方法論記事

ペトリ皿の中の概日リズム：概日時計遺伝子の発現解析に向けたマウス視床下部mHypoE-42細胞の同期化

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DOI:

10.3791/72039

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2026年9月3日

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1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、培養細胞の同期化、夜間の回収を伴わない24～72時間における時間差タイムコースサンプリングの実施、および概日時計遺伝子の発現解析のための、実用的で再現性のあるワークフローを提供します。

要約

概日リズムは、遺伝子発現、代謝、行動など、広範囲にわたる細胞および生理学的プロセスを制御する、約 24 h の内因性振動です。これらのリズムは、時間的および環境的な手がかりに反応する、相互に連結した転写・翻訳フィードバックループから生じます。概日調節は非常にダイナミックであるため、わずかな実験的変動であっても位相、振幅、およびリズム性に影響を及ぼす可能性があり、信頼性と再現性のある結果を得るためには、標準化された実験ワークフローが不可欠です。本プロトコルの目的は、標準的な実験室条件下で、培養細胞の同調、タイムコースサンプリング、および概日時計遺伝子の発現解析を行うための、実用的かつ再現可能なワークフローを提供することです。本プロトコルでは、血清ショック法による同調、夜間サンプリングを避けるための 24–72 h にわたるずらしサンプリング、リボ核酸抽出、相補的脱氧リボ核酸合成、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、および適切な統計的手法を用いた概日リズム解析について解説します。また、このワークフローでは、実験間の再現性を向上させるために、同調条件、サンプル品質の評価、参照遺伝子の選択、およびデータ解析を含む重要な実験上の検討事項についても強調しています。本手法は、分子的な概日メカニズムの調査および培養細胞におけるリズム性遺伝子発現の評価のための簡便なアプローチを提供し、生理学的および疾患関連の実験モデルにおける概日調節の研究を促進します。

概要

概日リズムは、約24時間周期を持つ内因性のサイクルであり、広範な生理的、代謝的、および細胞的プロセスを調節しています1。哺乳類においては、これらのリズムは視床下部の視交叉上核（SCN）に位置する中枢時計と、細胞レベルの自律的な分子時計によって調整されています。これらの時計は、circadian locomotor output cycles protein kaput (Clock)、basic helix-loop-helix aryl hydrocarbon receptor nuclear translocase-like 1 (Bmal1)、period (Per)、およびcryptochrome (Cry)を含む中核的な時計遺伝子が関与する、相互に連結した転写・翻訳フィードバックループで構成されています2。多様な生物学的プロセスにおいて概日時計が中心的な役割を担っていることから、in vitroの細胞モデルは、制御された実験条件下で時間的調節の分子メカニズムを調査するための重要なツールとなっています。

本プロトコルの目的は、血清ショック法を用いて培養細胞を同期させ、時間をずらしたタイムコースサンプリングを行い、徹夜でのサンプル回収を避けながら概日時計遺伝子の発現を解析するための、信頼性が高く実用的で再現可能なワークフローを提供することです。データの質を損なうことなく概日サンプリングの実現可能性を高めることで、本ワークフローは標準的な実験手法を用いたリズム生物学的プロセスの研究を促進することを意図しています。

概日リズムの研究は、ヒトがん細胞株3、Rat-1線維芽細胞4、SCN 外植片5、オルガノイド6など、幅広いin vitroモデルで実施されてきました。ほとんどの哺乳類細胞は機能的な概日時計を保持していますが、光などの同調手が欠如すると、培養下では急速に脱同調が起こり、in vitroでの概日リズム研究が制限されます7。したがって、分子時計のメカニズムや、それが健康および疾患に与える影響を調査するためには、同調技術が不可欠です。

培養哺乳類細胞のために、いくつかの同期戦略が開発されてきました。デキサメサゾンを用いた糖質コルチコイドベースの同期は、血清刺激に伴う変動の一部を軽減しつつ、多くの細胞型で概日リズムを強力にリセットできるため、最も広く用いられている手法の一つです8。同様に、フォルスコリンによるcAMP（環状アデノシン一リン酸）シグナリングの活性化も、特定の細胞モデルにおいて末梢時計を同期させるために成功裏に使用されてきました9。その他のアプローチとしては、血中シグナルによる処理4、異なる化学化合物8,10、培地交換3、温度ショック11、酸素サイクル12、および機械的刺激13などが挙げられます。総じて、これらの手法は概日リズム研究を大幅に前進させましたが、専用の装置や特定の実験条件、あるいは追加の最適化が必要な場合があるため、個々の生物学的モデルおよび実験的応用に合わせて、選択した同期戦略を検証することが重要です14

血清ショックは、最も広く確立されている同期手法の一つであり、培養細胞を短期間の高濃度血清刺激にさらすことで行われます4。刺激は一過性であるため、細胞シグナル伝達経路への長期的な摂動が最小限に抑えられ4、その後の解析に及ぼす潜在的な混入影響を軽減できます。そのため、血清ショックは概日遺伝子発現や分子時計機能の研究に特に適しています。さらに、この手順は実施が容易で特別な装置を必要としないため、多くの研究室で容易に導入および再現が可能です。しかし、血清ショック実験における実用上の制限は、概日リズム性を正確に特性評価するために必要となる集中的なサンプリングスケジュールです。信頼性の高いリズム解析には、通常、1回以上の概日サイクル（24–72 h）にわたって2–6 hごとの一定間隔でサンプルを回収する必要があり14、夜間の回収作業を伴うことがよくあります。

