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方法論記事

全層解析を用いたマウス嗅覚神経系モデルにおけるIn Vivo組織複雑性の維持：神経再生の研究に向けて

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DOI:

10.3791/72036

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2026年8月18日

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

この記事について

サマリー

本プロトコールでは、マウスの嗅覚神経系の解剖学的複雑性を維持するための完全なワークフローについて概説します。ここでは、解剖、組織標本作成、およびイメージングを含む詳細なワークフローを解説しています。本プロトコールは、正常な状態および、自然修復過程を含む異常な状態における嗅覚系の研究に活用いただけます。

要約

3次元（3D）イメージングの時代において、標準的な免疫組織化学は、病理学や複雑な人体解剖の研究において非常に限定的であると認識されています。狭い切片のみを解析すると、より大きな構造や組織構築の不可欠な側面において重要な文脈上の詳細が失われる可能性があり、不完全または誤解を招く解釈につながります。2次元（2D）切片は組織構築の基本的な理解を支えてきましたが、生物学的組織の真の3次元的な実態を捉えるには不十分です。

現在、複数の解剖学的領域にわたる多くの研究において、フラットマウント、ホールマウント、またはエンフェイス（en face）標本といった、完全な解剖学的単位を単離する手法と、高解像度蛍光顕微鏡法を組み合わせた手法が採用されています。これらのアプローチにより、構造的組織のより包括的な可視化と解釈が可能になります。これは、驚異的な再生能力の根底にある複雑な細胞メカニズムを定義するために全層的なコンテキストを必要とする嗅覚神経系において、特に重要です。薄切片では、十分に定義されていない重要な病理生理学的特徴を見逃すリスクがあります。

これらの限界および嗅覚再生を促進する細胞間相互作用に関する知識の不足を考慮し、組織全体の複雑性を維持できる精緻なホールマウント法の開発が不可欠であった。嗅粘膜全体を全層サンプルとして分離し、最適化した抗体浸透プロトコルを併用した。高解像度イメージング（EVIDENT SpinSR）と3D再構成により、in vivoでの細胞間相互作用の正確な可視化が可能となった。

概要

嗅覚神経系（ONS）は、生涯を通じてニューロンの更新という独自の能力を保持しているため、神経再生のメカニズムを研究するためのユニークで確立されたモデルとなっています1。しかし、嗅覚系における細胞の挙動に関する理解に大きな不十分な点があるため、この神経修復能力を臨床的に応用する可能性は依然として限られています2,3,4。一次嗅覚ニューロン、嗅神経鞘細胞（OEC）、および神経周囲線維芽細胞を含むONSの細胞応答と解剖学的構成は、齧歯類のONSに適用した重度の物理的損傷モデルと、極薄（<2 µm）の組織切片作製を組み合わせた複数の動物研究で記述されてきました1,2。これらの研究における動物は、通常、損傷後10日目に屠殺されており、神経損傷時に起こる広範かつより複雑な組織リモデリングの、ある特定の時点というわずかな期間しか捉えられていません2。これらの研究では、軸索の死滅後、OECと線維芽細胞が損傷に沿って連続的なチャネルとして持続することが報告されています。

本アプローチは有益ではあるものの、上述した多くの制限により、ONSの概念的な概要を低解像度かつ表層的なレベルで提供することに留まり、結果として、無傷のONS内における実際の細胞組織の包括的な評価は困難であった3。その結果、重要な空間的関係性が見落とされた可能性がある。

三次元的な組織構造の保存は、正確な解剖学的および細胞学的解析に不可欠であり、多くの臓器や病理において適用実績がある4,5,6,7,8,9,10,11,12。嗅粘膜内の神経組織のマッピングにはホールマウント法が用いられてきたが13,14、保存された固有層を含む全層のONS構造における細胞間相互作用の可視化は、まだ達成されていない。

本研究では、マウスモデルを用い、組織のホールマウント処理、免疫染色、高解像度イメージング、および3次元再構成を組み合わせたワークフローを確立し、嗅神経系（ONS）構造の詳細な解析を可能にしました。本プロトコルは、既存の報告された手法の不足を補うために開発されたものであり、固有層を含む全層の嗅粘膜を保存・保持することで、細胞間相互作用の研究を可能にします。特筆すべきは、この精緻化された組織採取および処理手法が、さまざまな嗅覚系モデルに適用し、組み合わせることが可能である点です。

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プロトコル

動物および遺伝子組み換え細胞を用いたすべての実験は、オーストラリア連邦遺伝子技術規制局（OGTR）のガイドラインに従い、グリフィス大学バイオセーフティ委員会（NLRD/003/2020_var3）およびグリフィス大学動物倫理委員会（MHIQ/04/23/AEC）の承認を得て実施されました。

