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方法論記事

薬剤送達研究に向けた、BBB-膠芽腫マイクロ流体チップにおける超音波制御による血液脳関門（BBB）開通

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DOI:

10.3791/72041

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2026年8月18日

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、血液脳関門-神経膠芽細胞腫（BBB‑GBM）マイクロ流体チップモデルの構築について説明します。このモデルはBBBの完全性が検証されており、低強度超音波によって誘導される一過性かつ概ね可逆的なBBBの開通を調査することが可能です。これにより、超音波を介したナノミセルのBBB透過および腫瘍標的効率の定量的な評価が可能となります。

要約

血液脳関門（BBB）は、ほとんどの治療分子の脳内への進入を制限するため、膠芽腫（GBM）治療における大きな障害となっています。BBBの構造と機能における種間差は、動物モデルの臨床応用の妨げとなっており、GBM治療における薬剤透過性を評価するための、ヒトへの適合性が高いin vitro BBBプラットフォームの必要性が強調されています。本稿では、マイクロ流体BBB-GBMチップモデルの構築プロトコルについて記述します。このモデルでは、Matrigelを埋め込んだマイクロ流体プラットフォーム内で、ヒト脳微小血管内皮細胞（HCMECs）、初代アストロサイト（ACs）、およびU87-MG細胞からなる三細胞共培養システムを構築します。BBBの完全性は、zonula occludens-1（ZO-1）の連続免疫染色およびFITC-dextran透過性試験によって検証されます。その後、低強度超音波（US）（1 MHz, 1 W/cm2, 30 s）を用いて、一過性で概ね可逆的なBBBの開口を誘導し、腫瘍標的性ナノミセル（SFN@RB@SPMs）が効率的に関門を通過してGBM細胞に蓄積することを可能にします。本プロトコルの重要な特徴は、単一の超音波応答性チップ内でBBB透過性と薬剤配送のリアルタイム測定を統合したことであり、これによりGBMにおける超音波増強薬剤配送のメカニズムを解明するための強力なプラットフォームが提供されます。

概要

膠芽腫（GBM）の治療は血液脳関門（BBB）によって強く制限されており、これがほぼすべての治療薬剤の脳内への進入を著しく制限しています1,2。BBBは、密接結合タンパク質（例：occludin、ZO-1）で結合した非窓辺状内皮細胞によって形成されており、ペリサイトやアストロサイトの終足によるさらなる支持を受けています3。動物モデルはBBB機能に関する貴重な知見を提供してきましたが、生理学的および代謝的な種特異的変動があるため、ヒトにおける薬物反応を正確に予測する能力には限界があります4,5。したがって、GBM治療における薬物透過性を評価するためには、生理学的に適切なヒトBBBモデルが不可欠です。

Transwell培養システムなどの従来のin vitro BBBモデルは、細胞間相互作用、動的な流体変化、および流れによるせん断応力を含むBBBの複雑さを再現できていません6。対照的に、マイクロ流体BBBモデルは、これらのin vivoのような特性を密接に模倣する優れたプラットフォームとして登場しました7。このようなBBB-on-a-chipシステムは、脳腫瘍の転移の研究8、アルツハイマー病などの神経変性疾患におけるBBB機能不全の調査9、およびBBBを介した薬物輸送の評価10,11に広く利用されてきました。しかし、既存のBBB-chipモデルの多くは主に薬物透過性試験に使用されており、BBB透過性を調節する外部物理刺激を組み込む機能が不足しています。現在、聚焦超音波（FUS）は、BBBを一時的に開放し、かつ大幅な回復を伴う有望な戦略として登場しており、治療薬の脳内への送達効率を向上させることが可能です12,13。これまでのメカニズム研究により、超音波による機械的刺激が細胞間接合を再構築し、内皮透過性を高めることで、バリア機能を一時的に調節できることが示されています。例えば、Silvaniらは、超音波誘発機械力がin vitroのvessel-on-a-chipにおいて、可逆的な内皮細胞間隙の形成を誘導することを示しました14。これらの知見と一致して、Beekersらは、超音波介在性の機械的バイオエフェクトが内皮細胞間の接触を一過性に開放し、それによって内皮透過性を増加させることを実証しました15。より最近では、Qiaoらが、内皮バリアの透過性は超音波照射パラメータ、特にパルス長によって決定的に制御されることを報告し、安全で制御可能なBBB調節を実現するための音響パラメータ最適化の重要性を強調しました16。このような進展にもかかわらず、超音波介在性のBBB開放とそのナノメディシン送達への影響を同時に定量的に分析できるin vitroプラットフォームは依然として限られています。

