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研究記事

グルココルチコイド受容体を用いた慢性閉塞性肺疾患治療におけるβ-シトステロールのネットワーク薬理学および実験的研究

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DOI:

10.3791/72018

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2026年8月7日

 ,  ,  , 
1Bishan Hospital of Chongqing Medical University, Bishan Hospital of Chongqing, 2Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Geriatrics Department, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Yuhua Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

β-シトステロールはCOPDを緩和し、デキサメタゾンの有効性を高め、グルココルチコイド受容体がこの効果を媒介しました。さらに、βシトステロールはCSE刺激された気管支上皮細胞およびタバコの煙誘発性COPDマウスの両方において、炎症、酸化ストレス、細胞老化を軽減しました。

要約

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、持続的な炎症、酸化ストレス、進行性の肺機能低下を特徴とする一般的な呼吸器疾患です。COPDにおけるβシトステロールの治療的可能性はまだ明らかではありません。本研究は、βシトステロールのCOPDに対する保護効果を調査し、その根本的なメカニズムを明らかにすることを目的としました。データベーススクリーニングにより、グルココルチコイド受容体(GR)がβシトステロールの潜在的な標的として特定されました。タバコの煙誘発COPDマウスモデルと、タバコ煙抽出物(CSE)刺激BEAS-2B細胞モデルを確立しました。肺機能、肺損傷関連マーカー、炎症、酸化ストレス、細胞老化は、RT-qPCR、DCFH-DA蛍光プローブアッセイ、老化検出キットを用いて評価されました。βシトステロール単独またはデキサメタゾン(DEX)との併用の効果も評価されました。βシトステロールは肺機能を有意に改善し、肺損傷関連マーカーを正常化し、CSE刺激されたBEAS-2B細胞およびタバコ煙曝露マウスの両方において炎症、酸化ストレス、細胞老化を軽減しました。これらの保護効果はGR発現の増加を伴っていました。さらに、β-シトステロールはDEXへの反応性を高め、β-シトステロールとDEXの併用治療は、DEX単独治療よりも肺機能、肺損傷マーカー、炎症、活性酸素種レベル、細胞老化において大きな改善をもたらしました。これらの発見は、βシトステロールがGR発現を上方調節し、治療効果を高めることで少なくとも部分的にCOPD関連の病理学的変化を緩和することを示唆し、COPD治療の補助戦略としての可能性を示しています。

概要

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、持続的な気道炎症、歯槽障害、不可逆的な気流閉塞を特徴とする進行性呼吸器疾患であり、呼吸機能を損ない、生活の質を低下させます。発症率は年齢とともに大きく増加し、65歳以上の人のリスクは42歳未満の約5倍です。この人口動態の傾向は、疾病発生率、死亡率、障害の増加と関連しています。3.疫学的予測によると、2030年までにCOPDは世界で4番目に多い死因となり、全死亡の約5%を占める可能性があります。現在、特定されたリスク要因には遺伝的感受性、肺形成不全、微粒子状物質曝露、慢性気管支炎、呼吸器感染症が含まれます。

リスク要因の中で、タバコの煙はCOPDの最も重要な病原性因子です。この薬には、気管支上皮損傷を引き起こし、炎症細胞の浸潤を促進し、肺組織の再形成を引き起こす数千種類の化学物質が含まれています。長期曝露は持続的かつ不可逆的な上皮損傷を誘発し、多数の炎症促進ケモカインの放出を促進し、ROS産生(ROS)を有意に増加させ、細胞アポトーシスを誘発する可能性があります10。多くの研究では、インターロイキン8(IL-8)や腫瘍壊死因子α(TNF-α)などの炎症促進ケモカインの増加、過剰なROS産生および細胞老化がCOPDの重症度と密接に関連していることが示されています11,12。これは、COPDにおいて保護的かつ治療効果を発揮するために、これらの主要な病原性因子を効果的かつ安全に調節できる薬剤の必要性を強調しています。