ここで述べるワークフローは、複数の培養プレートにわたって同期の開始時間をずらすことで、このロジスティック上の課題に対処しており、これにより、夜間のサンプル回収を避けつつ、標準的な勤務時間内に概日サンプリングを完結させることが可能になります。本プロトコルは、新しい同期戦略を導入するのではなく、確立された血清ショック法を、実用的なサンプリングスケジュールおよび下流の遺伝子発現解析と組み合わせて、詳細かつ再現可能な形で実装する方法を提供します。このワークフローは、汎用的な実験手法を用いて培養細胞における概日遺伝子発現を研究する場合に特に適しています。本プロトコルを他の細胞モデルに適応させる際は、細胞密度、同期条件、サンプリング間隔、および参照遺伝子の選択を含む実験パラメータを、導入前にその細胞型に合わせて最適化し、検証する必要があります。

プロトコル

本プロトコルでは、マウス胚下垂体細胞株mHypoE-42における、検証済みの同期化方法について説明します。他の培養細胞種に適用する前に、同期化プロトコルの検証および最適化を個別に実施してください。参照してください。 図1 ワークフローの概要および 補足図1 週次サンプリングスケジュールに従ってください。「（参照先）」を参照してください。 材料一覧表 本プロトコルで使用するすべての試薬、器具、および装置について準備してください。すべての細胞培養操作は、滅菌済みの試薬および器具を使用し、認証済みのバイオセーフティキャビネット内で行ってください。

細胞同期化プロセスの図、血清ショック法、タイムライン、実験セットアップ、CT間隔。
図 1. ずらして実施する血清ショック同期化プロトコルの概略図。2つのずらした実験セットで血清ショックを用いてmHypoE-42細胞を同期化させるワークフローを示す模式図。このずらした設計により、夜間のサンプリングを避けながら、標準的な勤務時間内に概日サンプリングを行うことが可能になる。その後、サンプルはRNA抽出、定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）、および概日リズム解析のために処理される。Biorender.comを用いて作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 細胞培養

  1. 10% (v/v) 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、3.7 g/L 重曹、および 1% 抗生物質溶液を添加した Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 高グルコース (4500 mg/L) で、接着性 mHypoE-42 細胞を培養する。
  2. T75 培養フラスコを用い、最終培養液量 10 mL で、空気 95% および 二酸化炭素 (CO2) 5% を含む 37°C の加湿インキュベーター内で細胞を維持する。
    注：血清のロットによって差があるため、実験を開始する前に新しい FBS のロットをそれぞれテストすること。
  3. 細胞が約 80%–90% のコンフルエンシーに達した時に継代する。滅菌 1× リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; pH 7.4) で細胞を洗浄し、0.5% トリプシン溶液 3 mL を加えて 3–5 分間インキュベートし、細胞を剥離させる。
  4. トリプシンを中和するため、トリプシン液量の少なくとも 2 倍量の 10% (v/v) FBS 含有完全培地を加える。
  5. 新鮮な増殖培地を用いて、細胞を最大 1:2 の割合で希釈する。
    注：過剰な継代が行われた細胞（例：mHypoE-42 細胞で継代数 40 回超）の使用は避けること。すべての溶液は使用前に予熱する。定期的に培養物のマイコプラズマ汚染を確認すること。
  6. ステップ 2 に記載されている通り、1 ウェルあたり 2.0 × 105 個の細胞を播種し、24 時間後に同期化アッセイを行う。通常の細胞培養は、継代前に約 80%–90% のコンフルエンシーに維持する。

