このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

オリゴヌクレオチド送達を評価するモデルとしてのヒト誘導多能性幹細胞由来カルディオイド

219 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

2026年8月11日

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルにより、ヒト誘導多能性幹細胞から自己組織化心筋細胞ベースの心型細胞を生成し、蛍光標識オリゴヌクレオチドの吸収を顕微鏡的に評価することが可能になります。

要約

オリゴヌクレオチドベースの治療薬は、心血管疾患の治療に大きな可能性を持つ急速に進化している薬剤のクラスです。しかし、心臓組織への効率的な投与を達成することは依然として重要で未解決の課題です。主な障害は、オリゴヌクレオチド細胞の取り込みと細胞内分布の定量的評価を支援できる、強固で生理学的に関連性の高いヒトin vitro モデルの入手が限られていることです。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から自己組織化3Dカルディオイドを生成し、それをプラットフォームとして蛍光標識オリゴヌクレオチドの取り込みを評価するための詳細なステップバイステッププロトコルを提示します。このプロトコルは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を時間的に変調することで、懸濁培養における指向性心の分化をユーザーに導き、中胚葉、心臓中胚葉、心筋細胞の前駆体段階を通じてiPSCを順次的に指定できるようにします。このような条件下で、細胞は自発的に自己組み立てを行い、心臓の典型的な心筋細胞マーカーを表現する三次元構造を形成します。その結果生まれたカーディオイドは、オリゴヌクレオチドの取り込み効率を画像診断で評価するための拡張可能で実験的に扱いやすいプラットフォームを提供し、心臓応用のための送達戦略の開発と最適化を支援します。

概要

主にアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)と小さな干渉RNA(siRNA)を含むオリゴヌクレオチドベースの治療薬は、遺伝性および後天性疾患を含む幅広い疾患の治療において、変革的かつ高度に特異的なアプローチとして急速に注目されています。1,2,3。これらのモダリティは、標的転写産物への配列特異的結合を通じてmRNAレベルで遺伝子発現を直接調節することを可能にします。これにより、従来の小分子治療では得られない疾患関連遺伝子の遺伝子サイレンシングやスプライシング補正が可能となります。したがって、オリゴヌクレオチドベースの遺伝子治療薬は、心血管疾患を含む複数の疾患領域にわたる多様な病原性機構を標的とする多用途なプラットフォームを提供します。これまでに、ASOs、siRNA、スプライススイッチング薬など複数のオリゴヌクレオチドベースの治療薬が臨床利用として承認されています7。この進展にもかかわらず、前臨床および臨床の両方での治療効果は、非効率な細胞内送達により制約が続いています。現在の推定では、内部化されたオリゴヌクレオチドのうち1%未満がエンドソーム区画から細胞質に到達し標的RNAに作用し、機能活性を制限しています。この制限は特に心臓組織で顕著で、取り込みや細胞内輸送が十分に理解されていません。

歴史的に、心血管治療薬の前臨床評価は主に動物モデルに依存してきましたが、これらは薬物動態学、生体分布、有効性、生 体内での安全性評価に欠かせません。しかし、心臓生理学、遺伝子調節、細胞応答における重要な種間差異が、ヒトにおける治療効果や毒性の正確な予測能力をしばしば制限しています。これらの制約により、生理学的関連性が向上したヒトベースの in vitro モデルの開発が促進されました。その中でも、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)技術は、心血管疾患モデルに革命をもたらし、心血管系譜に分化可能なほぼ無限の細胞源を提供しました。ヒトiPSC由来心筋細胞(iPSC-CMs)は、ヒト心筋の分子的、構造的、機能的特性の多くを再現しており、疾患メカニズム、薬物反応、新興治療法の研究において広く採用されたプラットフォームとなっています11。しかし、従来の二次元培養によるヒトiPSC-CMには重要な限界があります。ほとんどの分化プロトコルは胎児細胞に似た心筋細胞を生成し、未成熟な構造的、電気生理学的、代謝的、収縮性を示す12。

