内寄生蜂Asobara japonicaおよびその宿主Drosophila melanogasterの効率的な飼育および機能解析のためのプロトコル

Summary

このプロトコルの目的は、 アソバラ・ジャポニカ およびショ ウジョウバエメラノガスター における寄生蜂–宿主相互作用の機能解析を促進することです。最適化された飼育方法、単一産卵感染アッセイ、RNAi介在遺伝子ノックダウンを通じて。

Abstract

寄生とは、ある生物が別の生物(宿主)の身体や資源を利用し、宿主に重大な損傷や死をもたらす生物学的相互作用のことです。寄生動物の中でも、寄生蜂は最も種が豊富な系統の一つであり、全昆虫種の約20%を占めています。特に、内寄生蜂は宿主体内に直接産卵し、多様な毒因子を用いて宿主の発生、免疫、生理を操作します。スズメバチの攻撃に対して、宿主は自然免疫機構を通じて寄生蜂の卵を排除しようとします。しかし、個々の毒成分が宿主の生物学を調節し、寄生を促進する分子および細胞のメカニズムは依然として十分に解明されていません。ここでは、内寄生蜂( Asobara japonica )とその宿主である ショウジョウバエ・メラノガスター(Drosophila melanogaster )の飼育に関する標準化された実験プロトコルを説明します。 A. japonicaの単為生殖株と有性生殖株の両方が利用可能であり、単為生殖株は寄生成功率が高いため、ゲノム解析や寄生アッセイのために実験室の株を安定的に維持できます。単一産卵感染アッセイおよび二本鎖RNAベースの遺伝子ノックダウン法は、毒遺伝子の機能解析に最適化されました。これらのプロトコルは、寄生蜂と宿主の相互作用の分子メカニズムを解明するための実践的な実験的枠組みを提供し、発生生物学、免疫学、生理学の将来の研究を促進するでしょう。

Introduction

寄生とは、ある生物が別の生物の栄養資源を利用する生活様式であり、分類群全体に広く見られます。既知の生物の最大半数が生活環で寄生を示すと推定^{されています1。}寄生虫の中で、寄生蜂は特に多様なグループであり、全昆虫の約20%を占め^{ています。}彼らは昆虫、クモ、ダニなど幅広い節足動物宿主を利用し、生活史や寄生戦略において驚くべき多様性を示します。これらの特徴により、寄生蜂は進化的かつ生態学的に最も成功した昆虫群の一つとなっています。

寄生蜂とその宿主との相互作用は、進化的な「軍拡競争」のモデルシステムとして広く研究されてきました。特に、内寄生蜂は毒、共生ウイルス、奇形細胞など多様な因子を展開します ^4,5。これらの因子は宿主の生理学と発達を操作し、宿主内での成功した発育を保証します。これらの進歩にもかかわらず、寄生の分子メカニズムはほとんどの寄生蜂種で依然として十分に解明されていません。大きな制約の一つは、彼らの小さな体格であり、これが毒成分の生化学的同定を妨げています。さらに、実験室条件下で寄生蜂とその宿主を同期した発達段階で維持するのは技術的に困難です。

次世代シーケンシングやその他のオミクス技術の最近の進歩により、非常に小さな寄生蜂種でもゲノム全体解析が可能になりました。これらの手法は、これまでアクセス不可能だった分子メカニズムの研究に新たな道を開き、寄生蜂と宿主の相互作用を前例のない解像度で研究することを可能にしました。この文脈で、当研究室は日本で最初に同定された種であるAsobara japonica Belokobylskij (膜翅目:ブラコニダ科)^{に焦点を当てています。}A. japonicaには、交尾せずに子孫を残すテリトコス単為生殖株が含まれます。この機能により、全ゲノムシーケンシングのために大量の遺伝的に均一なゲノムDNAを収集^{できます。}さらに、この種はモデル生物D. melanogasterを含む幅広いショウジョウバエ種に寄生しており 確立された飼育条件と明確な発生段階により、再現性のある感染解析と寄生蜂の発生の正確な制御を可能にし、実験的に大きな利点を提供します¹⁰。

