グルココルチコイド受容体を用いた慢性閉塞性肺疾患治療におけるβ-シトステロールのネットワーク薬理学および実験的研究

サマリー

β-シトステロールはCOPDを緩和し、デキサメタゾンの有効性を高め、グルココルチコイド受容体がこの効果を媒介しました。さらに、βシトステロールはCSE刺激された気管支上皮細胞およびタバコの煙誘発性COPDマウスの両方において、炎症、酸化ストレス、細胞老化を軽減しました。

要約

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、持続的な炎症、酸化ストレス、進行性の肺機能低下を特徴とする一般的な呼吸器疾患です。COPDにおけるβシトステロールの治療的可能性はまだ明らかではありません。本研究は、βシトステロールのCOPDに対する保護効果を調査し、その根本的なメカニズムを明らかにすることを目的としました。データベーススクリーニングにより、グルココルチコイド受容体(GR)がβシトステロールの潜在的な標的として特定されました。タバコの煙誘発COPDマウスモデルと、タバコ煙抽出物(CSE)刺激BEAS-2B細胞モデルを確立しました。肺機能、肺損傷関連マーカー、炎症、酸化ストレス、細胞老化は、RT-qPCR、DCFH-DA蛍光プローブアッセイ、老化検出キットを用いて評価されました。βシトステロール単独またはデキサメタゾン(DEX)との併用の効果も評価されました。βシトステロールは肺機能を有意に改善し、肺損傷関連マーカーを正常化し、CSE刺激されたBEAS-2B細胞およびタバコ煙曝露マウスの両方において炎症、酸化ストレス、細胞老化を軽減しました。これらの保護効果はGR発現の増加を伴っていました。さらに、β-シトステロールはDEXへの反応性を高め、β-シトステロールとDEXの併用治療は、DEX単独治療よりも肺機能、肺損傷マーカー、炎症、活性酸素種レベル、細胞老化において大きな改善をもたらしました。これらの発見は、βシトステロールがGR発現を上方調節し、治療効果を高めることで少なくとも部分的にCOPD関連の病理学的変化を緩和することを示唆し、COPD治療の補助戦略としての可能性を示しています。

概要

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、持続的な気道炎症、歯槽障害、不可逆的な気流閉塞を特徴とする進行性呼吸器疾患であり、呼吸機能を損ない、生活の質を低下させます^。発症率は年齢とともに大きく増加し、65歳以上の人のリスクは⁴²歳未満の約5倍です。この人口動態の傾向は、疾病発生率、死亡率、障害の増加と関連しています^。3.疫学的予測によると、2030年までにCOPDは世界で4番目に多い死因となり、全死亡の約5%を占める^{可能性があります。}現在、特定されたリスク要因には遺伝的感受性、肺形成不全、微粒子状物質曝露、慢性気管支炎、呼吸器感染症^{が含まれます。}

リスク要因の中で、タバコの煙は^COPDの最も重要な病原性因子です。この薬には、気管支上皮損傷を引き起こし、炎症細胞の浸潤を促進し、^肺組織の再形成を引き起こす数千種類の化学物質が含まれています。長期曝露は持続的かつ不可逆的な上皮損傷を誘発し、多数の炎症促進ケモカインの放出を促進し、ROS産生(ROS)を有意に増加させ、細胞アポトーシスを誘発する可能性があります¹⁰。多くの研究では、インターロイキン8(IL-8)や腫瘍壊死因子α(TNF-α)などの炎症促進ケモカインの増加、過剰なROS産生および細胞老化がCOPDの重症度と密接に関連していることが示されています^11,12。これは、COPDにおいて保護的かつ治療効果を発揮するために、これらの主要な病原性因子を効果的かつ安全に調節できる薬剤の必要性を強調しています。

フィトステロールは、植物の細胞膜に広く存在する天然の生物活性化合物です。その中でβシトステロールが最も豊富で、脂質を豊富に含む植物由来食品(^野菜、ナッツ、種子、オリーブオイルなど)に広く分布^{しています。}研究により、ラットおよびマウスで最大1000 mg/kgのβシトステロール投与は細胞毒性や遺伝子毒性と関連しないことが確認されています¹⁷。さらに、研究によりβシトステロールは抗酸化酵素やヒトエストロゲン受容体への作用を通じて抗酸化特性を示すことが示されています¹⁸。

β-シトステロールは、抗炎症作用¹⁹、解熱作用²⁰、鎮痛作用²¹、抗糖尿病作用¹³を含む幅広い薬理学的活性を示します。また、大腸炎や腸の炎症など様々な疾患モデルで治療の可能性^{を示しており、}抗動脈硬化作用²³ および免疫調節特性²⁴も有しています。さらに、安全性も良好です。これらの特性から、βシトステロールは薬剤候補として大きな関心を集めています。しかし、COPDにおけるその正確な役割や根本的なメカニズムは、依然として大部分が不明瞭です。