上述の課題を解決するため、マイクロ流体BBB-GBMチップの構築プロトコルを提示する。このマイクロ流体デバイスは、Matrigelに埋め込まれたHCMECs、初代ACs、およびU87-MG GBM細胞の共培養を支持する。再構築されたBBBは、細胞間接合に沿った連続的なZO-1の局在と、血管界面における40 kDa FITC-dextranの限定的な拡散によって示されるように、完全なバリアの構造的および機能的特性の両方を示した。重要なことに、このチップは制御された超音波刺激と組み合わせることで、一過性のBBB開口を誘導し、これによりナノミセルのその後の輸送および腫瘍標的効率を高めることができる。本システムを用いることで、ナノミセルSFN@RB@SPMの輸送および腫瘍標的効率を定量的に評価することが可能である。総じて、本プラットフォームは、超音波パラメータ、可逆的な特性を持つBBB調節、およびGBM治療におけるナノミセル送達の向上との関係を研究するための有用なツールを提供する。

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プロトコル

すべての動物実験 procedure は、実験動物福祉の倫理審査に関するガイドライン (GB/T35892-2018) に準拠し、中国科学院大学 (UCAS) 寧波生命健康産業研究院の機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の承認を得て実施されました (承認番号: GK-2023-XM-0073)。使用した試薬および設備は、材料表に記載されています。