A. japonicaの寄生期間中、メスのスズメバチは毒と単一の卵をハエの幼虫に注入し、その卵の中でスズメバチの幼虫が宿主と共に成長します。特に、A. japonicaは宿主D. melanogasterに対して高い寄生成功率を示し、この寄生蜂-宿主ペアは強力な実験モデルとなっています。ここでは、A. japonicaにおける安定した育成プロトコル、単一産卵感染アッセイ、および二本鎖RNA(dsRNA)ベースの遺伝子ノックダウン法について説明します。これらのプロトコルは、寄生蜂と宿主の相互作用の分子メカニズムを解明するための信頼できる枠組みを提供します。

Protocol

D. melanogasterとA. japonicaの同期飼育法の概略は図1に示されています。

1. 実験室での宿主ショ ウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の飼育

1. すべての実験動物は12:12時間の明暗サイクルで、25°C、相対湿度50〜60%に保ちます。野生型株のOregon-R(OR)を A. japonicaの宿主として使用してください(図2A)。
2. 成虫を標準的なトウモロコシ粉酵母寒天培地(0.55%寒天、表1)を含む新しい飼料バイアルに移します。バイアルに移送日と品種名「OR」をラベル付けしてください。
3. 移植後1日、これらの成虫は卵の過剰な量を防ぐために除去してください。幼虫が餌の表面で餌を食べているか確認してください。
   注意:目安として、1つの小瓶あたり約200〜250個の卵(φ30×100 mm)を保ちましょう。卵密度が高いと寄生成功率が低下し、宿主やスズメバチの発達の変動が増す可能性があります。
4. ステップ1.2から4日後、卵産後4日後にスプーン一杯のハエ幼虫を新しい餌バイアルに移します。これらの幼虫を次世代のために寄生蜂にさらさないように保ちましょう。この手法はバイアル内の宿主幼虫密度の制御にも役立ちます。

2. 実験室での内寄生蜂(Asobara japonica)の飼育

1. 単為生殖株の東京株(TK)と有性株の西表島株(IR)(図2B)を使用します。前者はメスで構成され、後者はメスとオスで構成されています。オスはメスより2〜4日早く羽化します。したがって、移植前に産卵管でメスの存在を確認しましょう。
2. ストックバイアルから成虫10〜20匹を直接、4 dAELのハエ幼虫入りバイアルに移します。バイアルに移送日と品種名「TK」または「IR」をラベル付けしてください。ステップ1.1と同じ条件でスズメバチを維持してください。
3. 成虫のスズメバチがハエの幼虫に産卵させてください。スーパー寄生を防ぐため、宿主の死につながる可能性のあるスーパー寄生を防ぐため、1〜2日後にこれらのスズメバチを駆除してください。ステップ2.2から10日以上経過して寄生から逃げた閉じた成虫を除去してください。
4. ステップ2.2から2週間後、成虫のスズメバチは寄主バエの蛹ケースから巣立ち始めます。新たに閉じた成虫スズメバチを、25%のグルコースと50 mMのビタミンC溶液を含むフィルターペーパーを入れた新しい餌バイアルに移します。フィルターペーパーの断片は130°Cで2時間滅菌してください。フィルターペーパーに溶液を塗ることで産卵行動が促進され、成虫の寿命が延びます。産卵を促進するためにビタミンCを使う私たちのアプローチは、 ショウジョウバエの研究¹¹の観察に触発されました。

