エラスチン感作および血管周囲エラスターゼを用いたマウス腹部大動脈瘤モデルの信頼性の高い作成

サマリー

このプロトコルは、エラスチン感作と血管周囲エラスターゼの適用を用いてC57BL/6マウスにおける腹部大動脈瘤(AAA)を繰り返しかつ信頼性の高い誘導方法として提供し、免疫増細成分を含むAAAモデルとして提供します。

要約

腹大動脈壁の弾性ラメラーマトリックスの劣化は、腹部大動脈瘤(AAA)の組織病理学的特徴です。増え続ける証拠は、エラスチン分解および関連する宿主免疫応答がAAAの病因に関与していることを示しています。これらのプロセスの効果的なモデリングは、この一般的な病気の理解と治療を深めるために重要です。従来のAAAモデルでは動脈瘤誘発にエラスチン破壊技術が用いられてきましたが、多くのモデルでエラスターゼを単独使用しているだけでは、エラスチンおよびその分解生成物(EDP)に対する継続的な免疫応答を説明できません。この進行中の免疫応答をモデル化するために、動脈瘤誘導手術の7日前に皮下注射でEDPを注入することでC57BL/6マウスのEDP感度を高めるモデルを開発しました。動脈瘤誘発手術は、腹部大動脈を露出させ、大動脈周辺区画に局所エラスターゼを塗布し、マウス大動脈にエラスチンとEDPを曝露することを目的とします。これらのモイエトが露出されると、動物は以前に感作されていた抗原に対して免疫応答を発動します。7日後に繰り返し「ブースター」EDP注射を行うと、この免疫応答が伝播します。ここでは、EDPを用いた複数増致を経て、その後の血管周囲エラスターゼ施用によるAAA誘導手術を経て、C57BL/6マウスにおけるAAAの信頼性の高い作製プロトコルについて説明します。このモデルは迅速かつ適度なコストで作成可能で、誘導術後21日目に測定されたマウスの82%で大動脈拡張>30%、超音波>測定で73%、ビデオマイクロメトリで64%、超音波で27%の大動脈拡張を誘導します。この技術は術中生存率95%とも関連しています。

概要

腹部大動脈瘤(AAA)は世界中で>3,500万人に影響を及ぼし、65〜80歳の男性の4〜8%に影響を及ぼ^{しています。}破裂はAAAの最も壊滅的な合併症であり、動脈瘤の機械的壁応力が大動脈組織の強度を超える場合に通常発生し、大規模な出血と全体の死亡率80−90^{%となります3,4}。現在の管理は予防を目的としており、高リスク者の超音波検査や、破裂リスクが修復リスクを上回る場合は手術的修復(通常直径5.5cm)を行^{っています。}しかし、ほとんどのAAAは無症状で、多くは偶然に診断^{されています。}したがって、高リスク患者を特定し、AAAの増殖を抑え、破裂リスクを減らすための非手術的治療法の開発に努めるべきです。

AAAの医療治療法を開発するには、その病因をよりよく理解する必要があります。現在、アンジオテンシンII注入^7、異種移植^8、塩化カルシ^ウム9、注入¹⁰ および/またはエラスターゼ¹¹の局所塗布を用いた小動物モデルなど、いくつかの実験モデルが使用されています。これらのモデルはそれぞれAAAの病理的基盤に関する異なる理解を用いており、ほとんどは創設以来修正、改良、または他の手法と組み合わせられています。

重要なのは、AAA組織学が正常なラメラエラスチンマトリックスの喪失を示していることであり、これは慢性閉塞性肺疾患の肺組織でも見られることです(^12,13)。マトリックスメタロプロテインナーゼ活性によるエラスチン分解は、AAAの病因と喫煙との間に重要な連鎖をもたらし、AAA形成の最も重要な修飾リスク因子です^12,14。特に、ヒトAAAでは大動脈エラスチンの減少、エラスチン線維の破壊、循環エラスチンペプチドの増加が観察され、AAA壁の拡張性の増加と関連しています^15,16。したがって、エラスチン分解を刺激することは、翻訳可能なAAAモデルを作成する上で極めて重要です。エラスチン分解に依存する既存のAAAモデルは効果的であるものの、特に大動脈カニュレーションを用いたモデルでは高い動物死亡率や、特に局所エラスター^{ゼ適用のみ}に依存するモデルでは動脈瘤形成の不均一性により複雑化することがあります。さらに、誘導手術に依存するすべてのモデルは、オペレーターの習得曲線や技術的なばらつきの影響を受けます。