1. BBB-GBM オルガンオンチップデバイスの作製および準備

  1. チップ設計およびフォトマスクレイアウト
    1. Auto CADソフトウェアを使用してチップを設計する。
      注：チップは、血液チャネル、脳チャネル、腫瘍チャネルの3本の並行するマイクロ流体チャネルで構成される。血液チャネルと腫瘍チャネルの幅はいずれも1000 µmであり、脳チャネルの幅は1300 µmである。3つのチャネルの高さは150 µmであり、隣接するチャネルは幅200 µmの台形マイクロピラーアレイで隔てられており、これによりコンパートメント間の分子拡散および細胞間相互作用が可能になる。詳細なフォトマスク設計レイアウトはSupplementary Figure 1およびSupplementary Figure 2に提示されている。本研究で使用したSU-8フォトレジストは3050である。
  2. SU-8フォトレジストを用いた標準的なフォトリソグラフィによるシリコンマスターモールドの作製
    1. 未加工のシリコンウェハをスピンコーターの真空チャックに設置し、真空を起動してウェハを確実に固定する。
    2. 10 mLのSU-8フォトレジストをウェハの中央にゆっくりと滴下する。
    3. 均一なフォトレジスト層を得るために、2段階のスピンコーティング工程を行う。まず500 rpmで10秒間、次に2500 rpmで90秒間行う。
    4. コーティングしたウェハをホットプレートに移し、95 °Cで30分間のソフトベークを行い、溶剤を蒸発させる。
    5. ウェハを室温まで冷却し、膜厚計を用いてSU-8層の厚さを測定する。
      注：最適なBBB形成のためには、110–150 µmのチャネル高が推奨される。1回分のスピンコート（工程1.2.3）で得られる膜厚は通常40–50 µmである。したがって、目的の全厚に達するには2回から3回のスピンコーティング工程が必要である。
  3. フォトリソグラフィによるパターニング
    1. マスクアライナーの紫外線（UV）光強度を14–15 mW/cm2に設定する。
    2. クロムフォトマスクをSU-8コーティング済みのシリコンウェハに合わせ、10秒間UV露光を行う。
    3. シリコンウェハを直ちにホットプレートに移し、以下の条件で露光後ベーク（ポストベーク）を行う：65 °Cで10秒間、続いて95 °Cで300秒間。
    4. シリコンウェハが室温まで冷却した後、現像液（プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、PGMEA）に浸し、4–6分間現像させる。
    5. イソプロパノールでウェハをリンスして現像を停止させ、その後、脱イオン水で洗浄する。
    6. 窒素ガスを用いてウェハを乾燥させ、光学顕微鏡下でパターニングされたマイクロチャネル構造を検査する。
      注：未現像のフォトレジスト残渣が残っている場合は、微細構造が明確に定義されるまで現像工程を繰り返す。
    7. 完成したシリコンマスターをオーブンで200 °C、1時間ベークし、SU-8フォトレジストとシリコンウェハ表面の密着性を向上させる。
  4. PDMSチップの作製
    1. ベースプリポリマーと硬化剤を10:1の重量比（w/w）で十分に混合し、30分間かけて均質なPDMSプリポリマーを調製する。
    2. 作製したシリコンマスターモールドにPDMS混合液を流し込み、微細構造が完全に覆われていることを確認する。
    3. 気泡を除去するため、マスターモールドを真空デシケーターに入れて脱気する。
    4. マスターモールドをオーブンに移し、65 °Cで1.5–2時間硬化させる。
    5. 硬化後、デザインナイフを用いてチップの境界に沿ってPDMS層を慎重に切り出し、シリコンマスターモールドからゆっくりと剥がす。
    6. PDMSチップを70%–75%エタノールに30分間浸して予備滅菌を行い、その後、脱イオン水でリンスして風乾させる。
    7. 2 mmのバイオプシーパンチを用いて、入口および出口ポートを穿孔する。
  5. プラズマ接合およびデバイスの組み立て
    1. PDMSチップと洗浄済みのガラススライドをプラズマクリーナーのチャンバーに入れ、PDMSのマイクロチャネル側が上を向くように配置する。
    2. 圧力が30 Pa以下に下がるまでチャンバー内を排気し、その後、酸素ガスを導入する。
    3. チャンバー圧力を40 Pa以下に維持しながら、酸素フローを90秒間保持する。
    4. 高周波（RF）出力を55%に設定し、90秒間プラズマ処理を行ってPDMSおよびガラス表面を活性化させる。
    5. 活性化したPDMSチップを直ちにガラススライドに接触させ、軽く押して不可逆的な接合を行う。
    6. 組み立てたデバイスを65 °Cのオーブンで24時間保持し、接合を安定させ、疎水性を回復させる。
    7. 細胞播種前に、接合済みデバイスを紫外線照射で30分間滅菌する。
      注：使用時まで滅菌済みチップを封印したペトリ皿に入れ、バイオセーフティキャビネット内で保管することで無菌状態を維持する。

