し^ます。マイクロウェルベースの凝集により、定義された直径(最適200–230μm)を持つ胚体が生成され、細胞間相互作用やWntシグナル伝達の時間的変調における形態原勾配への曝露を標準化します。私たちの経験では、このサイズは1つのマイクロウェルあたり約3,000個の細胞をシーディングすることで一貫して達成されており(ステップ2.2)、この条件は複数のヒトiPSC系統、市販株や社内で再プログラムされた系統を含む経験的に最適化・検証されました。しかし、iPSCの増殖速度は変動するため、最適な播種密度は望ましい骨材サイズを維持するために調整が必要になることがあります。これらのパラメータを制御できないと、構造の不均一化、生存率の低下、分化効率の低下につながる可能性があります。

図2に示される組織学的解析は、心型形成の質管理評価に便利な手段となります。特に、内部空洞の欠如や崩壊・断片構造の存在は、分化段階におけるWntシグナル伝達の時間的制御が最適でないか、最適でない集まり形成を示している可能性があります(ステップ4.1–4.3)。一部の失敗した分化では、非収縮性細胞群が心状細胞の内部または周囲に現れることもあります。これらの細胞は通常、明視野顕微鏡で黄色がかったように見え、低付着型培養皿に付着する傾向がありますが、心筋細胞豊富な心型細胞は一般的に灰色で、コンパクトな三次元構造のままで、容易に付着しません。骨材のかなりの割合がこの非収縮性の付着表現型を示す場合、その分化は最適とは言えません。その場合、トラブルシューティングは分化前のiPSCコロニー形態の確認、Day −1からDay 0までの集合体サイズの確認、必要に応じて特定のiPSC系統のシーディング密度およびCHIR99021およびIWP4濃度の再最適化から始めるべきです。

10日目から12日目までの低または全くない自発拍動は、通常、非効率的な中胚葉誘導や心臓の特定を反映しており、最も一般的にはWnt調節因子の濃度やタイミングの不適切な、または治療後の過剰な細胞死(ステップ4.2)CHIR99021原因です。私たちの経験では、各iPSCラインごとに9〜13μMの範囲で滴CHIR99021定し、ストック溶液の濃度と活性を検証することで、分離効率を大幅に向上させることができます。 図3に示されるサルコメリックタンパク質組織の免疫蛍光解析は、心筋細胞分化の質管理を容易に評価する手段となります。特に心筋の末梢に限定される弱いまたは斑状のサルコメリックタンパク質染色は、一般的に心筋細胞の不完全または異質な分化を示しています。このような場合、固定前の懸濁培養成熟期間(ステップ4.6および一時停止点)を延長し、固定および抗体染色の状態を確認することが推奨されます。

この心臓モデルは、従来の二次元心筋細胞培養を大幅に改良した三次元のヒト心臓微小環境を提供しますが、成人のヒト心臓の複雑さを完全に再現しているわけではありません。心筋細胞は人間の心臓発育の初期段階を示し、心筋細胞は未成熟で胎児に似た^表現型を保持します。さらに、組織には血管灌流、神経支配、常駐免疫細胞、成熟心筋の完全なチャンバー特異的構造が欠けています。したがって、このプラットフォームは制御された実験条件下でオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みおよび細胞内分布の調査に適していますが、取り込み速度論や送達機構を直接生 体内 環境に外投影する際は注意が必要です。今後、追加の心臓細胞タイプ、血管ネットワーク、組織成熟戦略の導入により、このプラットフォームの生理学的関連性がさらに高まるはずです。

本プロトコルで記述されるカルディオイドによるオリゴヌクレオチド取り込みの信頼性向上には、 図4 および 図5に示されるように、ASO濃度、培養時間、画像取得設定の最適化と標準化が必要です。蛍光色素の選択は特に重要で、染料は明るさ、光安定性、環境影響に対する感度が異なるためです。本研究では、ジャネリア・フルオ66(JF646)²²という遠赤色のシリコン・ロダミン蛍光素を用い、高輝度と光安定性を持ち、三次元試料における組織の自己蛍光を最小限に抑えつつ堅牢な信号検出を提供しました。これらの特性により、生カルディオイドや固定型カルディオイドでのオリゴヌクレオチドのイメージングに適しています。特に、蛍光色素の共役はオリゴヌクレオチドの取り込みや輸送を含む挙動に影響を与えるため、各実験システムごとに検証されるべきです。

現在の形態では、このプロトコルはオリゴヌクレオチドの取り込みを質的かつ定量的に評価します。細胞内ASO関連点の共焦点イメージングにより、心細胞内のオリゴヌクレオチド局在の可視化が可能となり、取り込み効率はFiji/ImageJのCell Counterプラグインを用いてASO陽性細胞の割合を手動で測定することで定量化されます。この手法はここで提示する中程度のスループット解析に適していますが、手動画像解析は労力がかかり、特に大規模なデータセットに適用した場合、観測者のバイアスを受けやすいことがあります。三次元顕微鏡における自己教師ありディープラーニングの最近の進展は、これらの制約を克服する有望な機会を提供しています。AIベースの画像解析は、複雑な三次元環境下で異質な細胞内構造を正確に区分、同定、追跡し、オリゴヌクレオチドの取り込みや細胞内輸送、エンドソーム動態を含む細胞内輸送の自動定量化を可能にします²³。これらの手法を将来のプロトコル実装に取り入れることで、スループット、再現性、分析精度の向上が期待されます。

今後、ヒトiPSC由来のカルディオイドと定量イメージング、機械学習に基づく画像解析、単一粒子手法の統合は、ヒト心組織におけるオリゴヌクレオチドの送達メカニズムを調査する強力な枠組みを提供します。生理学的に関連性の高い三次元心臓モデルと、細胞内組織や動態を解明できる高度な解析ツールを組み合わせることで、オリゴヌクレオチドの取り込み、細胞内輸送、そして適切な補完的アッセイを用いてエンドソーム脱出の包括的な定量的特徴解析が可能になります。このような統合的アプローチは、送達効率を決定する要因の体系的な同定を促進し、オリゴヌクレオチド化学や送達体の合理的な最適化を支援し、心血管疾患の文脈で新たなオリゴヌクレオチド治療薬を評価するためのスケーラブルなプラットフォームを提供することが期待されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021