さらに、単層培養には三次元(3D)組織構造、多細胞相互作用、細胞外マトリックスの組成が欠けており、 これらは生体内で心筋細胞の機能に影響を与えるものです。これらの課題に対応するため、ますます高度な3D心臓モデルが開発されています。その中でも、iPSC-CMを生体材料の足場に埋め込み機械的・電気的刺激を施すことで生成される人工心臓組織(EHT)は、構造的および機能的成熟を促進し、心筋の生体力学的環境をより忠実に再現します13。EHTは疾病モデリングや薬物試験において生理学的に非常に関連性の高いプラットフォームを提供しますが、その生成には通常、専門的なバイオエンジニアリングの専門知識と専用機器が必要です。一方、 生体外 の心臓組織スライスは、ネイティブ組織構造と細胞組成を最も忠実に保存しますが、一次心組織へのアクセスに依存し、培養での生存可能性が限られ、容易に拡張性が低いです。

近年では、心臓オルガノイドが心臓組織の組織構造や機能の重要な側面を再現するアクセス可能な3Dモデルシステムとして登場しています。心型細胞は、主に心筋細胞から構成される自己組織型の心臓オルガノイドであり、内在的な特化、空間パターン化、形態形成を経て、チャンバー状で空洞を含む構造を形成します(15,16)。心型細胞形成の方法は、通常、Wntシグナルの初期活性化によって中胚葉の指定を誘導し、その後の抑制によって心臓系統のコミットメントを促進することに依存します。カルディオイドは静的または攪拌された懸濁培養のいずれかで生成可能であり、これによりスケーラブルな生産を支援し、組織の自己組織化を促進します(15,16,17,18,19)。内皮、心外、その他の細胞タイプを含むより複雑な多系統心オルガノイドは生理学的関連性をさらに高めますが、より複雑な分化プロトコル、より長い培養期間、そして広範な最適化が必要です13,14。

ヒトiPSCから自己組織化心筋細胞ベースの心型細胞を生成し、蛍光標識オリゴヌクレオチドの取り込みを評価するための簡潔で再現性があり効率的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、心血管応用のためのオリゴヌクレオチドの化学および送達戦略の最適化を目指す研究者にとって有益なものとなるはずです。本研究で使用されるすべての材料は 材料表に記載されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 分化のためのiPSCの培養と調製

注意:細胞および培地のオープン取り扱いは、認定クラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行ってください。白衣と手袋を着用してください。作業面や液体廃棄物は適切な消毒剤で除染してください。

  1. iPSCを維持しましょう。
    1. 製造元の指示に従い、適切な基底膜マトリックスを用いた被膜培養プレートを用いてください。
    2. iPSCには定められたフィーダーフリー多能性幹細胞培地を投与し、培地は24時間ごとに交換します。
    3. 培養を過剰結合以下に保ち、細胞が70〜80%の結合に達したら通過します。
      注意:分化を開始する前に、iPSCが高品質で未分化の形態を保持し、マイコプラズマフリーであることを確認してください。
  2. 分化前パッシング。
    1. iPSCを解凍し、細胞を拡張してから心の分化を開始します。
    2. 酵素フリー解離法であるPBS-EDTAを用いたパッセージ細胞で、iPSC維持と適合しています。
      一時停止点:iPScは培養中に70〜80%の合流率に達し、自然分化の兆候なしに典型的な形態を保持するまで維持します。