2. 細胞播種およびBBB-GBMモデルの構築

  1. 以下の試薬を準備する：
    1. ACs培養液（脳チャネル用）：20%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン（P/S）を含むDMEM/F12基礎培地。
    2. HCMECs培養液（血管チャネル用）：1% P/Sを添加した血管内皮細胞培地（ECM）。
    3. GBM細胞培養液（グリオーマチャネル用）：10% FBSおよび1% P/Sを含むMEM基礎培地。
    4. 細胞解離試薬：接着細胞の剥離には0.25%トリプシン-EDTA溶液を使用する。
      注：トリプシンへの長時間曝露は細胞生存率を低下させる可能性がある。顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、速やかに完全培地でトリプシンを中和させること。
    5. すべての細胞（ACs、HCMECs、U87-MG）は、マイクロ流体デバイスへの播種前に100 mm培養皿で維持する。
  2. 初代ACsの分離
    1. 新生ラット（生後1～3日）の大脳皮質から初代ACsを分離する。氷上で髄膜と血管を慎重に取り除いた後、滅菌外科用ハサミで皮質組織を細切し、酵素消化に供する。
    2. 解離した細胞懸濁液を氷冷PBSで洗浄し、トリプシン処理して単一細胞へと解離させ、遠心分離（400 x g、5分、室温）によりペレットを回収する。
    3. 細胞を再懸濁し、ACs培養液を含むT25培養フラスコに播種する。
    4. 免疫蛍光染色により、GFAPを用いてACsを同定する。画像は補足 図3に提示されている。
  3. 細胞の播種
    ​注：1日目 － 脳チャネルへのACsの播種。
    1. ACsを含む培養皿に0.25%トリプシン-EDTAを1 mL導入する。穏やかに回転させ、均一に広げる。
    2. 細胞が培養皿から剥離するまで、37 °Cで1～2分間インキュベートする。
    3. トリプシンを中和するために、ACs培養液（手順2.1.1）を3 mL加える。穏やかにピペッティングし、単一細胞懸濁液を得る。
    4. 細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、4 °Cで300 × g、3分間遠心分離する。
    5. 上清を除去し、細胞ペレットを200 µLのAC培地で再懸濁する。
    6. 自動細胞カウンターを用いて細胞濃度を測定し、密度を2.5 × 106 cells/mLに調整する。
    7. ACs細胞懸濁液とMatrigelを3:5（v/v）の比率（AC細胞：Matrigel）で混合する。
    8. マイクロピペットを用いて、Matrigel-ACs混合液10 µLを脳チャネルに分注する。
      注：Matrigelの早期重合を防ぐため、チップを氷上に保持した状態でロード手順を行うこと。
    9. Matrigelの重合と細胞の安定化させるため、チップを5% CO2インキュベーター、37 °Cで30分間インキュベートする。
      注：1日目 － 血管チャネルへのHCMECsの播種。
    10. 0.25%トリプシン-EDTAを1 mL適用し、細胞が剥離するまで37 °Cで約30秒間インキュベートする。
    11. 酵素消化を停止させるため、HCMECs培地（手順2.1.2）を3 mL加える。
    12. 穏やかにピペッティングし、均一な単一細胞懸濁液を作成する。
    13. 懸濁液を回収し、4 °Cで300 × g、3分間遠心分離する。
    14. 上清を除去し、細胞ペレットを200 µLのHCMECs培地で再懸濁する。
    15. 細胞数をカウントし、濃度を2 × 106 cells/mLに調整する。
    16. HCMECs懸濁液10 µLを、チップの血管チャネルに慎重に導入する。
    17. チャネル壁に沿った内皮細胞の接着を促進するため、チップを横向きにして細胞インキュベーター内に30分間置く。
    18. 血管チャネル内の内皮密度を高めるため、さらに10 µLのHCMECs懸濁液を血管チャネルに播種する。
    19. HCMECsの接着させるため、チップをさらに30～60分間インキュベートする。
    20. チップのインレットに混合培養液100 µLを加える。
      注：混合培地は、AC培地とHCMECs培地を1:1（v/v）の比率で混合したものである。
      3日目 － グリオーマチャネルへのU87-MG細胞の播種。
    21. 培養皿に0.25%トリプシン-EDTAを1 mL加え、37 °Cで1～2分間インキュベートする。
    22. 消化を終了させるため、U87-MG培地（手順2.1.3）を3 mL加える。
    23. 穏やかにピペッティングし、均質な単一細胞懸濁液を得る。
    24. 細胞懸濁液を遠心チューブに移し、300 × gで3分間遠心分離する。
    25. 上清を捨て、細胞ペレットを200 µLのU87-MG培地で再懸濁する。
    26. 細胞濃度をカウントし、密度を2 × 106 cells/mLに調整する。
    27. U87-MG細胞懸濁液10 µLを、チップのグリオーマチャネルに導入する。
    28. 細胞を接着させるため、チップを37 °C、5% CO2下で30～60分間インキュベートする。
    29. チップのインレットにU87-MG培養液100 µLを加える。
    30. 内皮細胞のタイトジャンクション形成を促進するため、マイクロ流体デバイスを37 °C、5% CO2環境下でさらに48時間維持する。