2. mHypoE-42細胞株の同調化

  1. 細胞の調製
    1. トリプシン処理後、細胞を 700 × g で5分間遠心分離する。
    2. 上清を捨て、細胞ペレットを10 mLの新鮮な培地で再懸濁する。
    3. 細胞懸濁液とトリパンブルー染色液を1:1の比率（合計20 μL）で混合し、血球計数器を用いて細胞濃度を測定する。
      注意：トリパンブルーを含む溶液は、施設内の化学廃棄物処理ガイドラインに従って廃棄すること。未使用の染色液をシンクに捨てないこと。
  2. 細胞の播種および時差を設けた実験デザイン
    1. 6ウェルプレートまたは35-mm培養皿に、1ウェルあたり2.0 × 105個の細胞を播種する。37°Cで24時間インキュベートする。
      注意：細胞播種の24時間後に血清同期を開始する。したがって、同期前にあらかじめ定義された細胞コンフルエンスに達している必要はない。代わりに、同期手順を開始する前に、顕微鏡で培養細胞を確認し、細胞が完全に接着し、適切な形態を示していることを確認すること。
    2. 培養プレートをランダムに2つの実験セットに分ける。1つ目のセットを用いて、概日時間（CT）のCT0、CT4、CT8、CT24、CT28、CT32を作成する。2つ目のセットを用いて、CT12、CT16、CT20、CT36、CT40、CT44、CT48を作成する（図1、付随図1）。
    3. テクニカルレプリケートを含めるために、必要に応じてウェル数またはプレート数を増やす。
      注意：すべてのプレートを同一の細胞懸濁液から調製し、播種密度と培養条件を同一に保ち、同一の試薬と実験設定を用いて同期を行うことで、ばらつきを最小限に抑える。他の細胞種を用いる場合は、必要に応じて培養容器の形式と播種密度を調整する。6ウェルプレートを使用する場合、プレートの利用効率を最適化するため、同時に回収するCTをまとめること。
  3. 同期化
    1. 24時間後、1つ目のプレートセットから培地を吸引し、1 mLの無血清DMEMを加える。12時間インキュベートして血清飢餓を誘導する。
    2. 使用直前に、高グルコースDMEMを用いて50% (v/v) 馬血清溶液を調製する。
    3. 1つ目のセットから飢餓培地を吸引し、細胞を調製直後の50%馬血清溶液1 mLに2時間さらす。
    4. 同時に、2つ目のプレートセットから培地を吸引し、1 mLの無血清DMEMに交換する。12時間インキュベートする。
    5. 2時間の血清ショック後、培地を吸引し、10% (v/v) 熱不活化FBSを添加した高グルコースDMEM 1 mLを加える。この時点をCT0とする。
  4. サンプルの回収
    1. 培養プレートを氷上に置く。培地を吸引し、冷たい滅菌済み1× PBS 1 mLで細胞を2回洗浄し、洗浄液を捨てた後、最大1 mLの溶解試薬を用いて細胞を機械的に溶解する。
      注意：溶解試薬には有害化学物質が含まれている。適切な個人用保護具を着用し、認定された化学薬品用ドラフトチャンバー内ですべての操作を行うこと。廃棄物は施設内の化学安全ガイドラインに従って処理すること。
    2. 各ライセートを滅菌チューブに移し、RNA抽出まで−80°Cで保存する。
    3. ステップ2.4.1および2.4.2を繰り返し、CT4およびCT8でサンプルを回収する。
    4. CT8において、2つ目の実験セットに対してステップ2.3.2を繰り返し、残りの細胞を同期させる。
    5. 2時間の血清ショック後、培地を10% (v/v) 熱不活化FBSを添加した高グルコースDMEM 1 mLに交換し、2つ目の実験セットの同期を終了させる。
    6. 2つの実験セットから交互にサンプルを回収し、CT12、CT24、CT16、CT28、CT20、CT32を得る。翌日、回収手順を繰り返し、CT36、CT40、CT44、CT48を得る。
      注意：血清飢餓および同期は、あらかじめ定義された細胞コンフルエンスではなく、細胞播種後の実験タイムラインに従って開始した。同期を開始する前に、細胞が完全に接着し、適切な形態を示していることを確認すること。連続するCTは4時間の間隔があるが、回収は4時間おきに行うわけではない。週間回収スケジュールの詳細は付随図1を参照すること。

3. サンプル処理：RNA抽出

注：プロトコルは実験の状況や用途によって異なる場合があります。以下のワークフローは、RNA抽出、相補的DNA（cDNA）合成、および定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）のための効果的な手順の一例を示したものです。フェノールベースの溶解と相分離を組み合わせた手法で全RNAを抽出し、その後、シリカスピンカラムを用いて精製します。

  1. サンプルの調製および相分離
    1. サンプルを融解し、ライセートを再ホモジナイズして、室温で5分間インキュベートする。
    2. 溶解試薬1 mLにつき、クロロホルムを200 μL添加する。
      注意：クロロホルムは揮発性であり、毒性がある。クロロホルムを使用するすべての操作は、適切な個人用保護具を着用し、認定された化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うこと。
    3. チューブを15秒間激しく振盪し、室温で3分間インキュベートする。
    4. サンプルを4°C、12,000 × g で15分間遠心分離する。サンプルを、タンパク質を含む下層のフェノール・クロロホルム相、DNAを含む白い中間相、およびRNAが濃縮された上層の水相の3相に分離させる。
    5. 中間相を乱さないように注意しながら、水相を新しい滅菌チューブに回収する。後でタンパク質またはDNAの単離を行う予定がある場合は、有機相を4°Cで保存する。
      注：有機相からこれらの生体分子を回収する場合は、適切なプロトコルに従ってタンパク質またはDNAの単離を行うこと。
  2. RNAの精製
    1. 水相に等量の70%エタノール（RNaseフリー水で調製）を加え、ボルテックスミキサーで15秒間2回撹拌してRNAの結合を促進させる。
    2. サンプルをシリカスピンカラムにロードし、カラム精製ワークフローに従ってRNAを精製する。
    3. DNaseを用いて、室温で15分間、混入しているゲノムDNAを消化する。
    4. 付属の洗浄バッファーを用いてカラムを洗浄する。
    5. 洗浄バッファー100 μLでさらに洗浄し、11,000 × gで2分間遠心分離してシリカメンブレンを乾燥させる。
    6. スピンカラムを清潔なマイクロ遠心チューブに移す。RNaseフリー水40–60 μLをシリカメンブレンの中央に直接滴下し、11,000 × gで1分間遠心分離してRNAを溶出させる。
      注：目的のRNA収量と濃度に応じて溶出量を選択する。溶出量を60 μLにすると、一般的にシリカメンブレンからより完全にRNAを回収できるが、RNA溶液は希釈される。対して、溶出量を40 μLにすると、より高濃度のRNA調製物が得られるが、総RNA回収量が減少する場合がある。溶出量は、メーカーの推奨事項および下流のアプリケーションの要件に従って最適化すること。
  3. RNAの品質評価
    1. RNAサンプルを氷上に置き、品質評価のために各サンプル5 μLを新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移す。
    2. 1.5%アガロースゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を用いてRNAの完全性を評価する。28Sおよび18SリボソームRNAの明確なバンドの存在を確認する。
    3. 分光光度計で吸光度を測定し、RNA濃度と純度を決定する。
      注：フェノールを含む廃棄物は、施設の化学廃棄物処理ガイドラインに従って廃棄すること。有害化学廃棄物をシンクに捨ててはならない。培養細胞サンプルの場合、RNA濃度は通常200から1000 ng/μLの範囲であり、cDNA合成およびqRT-PCRに適している。A260/230比が2.0から2.2の間で、A260/280比がおよそ2.0のRNAサンプルを許容とする（付録表1を参照）。
  4. RNAの保存
    1. 精製したRNAサンプルは、cDNA合成まで−80°Cで保存する。