したがって、本研究はCOPDにおけるβ-シトステロールの潜在的な治療効果およびその根本的なメカニズムを調査することを目的としました。具体的には、タバコ煙抽出物(CSE)誘発性BEAS-2B細胞損傷モデルを用いて、βシトステロールがCSE介在性細胞損傷を効果的に緩和できるかどうかを評価し、COPD治療戦略の新規候補分子を特定しました。

プロトコル

本研究は、実験および^{臨床試験の}基礎・臨床薬理学および毒性学ガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験プロトコルは、浙江大学医学院第二附属病院動物倫理委員会(承認番号20230102)によって承認され、すべての実験は動物倫理委員会の指針に従って実施されました。この研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

ネットワーク薬理学を通じた主要成分および標的のスクリーニング

Fritillaria cirrhosa D. Don、Lonicera japonica Thunb.、Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.、およびAdenophora stricta Miq.の活性成分。これらは中医体系薬理学データベース(TCMSP、2024年3月12日アクセス)から取得されました。候補化合物は以下のADME基準でスクリーニングされました:経口バイオアバリアビリティ(OB)≥30%、薬物類似性(DL)≥0.18、Caco-2浸透率≥−0.425。これら3つの基準すべてを満たす化合物は、後続解析のために有効成分候補として保持されました。

β-シトステロールの標準的な簡略分子入力ライン入力システム(SMILES)構造はPubChem(2024年3月18日アクセス)から取得され、SwissTargetPrediction(2024年3月21日アクセス)にインポートされ、ターゲット予測が行われました。ホモ・サピエンスが対象種に選ばれました。潜在的な標的は、データベース内の既知の配位子βとの間の2次元および3次元構造的類似性に基づいて予測されました。確率が0を超える予測ターゲットは保持し、重複したエントリは削除されました。

COPD関連遺伝子は、治療標的データベース(TTD;2024年3月25日アクセス)および比較毒性ゲノミクスデータベース(CTD;2024年3月28日アクセス)から「慢性閉塞性肺疾患」というキーワードを用いて取得されました。重複遺伝子を除去した後、COPD関連遺伝子を予測されたβシトステロール標的と交差させ、βシトステロールの治療効果に関与する可能性のある候補標的を特定しました。

β-シトステロールとGRの分子ドッキング

SDF形式のβ 3次元構造はPubChemデータベース(2026年6月2日アクセス)から取得され、グルココルチコイド受容体(GR)の結晶構造は構造生物情報学タンパク質データベース研究共同研究所(RCSB PDB、2026年6月3日アクセス)から取得されました。リガンドおよび受容体構造の標準的な準備後、CB-Dock2オンラインプラットフォーム(2026年6月3日アクセス)を用いて分子ドッキングが行われました。準備済みのリガンドと受容体のファイルはプラットフォームにアップロードされ、ドッキング計算はデフォルトのパラメータで行われました。

遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の機能豊か解析

すべての予測されたβシトステロール標的遺伝子をGO機能豊化およびKEGG経路濃縮解析に適用しました。生物学的プロセス、細胞成分、分子機能、シグナル伝達経路の有意に濃縮された結果は、 補足ファイル1 に分類され、後続のバイオインフォマティクス解析のために保存されました。

動物のモデリングとグループ化

サンプルサイズは、G*Powerソフトウェアを用いた事前検出力分析(α = 0.05、検出力=0.80)を行った以前の研究に基づき、1群あたり6頭に設定され、n=6で生物学的に関連性のある差を検出するのに十分であることを示しました。²⁶。6〜8週齢の雄C57BL/6マウス(20 ± 2 g)は、対照群、COPDモデル群、COPD + デキサメタゾン(DEX)群、COPD + β-シトステロール群、COPD + DEX + β-シトステロール群の5つのグループに無作為に割り当てられました。マウスは標準的な実験室環境(25°C、12時間の明暗サイクル)で飼育され、標準的な食事と水に自由にアクセスされ、実験前に1週間の慣性を許されました。

COPDモデルの確立では、マウスを全身のタバコ煙曝露チャンバー(63 cm × 55 cm × 45 cm)に入れ、12週間にわたり主流のタバコ煙にさらしました。各タバコには10mgのタール、0.9mgのニコチン、10mgの一酸化炭素が含まれていました。煙曝露は週5日、午前9時30分と午後3時に1日2回実施され、18本のタバコから90分間チャンバーに投入された煙が²⁷セッションあたり90分発生しました。