2. マイクロウェルプレートにおけるiPSC骨材の製剤

  1. iPSCを単細胞懸濁液に解離します。
    1. 培地を吸引し、1×PBS1mLで細胞を洗浄します。
    2. 細胞剥離液(アキュターゼ)を6ウェルプレートのウェルごとに500μL加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。
    3. 1ウェルごとに1.5mLの洗浄培地を加え、優しく再懸浮させて単細胞懸濁液を生成します。
    4. 懸濁液を15mLの円錐形チューブに移し、室温で200× g の遠心分離機で3分間処理します。
    5. 上清液を吸引し、細胞ペレットを給餌者なしiPSC培地に再懸濁し、ROCK阻害剤(最終10μM)を補足します。
      注意:各iPSCラインの解離潜伏時間を調整し、剥離を5分で確認し、必要に応じて短時間で延長してください。
  2. セル数を数え、メッキ密度を準備します。
    1. 標準的な細胞計数法を用いて生存可能な細胞を数えます。
    2. 800μmマイクロウェル集体プレート(24ウェル形式、~300マイクロウェル/ウェル)の各ウェルに対して、0.9×106 Cell/mLの単一細胞懸濁液を準備します。
      注意:iPSCラインごとに集合体サイズや分化効率が異なるため、ウェルごとのセル数を最適化してください。
  3. マイクロウェルプレートをプライマーし、気泡を取り除きます。
    1. 各ウェルにROCK阻害剤を含むフィーダーフリーiPSC培地(最終10μM)500μLを加えます。
    2. マイクロウェルプレートを室温で300× gで遠心分離し、マイクロウェルの空気泡を取り除きます。
      重要事項:すべての気泡を完全に除去し、各マイクロウェルの底部に均等な細胞沈着を可能にし、効率的な骨材形成を支えること。
  4. iPSCをマイクロウェルにシードします。
    1. 各ウェルに1.0 mLの単一細胞懸濁液(0.9 × 106 cells/mL)を加え、1ウェルあたり0.9 × 106 cellsに相当します。
    2. P1000を使って井戸内で3〜5回優しく再懸浮し、気泡の侵入を避けてください。
    3. 200× g で室温で3分間遠心分離し、マイクロウェルにセルをペレット状に注入します。
    4. 細胞がマイクロウェルに沈殿しているか顕微鏡で確認し、プレートを37°Cで5%のCO₂で24時間置く。
      重要な点:遠心分離後はプレートを慎重に扱うこと。プレートをかき混ぜたり揺らしたりしないでください。これにより細胞がマイクロウェルから浮き上がる恐れがあります。

3. マイクロウェルにおけるiPSC集合体の拡張

  1. 骨材を乱したり剥がしたりしないまま、慎重に吸引して培地を交換してください。
    1. プレートを傾け、P1000ピペットを使って各ウェルから約1.0mLの培地をゆっくり吸引し、集合体がマイクロウェル内に固定されていることを確認します。
    2. 残りの500μLの培地をP1000ピペットでゆっくり吸引します。
    3. 各ウェルに給餌フリーiPSC培地1.5mLを、血清学ピペットを使ってゆっくりと滴入します。
    4. 37°C、5%のCO₂で培養し、培地の交換を毎日繰り返します。
      重要事項:油井の壁に媒体を供給し、骨材への直接流を避けてください。

4. iPSC集合体の心臓分化(0日目から12日目)