これらの問題に対処するため、宿主の免疫応答を利用してエラスチン分解産物(EDP)を注入して動物のエラスチン感作を図ります。1週間後、動脈瘤誘導手術は標準化された段階的に行われ、エラスターゼを大動脈周に施してEDPモイエティを作り、感作された宿主が免疫応答を発動できるようにします。誘導手術後1週間後の「ブースター」EDP感作により、宿主の免疫応答が継続されます。反復的な免疫感作により、信頼できる大動脈拡張が可能になります。私たちは、コストが低く、メンテナンスが容易で、病気の発生が早いこと、技術的な一貫性から、マウスAAAモデルを採用しています。

このモデルは大動脈破裂を確実に導くものではないため、AAA破裂に関連する要因の研究には適していません。しかし、このモデルは誘導手術後21日経過まで進行性大動脈拡張を確実に生じさせます。したがって、このモデルは動脈瘤形成時に大動脈拡張を減少または逆転させる治療法の研究に最適です。

プロトコル

1. 超音波画像診断

1. マウスの準備をしてください
   1. マウスを麻酔誘導室に入れます。
   2. マウスが麻酔されるまで、1.8−2%のイソフルランと酸素を吸入して投与します。イソフルラン使用時に揮発性麻酔薬への曝露を減らすために、麻酔ガスキャニスターを麻酔装置に接続していることを確認しましょう。
   3. マウスを仰向けにして、37°Cに加熱されたステージに置き、鼻を麻酔鼻のコーンに入れます。
   4. 後肢を舞台にラベルテープで貼り付けます。
   5. 綿先端のアプリケーターを使って腹部に脱毛剤を塗り、30秒待つ。
   6. 腹部の毛は5cm×5cmの綿ガーゼパッドで除去します。
   7. 温めた超音波伝導ジェルをマウスの腹部に置きます。
2. 腹部に38MHzの超音波プローブを当て、骨盤帯を特定します。
3. 大動脈は、超音波プローブを通じて中程度の後方方向圧力をかけても圧縮不可能な管状の正中線構造と特定します。
   注意:下大静脈(IVC)はマウスの大動脈右側に腔内構造として現れ、超音波プローブを通じて中程度の後方方向圧力をかけると圧縮可能です。
4. 腹大動脈の前後径を、頭側から分岐点まで測定します。
5. プローブを大動脈の近位部に沿って移動させ、左腎静脈が大動脈の前方を横断して下腔内腔に入っているのを特定します。
6. 腹部大動脈の前後径を、左腎静脈が前方で大動脈に向かう地点まで測定します。
7. プローブを近位に動かして横隔膜を特定してください。
   注:横隔膜は肝臓の頭側にある超エコーバンドとして識別できます。
8. 腹部大動脈の前後径を、尾部直近まで測定してください。
9. ネズミをケージに入れるか、タオルで覆ったリカバリーバスケットに入れ、37°Cで加熱されたステージに置きます。
10. 麻酔から抜けるまでマウスを監視してください。

2. 初期エラスチン感作

1. エラスチン分解製品(EDP)は、手袋、アイプロテクション、フェイスマスクなどの個人用防護具を着用しながら準備してください。
   1. PBS懸濁液中のマウス膵エラスターゼを0.475単位/mL(タンパク質4.75単位/mg)で製剤を取得します。
   2. エラスターゼ168μLを5mgのマウスエラスチンに加えます。この混合物にさらに200μLの1Xリン酸緩衝生塩水(PBS)を加え、ピペットで混合します。
   3. エラスターゼとエラスチンの混合物を37°Cで20分間、間欠的に優しく攪拌しながら培養します。
   4. エラスターゼとエラスチンの混合物に632μLの冷たい1X PBSを加えます。
   5. 完全なフロイントアジュバントを1mL加えます。
2. マウスを麻酔誘導室に入れます。
3. マウスが麻酔されるまで、1.8−2%のイソフルランと酸素を吸入して投与します。
4. マウスを37°Cに加熱したステージに伏せて置き、マウスの鼻を麻酔鼻のコーンに入れます。
5. 両脇腹に50μLのEDPを皮下注射し、各マウスに合計100μLのEDPを投与します。
6. ネズミをタオルで敷いたリカバリーバスケットに入れ、37°Cに加熱されたステージに置きます。
7. 麻酔から抜けるまでマウスを監視してください。