4. サンプル処理：cDNA合成

注：第一鎖cDNA合成キットを用いて、1 μgの全RNAからcDNAを合成します。反応量およびインキュベーション条件は、製造元の指示に従って調整してください。

  1. 逆転写
    1. RNAサンプルを氷上で解凍する。全RNA 1 μg、2× Master Mix（リボヌクレアーゼインヒビター、ランダムヘキサマー、oligo(deoxythymidine)プライマー、マグネシウムイオン [Mg2+]、およびデオキシヌクレオチド三リン酸を含む）10 μL、酵素ミックス（逆転写酵素を含む）2 μL、およびジエチルピロカルボネート処理水を加え、最終容量を20 μLとした20 μLの逆転写反応液を調製する。
    2. サーマルサイクラーを用いて、プライマーをアニーリングさせるため25°Cで10分間、続いてcDNA合成のため50°Cで30分間インキュベートする。反応液を85°Cで5分間インキュベートし、逆転写酵素を失活させる。
    3. RNase Hを1 μL加え、37°Cで20分間インキュベートして、RNA–DNAハイブリッドのRNA鎖を分解させる。
    4. アッセイの最適化要件に従い、cDNA調製液を滅菌水で最大1:20まで希釈し、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）分析まで希釈したcDNAを−20°Cで保存する。

5. サンプル処理：リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)

注：qRT-PCRを用いて概日時計遺伝子の発現を測定してください。検証済みのプライマー配列、アニーリング温度、およびプライマー濃度については、付録表2を参照してください。

  1. アッセイの最適化
    1. 実験サンプルを解析する前に、プールしたcDNAサンプルと標準曲線を用いて、プライマー濃度、アニーリング温度、およびcDNA投入量を検証および最適化する。アッセイの最適化と検証は、既報の方法15,16に従って行う。
  2. 反応セットアップ
    1. 96ウェルPCRプレートに、2×マスターミックス 5 μL、フォワードおよびリバースプライマー各 0.4 μL、ジエチルピロカーボネート処理水 0.2 μL、およびcDNAテンプレート 4 μLを混合し、10 μLのqRT-PCR反応液を調製する。
    2. プレートを光学的に透明なシーリングフィルムまたはシーリングマットで封印する。気泡を取り除き、反応混合物を各ウェルの底に集めるため、プレートを4°Cで最大5分間、700 × gで遠心分離する。
    3. すべてのcDNAサンプルを解析し、標的遺伝子 Bmal1 および Per2 の発現を決定する。
    4. サンプル間の遺伝子発現を標準化するため、同じcDNA希釈率を用いて選択したリファレンス遺伝子（B2m）を解析する。
  3. サーマルサイクリング
    1. 以下のサイクリング条件でqRT-PCRを行う：95°Cで2分間の初期変性およびホットスタートDNAポリメラーゼの活性化の後、95°Cで5秒間および60°Cで30秒間のサイクルを39回繰り返す。
    2. 反応液を95°Cで5秒間加熱し、その後0.5°Cずつ段階的に95°Cまで昇温させ、各段階で5秒間保持することで融解曲線分析を行う。
      注：必要に応じて、マスターミックスの推奨事項に基づき、保持時間と融解曲線の設定を調整すること。
  4. リファレンス遺伝子の検証
    注：血清同期実験では、血清処理によってハウスキーピング遺伝子の発現が変化する可能性があるため17、リファレンス遺伝子の候補を評価すること。BestKeeper18、geNorm19、NormFinder20、または比較ΔCt法21などの手法を用いて発現の安定性を評価する。標準化のために最も安定した遺伝子を選択する。本研究では、複数のリファレンス遺伝子検証アルゴリズムを統合したRefFinderソフトウェア22を用いて、β-actin (Actb) および β-2-microglobulin (B2m) を評価した。概日時間経過を通じて B2m が最も高い発現安定性を示したため、これを標準化に選択した。
  5. 産物の検証
    1. 2%アガロースゲル電気泳動を用いてPCR産物を解析し、増幅の特異性を検証する。
      注：複数の温度（例：58°C、60°C、62°C）をテストして、最適なアニーリング温度を決定する。プライマーダイマー形成の証拠がなく、単一の融解曲線ピークを維持しながら、最も低い定量サイクル（Cq）値を示す温度を選択する。
      注：増幅効率が90%から110%の間であり、決定係数（R2）が0.99以上のアッセイを採用する。テクニカルリプリケート間の融解温度の差が0.5°C以内であることを確認する。解析にはCqの差が ≤0.5 のテクニカルリプリケートのみを採用し、これらの値を用いて平均発現レベルを算出する。すべての反応はテクニカルリプリケート（例：3連）で行い、ノンテンプレートコントロールおよび逆転写なしコントロールの両方を含める。