介入の治療効果を評価するため、8週間のタバコ煙曝露後に薬物投与を開始し、その後4週間継続しました。9週目から、各治療群のマウスは、喫煙曝露の1時間前に毎日胃内投与でDEX(1 mg/kg)²⁸またはβ-シトステロール(50 mg/kg)^29,30 を受けました。過去の薬理動態研究では、齧歯類におけるβ-シトステロールの経口バイオアベイリーは約4%と^{報告されています。}さらに、いくつかのマウス研究では20から50 mg^/kgまでの投与量が用いられています。したがって、前臨床試験で一般的に用いられる範囲内に保ちつつ、十分な全身曝露を確保するために50 mg/kgの用量が選択されました。

対照群のマウスはろ過された室内空気にさらされ、モデル群と処理群のマウスは同等量の生理食塩水を載体として投与されました。実験期間終了時には、マウスはイソフルランによる深い麻酔を受け、足反射を失い、腹部大動脈採血による大量出血で安楽死させました。胸腔は直ちに開かれ、両側肺組織は慎重に切除され、氷のように冷たいリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で洗浄され、氷の上に置かれました。気管支肺泡洗浄液(BALF)採取では、気管をカニューレし、冷たい無菌PBSで洗浄し、これを優しく注入・抽出して洗浄液を採取しました。肺組織とBALFサンプルは氷上に保管され、その後下流解析のために処理されました。

BEAS-2B細胞培養

BEAS-2Bヒト気管支上皮細胞は、37°Cで5%CO₂下で10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle Medium/F12(DMEM/F12)に維持されました。

CSE製剤とBEAS-2B細胞曝露

BEAS-2B細胞はリン酸塩緩衝塩水で洗浄され、24ウェルプレートに3枚の3枚で5個×^10個4 細胞の密度でシードされました。培養12時間後、細胞は約60%のコンバーシティに達し、その後CSE曝露されました。CSEは前述通り新しく準備され、わずかな修正を加えた³³。簡単に言えば、1本のろ過されていない市販タバコが連続燃焼され、主流の煙を真空ポンプで10 mLの血清なし培地に、約5分間、一定流量1.05 L/min(約−11 kPa負圧)で蒸気を噴射し、タバコが完全に燃え尽くすまで続けました。得られた溶液はまず大きな粒子状不純物を除去するために予備ろ過を行い、その後0.22μmの無菌微細孔質フィルターで滅菌して残留粒子を除去しました。その結果得られるストック溶液は100%CSEと定義されました。新たに調製されたCSEはすべて、ろ過直後に細胞処理に使用され、保管されませんでした。細胞は2.5%のCSEを含む培地で刺激されました。CSE処理24時間後、培養上清液を-40°Cで採取し、後^{続分析のために}保存しました。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)

BEAS-2B細胞から全RNA抽出キットを用いて全RNAを抽出し、製造元の指示に従って逆転写キットでcDNAに逆転写しました。RT-qPCRはその後、リアルタイムPCR検出システムとSYBR GreenベースのqPCRマスターミックスを用いて実施されました。すべてのRT-qPCR実験は、データの信頼性を確保するために、サンプルごとに3回の生物学的複製と3回の技術的重複で実施されました。

各qPCR反応は合計20μLで行われ、10μLのSYBR Green qPCRマスターミックス、0.4μLの前方プライマー、0.4μLの逆プライマー、2μLの希釈cDNAテンプレート、7.2μLのRNaseフリー水が含まれていました。増幅条件は以下の通りです:95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで10秒間の変性40サイクル、60°Cで30秒のアニーリング/伸縮。相対的な遺伝子発現レベルは2^−ΔΔCt法を用いて計算され、GAPDHが内部参照遺伝子として機能しました。本研究で使用されたプライマー配列は 補足表1に記載されています。

細胞内活性酸素種(ROS)分析

BEAS-2B細胞における細胞内ROS産生は、フルオロゲンプローブ2′,7′-ジクロロジヒドフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて評価され、フローサイトメトリーで解析されました。フローサイトメトリウム取得時には、標準的な前方散乱(FSC)および側散乱(SSC)ゲート戦略を用いて細胞残骸を排除し、完全な単一細胞を選択しました。各サンプルごとに合計10,000件の有効な細胞イベントが取得されました。励起波長と発光波長はそれぞれ488 nmと525 nmに設定されました。その後、フローサイトメトリクスデータを解析し、細胞内ROS蛍光強度を定量化しました。

マロンジアルデヒド(MDA)レベル決定

細胞内MDA含有量は、製造元の指示に従い脂質過酸化アッセイキットを用いて測定されました。簡単に、処理済みのBEAS-2B細胞を採取・溶解し、低温で遠心分離して上清液を採取しました。その後、チオバルビツ酸(TBA)比色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて532 nmの吸収を測定しました。相対的なMDAレベルは標準曲線に従って計算されました。

細胞老化評価

細胞老化は、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性に基づく老化検出アッセイを用いて評価されました。SA-βガル陽性細胞はフローサイトメトリーで定量されました。同時に、老化関連マーカーp53およびp21のmRNA発現レベルはRT-qPCRで測定されました。

