このプロトコルの目的は、 アソバラ・ジャポニカ およびショ ウジョウバエメラノガスター における寄生蜂–宿主相互作用の機能解析を促進することです。最適化された飼育方法、単一産卵感染アッセイ、RNAi介在遺伝子ノックダウンを通じて。
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方法論記事
内寄生蜂Asobara japonicaおよびその宿主Drosophila melanogasterの効率的な飼育および機能解析のためのプロトコル
この記事について
サマリー
要約
寄生とは、ある生物が別の生物(宿主)の身体や資源を利用し、宿主に重大な損傷や死をもたらす生物学的相互作用のことです。寄生動物の中でも、寄生蜂は最も種が豊富な系統の一つであり、全昆虫種の約20%を占めています。特に、内寄生蜂は宿主体内に直接産卵し、多様な毒因子を用いて宿主の発生、免疫、生理を操作します。スズメバチの攻撃に対して、宿主は自然免疫機構を通じて寄生蜂の卵を排除しようとします。しかし、個々の毒成分が宿主の生物学を調節し、寄生を促進する分子および細胞のメカニズムは依然として十分に解明されていません。ここでは、内寄生蜂( Asobara japonica )とその宿主である ショウジョウバエ・メラノガスター(Drosophila melanogaster )の飼育に関する標準化された実験プロトコルを説明します。 A. japonicaの単為生殖株と有性生殖株の両方が利用可能であり、単為生殖株は寄生成功率が高いため、ゲノム解析や寄生アッセイのために実験室の株を安定的に維持できます。単一産卵感染アッセイおよび二本鎖RNAベースの遺伝子ノックダウン法は、毒遺伝子の機能解析に最適化されました。これらのプロトコルは、寄生蜂と宿主の相互作用の分子メカニズムを解明するための実践的な実験的枠組みを提供し、発生生物学、免疫学、生理学の将来の研究を促進するでしょう。
概要
寄生とは、ある生物が別の生物の栄養資源を利用する生活様式であり、分類群全体に広く見られます。既知の生物の最大半数が生活環で寄生を示すと推定されています1。寄生虫の中で、寄生蜂は特に多様なグループであり、全昆虫の約20%を占めています。彼らは昆虫、クモ、ダニなど幅広い節足動物宿主を利用し、生活史や寄生戦略において驚くべき多様性を示します。これらの特徴により、寄生蜂は進化的かつ生態学的に最も成功した昆虫群の一つとなっています。
寄生蜂とその宿主との相互作用は、進化的な「軍拡競争」のモデルシステムとして広く研究されてきました。特に、内寄生蜂は毒、共生ウイルス、奇形細胞など多様な因子を展開します 4,5。これらの因子は宿主の生理学と発達を操作し、宿主内での成功した発育を保証します。これらの進歩にもかかわらず、寄生の分子メカニズムはほとんどの寄生蜂種で依然として十分に解明されていません。大きな制約の一つは、彼らの小さな体格であり、これが毒成分の生化学的同定を妨げています。さらに、実験室条件下で寄生蜂とその宿主を同期した発達段階で維持するのは技術的に困難です。
次世代シーケンシングやその他のオミクス技術の最近の進歩により、非常に小さな寄生蜂種でもゲノム全体解析が可能になりました。これらの手法は、これまでアクセス不可能だった分子メカニズムの研究に新たな道を開き、寄生蜂と宿主の相互作用を前例のない解像度で研究することを可能にしました。この文脈で、当研究室は日本で最初に同定された種であるAsobara japonica Belokobylskij (膜翅目:ブラコニダ科)に焦点を当てています。A. japonicaには、交尾せずに子孫を残すテリトコス単為生殖株が含まれます。この機能により、全ゲノムシーケンシングのために大量の遺伝的に均一なゲノムDNAを収集できます。さらに、この種はモデル生物D. melanogasterを含む幅広いショウジョウバエ種に寄生しており 確立された飼育条件と明確な発生段階により、再現性のある感染解析と寄生蜂の発生の正確な制御を可能にし、実験的に大きな利点を提供します10。