フィトステロールは、植物の細胞膜に広く存在する天然の生物活性化合物です。その中でβシトステロールが最も豊富で、脂質を豊富に含む植物由来食品(野菜、ナッツ、種子、オリーブオイルなど)に広く分布しています。研究により、ラットおよびマウスで最大1000 mg/kgのβシトステロール投与は細胞毒性や遺伝子毒性と関連しないことが確認されています17。さらに、研究によりβシトステロールは抗酸化酵素やヒトエストロゲン受容体への作用を通じて抗酸化特性を示すことが示されています18。

β-シトステロールは、抗炎症作用19、解熱作用20、鎮痛作用21、抗糖尿病作用13を含む幅広い薬理学的活性を示します。また、大腸炎や腸の炎症など様々な疾患モデルで治療の可能性を示しており、抗動脈硬化作用23 および免疫調節特性24も有しています。さらに、安全性も良好です。これらの特性から、βシトステロールは薬剤候補として大きな関心を集めています。しかし、COPDにおけるその正確な役割や根本的なメカニズムは、依然として大部分が不明瞭です。

したがって、本研究はCOPDにおけるβ-シトステロールの潜在的な治療効果およびその根本的なメカニズムを調査することを目的としました。具体的には、タバコ煙抽出物(CSE)誘発性BEAS-2B細胞損傷モデルを用いて、βシトステロールがCSE介在性細胞損傷を効果的に緩和できるかどうかを評価し、COPD治療戦略の新規候補分子を特定しました。

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プロトコル

本研究は、実験および臨床試験の基礎・臨床薬理学および毒性学ガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験プロトコルは、浙江大学医学院第二附属病院動物倫理委員会(承認番号20230102)によって承認され、すべての実験は動物倫理委員会の指針に従って実施されました。この研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

ネットワーク薬理学を通じた主要成分および標的のスクリーニング

Fritillaria cirrhosa D. Don、Lonicera japonica Thunb.、Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.、およびAdenophora stricta Miq.の活性成分。これらは中医体系薬理学データベース(TCMSP、2024年3月12日アクセス)から取得されました。候補化合物は以下のADME基準でスクリーニングされました:経口バイオアバリアビリティ(OB)≥30%、薬物類似性(DL)≥0.18、Caco-2浸透率≥−0.425。これら3つの基準すべてを満たす化合物は、後続解析のために有効成分候補として保持されました。

β-シトステロールの標準的な簡略分子入力ライン入力システム(SMILES)構造はPubChem(2024年3月18日アクセス)から取得され、SwissTargetPrediction(2024年3月21日アクセス)にインポートされ、ターゲット予測が行われました。ホモ・サピエンスが対象種に選ばれました。潜在的な標的は、データベース内の既知の配位子βとの間の2次元および3次元構造的類似性に基づいて予測されました。確率が0を超える予測ターゲットは保持し、重複したエントリは削除されました。

COPD関連遺伝子は、治療標的データベース(TTD;2024年3月25日アクセス)および比較毒性ゲノミクスデータベース(CTD;2024年3月28日アクセス)から「慢性閉塞性肺疾患」というキーワードを用いて取得されました。重複遺伝子を除去した後、COPD関連遺伝子を予測されたβシトステロール標的と交差させ、βシトステロールの治療効果に関与する可能性のある候補標的を特定しました。

β-シトステロールとGRの分子ドッキング

SDF形式のβ 3次元構造はPubChemデータベース(2026年6月2日アクセス)から取得され、グルココルチコイド受容体(GR)の結晶構造は構造生物情報学タンパク質データベース研究共同研究所(RCSB PDB、2026年6月3日アクセス)から取得されました。リガンドおよび受容体構造の標準的な準備後、CB-Dock2オンラインプラットフォーム(2026年6月3日アクセス)を用いて分子ドッキングが行われました。準備済みのリガンドと受容体のファイルはプラットフォームにアップロードされ、ドッキング計算はデフォルトのパラメータで行われました。

遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の機能豊か解析

すべての予測されたβシトステロール標的遺伝子をGO機能豊化およびKEGG経路濃縮解析に適用しました。生物学的プロセス、細胞成分、分子機能、シグナル伝達経路の有意に濃縮された結果は、 補足ファイル1 に分類され、後続のバイオインフォマティクス解析のために保存されました。