6. データ解析

  1. 遺伝子発現解析
    1. 後続の解析を行う前に、各サンプルのテクニカルリプリケートの平均値を算出する。
    2. 以下の式を用いて、各サンプルおよびタイムポイントのΔCq値を算出する：
      ΔCq   = Cqターゲット遺伝子  -  Cqハウスキーピング遺伝子
    3. 以下の式を用いて、各サンプルおよびタイムポイントのΔΔCq値を算出する：
      ΔΔCq   = ΔCqサンプル  -  ΔCqコントロール  
      注：ΔΔCqの算出において、ΔCqコントロールは、すべてのCTにおけるすべてのコントロールサンプルの平均ΔCq値として定義した。
    4. CircaCompare23を用いて、リズムの中間推定統計量（MESOR）、振幅、ピーク、および位相を含む概日リズムパラメータを評価する。解析は、オンラインアプリケーションまたはRパッケージの実装のいずれかを用いて行う。
  2. オンラインCircaCompare解析
    注：オンライン実装では、データセットがリズム性の統計的基準を満たしている場合にのみ、完全な概日パラメータ推定値が報告される。リズム性が弱い場合、または統計的に有意でない場合は、R実装を用いてすべてのデータセットのパラメータ推定値を取得すること。
    1. カンマ区切り値（.csv）ファイルを作成する。
      1. 列1に時間変数（数値；hour）を入力する。
      2. 列2にグループ変数（実験群は2群のみ）を入力する。
      3. 列3にアウトカム変数（数値；ΔΔCq）を入力する。
    2. 作成した.csvファイルをオンラインCircaCompareアプリケーションにアップロードする。
    3. 時間、グループ、およびアウトカム変数を対応する列に割り当てる。
    4. Runを選択して解析を実行する。
  3. RによるCircaCompare解析
    1. R version 4.5.1およびCircaCompareパッケージ version 0.2.024を用いて解析を行う。
    2. 必要なRパッケージをインストールする。
      1. devtoolsパッケージ（version 2.5.2）をインストールする。
      2. circacompareパッケージ（version 0.2.0）をインストールする。
      3. ggplot2パッケージ（version 4.0.3）をインストールする。
      4. svgliteパッケージ（version 2.2.2）をインストールする。
    3. 入力用.csvファイルをアップロードする。
    4. alpha_threshold = 1に設定した後、CircaCompare解析を実行する。
      注：alpha_threshold = 1に設定すると、統計的な有意性に関わらず、フィッティングされたすべての振動の概日パラメータ推定値が報告される。ただし、p-value < 0.05の振動のみをリズム性があり統計的に有意であると解釈すべきである。
    5. スクリプトを実行する前にSupplementary File 1をカスタマイズする。
      1. 「XXX.csv」を入力データファイル名に置き換える。
      2. 「YYY.csv」を希望する結果ファイル名に置き換える。
      3. 「ZZZ.svg」を希望するプロットファイル名に置き換える。
      4. データセットに応じて、y軸の範囲（ylim）およびその他の作図パラメータを調整する。
    6. 入力ファイルの例については、Supplementary Table 3を参照すること。

結果

同期の成功は、対照条件下で解析した時計遺伝子が統計的に有意な概日リズムを示すこと（p < 0.05）によって判断されます。本研究では、0.1% ジメチルスルホキシドを陰性対照とし、3回の独立した生物学的実験を行いました。Bmal1 および Per2 は、分子概日時計のコアコンポーネントであり、特性がよく分かっている逆位相の発現パターンを示すため、代表的な概日マーカーとして選定しました。同期後に得られた代表的なリズム発現プロファイルを図2に示します。リズム性、MESOR、振幅、ピーク時刻を含む対応する概日パラメータを表1にまとめ、Bmal1 と Per2 のペア比較を表2に示します。

概日mRNA発現グラフ。24〜48時間におけるPer2/Bmal1レベル。リズム遺伝子発現解析。
図 2. 血清ショック同期後のBmal1およびPer2の概日振動。 同期させたmHypoE-42細胞におけるBmal1（濃い青）およびPer2（薄い青）の代表的な概日発現プロファイル。同期後24時間から48時間まで定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）により測定した。曲線はCircaCompareを用いて作成されたフィッティング概日モデルを示す。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

遺伝子リズム性
(p値)		MESOR振幅ピークタイム
(h)
Bmal10.0205−0.29480.464820.4239
Per20.0071−0.3180.46299.4883
Bmal1 + 化合物A0.1068———

表 1：基礎条件下におけるBmal1およびPer2、ならびにCompound A処理後のBmal1について推定された概日リズムパラメータ。概日リズム性はCircaCompareを用いて評価した。本表は、各条件におけるリズム性のp値、リズムの推定中心値（MESOR）、振幅、およびピーク時間を報告している。Compound A処理後のBmal1については、リズム性が統計的に有意ではなかったため（p = 0.1068）、概日パラメータは報告していない。

MESOR差の推定値
(p-値)		振幅差推定
(p-値)		位相差推定
(p-値)		共有期間
(h)
−0.0232 (p = 0.8904)−0.0019 (p = 0.9936)−10.9356 (p = 2.3155 × 10⁻6)24

表2：Bmal1とPer2における概日パラメータのペア比較。CircaCompareを用いて推定した、Bmal1とPer2の適合概日発現プロファイルにおけるリズム推定中心値（MESOR）、振幅、および位相のペア比較。数値はパラメータの差分と対応するp値として示されている。モデル適合中の共通周期は24 hに固定した。

基底条件下において、Bmal1およびPer2の両方が統計的に有意なリズム性を示した（Bmal1: p = 0.0205; Per2: p = 0.0071）。さらにCircaCompare解析により、これら2つの遺伝子が−10.9356 hの位相差（p = 2.3155 × 10⁻6）をもって逆位相で振動していることが示され、これは分子概日時計ネットワークにおける予測される逆位相関係と一致していた。後続の遺伝子発現解析を裏付けるRNA品質指標は、付録表1に記載されている。