3. BBB整合性の評価

  1. 透過性アッセイ
    1. 混合培養液（ACs medium: HCMEC medium = 1:1, v/v）を用いて、分子量40 kDaのフルオレセインイソチオシアネートデキストラン（FITC-dextran）を最終濃度10 µg/mLで調製する。
    2. FITC-Dextran溶液10 µLを血管チャネルに導入する。
    3. マイクロ流体チップを倒立蛍光顕微鏡のステージに設置し、血管チャネルと隣接する脳チャネルの両方の蛍光画像を20分間隔で取得して、内皮バリアを介したデキストランの拡散をモニタリングする。
    4. 以下の式を用いて透過係数（Papp, cm/s）を定量する：
      Papp (cm/s)= プロセス効率の式。Fs、Fc、Δtを含む科学研究用の数式。
      ここで、Pappは見かけの透過係数（cm/s）、FS は血液チャネルにおける初期時点の蛍光強度、FCは拡散間隔終了時の脳チャネルにおける蛍光強度、Δtは拡散時間（s）、VTは脳チャネルにおけるFITC-dextranの拡散体積（cm3）、Aは内皮表面積（cm2）である。
      注：透過係数が低いほど、BBBの完全性が高く、より強固な内皮バリアが形成されていることを示す。
    5. データ解析およびパラメータ定義を行う。
      注：血液チャネルと脳チャネル両方の蛍光強度値から、チップの細胞のない領域で得られた測定値を用いてバックグラウンド減算を行った。ROIは、蛍光拡散距離に基づき血液脳界面の両側に定義した。内皮表面積（A）は、血管チャネルと脳チャネルの界面面積（2本のマイクロピラー間の隙間を基準として使用）から算出した：200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2。FITC-dextranの拡散体積（VT）は、脳チャネルにおける拡散浸透距離にAを乗じて導出した。蛍光画像は60分間にわたって20分（1200 s）ごとに取得し、透過係数は20分間隔のデータを用いて算出した。透過値は、各実験群につき3つの独立したチップから算出した。透過性をcm/sとして表す前に、すべての単位換算を行った。
  2. ZO-1の免疫蛍光分析
    1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でマイクロ流体チャネルを3回洗浄し、残った培養液を除去する。
    2. 4%パラホルムアルデヒド（PFA）をチャネルに導入し、室温で10分間インキュベートして細胞を固定する。
    3. 0.1% Triton X-100含有PBSを用い、室温で15分間細胞を透過処理する。
    4. 2%牛血清アルブミン（BSA）含有PBSを用いてチャネルを室温で45分間インキュベートし、非特異的な抗体結合をブロックする。
    5. 抗ZO-1一次抗体（1:200希釈）をチャネルに導入し、4 °Cで一晩インキュベートする。
    6. PBSでチャネルを十分に洗浄し、未結合の一次抗体を除去する。
    7. Alexa Fluor 555標識抗ウサギ二次抗体（1:1000希釈）を用い、遮光下、室温で45分間チップをインキュベートする。
    8. 1 µg/mL 4’6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用い、遮光下、室温で1分間核を対比染色する。
      注：DAPIは光に敏感であるため、染色中は遮光して保護する必要がある。
    9. PBSでチャネルを3回洗浄する。
    10. 倒立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてマイクロ流体デバイスを撮像し、内皮細胞接合部に沿ったZO-1の局在を可視化する。