動物のモデリングとグループ化

サンプルサイズは、G*Powerソフトウェアを用いた事前検出力分析(α = 0.05、検出力=0.80)を行った以前の研究に基づき、1群あたり6頭に設定され、n=6で生物学的に関連性のある差を検出するのに十分であることを示しました。26。6〜8週齢の雄C57BL/6マウス(20 ± 2 g)は、対照群、COPDモデル群、COPD + デキサメタゾン(DEX)群、COPD + β-シトステロール群、COPD + DEX + β-シトステロール群の5つのグループに無作為に割り当てられました。マウスは標準的な実験室環境(25°C、12時間の明暗サイクル)で飼育され、標準的な食事と水に自由にアクセスされ、実験前に1週間の慣性を許されました。

COPDモデルの確立では、マウスを全身のタバコ煙曝露チャンバー(63 cm × 55 cm × 45 cm)に入れ、12週間にわたり主流のタバコ煙にさらしました。各タバコには10mgのタール、0.9mgのニコチン、10mgの一酸化炭素が含まれていました。煙曝露は週5日、午前9時30分と午後3時に1日2回実施され、18本のタバコから90分間チャンバーに投入された煙が27セッションあたり90分発生しました。

介入の治療効果を評価するため、8週間のタバコ煙曝露後に薬物投与を開始し、その後4週間継続しました。9週目から、各治療群のマウスは、喫煙曝露の1時間前に毎日胃内投与でDEX(1 mg/kg)28またはβ-シトステロール(50 mg/kg)29,30 を受けました。過去の薬理動態研究では、齧歯類におけるβ-シトステロールの経口バイオアベイリーは約4%と報告されています。さらに、いくつかのマウス研究では20から50 mg/kgまでの投与量が用いられています。したがって、前臨床試験で一般的に用いられる範囲内に保ちつつ、十分な全身曝露を確保するために50 mg/kgの用量が選択されました。

対照群のマウスはろ過された室内空気にさらされ、モデル群と処理群のマウスは同等量の生理食塩水を載体として投与されました。実験期間終了時には、マウスはイソフルランによる深い麻酔を受け、足反射を失い、腹部大動脈採血による大量出血で安楽死させました。胸腔は直ちに開かれ、両側肺組織は慎重に切除され、氷のように冷たいリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で洗浄され、氷の上に置かれました。気管支肺泡洗浄液(BALF)採取では、気管をカニューレし、冷たい無菌PBSで洗浄し、これを優しく注入・抽出して洗浄液を採取しました。肺組織とBALFサンプルは氷上に保管され、その後下流解析のために処理されました。

BEAS-2B細胞培養

BEAS-2Bヒト気管支上皮細胞は、37°Cで5%CO₂下で10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle Medium/F12(DMEM/F12)に維持されました。

CSE製剤とBEAS-2B細胞曝露

BEAS-2B細胞はリン酸塩緩衝塩水で洗浄され、24ウェルプレートに3枚の3枚で5個×10個4 細胞の密度でシードされました。培養12時間後、細胞は約60%のコンバーシティに達し、その後CSE曝露されました。CSEは前述通り新しく準備され、わずかな修正を加えた33。簡単に言えば、1本のろ過されていない市販タバコが連続燃焼され、主流の煙を真空ポンプで10 mLの血清なし培地に、約5分間、一定流量1.05 L/min(約−11 kPa負圧)で蒸気を噴射し、タバコが完全に燃え尽くすまで続けました。得られた溶液はまず大きな粒子状不純物を除去するために予備ろ過を行い、その後0.22μmの無菌微細孔質フィルターで滅菌して残留粒子を除去しました。その結果得られるストック溶液は100%CSEと定義されました。新たに調製されたCSEはすべて、ろ過直後に細胞処理に使用され、保管されませんでした。細胞は2.5%のCSEを含む培地で刺激されました。CSE処理24時間後、培養上清液を-40°Cで採取し、後続分析のために保存しました。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)

BEAS-2B細胞から全RNA抽出キットを用いて全RNAを抽出し、製造元の指示に従って逆転写キットでcDNAに逆転写しました。RT-qPCRはその後、リアルタイムPCR検出システムとSYBR GreenベースのqPCRマスターミックスを用いて実施されました。すべてのRT-qPCR実験は、データの信頼性を確保するために、サンプルごとに3回の生物学的複製と3回の技術的重複で実施されました。

