全層解析を用いたマウス嗅覚神経系モデルにおけるIn Vivo組織複雑性の維持：神経再生の研究に向けて

サマリー

本プロトコールでは、マウスの嗅覚神経系の解剖学的複雑性を維持するための完全なワークフローについて概説します。ここでは、解剖、組織標本作成、およびイメージングを含む詳細なワークフローを解説しています。本プロトコールは、正常な状態および、自然修復過程を含む異常な状態における嗅覚系の研究に活用いただけます。

要約

3次元（3D）イメージングの時代において、標準的な免疫組織化学は、病理学や複雑な人体解剖の研究において非常に限定的であると認識されています。狭い切片のみを解析すると、より大きな構造や組織構築の不可欠な側面において重要な文脈上の詳細が失われる可能性があり、不完全または誤解を招く解釈につながります。2次元（2D）切片は組織構築の基本的な理解を支えてきましたが、生物学的組織の真の3次元的な実態を捉えるには不十分です。

現在、複数の解剖学的領域にわたる多くの研究において、フラットマウント、ホールマウント、またはエンフェイス（en face）標本といった、完全な解剖学的単位を単離する手法と、高解像度蛍光顕微鏡法を組み合わせた手法が採用されています。これらのアプローチにより、構造的組織のより包括的な可視化と解釈が可能になります。これは、驚異的な再生能力の根底にある複雑な細胞メカニズムを定義するために全層的なコンテキストを必要とする嗅覚神経系において、特に重要です。薄切片では、十分に定義されていない重要な病理生理学的特徴を見逃すリスクがあります。

これらの限界および嗅覚再生を促進する細胞間相互作用に関する知識の不足を考慮し、組織全体の複雑性を維持できる精緻なホールマウント法の開発が不可欠であった。嗅粘膜全体を全層サンプルとして分離し、最適化した抗体浸透プロトコルを併用した。高解像度イメージング（EVIDENT SpinSR）と3D再構成により、in vivoでの細胞間相互作用の正確な可視化が可能となった。

概要

嗅覚神経系（ONS）は、生涯を通じてニューロンの更新という独自の能力を保持しているため、神経再生のメカニズムを研究するためのユニークで確立されたモデルとなっています¹。しかし、嗅覚系における細胞の挙動に関する理解に大きな不十分な点があるため、この神経修復能力を臨床的に応用する可能性は依然として限られています^2,3,4。一次嗅覚ニューロン、嗅神経鞘細胞（OEC）、および神経周囲線維芽細胞を含むONSの細胞応答と解剖学的構成は、齧歯類のONSに適用した重度の物理的損傷モデルと、極薄（<2 µm）の組織切片作製を組み合わせた複数の動物研究で記述されてきました^1,2。これらの研究における動物は、通常、損傷後10日目に屠殺されており、神経損傷時に起こる広範かつより複雑な組織リモデリングの、ある特定の時点というわずかな期間しか捉えられていません²。これらの研究では、軸索の死滅後、OECと線維芽細胞が損傷に沿って連続的なチャネルとして持続することが報告されています。

本アプローチは有益ではあるものの、上述した多くの制限により、ONSの概念的な概要を低解像度かつ表層的なレベルで提供することに留まり、結果として、無傷のONS内における実際の細胞組織の包括的な評価は困難であった³。その結果、重要な空間的関係性が見落とされた可能性がある。

三次元的な組織構造の保存は、正確な解剖学的および細胞学的解析に不可欠であり、多くの臓器や病理において適用実績がある^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}。嗅粘膜内の神経組織のマッピングにはホールマウント法が用いられてきたが^13,14、保存された固有層を含む全層のONS構造における細胞間相互作用の可視化は、まだ達成されていない。

本研究では、マウスモデルを用い、組織のホールマウント処理、免疫染色、高解像度イメージング、および3次元再構成を組み合わせたワークフローを確立し、嗅神経系（ONS）構造の詳細な解析を可能にしました。本プロトコルは、既存の報告された手法の不足を補うために開発されたものであり、固有層を含む全層の嗅粘膜を保存・保持することで、細胞間相互作用の研究を可能にします。特筆すべきは、この精緻化された組織採取および処理手法が、さまざまな嗅覚系モデルに適用し、組み合わせることが可能である点です。