細胞増殖アッセイ

細胞増殖は比色細胞生存能力アッセイキットを用いて評価されました。吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。

GRノックダウンアッセイ

細胞トランスフェクションは脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて行われました。以下のオリゴヌクレオチドがトランスフェクトされました:グルココルチコイド受容体標的の小型干渉RNA(si-GR)および陰性対照の小型干渉RNA(si-NC)。GRを標的とした候補siRNA配列は、オンラインバイオインフォマティクスプラットフォームのsiDirect 2.0を用いて設計されました。トランスフェクション後、細胞は48時間培養され、すべてのsiRNAは最終濃度50 nMで使用されました。ノックダウン効率はRT-qPCRを用いてGR mRNA発現を測定することで検証されました。

車両対照群はβシトステロール処理およびトランスフェクション実験の両方に含まれました。βシトステロール介入では、車両溶媒のみで処理された細胞が車両対照群(CSE+0と表記)として機能しました。統計解析により、車両対照群と空白対照群間で有意差は認められなかった。

統計解析

すべての定量的結果は、3つの生物学的に独立した in vitro 実験の平均±標準偏差として表されました。統計解析は統計解析ソフトウェアを用いて実施されました。Shapiro–Wilk検定は統計検定前にデータセット分布の正規性を調べるために用いられました。分散解析後の複数比較(ANOVA)後の P 値を調整するためにボンフェローニ事後補正が採用されました。2つのグループ間の比較は、ペアなしの学生t検定で評価され、複数グループ比較では一方向または二方向ANOVAが用いられました。 p値≤0.05は統計的に有意とされました。

結果

βシトステロールはCOPD治療のための潜在的な天然産物でした

報告されている治癒効果は、 Fritillaria cirrhosa D. Don、 Lonicera japonica Thunb.の乾燥花、 Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.の乾燥根、および Adenophora stricta Miqの報告によるものです。肺疾患治療において^{35、36、37、38}において、本研究はTCMSPデータベースを用いてこれらの伝統中国薬草(TCM)の有効成分を体系的に特定しました。βシトステロールはこれらの中医薬草に共通する重要な有効成分として特定されました(図1A)).β-シトステロールの分子メカニズムを体系的に探求するため、そのSMILES構造情報はPubChemデータベースから取得され、ターゲット予測のためにSwissTargetPredictionデータベースにインポートされました。予測確率が0を超えるすべての予測対象は、後続解析のために保持されました。その結果得られた成分-標的相互作用ネットワークは、β-シトステロールとその候補標的との間のネットワークを可視化し、 図1Bに示しました。SwissTargetPredictionデータベースを用いて、合計43の推定標的遺伝子がβシトステロールの標的遺伝子を予測しました。その後、βシトステロールの標的遺伝子に対してGO機能豊か化およびKEGG経路濃縮解析を行い、すべての完全な濃縮データセットは 補足ファイル1にアーカイブされました。特に、ステロイド代謝過程が著しく濃縮された経路の一つとして特定されました。蓄積された文献は、^{COPDにおける}異常なステロイド代謝とグルココルチコイド耐性との密接な相関を示しています。さらに、GRはステロイド代謝に関連する機能クラスター内で明確に濃縮されていました。この発見は、βシトステロールがDEX感度を向上させGR発現レベルを変化させるメカニズムを調査する後の細胞実験において重要なバイオインフォマティクス的支援を提供します。

COPDに関連する遺伝子はTTDおよびCTDデータベースから取得されました。その後のVenn交差解析(図1C)では、β-シトステロール標的とTTD由来COPD関連遺伝子間で2つの重複遺伝子、β-シトステロール標的とCTD由来COPD関連遺伝子間で2つの重複遺伝子、TTDおよびCTDデータセット間で5つの共通COPD遺伝子が明らかになりました。最終的に、GRは3つのデータセットすべてに共通する唯一の遺伝子であり、COPDに対するβ-シトステロールの中核標的と定義されました。ベン分析の詳細な数値データは 補足ファイル2に記載されています。結合親和性のさらなる検証のために、β-シトステロールとGRの分子ドッキングが行われました(図1D)。Vinaスコアが−7.0 kcal/mol未満の結合ポケットは、良好な結合親和性を示すと考えられました。ポケットC1とC5のVinaスコアはそれぞれ−8.8と−7.2 kcal/molであり、β-シトステロールとGRの間に強い相互作用が予測されていることを示しています。