各qPCR反応は合計20μLで行われ、10μLのSYBR Green qPCRマスターミックス、0.4μLの前方プライマー、0.4μLの逆プライマー、2μLの希釈cDNAテンプレート、7.2μLのRNaseフリー水が含まれていました。増幅条件は以下の通りです:95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで10秒間の変性40サイクル、60°Cで30秒のアニーリング/伸縮。相対的な遺伝子発現レベルは2−ΔΔCt法を用いて計算され、GAPDHが内部参照遺伝子として機能しました。本研究で使用されたプライマー配列は 補足表1に記載されています。

細胞内活性酸素種(ROS)分析

BEAS-2B細胞における細胞内ROS産生は、フルオロゲンプローブ2′,7′-ジクロロジヒドフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて評価され、フローサイトメトリーで解析されました。フローサイトメトリウム取得時には、標準的な前方散乱(FSC)および側散乱(SSC)ゲート戦略を用いて細胞残骸を排除し、完全な単一細胞を選択しました。各サンプルごとに合計10,000件の有効な細胞イベントが取得されました。励起波長と発光波長はそれぞれ488 nmと525 nmに設定されました。その後、フローサイトメトリクスデータを解析し、細胞内ROS蛍光強度を定量化しました。

マロンジアルデヒド(MDA)レベル決定

細胞内MDA含有量は、製造元の指示に従い脂質過酸化アッセイキットを用いて測定されました。簡単に、処理済みのBEAS-2B細胞を採取・溶解し、低温で遠心分離して上清液を採取しました。その後、チオバルビツ酸(TBA)比色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて532 nmの吸収を測定しました。相対的なMDAレベルは標準曲線に従って計算されました。

細胞老化評価

細胞老化は、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性に基づく老化検出アッセイを用いて評価されました。SA-βガル陽性細胞はフローサイトメトリーで定量されました。同時に、老化関連マーカーp53およびp21のmRNA発現レベルはRT-qPCRで測定されました。

細胞増殖アッセイ

細胞増殖は比色細胞生存能力アッセイキットを用いて評価されました。吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。

GRノックダウンアッセイ

細胞トランスフェクションは脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて行われました。以下のオリゴヌクレオチドがトランスフェクトされました:グルココルチコイド受容体標的の小型干渉RNA(si-GR)および陰性対照の小型干渉RNA(si-NC)。GRを標的とした候補siRNA配列は、オンラインバイオインフォマティクスプラットフォームのsiDirect 2.0を用いて設計されました。トランスフェクション後、細胞は48時間培養され、すべてのsiRNAは最終濃度50 nMで使用されました。ノックダウン効率はRT-qPCRを用いてGR mRNA発現を測定することで検証されました。

車両対照群はβシトステロール処理およびトランスフェクション実験の両方に含まれました。βシトステロール介入では、車両溶媒のみで処理された細胞が車両対照群(CSE+0と表記)として機能しました。統計解析により、車両対照群と空白対照群間で有意差は認められなかった。

統計解析

すべての定量的結果は、3つの生物学的に独立した in vitro 実験の平均±標準偏差として表されました。統計解析は統計解析ソフトウェアを用いて実施されました。Shapiro–Wilk検定は統計検定前にデータセット分布の正規性を調べるために用いられました。分散解析後の複数比較(ANOVA)後の P 値を調整するためにボンフェローニ事後補正が採用されました。2つのグループ間の比較は、ペアなしの学生t検定で評価され、複数グループ比較では一方向または二方向ANOVAが用いられました。 p値≤0.05は統計的に有意とされました。

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結果

βシトステロールはCOPD治療のための潜在的な天然産物でした

報告されている治癒効果は、 Fritillaria cirrhosa D. Don、 Lonicera japonica Thunb.の乾燥花、 Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.の乾燥根、および Adenophora stricta Miqの報告によるものです。肺疾患治療において35、36、37、38において、本研究はTCMSPデータベースを用いてこれらの伝統中国薬草(TCM)の有効成分を体系的に特定しました。βシトステロールはこれらの中医薬草に共通する重...