プロトコル

動物および遺伝子組み換え細胞を用いたすべての実験は、オーストラリア連邦遺伝子技術規制局（OGTR）のガイドラインに従い、グリフィス大学バイオセーフティ委員会（NLRD/003/2020_var3）およびグリフィス大学動物倫理委員会（MHIQ/04/23/AEC）の承認を得て実施されました。

注：本研究では、雌雄合わせて計15匹の成体実験用マウス（8～9週齢）を使用した。具体的には、すべてのOECがS100βプロモーターの制御下で鮮やかな赤色タンパク質であるDsRedを発現するS100β-DsRedトランスジェニックマウスを用いた。S100βは広範なカルシウム結合タンパク質ファミリーの一員であり、OECなどの中枢神経系のグリア細胞に一般的に発現している。このモデルは、内因性蛍光信号を用いて標的細胞集団を容易に局在化できるため、本実験の目的に最適であった。S100β-DsRedトランスジェニックマウスは以前に作製されており、これらのトランスジェニックマウスの使用は、固定組織分析における免疫組織化学的染色と比較して、OECの検出能が向上することが示されている^15,16,17,18。

1. 頭部の採取および組織の固定

1. 実験の各タイムポイントにおいて、CO₂吸入により動物を安楽死させます。
2. 角膜反射および足底逃避反射の消失によって死亡を確認し、続いて頸椎脱臼を行うか、あるいは承認済みの標準作業手順書（SOP）に従ってください。
3. ハサミを用いて頭部全体と顎を取り除きます。
4. 頭蓋骨から皮膚を取り除き、鼻腔を露出させて固定剤が効率的に浸透するように、鼻端の軟骨を除去します。
   注意：動物の鼻軟骨の最前部を切除するこのステップは、鼻腔内の組織を正しく固定するために不可欠であることが観察されています。
5. 頭部を1× PBSで素早くすすぎ、過剰な血液を取り除きます。
6. 組織を4% パラホルムアルデヒドに浸し、ローラーを用いて4 °Cで一晩（12～18時間）、少なくとも6時間（目的組織の固定に十分な時間）固定します。
   注意：パラホルムアルデヒドはホルムアルデヒド蒸気を放出する有害化学物質です。吸入、皮膚接触、および飲み込みにより毒性があり、目、皮膚、および呼吸器への刺激を引き起こし、発がん性の疑いがあります。手袋、白衣、および保護眼鏡を含む適切な個人用保護具（PPE）を着用し、必ずドラフトチャンバー内で取り扱ってください。プロトコル中に発生した有害化学物質および生物学的廃棄物の安全な廃棄は、施設および地域の規制に従って行う必要があります。
   ​注意：最適化の過程で、目的組織の固定には6時間で十分であることが観察されましたが、12時間を超えると過固定が起こり、粘膜構造が分解される可能性が高いことが分かりました。
7. 頭部を固定剤から取り出し、ローラーを用いて室温（20～25 °C）の1× PBSで3時間洗浄します。
8. 頭部を新鮮なPBS中で4 °Cで保存し、48時間以内に粘膜組織をホールマウントで回収します。

2. 全身組織の採取

1. 顕微鏡下で組織の分離を行う。
2. メスを用いて、正中矢状線に沿って頭部を半分に切断する。
3. 鼻腔内部を露出させる（図 1）。解剖学的領域を確認し、解剖学的切片全体を覆う粘膜組織を回収する（図 1B）。
4. 骨切断機を用いて、粘膜腔の一部を覆っている鼻中隔骨を慎重に砕いて除去する。
   注： 図 2Aを参照。このステップは、軸索束が背側壁を走行している骨下の凹みにある腔を露出させるために極めて重要である（図 1B）。
5. この領域が露出したら、曲鉗子を用いて凹んだ背側壁から組織を慎重に剥離し、すくい出す。組織を下層の骨から持ち上げ、残りの嗅粘膜を慎重に剥がして、完全なホールマウント標本として回収する。
   注：この段階では、組織を破らないよう細心の注意が必要であった。
6. 左右両方の鼻孔から目的の組織を回収する。粘膜は中隔、背側の左右壁、および鼻腔の篩板を覆っている（図 1A, B）。中隔、背側壁、篩板を含む両鼻孔から組織を回収し、一次嗅覚構造を含む解剖学的領域を分離する（図 2C）。
7. 回収した組織をPBS 1×で洗浄し、骨片を含む不要な組織を除去する。組織をPBS 1×に入れ、4 °Cで保存し、後の免疫組織化学分析に使用する。
   注：組織を長期保存する場合は、PBS 1×および0.001% (W/V) アジ化ナトリウム溶液に入れ、4 °Cで保存することを推奨する。