βシトステロールはBEAS-2B細胞をCSE損傷から守り、これはGR発現の上昇と関連している可能性があります

β-シトステロールはCSEによるBEAS-2B細胞損傷のモデルにおいて有意な保護効果を示しました。CSE+0群は、βシトステロールなしのCSEと同量の薬物溶媒を投与する車両対照群として設計されました。予想通り、CSE群とCSE+0群間で有意差は認められませんでした。この化合物は、濃度依存的にCSE誘発されたTNF-αおよびIL-6の産生を阻害しました(図2A)。また、細胞内ROSレベルも低下させました(図2B)。β-シトステロールはMDA含有量を有意に減少させ(図2C)、CSE誘発性細胞老化を抑制し(図2D)、老化関連マーカーp53およびp21のダウンレギュレーションも行いました(図2E)。これらの効果には、GR mRNA発現のアップレギュレーション(図2F)が伴い、その保護機能がGRの転写上アップレギュレーションと密接に関連している可能性が示唆されています。試験された濃度範囲内では、β-シトステロールはBEAS-2B細胞の生存率に明らかな細胞毒性を及ぼさず(図2G)、この化合物に対する細胞耐性が良好であることを示しました。20 μg/mL(約48.2 μM)が最も強力な抑制効果を示したことから、この用量が後続の実験で選ばれました。10 μg/mL群と20 μg/mL群の間で炎症性サイトカイン抑制に関して統計的に有意な差は認められませんでしたが、20 μg/mLのβシトステロール群は炎症因子レベルの軽度の低下傾向を示しました。さらに、10 μg/mLと比較して、20 μg/mLはCSE誘発性ROSおよびMDA蓄積の抑制、細胞老化の減少、GR mRNA発現のアップレギュレーションにおいて優れた効果を達成しました。これにより、追跡救済アッセイの最適作業濃度として20 μg/mLを選択することが可能になりました。

RT-qPCR結果(図2H)によりGRノックダウンが成功したことが確認されました。si-GR群のGR mRNAレベルはsi-NC対照群と比較して約78%減少し、その後の救済アッセイにおけるGRサイレンシングの効率が検証されました。GRノックダウン後、β-シトステロールの炎症因子およびROSに対する抑制作用は有意に逆転しました(図2I、J)。同様に、β-シトステロールによる細胞老化の減衰も無効化されました(図2K)。これらの結果を総合すると、βシトステロールがGR媒介の抗炎症、抗酸化、抗老化機構を通じて、CSEによる気管支上皮細胞の損傷から保護的な役割を果たしていることが示されました。

βシトステロールは、COPDのマウスモデルにおいてDEXの肺機能および炎症に対する治療効果を高めました

タバコの煙曝露によって確立されたCOPDのマウスモデルでは、βシトステロール、デックス、またはそれらの組み合わせによる治療が明らかな保護効果を示しました。複数のグループ間の統計比較は一方向ANOVAを用いて解析され、その後Tukeyの事後検定が行われました。実験コホートを区別するために5つの異なる記号スタイルが適用されました:コントロールグループには円、モデルグループには三角形、モデル+DEXグループにはアスタリスク、モデル+β-シトステロールグループには四角形、モデル+DEX+β-シトステロールグループにはダイヤモンドが使われました。各水平括弧は、2つの連結した実験群間の統計的比較を表しています。

対照群と比較して、COPDモデル群のマウスは0.1秒で強制呼気量(FEV₀.₁)、強制生命活量(FVC)、ピーク呼気流量(PEF)、およびFEV₀.₁/FVC比で著しい減少を示しました。図3A–Dに示すように、FEV₀.₁/FVC(平均体型)比率が70%未満であれば、COPDモデルの確立に成功することが確認されました。DEXまたはβシトステロール単独投与は、モデルマウスと比較してこれらの肺機能障害を有意に改善し、併用治療により単剤投与よりもさらに改善が見られました。さらに、MMP-9/TIMP-1比率の変化は気道再構築の特徴的な分子マーカーであり、MUC5AC発現の上昇は過剰な粘液過剰分泌を示します^40,41。さらにMMP-9、TIMP-1、粘液マーカーMUC5ACのmRNAレベルを検出し、MMP-9/TIMP-1比率を算出しました(図3E、F)。モデル群ではMMP-9/TIMP-1比率が著しく増加し、MUC5ACの発現が上昇しました。DEXまたはβ-シトステロール単独で両方のパラメータを効果的に低減し、併用治療は単独療法に比べて阻害効果が優れていました。

COPDモデルマウスでは、TNF-αおよびIL-6のBALFレベルが著しく上昇し、対照マウスと比較して肺のROS濃度も増加しました。DEXまたはβ-シトステロール単独で炎症性サイトカインレベルと酸化ストレスを著しく低下させ、併用治療により強い抑制効果が得られました(図3G、H)。さらに、COPDモデルマウスでは肺GRのmRNA発現が著しくダウンレギュレーションされました。DEXまたはβ-シトステロール単独でGR発現を有意に上行調節し、併用治療ではさらにGRレベルが上昇しました(図3I)。