3. 単一産卵感染アッセイ

1. 感染実験に使われたハエ幼虫の発生段階を同期させる。
   1. 成虫のハエを50mLのチューブに入れ、ブドウジュースの寒天プレート(3%寒天)を新鮮な酵母ペーストで塗り、24時間卵を産ませます。
   2. 孵化したばかりの第一齢幼虫をぶどうジュースの寒天プレートに採取し、2〜3gのハエ用ペースト(適切な量の水と混ぜたハエの餌)を入れた小さなバイアル(12 mL)に移します。20〜30匹の幼虫を小瓶に入れます。ハエの幼虫は25°Cで成長させられます。
2. 適切なタイミングで、直径約1.5〜2.0cmの範囲に薄く均等に広げたハエの餌ペーストを塗った4cmのペトリ皿(以下感染アッセイアリーナ)を準備します。感染検査場に加え、適切な量のハエ用ペーストを入れた新しい小バイアル(12mL)を準備します。このバイアルは感染検査後の宿主幼虫の育成に使用されます。
3. 段階的に育てられた幼虫を採取し、脱イオン水(抵抗率=15 MΩ·cm、25°C)の入った皿に移します。幼虫は優しくかき混ぜて洗い流し、体内の残留食物を取り除きます。
4. すすい後は、糸くずのない紙用ワイプで幼虫の余分な水分を優しく取り除きます。過剰な水分は感染アッセイ場でのスズメバチの産卵行動に干渉します。その後、幼虫をアリーナに移します。このステップは感染実験中の幼虫活動を増加させます。
5. 成虫スズメバチに対して_CO2 ガスを5L·^min-1 の流量、0.2MPaの圧力で麻酔します。次に、約3匹のメスのスズメバチを優しく感染アッセイアリーナに入れます。皿の蓋を閉めて、ハエ用のフードペーストで回復させます。
6. これらのスズメバチの産卵行動を立体顕微鏡(ズーム設定:10×から15×)で観察してください。
   注意:スズメバチが動くハエの幼虫体に触れると、すぐに産卵管をハエ体内に挿入し、毒成分を注入します。ハエの幼虫は体をもがき暴れますが、すぐに麻痺してしまいます。その後、スズメバチは腹部を振動させて卵を宿主の幼虫体に産み付け、産卵管を引っ込めます。この産卵行動は感染と呼ばれます。
7. 感染後、蓋を開けて感染したハエ幼虫をステップ3.2で作成した新しい小さなバイアルに移します。感染のタイミングを標準化するために、感染実験を15分以内に行ってください。
8. 小さなバイアルに日付、サンプル名、感染時間、個体数などの実験情報をラベル付けしてください。これらのバイアルは塞がれ、湿った容器に入れて25°Cで保管します。