3. 最適化された染色プロトコル

注意：一般的に利用されている染色プロトコルは、通常、薄型から中程度の厚さの切片（例：50 µmまで）向けに最適化されています。そのため、本プロトコルでは、より厚い組織に合わせて調整を行う必要がありました。
​重要なステップとして、染色工程全体を通じて組織をエッペンドルフチューブ内で浮かせて保持し、試薬の浸透中にチューブをローラー上に配置することが有効であると分かりました。したがって、組織をイメージングスライド上に置いた状態で染色ステップを行うのではなく、まず浮かせて染色し、その後にイメージングスライドに封入しました。これらの詳細な手順により、組織の折り畳みを防ぎ、試薬や抗体が全領域に浸透することを確実にしました。

1. 保存されていた組織を取り出し、ブロッキング溶液（使用する溶液は染色法により異なる）を入れたエッペンドルフチューブに移す。
   ​注：ブロッキング溶液：3% BSA、0.3% Triton X-100含有PBS。もう一つの重要な調整事項は、組織を各試薬および抗体カクテルに曝露させる時間である。
2. 組織をブロッキング溶液に入れ、室温のローラー上で3時間保持する。
   注：標準的な薄切切片の免疫組織化学染色の手法と比較して、曝露時間を延長すれば、選択した抗体および染色試薬（Table 1）の濃度を上げる必要はないことが観察された。これにより、高価な抗体試薬の使用量も最小限に抑えられた。インキュベーションは、ローラー上で回転させるため、蓋の留め具を切り取った1.5 mLエッペンドルフチューブを用いて行う。試薬量は500 µLとした。
3. 一次抗体とともに、4°Cのローラー上で72時間インキュベートする。
4. 室温のローラー上で、PBS 1×を用いて組織を2回洗浄する（1回の洗浄につき1.5時間）。
5. 二次抗体（アルミホイルで遮光）および核染色液とともに、まず室温のローラー上で最低4時間インキュベートし、その後4°Cのローラー上で一晩（12–18時間）インキュベートする。
6. 室温のローラー上で、PBS 1×を用いて組織を2回洗浄する（1回につき1.5時間）。

4. スライド標本の作製

1. エッペンドルフチューブから組織を慎重に取り出す
2. 顕微鏡下で組織をスライドガラス上に配置し、組織に折り畳みがないことを確認する。
   注意：蛍光がなくとも、顕微鏡下で組織の向きを識別することが可能である。粘膜組織の固有層側をスライドガラスに配置し、上皮側がガラススライドに接し、固有層側がカバーガラスに向くようにする。固有層は、染色なしで視認できる太い神経束の存在によって識別できる。固有層をカバーガラス側に、上皮側をスライドガラス側に配置することで、染色およびイメージング処理が容易になる。
3. 蛍光封入剤を用いてカバーガラスを被せ、スライドを密封する。
4. 室温の暗所で一晩（12–18 h）乾燥させた後、スライドを4 °Cで保存することができる