これらの発見は、βシトステロールが肺機能を維持し、炎症を抑制し、酸化ストレスを緩和し、GR発現を高めることでマウスのCOPD関連病変から守ることを示しました。さらに、βシトステロールの併用投与は、このモデルにおけるDEXの保護効果を強化しました。

βシトステロールは、CSE誘導BEAS-2B細胞モデルにおけるGR経路の調節を通じてDEX治療効果を高めました

CSE誘導のBEAS-2B細胞モデルでは、DEX単独療法は炎症性サイトカインのmRNA発現を有意にダウンレギュレーションし、細胞内ROSおよびMDAレベルを低下させ、老化細胞の割合および老化マーカーp53およびp21の発現を減少させました。これらの結果は、DEXの抗炎症作用、抗酸化作用、抗老化活性を裏付けています。特に、βシトステロールの併用はDEXの保護効果をさらに強化し、DEX単独療法と比較して炎症、酸化ストレス、細胞老化の抑制が強化されました。DEX + β-シトステロール共治療群でGRノックダウン(si-GR)が行われた際、結合療法に対する細胞応答は著しく鈍化しました。 図4A–Eに示されているように、DEXとβ-シトステロールの共媒介炎症、酸化ストレス、老化の抑制が有意に逆転しており、GR欠乏がDEXの有効性に対する有益βな効果を弱めていることを示しました。

これらの発見は、β-シトステロールがDEXの有効性を高め、おそらくGR関連プロセスを調節することでDEXの保護効果を高めることを示しました。これにより、CSE誘発性の気管支上皮細胞損傷に対するDEXの保護効果が強化されました。

データの利用可能性:

本研究の調査結果を裏付けるすべての生データは補足資料(補足ファイル1、 補足ファイル2)に提供されています。

図1: COPD治療におけるβ-シトステロールの重要な役割。 (A) Fritillaria cirrhosa D. Don、 Lonicera japonica Thunb.の乾燥花、および Glehnia littoralis の乾燥根の活性成分 F. Schmidt ex Miq.そして アデノフォラ・ストリクタ・ ミク。TCMSPデータベースを通じてスクリーニングされました。(B) β-シトステロールの潜在的な標的。(C) β-シトステロール下流標的およびCOPD関連遺伝子の交差解析。(D) β-シトステロールとGRタンパク質間の分子ドッキング解析。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:βシトステロール関連保護におけるGRの関与。(A) β-シトステロールによるCSE誘発炎症メディエーター(TNF-α、IL-6)の濃度依存的調節。(B) βシトステロール用量がCSE曝露細胞におけるROSレベルに与える影響。(C) βシトステロールがCSE上位調節したMDA含有量に与える影響。(D) β-シトステロールがCSE促進細胞老化に与える影響。(E) CSE刺激下のβ-シトステロールによる老化関連p53およびp21の調節。(F) CSE刺激下でのGR発現のβ-シトステロール濃度依存性調節。(G) BEAS-2B細胞内の検査濃度におけるβ-シトステロールの細胞生存率。(H)GR標的siRNAトランスフェクション後のノックダウン効率を検証するためのGR mRNA発現のRT-qPCR検出。(I) CSE誘発炎症因子に対するGRとβ-シトステロールの調節関連。(J) CSE誘発ROS蓄積に対するGRとβ-シトステロールの調節関連。(K) GCE誘発性細胞老化に対するGRとβ-シトステロールの調節関連。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;特に重要ではありません。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:COPDモデルマウスにおけるβシトステロールとDEXの組み合わせが肺機能、炎症、酸化ストレス、GR発現に与える影響。(A) COPDマウスにおける0.1秒(FEV₀.₁)での強制呼気量の変化。(B) COPDマウスにおける強制肺活量(FVC)の変化。(C) COPDマウスにおけるピーク呼気流量(PEF)への影響。(D)COPDモデルマウスにおけるFEV₀.₁/FVC比。(E) 気道再構築を反映したMMP-9/TIMP-1の相対mRNA比。(F) MUC5ACの相対的なmRNA発現は、マウス肺組織における粘液過剰分泌を示す。 (G) 気管支肺胞洗浄液中のTNF-αおよびIL-6のレベル(BALF)。(H)COPDマウスの肺組織におけるROS産生。(I) マウス肺組織におけるGRの相対mRNA発現。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:CSE誘導BEAS-2B細胞におけるβ-シトステロールがGR媒介DEX耐性に与える影響。(A) 各群における炎症因子(TNF-α、IL-6)の相対的なmRNA発現。(B)各グループのROSレベルです。(C)各実験群のMDA含有量。(D) 各グループにおける老化したBEAS-2B細胞の割合。(E) 老化関連マーカーp53およびp21の相対mRNAレベル。**p < 0.01;p < 0.001。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足表1:RT-qPCR解析に使用されるプライマー配列。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:βシトステロール標的遺伝子の完全なGOおよびKEGG濃縮解析データセット。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2:βシトステロールとCOPDの重なり標的を特定するベン分析の詳細な数値結果。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