4. 超音波によるBBB透過促進を用いたGBM細胞へのナノミセル送達

  1. 超音波刺激
    1. チップを培養皿から慎重に取り出し、バイオセーフティキャビネット内に入れます。
    2. 1 MHzのトランスデューサ（有効放射面積：5 cm²）を搭載した治療用超音波システムを用いて、超音波刺激を適用します。2).
    3. 効率的な音響伝達を確保するため、超音波プローブとマイクロ流体チップの表面の間に、厚さ3 mmの医療グレード音響結合パッドを装着します。
    4. 超音波プローブを、マイクロ流体デバイスの血管チャネル領域の直上に配置します。
      注意：トランスデューサとチップの間に気泡が生じると、音響エネルギーの伝達が著しく低下するため、避ける必要があります。
    5. 超音波パラメータを次のように設定する：デューティサイクル：60%、周波数：1 MHz、強度：1 W/cm²2照射時間：30秒、パルス繰り返し周波数（PRF）：100 Hz。詳細な超音波パラメータは、以下に記載されている。 補足表1
    6. 未処理の対照群については、超音波トランスデューサーを同様の位置に配置しますが、音響曝露のない同一の取り扱い手順を確保するため、シャム対照として非作動状態に保ってください。
    7. 超音波照射後、カップリングパッドを取り除き、直ちにチップを滅菌済みの培養皿に戻してください。
    8. チップの導入ポートに新鮮な培地を添加する。
    9. デバイスを～でインキュベートする 37 °C 5% CO含有2 さらなる解析まで。
  2. 超音波誘発性血液脳関門（BBB）変調の評価
    1. タイトジャンクションの完全性の変化を評価するため、超音波処理直後（0時間）および処理後24時間に、ZO-1免疫蛍光染色を行う。
    2. ステップ3.2で説明した免疫蛍光染色手順に従ってください。
    3. z軸に沿ったZO-1染色の分布を比較し、超音波刺激が血液脳関門（BBB）のタイトジャンクションの完全性に及ぼす影響を評価する。
  3. SFN@RB@SPMナノミセルの調製および特性評価
    1. 既報のプロトコルに従い、SFN@RB@SPMナノミセルを調製する。17簡潔に述べると、両親媒性ペプチド（SPMと命名、6 mg/mL）、RB（0.6 mg/mL）、およびSFN（6 mM）のストック溶液を、体積比1:1:1で混合した。
    2. 混合物を超音波洗浄機に入れ、28 kHzで超音波処理を行います。 25 °C 30分間。
    3. 遊離したRBおよびSFNを除去するため、混合液を48時間透析（分画分子量：1000 Da）する。
    4. 動的光散乱法（DLS）を用いて、ナノミセルのサイズおよびゼータ電位を測定する。特性評価データは以下に提示されている。 付随図4.
  4. 超音波刺激によるナノミセルの送達およびグリオーマ細胞への蓄積の評価
    1. 超音波照射の直後に、ナノミセルを含む培地をマイクロ流体デバイスの血管チャネルに導入してください。
    2. ナノミセルの血液脳関門（BBB）通過能を評価するため、マイクロ流体チップを倒立蛍光顕微鏡のステージに設置し、血管チャネルおよび隣接する脳チャネルの両方の蛍光画像を、60分間にわたり20分間隔で取得する。
    3. 超音波増強によるナノミセルの透過性を評価するため、脳チャネルの蛍光画像を定量化する。
    4. 神経膠腫細胞におけるナノミセルの蓄積を評価するため、標準的な培養条件下でデバイスをインキュベートします（37 °C, 5% CO22）超音波照射後3時間で、蛍光顕微鏡を用いてグリオーマチャネルをイメージングし、ナノミセルの細胞内取り込みを評価する。
  5. 統計解析
    1. すべての定量データは、平均値±標準誤差（SEM）で表記してください。
    2. 各実験は、3つの独立した生物学的反復（実験条件あたりn = 3チップ）で行う。データの信頼性を確保するため、各生物学的反復について、少なくとも3つのテクニカルリプリケート（チャネルあたりのROI）を測定した。
    3. 透過係数（Pアプリ各独立したチップからの（cm/s）が、すべての統計的比較における主要な解析単位として用いられた。
      注：2群間の比較には、非ペアの2検定（Student's t-test）を用いた。 t検定3群以上の比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、続いて多重比較のためにTukeyのポストホックテストを用いて解析した。2つの独立変数を含む実験については、二元配置分散分析（two-way ANOVA）を行い、続いてTukeyの多重比較検定を実施した。統計解析は、統計およびグラフ作成ソフトウェアを用いて行った。 p〜の値 <0.05を統計的に有意であると見なした。

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結果

～を再現するために in vivo BBB（血液脳関門）の構造を模倣するため、HCMEC、一次培養アストロサイト、およびU87-MG細胞を組み込んだ三共培養マイクロ流体チップ（以下「チップモデル」と呼ぶ）を開発した。図に示されているように、 図1A,Bデバイス内には3つの並行チャネルが配置されており、それぞれ血管チャネル（左、青）、Matrigelを充填した脳チャネル（中央、ピンク）、および腫瘍チャネル（右、緑）であり、それぞれにHCMEC、AC、およびU87-MG細胞が播種されています。各チャネルはマイクロピラーアレイによって隔てられており、これにより中央コンパートメント内のMatrigelの閉じ込めを維持しつつ、チャネル間の分子および細胞の交換を可能にしています。デバイスの滅菌後、AC（2.5 × 106 Matrigelに3:5 (v/v) の比率で懸濁させたHCMEC（2 × 10^5 cells/mL）を脳チャネル内に注入した。Matrigelの重合後、HCMEC（2 × 106