5. 画像取得および後処理

1. 低倍率免疫蛍光画像の取得
   1. 画像取得時に、リニアアルファブレンディングを用いて自動スティッチングを行う。
      ​注: zスタックのフレーム数は、組織体積を完全にカバーできるよう、標本の厚さに合わせて調整すること。
   2. 隣接する視野を15%のオーバーラップで撮影する。ミアンダー取得パターンを用いてタイル画像を習得する。
   3. 光学切片の総数を組織の厚さに合わせて調整する。
   4. 画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに215.594 nm/pixelに設定する。zステップサイズを0.8 µmとして、zスタック画像を取得する。
   5. マウントしたホールマウント組織を共焦点顕微鏡のステージに置く。30x対物レンズ（NA 1.04）を用いて概要画像を取得する。
2. 高倍率免疫蛍光画像の取得
   1. 60×対物レンズ（NA 1.5）を用いて詳細画像を取得する。画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに107.923 nm/pixelに設定する。zステップサイズを0.41 µmとして、zスタック画像を取得する。
   2. 光学切片の総数を組織の厚さに合わせて調整し、単一の視野から画像を撮影する。
      ​注：60×での取得では、各データセットが単一の視野で構成されているため、画像のスティッチングは不要である。
3. 組織学的参照画像の取得
   1. スライドスキャン顕微鏡を用い、明視野照明下でHE染色したマウス頭部の正中矢状断切片を撮像する。
   2. 40×対物レンズ（NA 0.95）および0.63xのカメラ倍率を用い、実効倍率25.2×で画像を取得する。
   3. X軸およびY軸ともにピクセルキャリブレーションが136.905 nm/pixelであることを確認し、単一焦点面として画像を取得する。
   4. ミアンダー取得パターンとリニアアルファブレンディングを用い、タイル画像を自動的にスティッチする。
4. 概要免疫蛍光参照画像の取得
   1. 10x対物レンズを用いて、補完的な概要免疫蛍光画像を取得する。
   2. 画像取得時のタイルオーバーラップを0%に設定し、標本を単一のzスライスとして撮影する。
   3. 画像キャリブレーションをX軸およびY軸ともに647.249 nm/pixelに設定し、関心のある解剖学的領域全体を包含する概要画像を生成する。
5. 画像処理および最終図の作成
   1. 取得した画像データセットを画像解析ソフトウェアにエクスポートする。zスタックデータセットから最大強度投影画像（MIP）を生成する。
   2. その後の解析および図の作成に向けた関心領域（ROI）を選択する。
   3. 概要免疫蛍光画像と対応するHE画像を組み合わせて、解剖学的参照図を作成する。その後、図を作成する前に、蛍光データセットと組織学的データセットの間でアライメントと解剖学的対応を確認する。
      注: すべての画像スティッチングは、あらかじめ設定された顕微鏡設定を用いて画像取得時に自動的に行われるべきであり、追加の後処理は不要である。本研究では、3DレンダリングはImarisソフトウェアを用いて生成した。具体的には、取得した各チャネルの閾値強度に基づくサーフェスレンダリングプラグインを使用して3D再構築を行った。最終的に、Adobe Illustratorで最終画像を編集した。

結果

本稿で提示するホールマウント法により、嗅覚粘膜を完全に単離し、保存することが可能となりました。本研究では、マクロ（全体的な解剖学的視点）とミクロ（細胞レベル）の両方のスケールにおいて、細胞および解剖学的な変化を理解することに焦点を当てました。

ホールマウント法を用いることで、上皮および固有層の両方の区画を回収し、軸索束、嗅神経鞘細胞（OEC）、および線維芽細胞という目的細胞間の空間的な関係を維持することが可能になります。このアプローチにより、粘膜組織の全厚と広い表面積を捉えた大規模で連続的なデータセットの取得が可能となり（図3）、複雑な細胞構造と相互作用の詳細（図3）、およびそれらが正常状態（n = 3）（図3A, B）と損傷状態（n = 12）（図3C, D）の間でどのように変化するかを捉えることができました。

この最適化された組織処理および染色手順を高解像度共焦点顕微鏡法と組み合わせることで、組織の全層にわたって、細胞レベルの非常に精細かつ正確な詳細を備えた、より広範囲の粘膜領域の画像を得ることができました。隣接する複数の領域でZスタック撮影を行うことで、解像度や信号の完全性を損なうことなく、広範な解剖学的領域の再構成が可能となりました（図 4A–F）。また、細胞レベルの高解像度な詳細が得られたため、組織全厚のZスタック画像（図 4G）を用いてレンダリング画像（図 4H）を作成し、組織の微細構造をさらに深く理解することができました。

蛍光標識を用いることなく、封入およびイメージング前の組織の方向を安定して正確に決定することができました。固有層側は、上皮層とは明確に区別できる太い神経束の存在により、明視野顕微鏡下で容易に識別可能です。固有層をカバーガラスに隣接させ、上皮表面をガラススライドに向けることでサンプルの方向を標準化したことにより、サンプル間のイメージングの整合性が向上し、その後の3次元再構成が容易になりました。抗体の浸透度は、組織の厚み全体にわたって観察される関連シグナルを分析することで判断できます。通常、シグナルが消失しているか、あるいは組織の深部に近づくにつれてシグナルが漸次的に減少していることで確認できます。

Imarisによる3次元レンダリングにより、無傷の粘膜内における複雑な細胞ネットワークと軸索組織の明確な可視化が可能となりました。チャネルごとの強度しきい値設定によるサーフェスベースのレンダリングを用いることで、微細な構造的詳細を保持しつつ、組織構造の正確な3D表現を生成しました。