COPDは世界的な大きな疾病負担をもたらし、^{世界の健康にとって}依然として大きな課題です。現在のCOPDの管理は、薬理学的介入と非薬物的介入の両方を含み^ます。薬物治療の中で、グルココルチコステロイド(GCs)は慢性炎症性疾患に広く使用されています。これらはGRに結合し、ヒストン脱アセチルゼ2を転写複合体に誘導してヒストンアセチル化を逆転させる作用をします⁴³。しかし、複数の研究でCOPD患者のGC感受性が低下することが示^{されており、この}疾患におけるGC耐性の証拠も示されています⁴⁶。これらの発見は、GC耐性の克服が重大な臨床的課題であることを示し、新規治療薬の必要性を強調しています。したがって、COPDに対するより効果的な治療法の特定は非常に重要です。

これまでの研究では、γシトステロールがCOPD⁴⁷における気管支上皮細胞に抗増殖効果を発揮することが示されています。植物ステロールの一般的な生物活性成分である植物ステロールγシトステロールおよびβシトステロールは、COPDにおける植物ステロールの作用に関する現在の理解を拡張し、β-シトステロールが疾患の病因に保護的価値を持つ可能性を強調しています。私たちの発見は、βシトステロールが炎症因子の放出を有意に抑制し、酸化ストレスを軽減し、細胞の老化を抑制することを明らかにしました。これは、βシトステロールがIL-6、誘導性一酸化窒素シンターゼ、TNF-α⁴⁸などのリポ多糖誘導炎症メディエーターのアップレギュレーターのアップレギュレーターを効果的に抑制するという以前の報告と一致しています。これらの発見は、その抗炎症活性を裏付け、異なる炎症モデル間での一貫性を支持しています。

吸入型GCは気道の炎症を抑える効果的な抗炎症薬です。主に^GR49に結合し活性化することで作用します。しかし、COPDの重要な病理的特徴は、GCsの抗炎症作用に対する細胞の感受性低下である⁴⁴。一般性共存性(GR)のダウンレギュレーションまたは機能障害は、COPD患者におけるGC耐性の発達の主要なメカニズムと考えられています⁵⁰。過去の研究では、特定の薬剤がGC感受性を高めることが示されています。例えば、アジスロマイシンとブデソニドの組み合わせは、いずれの薬剤単独よりもIL-4およびCXCL8産生に対して有意に強い抑制効果をもたらします⁵¹。

特筆すべきは、本研究で、タバコの煙曝露COPDマウスモデルおよびCSE誘発BEAS-2B細胞モデルの両方において、β-シトステロールとDEXの組み合わせが、DEX単独よりも炎症因子、酸化ストレス、細胞老化に対して有意に強い抑制効果を示したことである。この組み合わせはまた、マウスにおけるCOPD関連の病理変化や気管支上皮細胞損傷に対するDEXの保護効果を大幅に高めました。この結果は、βシトステロールが気管支上皮細胞のDEX感受性を改善し、一部のCOPD患者におけるGC感受性の低下や耐性に対処する新しいアプローチを提供する可能性を示唆しています。in vitro の定量的PCR結果と一致して、βシトステロールはGRの作動薬や拮抗薬として直接作用するのではなく、濃度依存的にGR mRNAレベルを上昇させます。検証されたsi-GRノックダウン効率とその後の機能救済アッセイにより、β-シトステロールは直接GRを活性化するのではなく、細胞内の総GRレベルを高めることで細胞GC応答性が改善され、標準的なGR作動薬であるDEXと組み合わせることで治療効果が強化されることがさらに裏付けられています。したがって、GR発現の変化はβ-シトステロールの作用と関連している可能性があり、これはCOPD患者の気道平滑筋細胞におけるGRおよびその有効アイソフォームGRαが有意に減少した過去の観察と一致しています⁵²。重要なのは、GRノックダウン実験により、この受容体がβシトステロール介在の細胞保護において中心的役割を果たすことが明らかになり、βシトステロールの生物学的機能の一部がGR経路の完全性に依存していることが示されたことです。

総合的に見て、本研究はGRがCOPD介入におけるβ-シトステロールの主要な媒介者として機能する可能性を明らかにするだけでなく、DEX耐性という臨床的課題を克服するための新たなアプローチの可能性を示し、GR経路を標的とした自然療法の開発に向けた実験的基盤を築くことを示しています。