注：本研究では、雌雄合わせて計15匹の成体実験用マウス（8～9週齢）を使用した。具体的には、すべてのOECがS100βプロモーターの制御下で鮮やかな赤色タンパク質であるDsRedを発現するS100β-DsRedトランスジェニックマウスを用いた。S100βは広範なカルシウム結合タンパク質ファミリーの一員であり、OECなどの中枢神経系のグリア細胞に一般的に発現している。このモデルは、内因性蛍光信号を用いて標的細胞集団を容易に局在化できるため、本実験の目的に最適であった。S100β-DsRedトランスジェニックマウスは以前に作製されており、これらのトランスジェニックマウスの使用は、固定組織分析における免疫組織化学的染色と比較して、OECの検出能が向上することが示されている15,16,17,18。

1. 頭部の採取および組織の固定

  1. 実験の各タイムポイントにおいて、CO2吸入により動物を安楽死させます。
  2. 角膜反射および足底逃避反射の消失によって死亡を確認し、続いて頸椎脱臼を行うか、あるいは承認済みの標準作業手順書（SOP）に従ってください。
  3. ハサミを用いて頭部全体と顎を取り除きます。
  4. 頭蓋骨から皮膚を取り除き、鼻腔を露出させて固定剤が効率的に浸透するように、鼻端の軟骨を除去します。
    注意：動物の鼻軟骨の最前部を切除するこのステップは、鼻腔内の組織を正しく固定するために不可欠であることが観察されています。
  5. 頭部を1× PBSで素早くすすぎ、過剰な血液を取り除きます。
  6. 組織を4% パラホルムアルデヒドに浸し、ローラーを用いて4 °Cで一晩（12～18時間）、少なくとも6時間（目的組織の固定に十分な時間）固定します。
    注意：パラホルムアルデヒドはホルムアルデヒド蒸気を放出する有害化学物質です。吸入、皮膚接触、および飲み込みにより毒性があり、目、皮膚、および呼吸器への刺激を引き起こし、発がん性の疑いがあります。手袋、白衣、および保護眼鏡を含む適切な個人用保護具（PPE）を着用し、必ずドラフトチャンバー内で取り扱ってください。プロトコル中に発生した有害化学物質および生物学的廃棄物の安全な廃棄は、施設および地域の規制に従って行う必要があります。
    ​注意：最適化の過程で、目的組織の固定には6時間で十分であることが観察されましたが、12時間を超えると過固定が起こり、粘膜構造が分解される可能性が高いことが分かりました。
  7. 頭部を固定剤から取り出し、ローラーを用いて室温（20～25 °C）の1× PBSで3時間洗浄します。
  8. 頭部を新鮮なPBS中で4 °Cで保存し、48時間以内に粘膜組織をホールマウントで回収します。

2. 全身組織の採取

  1. 顕微鏡下で組織の分離を行う。
  2. メスを用いて、正中矢状線に沿って頭部を半分に切断する。
  3. 鼻腔内部を露出させる（図 1）。解剖学的領域を確認し、解剖学的切片全体を覆う粘膜組織を回収する（図 1B）。
  4. 骨切断機を用いて、粘膜腔の一部を覆っている鼻中隔骨を慎重に砕いて除去する。
    注： 図 2Aを参照。このステップは、軸索束が背側壁を走行している骨下の凹みにある腔を露出させるために極めて重要である（図 1B）。
  5. この領域が露出したら、曲鉗子を用いて凹んだ背側壁から組織を慎重に剥離し、すくい出す。組織を下層の骨から持ち上げ、残りの嗅粘膜を慎重に剥がして、完全なホールマウント標本として回収する。
    注：この段階では、組織を破らないよう細心の注意が必要であった。
  6. 左右両方の鼻孔から目的の組織を回収する。粘膜は中隔、背側の左右壁、および鼻腔の篩板を覆っている（図 1A, B）。中隔、背側壁、篩板を含む両鼻孔から組織を回収し、一次嗅覚構造を含む解剖学的領域を分離する（図 2C）。
  7. 回収した組織をPBS 1×で洗浄し、骨片を含む不要な組織を除去する。組織をPBS 1×に入れ、4 °Cで保存し、後の免疫組織化学分析に使用する。
    注：組織を長期保存する場合は、PBS 1×および0.001% (W/V) アジ化ナトリウム溶液に入れ、4 °Cで保存することを推奨する。