染色および可視化において、期待される結果は、組織の厚み全体にわたって信号の異常な消失や劣化がなく、標的の染色信号が明確に可視化されることです。顕微鏡観察において、既知の染色標的を可視化できない場合は、不成功の結果とみなされるべきです。

図 1. 粘膜ホールマウント組織を重ね合わせた解剖学的領域の表現。(A–C)。マウスの左鼻孔内部の矢状面像（ヘマトキシリン・エオジン、HE染色）(A)と、解剖学的方向を確認するために同領域から得た粘膜ホールマウント染色像を重ね合わせた画像(B)。軸索束を緑色で、細胞核を青色で示し、その方向と位置を表している。この手法により、解剖学的構造全体を保存することが可能となった。これにより、一次嗅神経（ON）および副神経（鋤鼻神経、VNN）の軸索束を明確に区別し、中隔から篩板を介して嗅球（OB）に至る経路を追跡することができる(B, C)。ここで示す組織は、核をHoechst（青色）、軸索束をβ-III-Tubulin（緑色）で染色したものである。n = 15 の独立した標本からの代表的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2嗅覚系のマクロおよび概略図。 (Aボーンカッターを用いて、赤色の点線に沿って鼻中隔骨（黄色領域）を除去します。B下層の凹状の鼻腔（茶色）が露出したら、この領域から呼吸粘膜および嗅覚粘膜まで広がる粘膜組織全体を採取することができます。C) 嗅上皮から嗅球に至るまで、これらの構造が連続していることを示す模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3ホールマウント採取および染色プロトコルによって得られた、当該解剖学的領域の拡大像。 (A–D). 健康な粘膜と損傷した粘膜の代表的な画像を示す。上から順に、健康な組織由来の正常な粘膜（n = 3）および損傷した粘膜（n = 12）である。健康な組織では（A）、伸長した双極性の形態を持つOEC（A（左）で軸索束を包み込み、A、中央）、そして線維芽細胞がこれらのトンネル状構造の外層を形成している（A, 右、白矢印）。選択した3つのROIは、これらの詳細を反映している（B）。損傷した粘膜において、OECは双極形および円形の形態の両方を示します（C, D、左、白矢印）。軸索束は均一性が低く、密度が低くなっている（C, D、中央、白矢印）。線維芽細胞が領域全体に広く分布している（C, D（右、白矢印）。スケールバー = 100 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4粘膜ホールマウントの三次元蛍光イメージング。 (A–H). 細胞の低倍率像（A–F) および高倍率像（GSpinSR顕微鏡を用いて、連続する複数の領域の画像スタックから取得した。嗅神経鞘細胞（OEC）を赤色で、線維芽細胞をマゼンタ色で、軸索を緑色で、核を青色で示している。矢印は、異なるOECの形態（A）および軸索束を囲む線維芽細胞の外層（B および C). D–F 線維芽細胞の健全な構造における類似点を強調する矢印が付されています。これらの画像によって細胞成分の空間的配置が明確になり、その後、Imarisソフトウェアを用いてレンダリングされました（H）。スケールバー = 50 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

試薬	ターゲット	希釈	培養条件	理論的根拠
一次抗体
β-III-Tubulin (ウサギ)	軸索	1:300	72時間、～で 4 °Cローラー上で	全層に浸透させるため
PDGFR-β （ラット）	線維芽細胞	1:100
二次抗体
Alexa 488	ウサギ一次抗体	1:250	アルミホイルで包み、室温のローター上で最低4時間、その後一晩、 4 °C ローラー上で。	アルミホイルは光退色を防止します。処理時間、温度、およびローラーによる撹拌により、良好な浸透が可能になります。
Alexa 647	ラット一次抗体	1:500
細胞核
ヘキスト	細胞核	1:2500