  1. 中胚葉誘導(0日目)。
    1. ペース3.1.1–3.1.2に記載されている穏やかな吸引法で培地を除去します。
    2. 基礎培地1ウェルあたり1.5mLを追加し、インスリンを差し引いた2%のB27とWnt/βカテニン経路活性化剤(CHIR99021、最終濃度:11μM)を補足します。
      注意:グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3(GSK-3)の小分子阻害剤であるCHIR99021の10 mMストック溶液を準備してください。最終濃度11 μMを得るには、1.65 μLのストック溶液を1.5 mLの培地に加えます。
  2. 誘発分娩後の中間変化(1日目)。
    1. CHIR99021を加えてから24時間後に、各ウェルから培地を優しく吸引します。
    2. 1ウェルあたり1ウェルに新鮮な基礎培地1.5mLを加え、2%のB27からインスリンを差し引いた状態で48時間培養します。
      重要:Wnt変調のタイミングを厳守してください。偏差は微分効率を損なう可能性があります。
      注意:Wnt/βカテニン経路活性化剤への曝露後には、一部の細胞死が予想されます。もし広範な骨材損失が観察された場合は、今後の実験で活性化剤濃度を下げることを検討してください。
  3. WNT抑制による心臓コミットメント(3日目)。
    1. 各ウェルから使用済み培地760μLを無菌50mL円錐管に移して調製培地を準備します。
    2. 各ウェルごとに、2%のB27からインスリンを差した新鮮な基礎培地760μLをプールされた培地のチューブに加え、優しく混ぜます。
    3. Wnt経路阻害剤IWP4を混合培地に最終濃度5μMまで加え、チューブを数回優しく反転させて混合します。
    4. 各ウェルから残りの培地を慎重に吸引し、調整培地1ウェルにIWP4を補足して1.5mLを加えます。
    5. 37°Cで5%のCO₂を含んで48時間孵育します。
      注:Wnt経路阻害剤IWP4の1 mMストック溶液を準備してください。最終濃度5μMを得るために、各ウェルごとに1.52mLの総培地(760μLの調整培地+760μLの新鮮基礎培地)に対して7.6μLのストック溶液を加えます。
  4. マイクロウェルの中変化(5日目)。
    1. 中質をステップ3.1.1–3.1.2で説明した穏やかな吸引法で置き換えます。
    2. 各ウェルに2%のB27からインスリンを差した基礎培地1.5mLを加え、37°Cで5%のCO₂を含んで48時間培養します。
  5. マイクロウェルから6ウェルプレートへの骨材移送(7日目)。
    1. 各井戸から培地を慎重に吸引し、ステップ3.1.1–3.1.2に記載された穏やかな吸引法を用います。
    2. マイクロウェルプレートの各ウェルに、2%のB27をインスリンを補足した基礎培地1.0mLを加えます。P1000ピペットを使い、培地を優しく上下に5回ピペットしながら、ピペットの先端を円を描くようにウェル表面を移動させ、マイクロウェル内の凝集体を外して懸濁液に移します。
    3. 骨材懸濁液を未処理の6ウェル培養プレートの単一ウェルに移します。
    4. マイクロウェルプレートの各ウェルを、残った骨材を回収するために追加で1.0 mLの新鮮培地で2〜3回洗浄し、各リンスを6ウェルプレートの同じウェルに移します。
    5. 37°Cで5%のCO₂を含んで72時間培養します。
      注意:骨材移植後に死んだ細胞や細胞の破片が存在することが予想されます。ほとんどのゴミはその後の培地交換で除去されます。
  6. 懸濁培養中の中間変化(10日目)。
    1. 緩く付着した骨材を外すために、板を優しくかき混ぜます。
    2. 板を傾けて骨材が重力で井戸の底に沈殿するようにします。
    3. 使用済みの培地を慎重に吸引し、骨材を乱したり吸引したりしないでください。
    4. 各ウェルに2%のB27をインスリンを補足した新鮮な基礎培地2.0mlを加え、37°Cで5%のCO₂を48〜72時間培養します。
      注:自然発動は通常、約10日目以降に観察されます。
      一時停止点:打動型カルディオイドは、2〜3日ごとに培地を交換することで懸濁培養で長期成熟を維持できます。

5. カルディオイドの顕微鏡的特徴付け

注:この方法は、クリオ切開を用いた心肌の組織学的特徴付けのためのワークフローを提供します。得られた切片は、ヘマトキシリンやエオシン(H&E)染色による組織全体の構造評価や、心筋細胞の同一性を評価する免疫蛍光標識など、さまざまな組織学的解析に利用できます。