3. 手術準備

1. 手術器具を準備しろ。
   1. 歯付きピンセット2本、鋭い直線ピンセット1本、角角ピンセット1本、針ドライバー1本、ハサミ、少なくとも3本の自己保持式磁気リトラクター、皮膚ホチキス1個、ポリプロピレンボトルキャップ1個を用意してください。
   2. 手術直前に、4-0のポリグリコール酸編み縫合糸を無菌状態でキットに追加してください。
   3. 注意:3-0または5-0の縫合糸サイズでも十分です。
   4. ポリプロピレンのボトルキャップに滅菌温めた1X PBSを入れます。
      注意:滅菌1X PBSのボトルは、補充の際に37°Cの温まりで保管しています。
2. エラスターゼを準備しろ。
   1. 豚膵エラスターゼ27 μL 5.1 mg/mL(≥4.0 単位/mgタンパク質)を73 μLの1X PBSに希釈し、最終体積100 μLで10匹のマウス手術用にします(10 μL/マウス)。
   2. 手術室の準備をしろ。
   3. コットンチップのアプリケーター、テーパードチップのコットンチップアプリケーター、5cm×5cmのガーゼをまとめたビーカーをオートクレーブし、手術前に手術トレイの隣に置きます。
   4. 顕微鏡ステージに37°Cに設定された加熱パッドの上に磁気手術用ステージを設置します。加熱パッドは顕微鏡ステージにテープで固定しつつ、手術中の位置変更が可能になるように磁気部品は固定せずに置いてください。
   5. 温熱パッドの上に吸収パッドやペーパータオルを敷きます。5cm×5cmのガーゼを半分に折りたたみ、麻酔鼻のコーンの下に置きます。
   6. 脱毛剤を入れた30mLカップ、5%ポビドンヨード入りの30mLカップ、眼用潤滑剤のチューブ、手術用テープ、非滅菌の5 cm x 5 cmガーゼ、非滅菌の綿先付アプリケーター、密封された5 cm x 5 cmのアルコール綿棒、接着式フードサービス用フィルムのロール、70%エタノールのスプレーボトルを手術部位の近くに置きます。
   7. 1.3 mg/mLの徐放性ブプレノルフィンを1 mLのシリンジに、1匹あたり75 μLの容量で抽出し、30gのマウスに3.25 mg/kgの投与量を投与します。
3. 手術の準備をしてください。
   1. マウスの体重をグラム単位で測定・記録します。
   2. マウスを麻酔誘導室に入れます。
   3. マウスが麻酔されるまで、1.8−2%のイソフルランと酸素を吸入して投与します。
   4. マウスを仰向けにして、37°Cに加熱されたステージに置き、鼻を麻酔鼻のコーンに入れます。
   5. 75μLのブプレノルフィンを皮下注射します。
   6. 後肢を舞台にラベルテープで貼り付けます。
   7. 綿先端のアプリケーターを使って腹部に脱毛剤を塗り、30秒待つ。
   8. 腹部の毛は5cm×5cmの綿ガーゼパッドで除去します。
   9. マウスの目に目の潤滑剤を塗りましょう。
   10. マウスの腹部に5cm×5cmのガーゼパッドを使ってポビドンヨウ素を塗布し、乾かします。
   11. 腹部は5cm×5cmのアルコール綿棒で拭きます。ポビドンヨウ素を再塗布し、乾かします。
   12. 麻酔を試すために、マウスの足の指をつまんで反応がないか確認してください。
   13. 手術台の上に接着式フードサービスフィルムを貼ります。
   14. 手術ステージに70%エタノールをスプレーし、乾燥させます。
   15. 手を洗い、滅菌手術用手袋を着用してください。

4. 手術手順(初期エラスチン感作から7日後)