表1：本プロトコル用に最適化された抗体および希釈率の一覧。この表には、染色試薬とその標的、希釈率、およびインキュベーション条件の根拠が記載されています。

ディスカッション

ここ数十年の間に、科学分野において多くの革新的なアプローチが開発され、徐々に三次元時代の幕開けを迎えました。例えば、複雑なホールマウントイメージング法の開発と高解像度蛍光顕微鏡の組み合わせによって可能となった三次元再構成アプローチは、いくつかの全層組織の組織構築に関する理解を深めることに寄与してきました。これらの三次元レンダリングアプローチは、血管、腺、一般的な腫瘍など、人体におけるいくつかの構造を定義するために用いられています^4,5,6,7,8,9。さらに、例えばマウスの脳全体において、病理学的構造と正常構造との間の相違に関する情報が収集されています^10,11,12。このアプローチは、さまざまな生物学的システムのより良い理解に向けた重要なステップであるとされており、細胞回路、その構造的・機能的な空間的組織化、およびそれらがヒトの病理に寄与する可能性についての深い理解を促進しています。

三次元組織再構成とイメージングのさまざまな組み合わせにおける欠点は、ほとんどの手法で組織透明化ステップが必要となることです。この手法は多くの組織にとって有用ですが、すべての組織型に適しているわけではありません^8,9,19。実際、透明化の手順にはいくつかの洗浄ステップが含まれており、これが標的エピトープを損傷させたり、内因性シグナルに影響を与えたりする可能性があります²⁰。

上述のアプローチは、さまざまなシステムにおける多くの重要な細胞構造の定義に用いられてきました。しかし、嗅覚系およびその関心構造には、容易に分離するための骨成分がほとんど含まれていません。そのため、近年では透明化ステップを含まないホールマウントアプローチが試行されています^13,14。

これらの研究では、嗅覚系における神経構造の構成をより詳細に定義することの重要性が認識されました。したがって、主な目的は、異なるマーカーの発現に基づいた嗅覚感覚ニューロンの分布の明確な地形図を提供すること¹⁴、およびそれらの特異な繊毛に関する新たな知見を明らかにすること¹³でした。

本研究で開発し提示するホールマウント法により、粘膜組織を完全に採取して保存することが可能となり、この環境の解剖学的および生理学的構造に関する重要な知見を得る道が開かれました。本例では特に、OEC、線維芽細胞、および軸索束の間の関係に焦点を当てています。この精緻化した単離および染色法を高解像度共焦点イメージングと組み合わせることで、標的領域全体とその構成細胞の構造を反映した広域画像の取得が可能となりました。具体的に、本精緻化法には2つの明確な利点があります。1つは、固有層の構造¹³を含む粘膜全体を回収して処理できること、もう1つは、他のフラットマウントプロトコール¹⁴と比較して、より穏やかな組織調製法を用いることで、マクロスケールの解剖学的構造および細胞間相互作用（嗅神経鞘細胞、軸索、線維芽細胞など）の保存に寄与することです。そのため、本プロトコールでは薄切切片染色のバリデーションを含めていません。

前述のように、ホールマウント法は通常、長期間の組織処理と、特殊で高価な試薬の使用を伴います。本手法は、処理期間の短縮と重要な細胞構造への損傷リスクの軽減を目的として、組織処理を最小限に抑えることに焦点を当てて開発されました。したがって、最適化されたこの手法は、薄切切片の免疫組織化学染色で一般的に用いられる試薬を使用して実施できる迅速なプロセスであり、処理時間が長く、粘膜組織のような骨のない構造には適さないアプローチに代わる有効な選択肢となります。

画像取得および後処理は、厚い組織サンプルから高解像度のz-stackを取得でき、かつ目的の粘膜を透過して撮影するのに十分なレーザー浸透能を持つ共焦点顕微鏡プラットフォームであれば、どのような装置を用いてでも実施可能です（取得および画像処理設定の詳細については、メソッドセクションを参照してください）。

適切な変更を加えることで、本プロトコルは他の一般的なげっ歯類モデルにも転用および適用が可能であると考えられます。また、組織特異的な変更を行うことで、呼吸器や胃腸管（GIT）の粘膜および粘膜下組織の研究、神経系内における組織構成および多系間相互作用の調査、炎症プロセスおよび粘膜関連リンパ組織（MALTs）の解析、さらには腸脳軸などのさまざまな多系軸の探索など、複数の異なるコンテキストに本手法を適用することができます。

本プロトコルの最大の強みは、組織の完全性を維持しながら高品質な三次元イメージングを可能にする手法の改良にあり、同時に、これまでこの分野で試行されてきた他のホールマウント法と比較して、相対的に迅速なアプローチを実現している点にあります。