  1. 固定と冷凍解剖。
    1. カルジオイドを4%パラホルマルデヒドに4°Cで一晩固定します。
      注意:パラホルマルデヒドは有毒で発がん性の可能性が高いです。適切な個人用防護具を着用し、化学換気フード内で取り扱ってください。すべてのパラホルマルデヒド含有廃棄物(固定剤および洗浄剤)を、アルデヒド/化学有害廃棄物用に明確にラベル表示された容器に収集し、機関の有害廃棄物手順に従って処分してください。
      安全:すべてのパラホルマルデヒド固定および取り扱いは、適切な個人用防護具を着用したまま化学煙幕フード内で行ってください。
    2. PBSで3回洗浄し、固定されたカディオイドをPBSに浸して30%(w/v)のクオースに浸して4°Cで一晩かけます。
    3. カルディオイドをゼラチンに埋め込み、冷凍し、厚さ10μmのクライオセクションを顕微鏡スライドに切断しました。使用まで−20°Cの状態で保存してください。
  2. 免疫標識。
    1. 区画を室温で15分間解凍します。
    2. 37°CのPBSで10分間、2回洗います。
    3. 各スライドの関心領域を疎水性ペンで丸で囲み、ブロッキング液と抗体溶液を保持する井戸を作ります。
    4. 切片を2〜3分間、透過バッファー(PB)で再水和します。コプリンの瓶に0.1%のトゥイーン-20を含むPBSです。
    5. スライドをPBから取り出し、余分な溶液を排出してから、湿ったチャンバーにスライドを置きます。
      重要な点:ここからは、断片を乾燥させないことが非常に重要です。
    6. 切片を5%胎児用牛血清(FBS)を含む200〜300μLのPBで、室温の湿度の高いチャンバーで90分間ブロックします。
    7. ブロッキング溶液を除去し、切片を4°Cで一晩インキュベートし、100μLの一次抗体(抗cMYBP-C;1:50)をブロッキング溶液(PB含有1%FBSを含むPB)で希釈しました。
    8. スライドをPBで3回洗浄し、室温で緑色蛍光抗マウス二次抗体(1:200)、遠赤蛍光ファロイジン(1:400)、DAPI(1 μg/mL)と共に2時間インキュベートします。
    9. PBで3回洗い、アンチフェードマウントメディウムで取り付けます。
      注意:蛍光染料を含む溶液(二次抗体、ファロイジン、DAPI染色液および対応する洗浄液)をすべて容器に収集し、機関のガイドラインに従って化学廃棄物として処分してください。
  3. 画像取得。
    1. 10×および63×/1.40の油浸注対物レンズを用いた超分解能画像用のアレイ検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を取得します。
    2. 遠赤色蛍光色素、緑色蛍光色素、核染色をそれぞれ4.0%、4.0%、1.0%のレーザー透過率で639 nm、488 nm、405 nmのレーザーラインで励起します。
    3. ピクセルサイズ0.0353×0.0353μm²、単方向走査、スキャン速度6、ズーム1.7、ライン平均1、ピクセル滞留時間0.935μsの単一光学セクションを取得できます。
    4. 自動ウィーナーフィルタリングを用いたアレイ検出器の超高解像度画像処理を適用します。