このプロトコルは、健康個体と疾患モデル、あるいは対照群と処置群など、異なる実験条件間での概日リズム性の比較にも適用可能です。代表的な例として、ヒトの視床下部で検出された新興環境汚染物質であり内分泌攪乱物質である化合物を評価し、ここでは化合物Aとして記載します。代表的な結果を図3に示し、対応するリズム解析の結果を表1にまとめます。

RNA発現の時系列グラフ；mRNA (ΔΔCq) 対 時間；コントロール vs. 化合物A；データ解析。
図3. Bmal1発現の概日リズムに対する化合物Aの影響。定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）により測定した、化合物A処理後の同期化mHypoE-42細胞における代表的なBmal1発現プロファイル。曲線はCircaCompareを用いて作成されたフィッティング済みの概日モデルを示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

化合物Aに曝露した後、Bmal1は統計的に有意なリズム性を示さなくなった（p = 0.1068）。これらの条件下では、適合させた概日モデルはリズム性の統計的基準を満たさなかった。その結果、リズム性が統計的に有意でない場合は生物学的な解釈が不可能であると考えられるため、MESOR、振幅、ピークタイムなどの概日パラメータは報告しない。この例は、本ワークフローを用いてリズム性のある発現プロファイルとないものを区別でき、異なる実験条件下での概日遺伝子発現の潜在的な変化を評価できることを示している。時間差サンプリング戦略に伴う潜在的な技術的変動を最小限に抑えるため、すべての培養プレートは同一の細胞懸濁液から調製し、同一の培養条件下で維持し、同期のタイミングのみを異ならせて同一の実験ワークフローを用いて同期させた。

補足図1. ずらし同期プロトコルの週間スケジュール。 2つのずらし実験セット（セット1：紫、セット2：緑）における、細胞播種、血清飢餓、血清ショック同期、同期停止、および概日サンプル収集を示す代表的な週間タイムライン。このずらした設計により、夜間のサンプル収集を避けながら、標準的な勤務時間内に概日時間（CT）CT0～CT48のタイムポイントで収集することが可能となる。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表 1. 概日時間経過実験に含まれるすべての生物学的サンプルのRNA品質指標。 RNA純度は吸光度比 A260/A280 および A260/A230 を用いて評価し、相補的DNA（cDNA）合成前に分光光度計でRNA濃度を測定した。サンプルは、採取時間、処理群、および生物学的反復によって識別される。これらの測定値は、後続の定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）解析に先立ち、RNA品質を検証するために使用された。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表2. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）に使用したプライマー配列および増幅条件。 各標的遺伝子の増幅に使用したフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列を5′-3′方向に、対応するNCBIアクセッション番号、アニーリング温度、およびプライマー濃度と共に記載しています。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表3. CircaCompareを用いた概日リズム解析用の入力データセット例。 CircaCompareでの解析用にフォーマットされたカンマ区切り値（CSV）データセットの例。本データセットには、「Time (h)」、「Group」、「Outcome (ΔΔCq)」の3つの必須変数が含まれており、これらはデータ解析プロトコルで説明されている形式に対応し、概日パラメータ推定の入力ファイル例として使用される。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 1. CircaCompareを用いた概日リズム解析のRスクリプト例 R（バージョン 4.5.1）のCircaCompareパッケージ（バージョン 0.2.0）を使用して概日遺伝子発現データを解析するためのRスクリプト例です。このスクリプトは、入力データセットのインポート、周期24hでの概日パラメータ推定、統計要約の書き出し、および出版品質のプロットの生成を行います。使用前に、プレースホルダーのファイル名（XXX.csv、YYY.csv、ZZZ.svg）を任意の入力および出力ファイル名に置き換え、プロットパラメータ（例：ylim）をデータセットに合わせて適切に調整してください。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

概日リズムとは、保存された分子時計メカニズムを通じて、広範な生理学的、代謝的、および細胞的プロセスを調節する約24時間の内因性サイクルである1,2。In vitro 同期モデルは、これらのメカニズムを調査するための制御された実験環境を提供し、環境汚染物質への曝露やその他の実験的な摂動を含む、正常および病理学的条件下での概日調節を研究するための貴重なツールとなっている25。本プロトコルでは、血清ショックによる培養細胞の同期、スタガードサンプリング戦略を用いたタイムコースサンプルの収集、およびqRT-PCRによる概日遺伝子発現の定量化という実用的なワークフローについて説明する。このワークフローは、夜間のサンプル収集に伴うロジスティクス上の課題を最小限に抑えつつ、時間的な遺伝子発現プロファイリングを必要とする研究に特に適している。本プロトコルの成功と再現性を決定付ける重要なステップがいくつか存在する。不十分な同期はリズム性の弱化や検出不能を招く可能性があるため、細胞コンフルエンシー、血清飢餓、血清ショックの時間、および同期条件を適切に制御することが不可欠である14。一貫した細胞播種密度、同一の細胞懸濁液からのすべての実験プレートの調製、およびスタガード実験セット間での同一の培養条件により、技術的なばらつきをさらに低減できる。また、RNAの品質、cDNA合成、プライマーのバリデーション、および安定したリファレンス遺伝子の選択も、信頼性の高いqRT-PCR結果を得るための重要な決定要因となる。他の概日同期プロトコルと同様に、異なる細胞型や実験条件にワークフローを適応させる際には、これらのパラメータの最適化が必要な場合がある。