このアプローチを成功させるには、対象組織に関する深い解剖学的理解が不可欠でした。実際、本研究においては、頭蓋骨内部を露出させた後の採取手順における侵襲性を最小限に抑えるために、軸索束の予想される局在を知ることが不可欠でした。この解剖学的知識があったからこそ、目的の領域と組織を迅速に特定し、粘膜の全体的な構造を維持することができ、組織処理の成否は、後処理ステップのみならず、知識に基づいた採取戦略に本質的に結びついていることが浮き彫りとなりました。

メソッドセクションの複数の注記で述べたように、本手法の開発と最適化には、いくつかの技術的な調整が不可欠でした。染色プロセス全体を通じて組織をEppendorfチューブ内で自由に浮遊させ、試薬および抗体のインキュベーション中に継続的に回転させることは、より静的なホールマウント法や薄切切片プロトコルとは異なる重要なステップとなりました。この改良により、組織の折り畳みを防ぐとともに、サンプル全体への均一な試薬浸透が確保され、不要な透明化ステップを必要とせずに染色の整合性を向上させることができました。さらに、各試薬および抗体カクテルのインキュベーション時間を慎重に最適化することが不可欠であることが分かりました。この最後のステップについては、選択した抗体の種類に基づいて、さらに調整が必要になる場合があります。

これらの特定の要因が相まって、サンプルへの負荷を軽減し、全体の処理時間を短縮しつつ、再現性の向上を実現しました。

もう一つの重要な手法上のステップは、蛍光標識を必要とせずに、封入およびイメージングの前に組織の向きを確実に決定できることでした。粘膜組織の固有層側は、周囲の上皮組織によって明確に区別できる太い神経束の存在により、明視野顕微鏡下で容易に特定することができました。固有層をカバーガラス側に向け、上皮層をガラススライド上に配置してサンプルの向きを標準化することが、画像取得の品質向上に有効であることが分かりました。この単純ながら効果的な改良により、サンプル間でのイメージングの一貫性が向上し、得られた3次元再構築の品質に寄与しました。

ただし、いくつか考慮すべき制限があります。本プロトコルは、多くの一般的なマウス系統や他のげっ歯類では検証されていません。同様に、最適化は上述の特定の実験条件下および記載した抗体パネルのみを用いて行われました。本プロトコルは、ほとんどのマウスおよびラット系統、複数の異なる抗体、および粘膜を全層で採取可能なあらゆる実験モデルで適用できると考えられますが、さらなる慎重な最適化が必要となる場合があります。もう一つの顕著な制限は、薄切組織では各切片を個別の抗体パネルで染色できるため、複数の異なる抗体パネルをテストできるのに対し、全層標本（ホールマウント）の1切片では1つの抗体パネルしか染色できない点です。

総じて、これらの手法上の革新は、組織の取り扱い、染色条件、およびサンプルの向きに対する比較的簡単な調整によって、ホールマウントイメージングの結果を大幅に改善できることを示しています。広範な組織処理や透明化ステップを回避することで、このアプローチは、詳細で大規模な3次元データの取得を可能にしつつ、骨のない脆弱な組織の研究における実用的かつ適応可能な代替案を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
牛血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	免疫組織化学染色
Adobe Illustrator		version 28.5
抗beta III Tubulin抗体 - 神経マーカー	Abcam	ab18207
抗PDGFR beta抗体 [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 三塩酸塩	Sigma Aldrich	14533
カバーガラス 24X50MM No. 1.5 100枚入	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	免疫組織化学染色
ドンキー抗ウサギ IgG (H+L) 高交叉吸着二次抗体, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A 骨切断鉗子 - エポキシコーティング	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	組織解剖
Dumont #7 ピンセット - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	組織解剖
ヤギ抗ラット IgG (H+L) 交叉吸着二次抗体, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris ソフトウェア	Imaris	version 9.5.0	イメージング
Mayo 解剖用はさみ	ProSciTech	420SS	組織解剖
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148-500G	組織処理
リン酸緩衝生理食塩水、滅菌PBS錠剤 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	組織処理
ProLong Glass 抗退色封入剤	Thermo Fisher Scientific	P36980	免疫組織化学染色
メス刃 #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	組織解剖
メスハンドル #4	ProSciTech	T134	組織解剖
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002-25G	組織処理
ショ糖	Chem-Supply	57-50-1	組織処理
TOMO Adhesion 顕微鏡スライドグラス	ProSciTech	GEMS63705-09	免疫組織化学染色
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	免疫組織化学染色