A. japonicaの寄生期間中、メスのスズメバチは毒と単一の卵をハエの幼虫に注入し、その卵の中でスズメバチの幼虫が宿主と共に成長します。特に、A. japonicaは宿主D. melanogasterに対して高い寄生成功率を示し、この寄生蜂-宿主ペアは強力な実験モデルとなっています。ここでは、A. japonicaにおける安定した育成プロトコル、単一産卵感染アッセイ、および二本鎖RNA(dsRNA)ベースの遺伝子ノックダウン法について説明します。これらのプロトコルは、寄生蜂と宿主の相互作用の分子メカニズムを解明するための信頼できる枠組みを提供します。
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プロトコル
D. melanogasterとA. japonicaの同期飼育法の概略は図1に示されています。
1. 実験室での宿主ショ ウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の飼育
- すべての実験動物は12:12時間の明暗サイクルで、25°C、相対湿度50〜60%に保ちます。野生型株のOregon-R(OR)を A. japonicaの宿主として使用してください(図2A)。
- 成虫を標準的なトウモロコシ粉酵母寒天培地(0.55%寒天、表1)を含む新しい飼料バイアルに移します。バイアルに移送日と品種名「OR」をラベル付けしてください。
- 移植後1日、これらの成虫は卵の過剰な量を防ぐために除去してください。幼虫が餌の表面で餌を食べているか確認してください。
注意:目安として、1つの小瓶あたり約200〜250個の卵(φ30×100 mm)を保ちましょう。卵密度が高いと寄生成功率が低下し、宿主やスズメバチの発達の変動が増す可能性があります。 - ステップ1.2から4日後、卵産後4日後にスプーン一杯のハエ幼虫を新しい餌バイアルに移します。これらの幼虫を次世代のために寄生蜂にさらさないように保ちましょう。この手法はバイアル内の宿主幼虫密度の制御にも役立ちます。
2. 実験室での内寄生蜂(Asobara japonica)の飼育
- 単為生殖株の東京株(TK)と有性株の西表島株(IR)(図2B)を使用します。前者はメスで構成され、後者はメスとオスで構成されています。オスはメスより2〜4日早く羽化します。したがって、移植前に産卵管でメスの存在を確認しましょう。
- ストックバイアルから成虫10〜20匹を直接、4 dAELのハエ幼虫入りバイアルに移します。バイアルに移送日と品種名「TK」または「IR」をラベル付けしてください。ステップ1.1と同じ条件でスズメバチを維持してください。
- 成虫のスズメバチがハエの幼虫に産卵させてください。スーパー寄生を防ぐため、宿主の死につながる可能性のあるスーパー寄生を防ぐため、1〜2日後にこれらのスズメバチを駆除してください。ステップ2.2から10日以上経過して寄生から逃げた閉じた成虫を除去してください。
- ステップ2.2から2週間後、成虫のスズメバチは寄主バエの蛹ケースから巣立ち始めます。新たに閉じた成虫スズメバチを、25%のグルコースと50 mMのビタミンC溶液を含むフィルターペーパーを入れた新しい餌バイアルに移します。フィルターペーパーの断片は130°Cで2時間滅菌してください。フィルターペーパーに溶液を塗ることで産卵行動が促進され、成虫の寿命が延びます。産卵を促進するためにビタミンCを使う私たちのアプローチは、 ショウジョウバエの研究11の観察に触発されました。
3. 単一産卵感染アッセイ
- 感染実験に使われたハエ幼虫の発生段階を同期させる。
- 成虫のハエを50mLのチューブに入れ、ブドウジュースの寒天プレート(3%寒天)を新鮮な酵母ペーストで塗り、24時間卵を産ませます。