4. dsRNA注入によるRNA干渉(RNAi)スズメバチの生成

1. 400 bp以上のdsRNAを合成し、in vitro 転写ベースのdsRNA合成システムを用いてdsRNA介在遺伝子ノックダウン(RNA干渉、RNAi)を行います。dsRNAサンプルは使用まで-20〜-80°Cで保管してください。詳細なプロトコルは前述の^通りです。
2. スズメバチの体を置くために、2%寒天を含む5.5cmのペトリ皿を用意します。各皿の3分の2を寒天で満たし、注入用の厚い寒天プレートを作ります。
3. 水で湿らせた綿ずくりのない紙拭きをプラスチック皿の蓋に置きます。
4. 感染後7日目(DPI)にバイアルからホストハエの蛹を採取し、ステップ4.3で作成した綿くらいのない紙拭きに置きます。バイアルの壁に水を一滴加えると、宿主のハエの蛹の殻がバイアルから外れます。
5. 立体顕微鏡(ズーム設定:20×)で、宿主のハエ蛹の殻を取り出し、鉗子でスズメバチの体を露出させます。7 dpiの時点で、ほとんどのスズメバチは蛹期にあり、頭部、胸部、腹部の各部分が区別されます。スズメバチの体は動かない。
6. 回収したスズメバチの体をステップ4.2で準備した寒天プレートに置き、体の軸を同じ向きに合わせます。20〜30体のスズメバチの体を背側が上に並べて1〜2列に並べます。スズメバチが滑らないように、綿ずくりのない紙拭きで寒天プレートの余分な水分を取り除きます。
7. メーカーの指示に従い、注入装置と立体顕微鏡を設置します(図3A)。注射量と注入速度を正確に制御できるガラス毛細管針を備えたマイクロインジェクションシステムを使用してください。スズメバチの頭が注射針の先端に向かっている寒天プレートを置きます。注入体積は50 nL·^wasp-1 、注入速度は50 nL·^sec-1 です。
8. ニードルプラーを使ってガラス毛細血管針を準備します。ガラス毛細管の形状はヒーターの温度に応じて調整可能です。
9. ガラス毛細管針をニードルグラインダーに30〜35°の角度で置きます。針を研磨して先端の長さが0.04 mmになるまで(接眼レンズ照準の4分割、 図3B)。
10. 注射直前にdsRNAを解凍します。dsRNAの濃度は0.25-1 μg·^μL-1です。可視化のために、dsRNA溶液は青色染料(エリオグラウシン二ナトリウム塩、2%重量・体積^-1)で着色されます。マイクロローダーのピペットチップを使って、ガラス毛細管に青色染料を浸したdsRNA溶液を満たします。4μLで30体のスズメバチの体を注入するのに十分です。溶液内に気泡が存在しないか確認してください。
    注意:dsRNA溶液を装着した後、針の側面を爪で優しく叩いて、閉じ込められた気泡を取り除きます。残留気泡は溶液の流れを妨げ、注入の成功を妨げる可能性があります。
11. 1mLの注射器と針を使い、空いているガラス毛細管部分にミネラルオイルを注ぎ、毛細血管内に気泡が残らないようにします。
12. dsRNA溶液とミネラルオイルを含むガラス毛細管針を針ホルダーに取り付け、注入装置に取り付けます。
13. インジェクターの寒天プレートとガラス毛細管針の位置を調整し、スズメバチの体に対してガラス針を30〜45°の角度で配置します(図3A)。
14. ガラス毛細血管針をスズメバチの体の背側に挿入し、やや外側の側を背中線に差します。体内にdsRNA溶液をマイクロインジェインします。注入されたdsRNA溶液は青色染料で 見える(図3C)。
15. 注射後、寒天プレートを湿った容器(相対湿度70〜80%)に入れ、25°Cのインキュベーターで1週間保管し、成虫のスズメバチが巣立つまで保存します。損傷したスズメバチの体は、細菌汚染を防ぐために寒天プレートから取り除かれるべきです。
    一時停止点:ステップ4.6では、スズメバチの蛹を注入前に数時間寒天プレートに置いたままにすることができます。針は事前に準備できます(ステップ4.8および4.9)。しかし、時間が経つと詰まりやすいです。新たに調製された針は、一般的により信頼性の高い注射性能を提供します。

Results

アソバラ・ジャポニカの無性および有性株
ジャポニカは日本全土に広く分布しています。テリトクス単為生殖株は本島で優勢であり、亜熱帯の島々、例えば奄美大島や西表島などに分布する無性生殖株が見られます ^8,12。有性株では、オスがメスより数日早く羽化するため、成虫の移動時期は両株で明確に異なります。A. japonicaにおけるテリトコス単為生殖は、母系の内共生細菌であるウォルバキア(Wolbachia)への感染によって誘導されます。抗生物質治療によるウォルバキアの排除により雄が生まれます ^9,14 そしてウォルバキアを有性株に移植すると単為生殖が誘発されます¹⁵。A. japonicaの無性および有性株の両方は、複数のショウジョウバエ種にまたがって高い寄生成功率を示します。例えば、経済的に重要な果実害虫であるD. suzukiiに寄生することができ、農業における生物的防除剤の可能性も考慮されています¹⁶。利用可能な株の中で、私たちは主にウォルバチア感染のTK株を実験に使用しました。TK株はIR株¹⁴に比べて宿主幼虫への寄生活動が強いため、解析に適しています。