3. 最適化された染色プロトコル

注意：一般的に利用されている染色プロトコルは、通常、薄型から中程度の厚さの切片（例：50 µmまで）向けに最適化されています。そのため、本プロトコルでは、より厚い組織に合わせて調整を行う必要がありました。
​重要なステップとして、染色工程全体を通じて組織をエッペンドルフチューブ内で浮かせて保持し、試薬の浸透中にチューブをローラー上に配置することが有効であると分かりました。したがって、組織をイメージングスライド上に置いた状態で染色ステップを行うのではなく、まず浮かせて染色し、その後にイメージングスライドに封入しました。これらの詳細な手順により、組織の折り畳みを防ぎ、試薬や抗体が全領域に浸透することを確実にしました。

  1. 保存されていた組織を取り出し、ブロッキング溶液（使用する溶液は染色法により異なる）を入れたエッペンドルフチューブに移す。
    ​注：ブロッキング溶液：3% BSA、0.3% Triton X-100含有PBS。もう一つの重要な調整事項は、組織を各試薬および抗体カクテルに曝露させる時間である。
  2. 組織をブロッキング溶液に入れ、室温のローラー上で3時間保持する。
    注：標準的な薄切切片の免疫組織化学染色の手法と比較して、曝露時間を延長すれば、選択した抗体および染色試薬（Table 1）の濃度を上げる必要はないことが観察された。これにより、高価な抗体試薬の使用量も最小限に抑えられた。インキュベーションは、ローラー上で回転させるため、蓋の留め具を切り取った1.5 mLエッペンドルフチューブを用いて行う。試薬量は500 µLとした。
  3. 一次抗体とともに、4°Cのローラー上で72時間インキュベートする。
  4. 室温のローラー上で、PBS 1×を用いて組織を2回洗浄する（1回の洗浄につき1.5時間）。
  5. 二次抗体（アルミホイルで遮光）および核染色液とともに、まず室温のローラー上で最低4時間インキュベートし、その後4°Cのローラー上で一晩（12–18時間）インキュベートする。
  6. 室温のローラー上で、PBS 1×を用いて組織を2回洗浄する（1回につき1.5時間）。

4. スライド標本の作製

  1. エッペンドルフチューブから組織を慎重に取り出す
  2. 顕微鏡下で組織をスライドガラス上に配置し、組織に折り畳みがないことを確認する。
    注意：蛍光がなくとも、顕微鏡下で組織の向きを識別することが可能である。粘膜組織の固有層側をスライドガラスに配置し、上皮側がガラススライドに接し、固有層側がカバーガラスに向くようにする。固有層は、染色なしで視認できる太い神経束の存在によって識別できる。固有層をカバーガラス側に、上皮側をスライドガラス側に配置することで、染色およびイメージング処理が容易になる。
  3. 蛍光封入剤を用いてカバーガラスを被せ、スライドを密封する。
  4. 室温の暗所で一晩（12–18 h）乾燥させた後、スライドを4 °Cで保存することができる

5. 画像取得および後処理

  1. 低倍率免疫蛍光画像の取得
    1. 画像取得時に、リニアアルファブレンディングを用いて自動スティッチングを行う。
      ​注: zスタックのフレーム数は、組織体積を完全にカバーできるよう、標本の厚さに合わせて調整すること。
    2. 隣接する視野を15%のオーバーラップで撮影する。ミアンダー取得パターンを用いてタイル画像を習得する。
    3. 光学切片の総数を組織の厚さに合わせて調整する。
    4. 画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに215.594 nm/pixelに設定する。zステップサイズを0.8 µmとして、zスタック画像を取得する。
    5. マウントしたホールマウント組織を共焦点顕微鏡のステージに置く。30x対物レンズ（NA 1.04）を用いて概要画像を取得する。
  2. 高倍率免疫蛍光画像の取得
    1. 60×対物レンズ（NA 1.5）を用いて詳細画像を取得する。画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに107.923 nm/pixelに設定する。zステップサイズを0.41 µmとして、zスタック画像を取得する。
    2. 光学切片の総数を組織の厚さに合わせて調整し、単一の視野から画像を撮影する。
      ​注：60×での取得では、各データセットが単一の視野で構成されているため、画像のスティッチングは不要である。
  3. 組織学的参照画像の取得
    1. スライドスキャン顕微鏡を用い、明視野照明下でHE染色したマウス頭部の正中矢状断切片を撮像する。
    2. 40×対物レンズ（NA 0.95）および0.63xのカメラ倍率を用い、実効倍率25.2×で画像を取得する。
    3. X軸およびY軸ともにピクセルキャリブレーションが136.905 nm/pixelであることを確認し、単一焦点面として画像を取得する。
    4. ミアンダー取得パターンとリニアアルファブレンディングを用い、タイル画像を自動的にスティッチする。
  4. 概要免疫蛍光参照画像の取得
    1. 10x対物レンズを用いて、補完的な概要免疫蛍光画像を取得する。
    2. 画像取得時のタイルオーバーラップを0%に設定し、標本を単一のzスライスとして撮影する。
    3. 画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに647.249 nm/pixelに設定し、関心のある解剖学的領域全体を包含する概要画像を生成する。
  5. 画像処理および最終図の作成
    1. 取得した画像データセットを画像解析ソフトウェアにエクスポートする。zスタックデータセットから最大強度投影画像（MIP）を生成する。
    2. その後の解析および図の作成に向けた関心領域（ROI）を選択する。
    3. 概要免疫蛍光画像と対応するHE画像を組み合わせて、解剖学的参照図を作成する。その後、図を作成する前に、蛍光データセットと組織学的データセットの間でアライメントと解剖学的対応を確認する。
      注: すべての画像スティッチングは、あらかじめ設定された顕微鏡設定を用いて画像取得時に自動的に行われるべきであり、追加の後処理は不要である。本研究では、3DレンダリングはImarisソフトウェアを用いて生成した。具体的には、取得した各チャネルの閾値強度に基づくサーフェスレンダリングプラグインを使用して3D再構築を行った。最終的に、Adobe Illustratorで最終画像を編集した。