- 孵化したばかりの第一齢幼虫をぶどうジュースの寒天プレートに採取し、2〜3gのハエ用ペースト(適切な量の水と混ぜたハエの餌)を入れた小さなバイアル(12 mL)に移します。20〜30匹の幼虫を小瓶に入れます。ハエの幼虫は25°Cで成長させられます。
- 適切なタイミングで、直径約1.5〜2.0cmの範囲に薄く均等に広げたハエの餌ペーストを塗った4cmのペトリ皿(以下感染アッセイアリーナ)を準備します。感染検査場に加え、適切な量のハエ用ペーストを入れた新しい小バイアル(12mL)を準備します。このバイアルは感染検査後の宿主幼虫の育成に使用されます。
- 段階的に育てられた幼虫を採取し、脱イオン水(抵抗率=15 MΩ·cm、25°C)の入った皿に移します。幼虫は優しくかき混ぜて洗い流し、体内の残留食物を取り除きます。
- すすい後は、糸くずのない紙用ワイプで幼虫の余分な水分を優しく取り除きます。過剰な水分は感染アッセイ場でのスズメバチの産卵行動に干渉します。その後、幼虫をアリーナに移します。このステップは感染実験中の幼虫活動を増加させます。
- 成虫スズメバチに対してCO2 ガスを5L·min-1 の流量、0.2MPaの圧力で麻酔します。次に、約3匹のメスのスズメバチを優しく感染アッセイアリーナに入れます。皿の蓋を閉めて、ハエ用のフードペーストで回復させます。
- これらのスズメバチの産卵行動を立体顕微鏡(ズーム設定:10×から15×)で観察してください。
注意:スズメバチが動くハエの幼虫体に触れると、すぐに産卵管をハエ体内に挿入し、毒成分を注入します。ハエの幼虫は体をもがき暴れますが、すぐに麻痺してしまいます。その後、スズメバチは腹部を振動させて卵を宿主の幼虫体に産み付け、産卵管を引っ込めます。この産卵行動は感染と呼ばれます。 - 感染後、蓋を開けて感染したハエ幼虫をステップ3.2で作成した新しい小さなバイアルに移します。感染のタイミングを標準化するために、感染実験を15分以内に行ってください。
- 小さなバイアルに日付、サンプル名、感染時間、個体数などの実験情報をラベル付けしてください。これらのバイアルは塞がれ、湿った容器に入れて25°Cで保管します。
4. dsRNA注入によるRNA干渉(RNAi)スズメバチの生成
- 400 bp以上のdsRNAを合成し、in vitro 転写ベースのdsRNA合成システムを用いてdsRNA介在遺伝子ノックダウン(RNA干渉、RNAi)を行います。dsRNAサンプルは使用まで-20〜-80°Cで保管してください。詳細なプロトコルは前述の通りです。
- スズメバチの体を置くために、2%寒天を含む5.5cmのペトリ皿を用意します。各皿の3分の2を寒天で満たし、注入用の厚い寒天プレートを作ります。
- 水で湿らせた綿ずくりのない紙拭きをプラスチック皿の蓋に置きます。
- 感染後7日目(DPI)にバイアルからホストハエの蛹を採取し、ステップ4.3で作成した綿くらいのない紙拭きに置きます。バイアルの壁に水を一滴加えると、宿主のハエの蛹の殻がバイアルから外れます。
- 立体顕微鏡(ズーム設定:20×)で、宿主のハエ蛹の殻を取り出し、鉗子でスズメバチの体を露出させます。7 dpiの時点で、ほとんどのスズメバチは蛹期にあり、頭部、胸部、腹部の各部分が区別されます。スズメバチの体は動かない。
- 回収したスズメバチの体をステップ4.2で準備した寒天プレートに置き、体の軸を同じ向きに合わせます。20〜30体のスズメバチの体を背側が上に並べて1〜2列に並べます。スズメバチが滑らないように、綿ずくりのない紙拭きで寒天プレートの余分な水分を取り除きます。
- メーカーの指示に従い、注入装置と立体顕微鏡を設置します(図3A)。注射量と注入速度を正確に制御できるガラス毛細管針を備えたマイクロインジェクションシステムを使用してください。スズメバチの頭が注射針の先端に向かっている寒天プレートを置きます。注入体積は50 nL·wasp-1 、注入速度は50 nL·sec-1 です。
- ニードルプラーを使ってガラス毛細血管針を準備します。ガラス毛細管の形状はヒーターの温度に応じて調整可能です。