血清ショックは、概日リズム生物学において最も広く確立された同期法の一つですが4,26、あらゆる実験的適用において普遍的に最適であるわけではありません。生物学的モデルや研究目的に応じて、デキサメタゾン処理、フォルスコリン刺激、温度同調、およびレポーターベースのシステムを含む代替的な同期アプローチの方が適切である場合があります14。各手法には固有の利点と限界があるため、これらの方法は競合するアプローチではなく、補完的なアプローチとして検討されるべきです。血清ショックは、特殊な機器や遺伝子組み換えレポーターシステムを必要とせず、実験の簡便さ、アクセスのしやすさ、および再現性の実用的なバランスを提供します。それにもかかわらず、研究者は同期刺激が生物学的システムに及ぼす潜在的な影響を慎重に検討し、実験上の疑問に最も適切に応えるアプローチを選択する必要があります。血清飢餓ステップを省略した血清ショックプロトコルも報告されており、特定の実験状況においては適切な代替案となる可能性があります27。本プロトコルの柔軟性により、いくつかの修正やトラブルシューティング戦略が可能です。時差サンプリング設計は、異なる時間に同期させた並列培養プレートを利用して、夜間のサンプル収集を回避しながら補完的なCTを生成することに基づいています。プレート間のばらつきを最小限に抑えるため、すべてのプレートを同一の細胞懸濁液から調製し、同一の密度で播種し、同一の培養条件を維持し、同期のタイミングのみが異なる同一の実験ワークフローを用いて同期を行ってください。このアプローチではバッチに関連する変動を完全に排除することはできませんが、技術的なばらつきを最小限に抑え、夜間サンプリングに伴うロジスティック上の課題を大幅に軽減しつつ、生物学的に意味のある概日リズムを検出する能力を維持できます。時差サンプリング戦略は、すべての実験セットで同一の培養条件を維持することで技術的ばらつきを最小限に抑えるように設計されていますが、本研究では従来の連続サンプリング設計との直接的な比較は行っていません。今後の研究において、他の実験モデルでのこれらのアプローチの同等性をさらに評価できる可能性があります。このワークフローを新しい細胞型や実験条件に適応させる際は、プロトコルのバリデーション中に同期効率を最適化し、潜在的なバッチ効果を評価してください。実験目的に応じて、同期開始時間を調整するか、サンプリングウィンドウを短縮して単一の同期培養を維持することで、同期スケジュールを変更してください。トラブルシューティング戦略には、血清ショック期間の最適化、同期前の細胞生存率およびコンフルエンシーの確認、ダウンストリーム解析前のRNA品質の確認、および概日リズム検出を向上させるためのサンプリング間隔の調整が含まれます。本プロトコルはmHypoE-42マウス胚下垂体細胞株でバリデートされており、したがって、他の細胞モデルに適用する前には独立して最適化およびバリデーションを行う必要があります。本研究では評価されていませんが、本プロトコルは、当研究室における他の細胞株（例：N2a細胞およびヒト線維芽細胞）を用いた以前の最適化に基づいて開発されており、異なる細胞モデルへの適用の可能性を支持しています。同様に、時差サンプリング戦略は、標準的な勤務時間内に完全な概日サンプリングを可能にすることで、実験の実現可能性を大幅に向上させます。ただし、潜在的なバッチ効果を最小限に抑えるため、ユーザーはすべての培養プレートで同一の実験条件を維持する必要があります。適切に最適化された場合、このワークフローは、広範な研究適用において、概日遺伝子発現を調査し、分子時計機能を変える実験的介入を評価するための、アクセスしやすく再現可能なアプローチを提供します。

実用的な利点がある一方で、この方法にはいくつかの限界があります。時間差サンプリング戦略では、連続的なモニタリングではなく離散的な時点での測定となるため、蛍光または生物発光ベースのリポーターアッセイと比較して時間分解能が低下します7。その結果、周期推定の精度や、わずかな位相シフトまたは低振幅の振動の検出能が低下する可能性があります。さらに、プレートベースのサンプリングワークフローは、条件ごとに別途培養プレートが必要となるため、処理数や実験条件が増えるにつれて労力が大幅に増大します。既存の手法の中で、このワークフローは、生細胞における概日活動のリアルタイムモニタリングを可能にするE-box駆動型ルシフェラーゼアッセイ（例：Bmal1-LucおよびPer2-Luc）を含むリポーターベースのシステムに代わる実用的な選択肢となります28,29。蛍光および生物発光ベースのリポーターシステムは高い時間分解能を提供し、特に候補となる概日リズム調節因子のハイスループットスクリーニングに有用ですが、安定した遺伝子改変、専用の検出装置、および厳密に制御された環境条件が必要であり30、すべての研究室で利用可能とは限りません。さらに、リポーターシステムは一般的に定義済みのリポーター構築物に限定されており、構成的なシグナルや細胞量による標準化が必要な場合があるため、複数の遺伝子の同時評価や下流の分子解析が制限されます。対照的に、本稿で述べるワークフローは、定量的遺伝子発現解析やタンパク質ベースのアッセイを含む複数の下流アプリケーションと互換性があり、分子レベルの概日調節を研究する研究室にとって、簡便で汎用性の高いアプローチとなります。