寄生の成功は育成環境に依存します
A. japonicaの寄生成功率は一般的に高いですが、宿主のハエの育成条件に大きく影響されます。栄養が乏しい条件下では、ハエの幼虫の成長期間が長くなり、蛹化の時期が遅れ^ます。このような条件下では、スズメバチは宿主資源を適切に活用できず、宿主の発達と同期できないことがあります。この可能性を調べるために、正常な酵母(1×)と酵母が少ない(0.1×)条件下でハエとスズメバチを飼育しました。次に寄生の成功率と発生タイミングを評価しました(図2C、2D)。寄生成功率は、羽化した成虫スズメバチと宿主幼虫の比率として計算されました。

正常酵母条件下では、単一産卵感染アッセイで寄生成功率は81.7%でした(図2C、左;表2)。酵母含有量が10%に減少したとき(酵母の劣悪状態)、寄生成功率は35.0%に低下しました(図2C、右;表2)。この減少は、感染後に宿主幼虫の約50%が死亡したことに起因していると考えられます。これらの結果は、栄養分が乏しい条件下で宿主と寄生蜂間の資源配分が乱されることを示唆しています。

特筆すべきは、酵母が少ない条件下では、スズメバチの排出のタイミングが通常の酵母条件下ほど遅れなかったことです。ハエのエクロージョンタイミングは最大9日遅れましたが、スズメバチのエクロージョンタイミングは最大4〜5日遅れました。この結果は、栄養素の利用可能性が主に宿主の発生に影響を与えることを示唆しています。通常の酵母条件下ではハエとスズメバチの両方で一貫した発育のタイミングが見られますが、酵母の少ない条件下ではそうではなく、寄生蜂と宿主間の同期発生は栄養の利用可能性に依存していることを示唆しています。

毒遺伝子の機能解析におけるRNAiベースのアプローチ
毒腺のトランスクリプトミクスおよびプロテオーム解析により多くの候補分子が特定されていますが、これらのうちどれが寄生の成功に必要かは依然として明確ではありません。これらの候補分子の生理学的役割を特定するためには、遺伝子ノックダウン手法を用いた in vivo 機能解析が必要です。

最近、 A. japonica の寄生がD . melanogaster 幼虫の想像椎間板でアポトーシス、オートファジー、有糸分裂停止を引き起こし、深刻な組織劣化を引き起こす現象、すなわち想像椎間板分解(IDD)¹⁰と呼ぶ現象を報告しました。IDDの原因となる分子を特定するため、トランスクリプトミック解析、プロテオーム解析、比較ゲノム解析から同定された候補遺伝子のRNAiスクリーニングを実施しました。その結果、 想像椎間板分解因子 (IDDF1)-1 と IDDF-2 の2つの遺伝子が同定されました。IDDF-1とIDDF-2の両方は未知機能ドメイン4803(DUF4803)を含んでいます。特筆すべきは、最初の報告の後、独立した研究でIDDに関連する複数の A. japonica毒タンパク質(毒誘導分解(VID)が同定され、これらはすべてDUF4803ドメイン¹⁸も持っています。

これらの結果に基づき、RNAiプロトコルをさらに最適化し、再現性と効率を向上させました。特に、Nanoject IIIの使用により注入量と速度の精密な制御が可能となり、より一貫したノックダウン結果が得られました。

最適化されたRNAiプロトコルの効率を評価するために、IDDF-1のノックダウンを実施しました。閉鎖性成虫スズメバチでは、IDDF-1の発現レベルが対照群と比較して有意に低下しました(図3D)。機能的検証のため、これらのRNAiスズメバチと翅袋領域¹⁹でアポトーシス報告体GC3Aiを発現する宿主ハエ幼虫を用いた単一産卵感染アッセイを実施しました。対照(GFP RNAi)スズメバチによる感染後、ウィングポーチ内でGC3Aiシグナルが検出されました。対照的に、IDDF-1 RNAiスズメバチ感染後はGC3Aiシグナルが有意に低下しました(図3E、3F)。これらの結果は以前の発見と一致しており、IDDF-1の機能がRNAiによって効果的に抑制されることを裏付けています。