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結果

本稿で提示するホールマウント法により、嗅粘膜をその entirety（全体）として単離および保存することが可能となりました。本研究では、マクロ（全解剖学的視点）およびミクロ（細胞レベル）の両スケールにおける細胞学的および解剖学的変化の理解に焦点を当てました。

ホールマウント法を用いることで、上皮層と粘膜固有層の両方のコンパートメントを回収し、軸索束、嗅神経鞘細胞（OECs）、および線維芽細胞という目的細胞間の空間的な関係を維持することが可能になります。この手法により、粘膜組織の全厚および広範な表面積を捉えた大規模で連続的なデータセットの取得が可能となり（図3）、複雑な細胞構造と相互作用の詳細（図3）、およびそれらが正常状態（n = 3）（図3A, B）から損傷状態（n = 12）（図3C, D

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ディスカッション

ここ数十年の間に、科学分野において多くの革新的なアプローチが開発され、徐々に三次元時代の幕開けを迎えました。例えば、複雑なホールマウントイメージング法の開発と高解像度蛍光顕微鏡の組み合わせによって可能となった三次元再構成アプローチは、いくつかの全層組織の組織構築に関する理解を深めることに寄与してきました。これらの三次元レンダリングアプローチは、血管、腺、一般的な腫瘍など、人体におけるいくつかの構造を定義するために用いられています4,5,6,7,8,9。さらに、例えばマウスの脳全体において、病理学的構造と正常構造との間の相違に関する情報が収集されています10,

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開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

本研究は、Clem Jones Foundation、Perry Cross Spinal Research Foundation、およびMotor Accident Insurance CommissionからJSTJおよびRRへの助成金、National Injury Insurance Scheme Queensland fellowshipからRRへの助成金、およびPerry Cross Spinal Research Foundation fellowshipからFOへの助成金によって支援を受けました。また、本プロジェクトの一部は、「Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)」および「Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)」によるFOへの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
牛血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA3294-50G免疫組織化学染色
Adobe Illustratorversion 28.5
抗beta III Tubulin抗体 - 神経マーカーAbcamab18207
抗PDGFR beta抗体 [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 三塩酸塩Sigma Aldrich14533
カバーガラス 24X50MM No. 1.5 100枚入Bio-strategyEPBRCS245015GP免疫組織化学染色
ドンキー抗ウサギ IgG (H+L) 高交叉吸着二次抗体, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Dumont #15A 骨切断鉗子 - エポキシコーティングDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02組織解剖
Dumont #7 ピンセット - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10組織解剖
ヤギ抗ラット IgG (H+L) 交叉吸着二次抗体, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Imaris ソフトウェアImarisversion 9.5.0イメージング
Mayo 解剖用はさみProSciTech420SS組織解剖
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148-500G組織処理
リン酸緩衝生理食塩水、滅菌PBS錠剤 (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014組織処理
ProLong Glass 抗退色封入剤Thermo Fisher ScientificP36980免疫組織化学染色
メス刃 #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240B組織解剖
メスハンドル #4ProSciTechT134組織解剖
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002-25G組織処理
ショ糖Chem-Supply57-50-1組織処理
TOMO Adhesion 顕微鏡スライドグラスProSciTechGEMS63705-09免疫組織化学染色
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mL免疫組織化学染色

参考文献

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