しかし、本研究にはいくつかの制約がありました。まず、肺機能はCOPDマウスモデルの確立成功を確認するためのみ評価され、ヘマトキシリン・エオシン(HE)およびマソン染色は、肺気腫、気道再形成、粘液過剰分泌などの典型的な病理的特徴をさらに検証するために行われませんでした。すべての固定肺標本が以前の実験で消費されていたため、12週間のタバコ煙誘発COPDマウスモデルの再構築は、利用可能な研究期間内で実現不可能でした。この制限を部分的に補うため、保存された肺RNAサンプルを用いてMMP-9/TIMP-1比率およびMUC5AC mRNA発現レベルを定量化しました。次に、生体内で評価されたβシトステロールとDEXの単一併用投与のみであり、用量反応や相乗効果は体系的に調査されませんでした。複数の投与量の組み合わせを取り入れたさらなる研究が、潜在的な相乗効果を特徴づけるために必要とされています。第三に、実験の制約と研究コストのため、各グループに含まれたマウスは6匹のみでした。比較的少ないサンプルサイズが動物間変動への感受性を高め、結果の統計的堅牢性を制限した可能性があります。今後、より大きなサンプル数の研究で現在の結果をさらに検証する必要があります。第四に、安定したDEX耐性細胞株は確立されませんでした。したがって、βシトステロールが既存のグルココルチコイド抵抗性を逆転させる能力は直接評価できませんでした。この潜在的なメカニズムをさらに調査するために、検証済みのグルココルチコイド抵抗性モデルを用いた追加の研究が必要です。

結論として、これらの発見は、GRシグナル伝達がBEAS-2B細胞におけるCSE誘発損傷に対するβシトステロールの保護効果、すなわち炎症因子放出の抑制、酸化ストレス、細胞老化の抑制、肺機能および肺損傷バイオマーカーの改善に関与している可能性を示唆しています。さらに、βシトステロールはこれらの細胞のDEXに対する治療感受性を高めました。これらの発見は総合的に、βシトステロールがCOPDの新規治療戦略の開発に寄与する可能性のある自然の候補分子であることを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, 中国	SC-0218	ヒト気管支上皮細胞株 in vitro 研究用
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, 中国	213	動物モデル in vivo 実験用COPD
CB-DOCK2	中国	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	リガンドと受容体タンパク質間の分子ドッキングシミュレーション用
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, 中国	C0038	細胞の生存率と増殖の検出
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, 米国	C10851	細胞老化の検出
Cigarettes	Hongta, 中国	提供されていません	煙露法とCSE調製に使用する煙草
CTD	米国	https://ctdbase.org/	COPD関連遺伝子を取得用
DCFH-DA 蛍光プローブ	Sigma-Aldrich, 米国	D6883-50MG	細胞内ROSレベルの検出
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, 中国	40323ES03	複合介入用グルココルチコイド
DMEM/F12 培地	Gibco, 米国	11330032	BEAS-2B 細胞培養用基底培地
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, 米国	10270106	細胞培養培地用サプリメント
GraphPad Prism	GraphPad Software, 米国	9.3.1	データ統計分析とグラフ描画
Isoflurane	RWD Life Science, 中国	R510-22-10	動物安楽死用吸入麻酔薬
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, 中国	S0131S	細胞内マロニアルデヒド（MDA）含有量の検出
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, 米国	11668030	siRNA 配送用トランスフェクション試薬
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, 米国	VL0000D0	吸光度と蛍光値の検出
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, 米国	B80912	ROS と老化細胞の分析
Penicillin/streptomycin	HyClone, 米国	SV30010	細菌汚染を防ぐための抗生物質
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, 米国	4367659	蛍光定量PCR増幅
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, 日本	RR037Q	cDNA 合成用逆転写
PubChem データベース	米国	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	ベータ-シトステロールの標準的な SMILES 配列と3D SDF 構造情報の取得用
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, 米国	4479889	リアルタイム RT-qPCR 検出
RCSB PDB	米国	https://www.rcsb.org/	GR 結晶 3D 構造ファイル取得用
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, 中国	R0018S	細胞および肺組織からの総RNA抽出
si-GR	siDirect 2.1 を用いて in silico で設計	カスタム合成	ガイド: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; 乗客: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, GR のノックダウン
si-NC	Thermo Fisher, 米国	4390843	細胞および in vivo 実験のネガティブトランスフェクションコントロールとして使用
SwissTargetPrediction データベース	スイス	http://swisstargetprediction.ch/	潜在的な薬物関連タンパク質ターゲットの in silico 予測用
TCMSP データベース	中国	https://www.tcmsp-e.com/	ハーブ成分スクリーニングとターゲット予測用
TTD	シンガポール	https://db.idrblab.net/ttd/	検証済みのCOPD関連疾患遺伝子の収集用
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, 米国	TE-2	喫煙誘発COPDモデルの確立
β-sitosterol	ChemicalBook, 中国	83-46-5	薬物治療用の活性フィトステロール