図1。D. melanogasterおよびA. japonicaの飼育手順の概説 
D. melanogasterの発生段階に応じて段階的な手順が示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。ア ソバラ・ジャポニカ による寄生。(A) D. melanogaster とその寄生蜂 A. japonica の発生関係の概略。メスのスズメバチはハエの幼虫に毒と1つの卵を注入します。孵化後、スズメバチの幼虫は寄主幼虫と並行して発育し、その後蛹化します。蛹化後、スズメバチはハエの体全体を食べ、最終的にハエの蛹殻から外側に出てきます。 (B) A. japonica の無性株(左)および有性株(右)の成虫スズメバチ。スケールバー、1 mm。 (C) 正常(1×)および酵母が少ない(0.1×)条件下でのハエまたはスズメバチの出現率。産卵後4日後に宿主ハエ幼虫を用いた単一産卵感染解析(dAEL)を実施しました。 n = 267羽(1×羽、ハエ120羽×)、85羽(1×羽、スズメバチ)、80羽(0.1×羽)です。 (D) (C)に示された2つの栄養条件下でのハエとスズメバチの閉鎖タイミング。成虫と蛹の比率が示されています。 n = 250、107、61、41 です。黒い矢印はスズメバチ感染の時期を示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。Nanoject IIIを用いた最適化されたRNAi手技。(A) 立体顕微鏡下でのマイクロインジェクション装置の設置。ガラス毛細管針は寒天プレートに対して30〜45°の角度で配置されました。(B) ガラス毛細管針の先端を針粉砕機で研ぎました。(C) 青色染め溶液をガラス毛細管針を使ってスズメバチの体に微量注射した。画像ではスズメバチの前側はAで示されています。P、後部。スケールバー、1 mm。(D) GFP RNAiおよびIDDF-1 RNAiスズメバチにおけるIDDF-1の発現レベルはデルタデルタC _t法を用いて定量されました。発現レベルはRpL32-Ajに正規化されました。データは個々のデータ点(n=5)を用いた平均SD±を表します。P < 0.005(学生のt検定)。(EとF)GC3Ai信号は、対照(GFP RNAi) またはIDDF-1 RNAiスズメバチによる感染後6時間後(hpi)に感染した未感染幼虫および宿主幼虫の翼盤で検出されます。翼の円盤は核のDAPI染色に基づく白い点線で縁取りされています(1:10000, 62247;サーモフィッシャー・サイエンティフィック)。GC3Ai陽性面積と翼袋面積の比率が定量化されました。P < 0.005(一方向ANOVAに続いてTukeyの多重比較検定)。n = グループあたり11回の生物学的複製。スケールバー、100μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

構成要素	金額
水	1 L
寒天	5.5 g
酵母	40 g
トウモロコシミール	90 g
グルコース	100 g
プロピオン酸	3 mL
10%のブチルp-ヒドロキシベンゾエートを70%のEtOHに含めて	3.5 mL

表1:標準的なトウモロコシ粉酵母寒天培地(フライフード)の成分。

食料の種類	状態	# 個人全体の	# 閉じた、または死んだ個体の				ハエまたはスズメバチの出現率(%)
			飛んで	スズメバチ	蛹致死性	幼虫致死
1×	感染していない	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica 感染	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	感染していない	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica 感染	80	0	28	13	39	35

表2:正常(1x)および酵母不足(0.1x)条件下での個体数および出現率。

プライマーネーム	シーケンス(5分>3分)	目的
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTCTCTACT(呪文の呪文を誇る)	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGGATTCTGTCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	CDSクローン
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDSクローニング、dsRNAテンプレート
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	ガッカッタタグ	dsRNAテンプレート
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATATAGGT カッカッタッタッカッカット	dsRNAテンプレート
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG ガガッカッカッタタグ	dsRNAテンプレート
※ これらのプライマーおよびdsRNAテンプレートはKamiyama らに報告されています。2022.
※ gene007424 は IDDF-1の略です。