1. 腹部大動脈を露出させてください。
   1. 腹部の正中線に沿って、ハサミやメスを使って皮膚を切開し、陰茎から頭骨まで0.5⁻1cmから尾骨まで0.5cmまで伸びます。
   2. 歯型鉗子で皮膚を掴み、優しく引き上げると白線(linea alba)が見えます。これは直筋の間に無血管面として現れます。
   3. ハサミを使って白線を切りながら、皮膚を引っ張り上げ続けます。腹部内の構造物は避け、白線だけを切るように注意してください。
   4. 磁気式自己保持リトラクターを設置します。1つは腹壁の右側を引っ込め、1つは腹壁左側を引っ込め、もう1つは膀胱や精嚢など後方側の構造を引っ込めます。
   5. 湿らせた綿先のアプリケーターを使って、腸を体から切り離し、湿った5cm×5cmのガーゼで覆います。または、巻いた湿らせた5cm×5cmのガーゼをマウスの腹部左側に詰めて腸を詰めます。
      注意:マウスの解剖学やリトラクターの位置によっては、腸を切り取ったり逆方向に詰めたりして最適な視認性を図ることがあります。
   6. 正中線の下腔内総管と腹部大動脈を後方に位置付けます。
   7. 綿先端のアプリケーターを使い、後方血管構造を覆う組織面を優しく開いて後腹膜に挿入します。
      注:対象の組織に後方方向の圧力をかけ、その後コットンアプリケーターの先端を互いに引き離すことで、より強い牽引力が加わります。より優しいトラクションを得るには、綿アプリケーターの先端を逆方向に回してください。
   8. 外側リトラクターをより深く配置することで、より良い牽引力と大動脈の視認性を得られます。
   9. 綿先端のアプリケーターを使い、IVCと腹下大動脈を優しく分離し、この段階で大動脈の外側付着部の解放を防ぎます。
   10. 大動脈と大動脈の間の平面をさらに発達させ、大動脈と大動脈の間に三角形の空間が見えるまで続けます(図1)。
       注意:このステップは通常、左腎静脈の尾部だけを行って行うのが最も簡単です。
   11. 鈍い解離や鋭い鉗子を使い、マウスの左側の結合組織や腰筋から大動脈を引き離して外側大動脈付着部を解放します。
   12. 斜めの鋭い鉗子を大動脈と下谷内静脈の間に形成された空間に置き、鉗子を優しく開閉して後大動脈付着部を開けます。
   13. 同じ開閉技術を用いて、大動脈に沿って頭から尾側にかけて後面を発達させます。
   14. 大動脈全体のビデオマイクロメトリー画像を取得し、解析用に保存してください。
2. 血管周囲エラスターゼを塗布します。
   1. ピペットを使い、露出した大動脈の長さに沿って10μLのエラスターゼ溶液を落とします。
      注:大動脈の内側と外側の組織のみを解離すると、エラスターゼが溜まる溝が現れます。
   2. 開腹に湿らせた5cm×5cmのガーゼパッドを敷き、エラスターゼ溶液を10分間培養させます。
   3. ガーゼパッドの被覆を外し、腹部を無菌の1X PBSで3回洗浄して残留したエラスターゼ溶液を除去します。
3. 腹部を閉じて。
   1. 腹部の臓器を元の位置に戻す。腸のねじれや曲がりがないか観察し、除去してください。
   2. ピンセットを使って、直筋と筋膜を皮膚から剥がし、0.25cmの皮膚弁を作ります。
   3. 腹部筋膜を4-0編み込みポリグリコール酸(または類似)縫合糸で、簡単なランニングで縫合し、切開部の角を含み、噛み合わせ間に2mm以内の距離を移動させてください。
   4. 上に覆う皮を3⁻4インチのホチキスでホチキスで留めます。

5. 術後ケア

1. マウスを手術段階から取り出し、タオルで覆ったリカバリーバスケットに入れ、37°Cに加熱されたステージに置きます。
2. 麻酔から抜けるまでマウスを監視してください。
3. 術後4日間、マウスの健康状態や腹部切開の状態を毎日観察してください。
4. 術後は、上記の通りの再超音波検査を行い、動脈瘤の成長を監視します。
5. 手術後1週間、または週1回目の超音波検査時にホチキスを外してください。