- ガラス毛細管針をニードルグラインダーに30〜35°の角度で置きます。針を研磨して先端の長さが0.04 mmになるまで(接眼レンズ照準の4分割、 図3B)。
- 注射直前にdsRNAを解凍します。dsRNAの濃度は0.25-1 μg·μL-1です。可視化のために、dsRNA溶液は青色染料(エリオグラウシン二ナトリウム塩、2%重量・体積-1)で着色されます。マイクロローダーのピペットチップを使って、ガラス毛細管に青色染料を浸したdsRNA溶液を満たします。4μLで30体のスズメバチの体を注入するのに十分です。溶液内に気泡が存在しないか確認してください。
注意:dsRNA溶液を装着した後、針の側面を爪で優しく叩いて、閉じ込められた気泡を取り除きます。残留気泡は溶液の流れを妨げ、注入の成功を妨げる可能性があります。 - 1mLの注射器と針を使い、空いているガラス毛細管部分にミネラルオイルを注ぎ、毛細血管内に気泡が残らないようにします。
- dsRNA溶液とミネラルオイルを含むガラス毛細管針を針ホルダーに取り付け、注入装置に取り付けます。
- インジェクターの寒天プレートとガラス毛細管針の位置を調整し、スズメバチの体に対してガラス針を30〜45°の角度で配置します(図3A)。
- ガラス毛細血管針をスズメバチの体の背側に挿入し、やや外側の側を背中線に差します。体内にdsRNA溶液をマイクロインジェインします。注入されたdsRNA溶液は青色染料で 見える(図3C)。
- 注射後、寒天プレートを湿った容器(相対湿度70〜80%)に入れ、25°Cのインキュベーターで1週間保管し、成虫のスズメバチが巣立つまで保存します。損傷したスズメバチの体は、細菌汚染を防ぐために寒天プレートから取り除かれるべきです。
一時停止点:ステップ4.6では、スズメバチの蛹を注入前に数時間寒天プレートに置いたままにすることができます。針は事前に準備できます(ステップ4.8および4.9)。しかし、時間が経つと詰まりやすいです。新たに調製された針は、一般的により信頼性の高い注射性能を提供します。
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結果
アソバラ・ジャポニカの無性および有性株
ジャポニカは日本全土に広く分布しています。テリトクス単為生殖株は本島で優勢であり、亜熱帯の島々、例えば奄美大島や西表島などに分布する無性生殖株が見られます 8,12。有性株では、オスがメスより数日早く羽化するため、成虫の移動時期は両株で明確に異なります。A. japonicaにおけるテリトコス単為生殖は、母系の内共生細菌であるウォルバキア(Wolbachia)への感染によって誘導されます。抗生物質治療によるウォルバキアの排除により雄が生まれます 9,14 そしてウォルバキアを有性株に移植すると単為生殖が誘...
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ディスカッション
本研究では、分子レベルで寄生蜂と宿主の相互作用を調査するための多用途な実験プラットフォームを構築しました。育成条件の最適化、単一産卵感染アッセイ、RNAiプロトコルを通じて、寄生蜂由来因子の機能的研究のための堅牢なシステムを提供します。このプラットフォームは、寄生蜂が宿主発生を操作するメカニズムを解明する将来の研究を促進し、生物的害虫駆除戦略の開発にも貢献する可能性があります。
ウォルバキア感染のTk株であるA. japonicaは、寄生性の解析に非常に再現性の高い実験システムを提供します。多くの寄生蜂-宿主研究では、実験結果はしばしば変動し、宿主の生存率や寄生蜂の成功率は環境的および生理学的条件に敏感に依存します。対照的に、TK株は一貫して高い寄生成功率を示し、感染の結果がほぼ均一である「寄生蜂優性」状態を効果的に生み出します。さらに、単為生殖株として、その均一な遺伝的背景により個体間の実験的変異を減少させます。この再現性により、寄生過程の信頼できる追跡が可能となり、宿主反応や...