表3:本研究で使用されたプライマーおよびdsRNAテンプレートの配列。

Discussion

本研究では、分子レベルで寄生蜂と宿主の相互作用を調査するための多用途な実験プラットフォームを構築しました。育成条件の最適化、単一産卵感染アッセイ、RNAiプロトコルを通じて、寄生蜂由来因子の機能的研究のための堅牢なシステムを提供します。このプラットフォームは、寄生蜂が宿主発生を操作するメカニズムを解明する将来の研究を促進し、生物的害虫駆除戦略の開発にも貢献する可能性があります。

ウォルバキア感染のTk株であるA. japonicaは、寄生性の解析に非常に再現性の高い実験システムを提供します。多くの寄生蜂-宿主研究では、実験結果はしばしば変動し、宿主の生存率や寄生蜂の成功率は環境的および生理学的条件に敏感に依存します。対照的に、TK株は一貫して高い寄生成功率を示し、感染の結果がほぼ均一である「寄生蜂優性」状態を効果的に生み出します。さらに、単為生殖株として、その均一な遺伝的背景により個体間の実験的変異を減少させます。この再現性により、寄生過程の信頼できる追跡が可能となり、宿主反応や寄生蜂由来因子の定量的分析が可能となります。

さらに、thelytokous生殖は高品質なゲノムアセンブリ9に不可欠な非常に均一なゲノムDNAの生成を可能にすることでゲノム解析を大いに容易に^します。このような単為生殖株はすべての寄生蜂種に存在するわけではありませんが、私たちの結果は ウォルバキア誘導のテリトキーがゲノム資源を改善する戦略としての可能性を浮き彫りにしています。したがって、他の寄生蜂種に ウォルバチア感染系統を確立することは、ゲノム資源を拡大し、寄生蜂間の比較分子研究を加速させる強力な方法となり得ます。

寄生の結果は宿主の栄養条件に強く影響されるため、飼育条件が寄生蜂の成功を決定づける重要な要素であることを示しています。寄生の成功は宿主とスズメバチの発生との正確な時間的協調に依存しているため、制御されていない栄養条件はこの過程を妨げ、再現性を低下させる可能性が高いです。したがって、寄生蜂と宿主の相互作用を研究する信頼性の高い実験システムを確立するためには、宿主育成条件の慎重な標準化が不可欠です。さらに、ハエ用のストックバイアルはスズメバチのストックバイアルとは別に保管すべきであり、スズメバチの存在はハエの産卵行動を減少させるためです^20,21。

寄生蜂と宿主の相互作用を定量的に評価するために、各宿主に単一の卵を産み付ける単一産卵感染アッセイを考案しました。このアッセイは、複数の産卵イベントを伴い過剰な宿主損傷や死亡率を引き起こす従来のバルク感染アッセイとは対照的です。限られた時間(~15分)内で効率的な産卵を促進するため、新たに閉じたスズメバチの成虫にはグルコースとビタミンC溶液を事前に処理し、産卵効率と全体的な再現性を向上させました。

さらに、寄生蜂の遺伝子機能解析のためにRNAiプロトコルを最適化しました。マイクロインジェクションシステムを用いることで、注入量の精密制御を実現し、ノックダウン効率の一貫性を向上させました。 IDDF-1を用いた機能検証により、この方法は遺伝子発現を効果的に抑制し、再現可能な表現型アウトカムを生み出すことが確認されました。トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス研究が引き続き多数の候補毒因子を特定していることから、機能的なスクリーニングプラットフォームの存在は、それらの生物学的役割を明らかにするために不可欠です。