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ディスカッション

本プロトコルでは、超音波によるBBB（血液脳関門）変調およびナノミセル輸送を評価するための、マイクロ流体BBB-GBMチップの構築について説明します。従来のin vitro BBBモデル（Transwellなど）と比較して、このマイクロ流体プラットフォームでは、内皮細胞、アストロサイト（AC）、およびグリオーマ細胞を空間的に定義して共培養できるため、生理学的に適切なBBBを介した薬物輸送の調査が可能です。本プロトコルのいくつかの重要なステップでは、信頼性の高いバリア形成を確実にするために慎重な最適化が必要です。重要なパラメータの1つは、中央の脳チャネルに充填する混合液を調製する際に用いる、MatrigelとAC細胞懸濁培地の容量比です。この比率は、充填中にAC-Matrigel混合物が中央チャネル内に保持されるよう、適切なゲルの粘性を維持するために極めて重要です。混合物中にAC細胞懸濁培地が多く含まれていると、粘性が低下してMatrigelが隣接するマイクロチャネルに漏れ出し、AC細胞が隣接チャネルへ移行する可能性があります。逆に、Matrigelの濃度が高すぎると、細胞生存率が低下し、栄養素の拡散が妨げられる可能性が...

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開示事項

本原稿の作成にあたり、著者は言語編集および改善のみを目的としてChatGPT (OpenAI)を使用しました。著者はAIによる支援を受けたすべての内容を確認・編集し、原稿の正確性と完全性について全責任を負います。データの生成、解析、および図の作成にAIツールは使用していません。

謝辞

本研究は、浙江省自然科学基金（LQ24H160003）、浙江省医学科学研究基金（2024KY351）、寧波市自然科学基金（2023J365）、永江人材導入プログラム（若手革新的人材プロジェクト、2021A-012-G）、および寧波市江北区北岸人材プログラム（2023RC004）からの助成を gratefully いただいたことを謝意的に報告いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 555標識抗ウサギ二次抗体Cell Signaling Technology, Inc.4413
抗ZO-1抗体Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
生検パンチZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
ウシ血清アルブミンAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
細胞計数器Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
細胞培養ディッシュ（100 mm）Corning Inc.430167
遠心分離機Beckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
クロムマスクSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
共焦点レーザー走査顕微鏡Carl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
開発者Suzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
細胞外マトリックスScienCell Research Laboratories1001
エタノール寧波鎮海永豊化工場6923193900015
ウシ胎児血清ScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)オープンソースプロジェクト該当なし
FITC-デキストラン (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
ガラススライドCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.該当なし
ヒト脳微小血管内皮細胞 (HCMECs)BeNa कल्चर コレクションBNCC337717
インキュベーターEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
倒立蛍光顕微鏡Nikon Instruments Inc.TS2-FL
イソプロパノール国药化学试剂有限公司80109218
マトリゲルCorning Inc.354234
最小必須培地プリセラ・ライフサイエンス & Technology株式会社PM150410
窒素Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.翻訳するテキストが提供されていません。翻訳対象の英文をご提示ください。
酸素Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳するソーステキストをご提示ください。
パラホルムアルデヒド (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
リン酸緩衝生理食塩水ScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
ポリジメチルシロキサンCorning Inc.220777
ペニシリン/ストレプトマイシンPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
フォトリソグラフィ中国科学院光学電子研究所URE-2000\AL
フォトリソグラフィー用ホットプレートSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
プラズマアッシャーTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
初代アストロサイト該当事項なし該当なし新生仔ラット（生後1〜3日）の脳から単離
シリコンウェハー浙江英集科技有限公司10204040001
スピンコーターSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8株式会社火薬 ライフサイエンス1030403002
Triton X-100北京Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
トリプシンScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
U87-MG細胞Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
超音波診断装置 Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(ブルーエディション)Carl Zeiss AG翻訳すべき原文が提供されていません。翻訳したいテキストを入力してください。

参考文献

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