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ディスカッション

COPDは世界的な大きな疾病負担をもたらし、世界の健康にとって依然として大きな課題です。現在のCOPDの管理は、薬理学的介入と非薬物的介入の両方を含みます。薬物治療の中で、グルココルチコステロイド(GCs)は慢性炎症性疾患に広く使用されています。これらはGRに結合し、ヒストン脱アセチルゼ2を転写複合体に誘導してヒストンアセチル化を逆転させる作用をします43。しかし、複数の研究でCOPD患者のGC感受性が低下することが示されており、この疾患におけるGC耐性の証拠も示されています46。これらの発見は、GC耐性の克服が重大な臨床的課題であることを示し、新規治療薬の必要性を強調しています。したがって、COPDに対するより効果的な治療法の特定は非常に重要です。

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開示事項

著者は利益相反がないと宣言します。

謝辞

著者には謝辞はありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BEAS-2B human bronchial epithelial cellsSunnCell, 中国SC-0218ヒト気管支上皮細胞株 in vitro 研究用
C57BL/6 miceVital River Laboratories, 中国213動物モデル in vivo 実験用COPD
CB-DOCK2中国https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.phpリガンドと受容体タンパク質間の分子ドッキングシミュレーション用
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Beyotime Biotechnology, 中国C0038細胞の生存率と増殖の検出
CellEvent™ Senescence Green Detection KitThermo Fisher, 米国C10851細胞老化の検出
CigarettesHongta, 中国提供されていません煙露法とCSE調製に使用する煙草
CTD米国https://ctdbase.org/COPD関連遺伝子を取得用
DCFH-DA 蛍光プローブSigma-Aldrich, 米国D6883-50MG細胞内ROSレベルの検出
Dexamethasone (DEX)Yeasen, 中国40323ES03複合介入用グルココルチコイド
DMEM/F12 培地Gibco, 米国11330032BEAS-2B 細胞培養用基底培地
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, 米国10270106細胞培養培地用サプリメント
GraphPad Prism GraphPad Software, 米国9.3.1データ統計分析とグラフ描画
IsofluraneRWD Life Science, 中国R510-22-10動物安楽死用吸入麻酔薬
Lipid Peroxidation MDA Assay KitBeyotime Biotechnology, 中国S0131S細胞内マロニアルデヒド（MDA）含有量の検出
Lipofectamine 2000Thermo Fisher, 米国11668030siRNA 配送用トランスフェクション試薬
Multimode microplate readerThermo Fisher, 米国VL0000D0吸光度と蛍光値の検出
Navios EX Flow CytometerBeckman Coulter, 米国B80912ROS と老化細胞の分析
Penicillin/streptomycinHyClone, 米国SV30010細菌汚染を防ぐための抗生物質
Power SYBR™ Green Master MixThermo Fisher, 米国4367659蛍光定量PCR増幅
PrimeScript™ RT reagent KitTakara, 日本RR037QcDNA 合成用逆転写
PubChem データベース米国https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ベータ-シトステロールの標準的な SMILES 配列と3D SDF 構造情報の取得用
QuantStudio Dx PCR InstrumentThermo Fisher, 米国4479889リアルタイム RT-qPCR 検出
RCSB PDB米国https://www.rcsb.org/GR 結晶 3D 構造ファイル取得用
RNA/Protein Isolation KitBeyotime Biotechnology, 中国R0018S細胞および肺組織からの総RNA抽出
si-GRsiDirect 2.1 を用いて in silico で設計カスタム合成ガイド: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; 乗客: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, GR のノックダウン
si-NCThermo Fisher, 米国4390843細胞および in vivo 実験のネガティブトランスフェクションコントロールとして使用
SwissTargetPrediction データベーススイスhttp://swisstargetprediction.ch/潜在的な薬物関連タンパク質ターゲットの in silico 予測用
TCMSP データベース中国https://www.tcmsp-e.com/ハーブ成分スクリーニングとターゲット予測用
TTDシンガポールhttps://db.idrblab.net/ttd/検証済みのCOPD関連疾患遺伝子の収集用
Whole-body smoke exposure chamberTeague Enterprise, 米国TE-2喫煙誘発COPDモデルの確立
β-sitosterolChemicalBook, 中国83-46-5薬物治療用の活性フィトステロール

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