このRNAiプロトコルの制約は、スズメバチの発生初期段階で機能する遺伝子の解析には適していないことです。宿主体内に存在するスズメバチの卵にdsRNAを注入するのは技術的に難しいためです。これを克服するために、生外飼育システムを確立することが有用なアプローチとなるかもしれません^。あるいは、直接親(DIPA)-CRISPRを用いた遺伝子ノックアウトアプローチは補完的な戦略を提供し、試薬を成体雌に注入してゲノム編集後の子孫²³を生成することもあります。実際、この方法は成虫の雌や蛹期²⁴の個体に試薬を注入することで、蛹の外寄生蜂Nasonia vitripennisで遺伝子ノックアウト個体を成功裏に生成しています。RNAiベースの遺伝子ノックダウン法と組み合わせることで、寄生過程に関与する遺伝子機能のより包括的な解析が可能になります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	感染アッセイ
1 mL 注射器	TERUMO	SS-01T	dsRNA 注射
アガー	大新化学工業株式会社	P-700	飼育
アズノール培養皿 φ40×13.5mm	アズワン	1-8549-01	感染アッセイ
アズノール培養皿 φ55×17mm	アズワン	1-8549-02	dsRNA 注射
ブルー染色剤（エリオングルシンジナトリウム塩）	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA 注射
p-ヒドロキシ安息香酸ブチル	中村製作所	06327-15	飼育
CO2 圧力調整器	山東精機	YR-507F-2	感染アッセイ
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Zeiss	LSM700	画像分析
コーングリッツ	サニーコーン株式会社	No.4M	飼育
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	核染色、1:10000
デイオナイズド水	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	感染アッセイ
デュアルステージガラスマイクロピペット引抜器	ナリシゲ	PC-10	dsRNA 注射
Fiji	NA	https://fiji.sc	画像分析
フィルターペーパー	アズワン	ITEM 526	飼育
フライフードバイアル	千代田科学技術	KFB-3M	飼育
フライフードバイアルプラグ	千代田科学技術	AS-275	飼育
鉗子	Dumont Biologie	11252-20	解剖
冷凍庫、-20 °C	日本フリーザー	GS-3120HC	サンプル保管
冷凍庫、-80 °C	日本フリーザー	CLN-52UD2	サンプル保管
ガラススライド	松波製作所	S7213	感染アッセイ
グルコース	昭和産業株式会社	入手不可	飼育
KOD Plus Neo	東洋紡株式会社	KOD-401	dsRNA 合成
インキュベーター	パナソニック	MIR-254-PJ	飼育
リゲーション high Ver.2	東洋紡株式会社	LGK-201	dsRNA 合成
マイクロピペットグラインダー	ナリシゲ	EG-401	dsRNA 注射
ミネラルオイル	中村製作所	23306-84	dsRNA 注射
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA 注射
Nanoject ガラスキャピラリー	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA 注射
pBluescript KS (+) プラスミド	入手不可	入手不可	dsRNA 合成
pBluescript SK (-) プラスミド	入手不可	入手不可	dsRNA 合成
PrimeScript リバース トランスクリプターゼ	タカラバイオ	2680A	dsRNA 合成
プロピオン酸	中村製作所	29018-55	飼育
PROWIPE	大王製紙株式会社	2-2624-02	感染アッセイ、dsRNA 注射。
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	東洋紡株式会社	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus リエージェント	タカラバイオ	9108	qRT-PCR
小バイアル（テストチューブ 12 mL）	Sarstedt	REF 58.487	感染アッセイ
小バイアルプラグ	千代田科学技術	QD-S4	感染アッセイ
ヘラ	アズワン	6-522-02	飼育
四角培養皿	永岡書店	64-2192-55, AW2000	dsRNA 注射
ステレオ顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	lvesta3 (C-Mount)	感染アッセイ
ステレオ顕微鏡	ニコンソリューションズ株式会社	SMZ1000	dsRNA 注射
T7 RiboMAX Express RNAi システム	プロメガ	P1700	dsRNA 合成
熱サイクラー Dice Real Time System	タカラバイオ	TP815	qRT-PCR
熱サイクラー GeneAtlas	アステール	G02	dsRNA 合成、qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	東洋紡株式会社	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	入手不可	qRT-PCR
ビタミン C、L-アスコルビン酸	中村製作所	03420-65	飼育
ウェルチーズグレープ100果汁	アサヒ飲料株式会社	32390	感染アッセイ
酵母	アサヒグループ食品株式会社	HB-P02	飼育