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開示事項
私たちには開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者らは、立花彼方、工藤詩音、牧野敏也、頼本俊太、重信修司、川村明子、藤野亜里、飯田雅子に技術支援をいただき感謝申し上げます。また、研究室の他の皆さんにも感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 210261 | 感染アッセイ |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | dsRNA注射 |
| Agar | Daisin, Ltd. | P-700 | 飼育 |
| Asnol Petri Dish φ40×13.5mm | As One Corporation | 1-8549-01 | 感染アッセイ |
| Asnol Petri Dish φ55×17mm | As One Corporation | 1-8549-02 | dsRNA注射 |
| Blue dye (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich Co. Llc. | 861146-25G | dsRNA注射 |
| Butyl p-Hydroxybenzoate | Nacalai Tesque, Inc. | 06327-15 | 飼育 |
| CO2 pressure regulator | YAMATOSANGYO | YR-507F-2 | 感染アッセイ |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM700 | 画像解析 |
| Corn meal | Sunny Maize Co., Ltd. | No.4M | 飼育 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | PI62247 | 核染色、1:10000 |
| Deionized water | Millipore Inc. | ZLXEV030WW | 感染アッセイ |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | dsRNA注射 |
| Fiji | NA | https://fiji.sc | 画像解析 |
| Filter paper | Advantec | ITEM 526 | 飼育 |
| Fly food vial | Chiyoda Science Co., Ltd. | KFB-3M | 飼育 |
| Fly food vial plug | Chiyoda Science Co., Ltd. | AS-275 | 飼育 |
| Forceps | Dumont Biologie | 11252-20 | 解剖 |
| Freezer, -20 °C | Nihon Freezer | GS-3120HC | サンプル保管 |
| Freezer, -80 °C | Nihon Freezer | CLN-52UD2 | サンプル保管 |
| Glass slides | Matsunami Glass Ind., Ltd | S7213 | 感染アッセイ |
| Glucose | Showa Sangyo Co., Ltd. | Not availavle | 飼育 |
| KOD Plus Neo | Toyobo | KOD-401 | dsRNA合成 |
| Incubator | Panasonic | MIR-254-PJ | 飼育 |
| Ligation high Ver.2 | Toyobo | LGK-201 | dsRNA合成 |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-401 | dsRNA注射 |
| Mineral oil | Nacalai Tesque, Inc. | 23306-84 | dsRNA注射 |
| Nanoject III | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | dsRNA注射 |
| Nanoject Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | dsRNA注射 |
| pBluescript KS (+) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA合成 |
| pBluescript SK (-) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA合成 |
| PrimeScript reverse Transcriptase | Takara | 2680A | dsRNA合成 |
| Propionic acid | Nacalai Tesque, Inc. | 29018-55 | 飼育 |
| PROWIPE | Daio Paper Corporation | 2-2624-02 | 感染アッセイ、dsRNA注射。 |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover | Toyobo | FSQ-301 | qRT-PCR |
| RNAiso Plus reagent | Takara | 9108 | qRT-PCR |
| Small vial (Test tube 12 mL) | Sarstedt | REF 58.487 | 感染アッセイ |
| Small vial plug | Chiyoda Science Co., ltd. | QD-S4 | 感染アッセイ |
| Spatula | As One Corporation | 6-522-02 | 飼育 |
| Square petri dish | Eiken Chemical Co., Ltd. | 64-2192-55, AW2000 | dsRNA注射 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | lvesta3 (C-Mount) | 感染アッセイ |
| Stereomicroscope | Nikon Solutions Co., Ltd. | SMZ1000 | dsRNA注射 |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | dsRNA合成 |
| Thermal Cycler Dice Real Time System | Takara | TP815 | qRT-PCR |
| Thermal Cycler GeneAtlas | Astel | G02 | dsRNA合成、qRT-PCR |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | Toyobo | QPS-201 | qRT-PCR |
| TissueLyser II | Qiagen | Not availavle | qRT-PCR |
| Vitamin C, L-Ascorbic Acid | Nacalai Tesque, Inc. | 03420-65 | 飼育 |
| Welch's grape 100 juice | Asahi Soft drinks Co., Ltd. | 32390 | 感染アッセイ |
| Yeast | Asahi Group Foods, Ltd. | HB-P02 | 飼育 |
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