サンプルの収集とダウンストリーム解析の後、観察された振動が統計的に有意であり、かつ生物学的に意味があるか determining ためには、適切な統計評価が不可欠です。本プロトコールでは、CircaCompareを用いることで、cosinorベースの回帰モデルを用いてMESOR、振幅、および位相を推定し、統計的に比較するための堅牢なフレームワークが提供されます23。リズム性のみを評価するアプローチとは異なり、CircaCompareでは実験群間での概日パラメータの直接的なペア比較が可能であり、治療効果、遺伝的摂動、または概日行動における疾患関連の変化の評価を容易にします。この解析ワークフローは、概日遺伝子発現の変化を解釈するための標準化された定量的指標を提供することにより、同期プロトコールを補完します。「代表的な結果（Representative Results）」で示されているように、血清ショック後のBmal1およびPer2メッセンジャーRNA（mRNA）の期待される振動発現パターンにより、同期が成功したことが示されました（図2）。対照的に、化合物Aへの曝露により、統計的に有意なBmal1のリズム性が消失し（図3）、概日遺伝子発現を変化させる実験的介入を評価する上での本ワークフローの有用性が示されました。概日遺伝子発現データを解釈する際の重要な検討事項は、独立した実験間の生物学的ばらつきです。本研究における代表的な結果は、異なる日および異なる細胞継代数で実施された独立した生物学的反復試行から得られたものです。したがって、ある程度のばらつきが予想されますが、これは技術的な変動ではなく生物学的な変動を反映しています。このため、同期実験には独立した生物学的反復を含めるべきであり、調査対象となる細胞モデルの期待される生物学的ばらつきの文脈の中で解釈される必要があります。このようなばらつきがあるにもかかわらず、統計的に有意なリズム性と、Bmal1とPer2の間の期待される逆位相関係が一貫して観察されました。さらに、振動振幅、位相、周期長、減衰率を含む概日特性は、細胞モデルによって異なります。したがって、同期性能は、無関係なモデルとの直接比較ではなく、調査対象の特定の細胞型の文脈の中で評価されるべきです。

このワークフローは、疾患メカニズムや治療応答における概日リズムの役割を研究する上で特に有用です。概日調節の乱れは、がん、代謝性疾患、神経変性疾患を含む多くの病理学的状態に関与しているとされています31,32。遺伝子発現やタンパク質量の律動性をin vitroで評価できることは、これらのプロセスを調査し、潜在的な治療標的として認識が高まっている分子概日時計に対する薬理学的介入の効果を評価するための実用的な枠組みを提供します14,33。例えば、本プロトコルを適切に最適化および検証することで、疾患に関連する細胞モデルにおいて、候補モジュレーターが概日遺伝子発現にどのように影響するかを調べるのに応用できます。重要な点として、本研究の目的は、血清ショックを他の同調方法の代替として推奨したり、代替的なアプローチに対する優位性を提示したりすることではありません。むしろ、本プロトコルは、広く用いられている同調戦略の実施、時間差サンプリング設計を用いた標準的な勤務時間内での概日サンプルの回収、および簡便なダウンストリーム手法による律動的遺伝子発現の解析について、詳細かつ再現可能なワークフローを提供するものです。本枠組みは、概日リズム実験を新たに導入する研究室や、既存の細胞モデルに時間的解析を組み込むための実用的で再現可能かつ簡便なワークフローを求める研究室にとって、特に有用であると考えられます。

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、欧州連合（EU）の復興・レジリエンス基金および、プロジェクトLA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020)、UID/04539/2025、UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025)、およびUID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025) を通じたFCT（科学技術財団）によるポルトガル国家資金、プロジェクトCENTRO2030-FEDER-02360200を通じたCentro 2030地域運用プログラムによる欧州地域開発基金（ERDF）、および助成金2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT)、2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX)、2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008)、2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD)、および2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD) を通じたFCTによるポルトガル国家資金より共同助成を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェル細胞培養プレートNest Biotechnology15140122細胞培養プレート
アガロースNZYtechMB02702RNA品質評価
抗生物質混合液（ペニシリン/ストレプトマイシン）Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648細胞培養サプリメント
cDNA合成キット（第一鎖）NZYtechMB12502逆転写
クロロホルムSigma-AldrichA5256701相分離試薬
DMEM、高グルコース (4500 mg/L glucose, L-glutamine)Sigma-Aldrich26050088細胞培養基材
Eppendorf マイクロ遠心チューブEppendorf30120086サンプルの保存
エタノール (96%)Fisher Bioreagents15552393RNA精製
熱不活化ウシ胎児血清Gibco, Thermo Fisher Scientific※この入力は識別番号（J62692.K7）のみであり、翻訳すべきテキストが含まれておりません。翻訳対象のソーステキストをご提示ください。細胞培養サプリメント
ハードシェル96ウェルPCRプレートBio-Rad LaboratoriesHSP9601qRT-PCRプレート
馬血清（熱不活化）Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054血清ショック同期化
mHypoE-42細胞株 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402マウス胚視床下部細胞株
オリゴヌクレオチドプライマーNZYtechMB12501qRT-PCRプライマー
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502細胞の洗浄
qPCR グリーンマスターミックス (2×)NZYtechMB22403qRT-PCR試薬
リアルタイムPCR検出システムBio-Rad LaboratoriesEP0030108116qRT-PCR装置
RNA抽出キットNZYtech288306シリカスピンカラム精製
RNA溶解試薬NZYtechMB18502フェノール系RNA抽出試薬
炭酸水素ナトリウムSigma-AldrichMB22401細胞培養培地サプリメント
滅菌済み35 mm培養ディッシュThermo Fisher Scientific121V細胞培養ディッシュ
T100 サーマルサイクラーBio-Rad Laboratories1861096cDNA合成
T75組織培養フラスコCorning430641U細胞培養容器
トリパンブルー溶液 (0.4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061細胞計数
トリプシン-EDTA (0.5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054細胞解離

参考文献

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