6. 動脈瘤誘導手術後7日後にエラスチン感作の繰り返し

1. 上記の手順と同様に初期エラスチン感作を行い、EDP溶液を同じ方法で準備し、完全なフロイント助剤ではなく不完全フロイントのアジュバントを1回置換します。

7. 組織採取手順

1. 術後21日目の採取組織を様々な分析のために採取。
2. 誘発手術の時と同じ方法でマウスを準備します。
3. 誘導手術時と同じ方法で大動脈を再び露出させ、組織学的分析のために採取する標本を損傷しないように注意します。
   注:この時点でマウスは粘着性瘢痕を形成しているため、鈍い解剖よりも鉗子を使った鋭い剥離を多用する必要があるかもしれません。
4. ビデオマイクロメトリー画像を取得してください。
5. 血液を採取して分析し、マウスを安楽死させるために心臓穿刺を行います。
6. マウスを血液洗浄し、適切な防護具(手袋、保護眼鏡、マスクなど)を着用して分析してください。
   1. 組織がフローサイトメトリー(または類似)解析に指定されている場合は、血管拡張器なしの1X PBSを100−120 mm Hgで8 mLの体積で左心室に灌流します。
   2. 組織がPCR解析対象の場合、左心室に1XのPBSと血管拡張剤(0.1Mマデノシンおよび0.01mナトリウムニトロプルシド)を灌流し、その後RNA安定化液を投与します。
   3. 組織解析対象の組織がある場合は、血管拡張器付きの1X PBSを左心室に灌流し、その後10%緩衝ホルマリンリン酸を投与します。
7. 組織学的分析用の組織を構造的に損傷しないように注意しながら、目的の組織を採取してください。縫合やマーキング剤で向きをマークしてください。

結果

この手術プロトコルは合計28頭の雄C57BL/6Jマウスが受けており、そのうち1匹はIVC損傷による周術期死亡率(3.6%)でした。さらに3件の遅れ死亡があり、そのうち1件は切開ヘルニア、残りの2件は原因不明で、合計21日の生存率は85.7%でした。麻酔誘導から麻酔投与終了までの平均時間は46.4±8.0分でした。偽手術マウスは動脈瘤群とほぼ同一のプロトコルを受け、初期EDP感作、開腹手術、大動脈曝露、繰り返しEDP感作を含みます。主な違いは、偽グループは誘導手術時に局所的な血管周囲エラスターゼを受け取らなかったことです。

大動脈径は超音波およびビデオマイクロメトリで測定されました。代表的な超音波および術中画像は 図2に示されています。大動脈瘤は、21日目の大動脈直径比がベースラインと比較して≥1.5であることで定義されました。動脈瘤群の超音波平均大動脈径比は21日目のベースラインと比べて1.43 ± 0.17で、偽手術対照群では1.04 ± 0.11でし...

ディスカッション

1990年にラットで初めて記載されて以来、エラスターゼベースのAAAモデルは何度も改良され、^{10、19、20、21、22}、²³の動物で使用されています。その中には大動脈カニュレーションが含まれており、これは死亡率を上げ、大動脈病理に外傷的な要素をもたらす^{可能性があります。}より侵襲的な修飾には、リシル酸化酵素阻害剤である3-アミノプロピオニトリルフマル酸塩(β-アミノプロピオニトリル(BAPN))があり、動物の飲料水に溶解します¹⁸。モデルの多くの修正の根拠は、動脈瘤形成の一貫性、技術的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL Tuberculin Syringes	Becton Dickinson	309628
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-4
70% Isopropyl Alcohol Swabs	Cardinal Health	S-16183
Angled sharp forceps	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)	MikRon	427630
Betadine	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
Cotton gauze pad	Dynarex Corporation	3223
Cotton tipped applicator	Puritan Medical Products	25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)	Sigma-Aldrich	E1250	4 °Cで水溶液中に保存
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)	Elastin Products Co., Inc.	MS838	4 °Cで水溶液中に保存（0.1 mgを1 mLのPBSに）
Elastin	MP Biomedicals	101636	4 °Cで水溶液中に保存
Enersight Desktop Software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)	Fidelis	NDC 86084-100-30
Eye lubricant	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5 (Stereo)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvant	MP Biomedicals	642851	4 °Cで水溶液中に保存
Freund’s incomplete adjuvant	MP Biomedicals	642861	4 °Cで水溶液中に保存
Gloves (Sterile)	Encore	7824PF
Hypodermic Needles (23 G)	Becton Dickinson	305145
Hypodermic Needles (27 G)	Becton Dickinson	305109
Isospire (Isoflurane)	Dechra Veterinary	07-894-8943
Labeling Tape	Fisher Scientific	15959
Masks	Dukal Corp.	1540
Needle driver	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas Canister	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater Stabilization solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Scissors	Fine Science Tools	14005-12
Skin staples (clips)	MikRon	205016
Small Rodent Warmer Heater	Stoelting	53851
Small Rodent Warmer Stage	Stoelting	53812
Stereo Microscope M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forceps	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stage	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe Portable Oxygen Concentrator	Vetland Medical	595-2300A
Toothed forceps	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 Ultrasound	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb polyglycolic acid suture	CP Medical	397A
VWR Absorbents	VWR	95057-860