6. 蛍光オリゴヌクレオチド取り込みアッセイ

  1. 脂溶性を高めるために、パルミチン酸に共役した蛍光標識オリゴヌクレオチドのストック溶液を準備します。
    1. ヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥蛍光標識オリゴヌクレオチドを最終濃度1 mMに再構成します。一時的に渦を流し、3,000 × g で30秒間遠心分離してチューブの底に溶液を回収します。
    2. 1 mMのストック溶液を使い捨てにアリコートを準備し、光から保護して−20°Cで保存します。
    3. 実験当日、1 mMストック1 μLを1 mLのカルジオイド培養培地に加え、最終オリゴヌクレオチド濃度1 μMを得ます。優しいプレート攪拌で混合します。
  2. 蛍光標識オリゴヌクレオチド(最終濃度1μM)を、血清不使用培地37°C、5%のCO₂で24時間培養します。
  3. カルジオイドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、細胞外オリゴヌクレオチドを除去します。
  4. カルジオイドを4%パラホルムアルデヒドに室温で20分間固定し、PBSで3回洗い、蛍光標識を続けて画像処理を行います。
  5. 光から保護された状態で、5 μg/mLの小麦胚細胞凝集素(WGA)と緑色蛍光素と1 μg/mL DAPIを共役したPBS中に、完全な固定カルディオイドを4°Cで一晩インキュベートします。PBSで3回洗い、アンチフェードマウンティングメディウムでマウントします。
    注意:ステップ6.2の標識付きオリゴヌクレオチド培養培地およびWGA/DAPI染色液を含むすべてのオリゴヌクレオチドおよび蛍光染料を含む培地および洗浄液は別の容器に収集し、機関ガイドラインに従って化学・生物有害廃棄物として処分してください。
  6. オリゴヌクレオチドの取り込みと分布の共焦点画像を取得します。
    1. 超分解能撮影用のアレイ検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡と40×の水浸式対物レンズを用いて共焦点画像を取得します。画像を8セクションのZスタックとして取得し、zステップサイズは2μm、総深さは16μmをカバーします。
    2. 核染色、膜マーカー、遠赤色蛍光標識オリゴヌクレオチドを、それぞれ0.9%、0.2、3.0%のレーザー透過率で405 nm、488 nm、639 nmレーザーラインを励起します。
    3. ボクセルサイズが0.0449×0.0449×2μm3、双方向走査、スキャン速度5、ライン平均1、ピクセル停留時間1.51μsの画像を取得します。自動ウィーナーフィルタリングを用いたAiryscan/超解像度画像処理を適用します。
    4. すべてのz位置およびすべての試料で取得設定(レーザー出力、検出器利得、zステップ、ボクセルサイズ)を一定に保ち、条件間のオリゴヌクレオチド信号の有効比較を可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1 は分化ワークフローをまとめ、iPSCの凝集から自己組織化心型の形成までプロトコルの各段階で期待される特徴的な形態変化を示しています。サスペンションベースのマイクロウェル集約は、多数のサイズ制御されたカーディオイドを並列生成するためのシンプルかつ標準化されたアプローチを提供します。成功した分化は、均一な大きさの集合体が生成され、その後内部空洞の発生と自然発生的な打動の開始によって特徴づけられ、通常は10日目頃から始まります。これらの形態的特徴は、心型生成の効率性と再現性を評価するための実用的な品質管理チェックポイントを提供します。

心型構造や組織組織は、クライオセクションの組織学的解析によって評価できます。 図2に示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色で成功裏に分化したカルディオイドは、1つ以上の内部空洞を形成し、その周囲にコンパクトな細胞層が入ったよく組織化された三次元組織を...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

オリゴヌクレオチドベースの治療薬は、オリゴヌクレオチド化学の数十年にわたる進歩によって支えられ、標的特異性、代謝安定性、免疫原性の容容性が向上した強力な遺伝子標的モダリティのクラスとして登場しました7,8。臨床的に承認されたRNA治療薬の数が増加しているにもかかわらず、その広範な応用は非効率的な細胞内送達により制限されています7,8。その大きさ、電荷、親水性のため、オリゴヌクレオチドは細胞膜を受動的に拡散できず、代わりにエンドサイトーシス経路を通じて内部化されます。取り込み後、内部化されたオリゴヌクレオチドの大多数(~99%)はエンドソーム区画内に隔離されたまま

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

ノボノルディスク財団最適化オリゴ脱出チャレンジセンターのメンバー、特にオリゴヌクレオチドの設計と合成に関してKnud Jensen氏、定量イメージングおよび細胞内輸送解析に関する貴重な指導をいただいたNikos S. Hatzakis氏とTomas Kirchhausen氏に感謝いたします。この研究はノボ・ノルディスク財団最適化オリゴ脱出チャレンジセンター(NNF23OC0081287)の資金提供を受けました。M.F.はポルトガル(2020.04836.BD 年)のFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)からフェローシップを受けました。技術支援をいただいたGIMMバイオイメージングおよびGIMM組織病理学プラットフォーム(ポルトガル・リスボン)に感謝いたします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

参考文献

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

人工多能性幹細胞カルディオイドモデル心筋分化Wntシグナリング心中胚葉心筋前駆細胞蛍光オリゴヌクレオチド細胞内取り込み三次元カルディオイド

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。