方法論記事

病変可視化のための エクスビブCy5.5 染色シリカナノ粒子標識を用いた子宮内膜症のマウスモデル

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DOI:

10.3791/72070

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2026年8月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いた エクスビブ 標識を用いて子宮内膜症の誘導を示し、遺伝子操作なしで子宮内膜症病変の蛍光可視化を可能にします。

要約

子宮内膜症は、子宮腔外に子宮内膜様組織が増殖し、慢性的な炎症、骨盤痛、不妊を引き起こす一般的な婦人科疾患です。信頼性の高いマウスモデルは、疾患の発症と進行の分子、ホルモン、免疫、環境メカニズムを調査するために不可欠です。従来の子宮内膜病変の特定方法は、遺伝子組み換えで作られた蛍光リポーターマウスに依存することが多いですが、これらは時間とコストがかかります。ここでは、移植前にドナーの子宮組織断片にCy5.5ドープシリカナノ粒子をエクス ビ ボで標識することで、マウスの子宮内膜症を誘導し可視化する、単純な非遺伝的アプローチを提案します。ナノ粒子は良好な物理化学的特性、高い蛍光安定性、最小限の細胞毒性を示し、実験手順を損なうことなく子宮組織の効率的な標識を可能にしています。受容マウスへの腹膜内着床後、Cy5.5標識された子宮内膜病変は蛍光画像法を用いて周囲の宿主組織と容易に区別できます。このプロトコルは病変の可視化と追跡に再現可能かつ多用途な方法を提供し、遺伝子操作を必要とせずに子宮内膜症の病因の研究や診断・治療戦略の前臨床評価を促進します。

概要

子宮内膜症は、子宮外側に内膜の細胞が増殖する一般的な婦人科疾患です。その結果生じる子宮内膜病変は慢性炎症性疾患を引き起こし、影響を受けた女性は骨盤痛や不妊を経験することが多いです。子宮内膜間質細胞および上皮細胞の機能障害は、子宮内膜病変の生存率と発達を促進します 3,4,5,6。この一般的な障害は、アメリカだけでも約11%の女性に影響を受けています。これは不妊と骨盤痛の主な原因であり、慢性骨盤痛と不妊の女性では有病率が50%〜60%に増加します 8,9,10,11,12,13。米国における子宮内膜症の診断および治療にかかる年間推定費用は220億ドルを超えています。現在の治療法には、病変の外科的切除や低エストロゲン状態の誘導が含まれます。しかし、手術後の再発は一般的であり、既存の治療法はしばしば効果が薄い9,16。診断は通常、外科的可視化および組織学的検証によってのみ確定されます17,18。さらに、子宮内膜症はしばしば診断されなかったり誤診されたりしており、診断の遅れは9〜11年です。この遅延は患者と医療システムの双方に大きな精神的・経済的負担を課しています20,21。したがって、子宮内膜症の診断と治療の両方に非侵襲的な方法を開発する緊急の必要性があります。

in vitroモデルは子宮内膜症の高度な研究を行っています。しかし、病気の複雑さを完全に再現する能力には限界があります。大きな課題は、子宮内膜症の多因子性にあり、ホルモン、炎症、免疫細胞、神経、多様な細胞タイプが動的な三次元環境の中で複雑な相互作用を含みます。さらに、in vitroシステムは卵巣ステロイドホルモンの自然な変動を捉えられず、生殖管への疾患影響の研究が制限されています(21,22,23)。したがって、未去勢マウスを用いた誘導子宮内膜症モデルは、免疫系24、ホルモン25,26、環境要因27,28の個別かつ相互作用的な役割を子宮内膜症の発生および生殖管への影響を調査するための多様なプラットフォームを提供します.さらに、特定の遺伝子を選択的に削除または過剰発現させるトランスジェニックマウスモデルの利用により、研究者は子宮内膜症の発症と進行における異なる分子経路の役割を明らかにすることが可能になります。しかし、子宮内膜病変と周囲の宿主組織を正確に区別することは依然として大きな技術的課題です。

染色ドープシリカナノ粒子は、細胞追跡やバイオイメージングのための多用途で堅牢なプローブです。合成が簡単で、高度に分散し、光安定性があり、生体適合性があり、細胞標識において効率的です30,31。シリカ骨格はマトリックス内の疎水性蛍光素を安定化させ、効率的かつ高量子収率(QY)蛍光分子報告体として機能させます。長年にわたり、このような蛍光シリカナノ粒子は、移植およびその後のin vivo画像化前の細胞や組織構造の明るく耐久性のある生外ラベルとして広く採用されてきました。ここでは、以前の論文35で用いられたCy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いたエクスビボ標識を用いたマウスの子宮内膜症誘導の詳細な手順を説明し、病変追跡のための安定したイメージングマーカーとしての応用を可能にします。

プロトコル

すべての動物処置はミズーリ大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認され(プロトコル番号65323)、実験動物のケアおよび使用に関する機関のガイドラインおよび適用される国家規則に従って実施されました。

1. Cy5.5-APTES共役体の調製

  1. 1 mgのシアニン5.5-NHSエステルを100 μLのジメチルスルキシド(DMSO)に溶かし、透明な11.1 mLのガラスねじバイアルに溶かします。すぐにアルミホイルで蓋をして、溶液を光から守ります。
    注:Cy 5.5-APTES共役は室温で4°Cで1週間保存可能です。
  2. 染料溶液に1μLの(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)を加えます。
  3. トリエチルアミン(TEA)を0.5 μL加え、反応を促進するためにすぐに混合します。
  4. 反応混合物を暗闇で300 rpm、30°Cで24時間かき混ぜ、Cy5.5とAPTESの共有結合を可能にします。
  5. 瓶をキャップで密封し、アルミホイルで包んで光から守り続けてください。

2. Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子の合成

  1. 新しい透明ガラスネジバイアルに濃縮アンモニア溶液1μL(28%)を加えます。
  2. 分子生物学グレードの絶対エタノール8.5mLを加えます。
  3. テトラエチルオルトシリケート(TEOS)を350μL追加します。
  4. 準備済みのCy5.5-APTES溶液15 μLをシリカ合成反応混合物に加えます。
  5. 反応混合物を室温の暗い環境で500rpmで24時間かき混ぜ、シリカマトリックスへの共有結合を可能にします。

3. 精製と分散

  1. 反応混合物全体を15mLの遠心分離機チューブに移します。
  2. 遠心分離用に同量の蒸留水を入れたバランスチューブを準備します。
  3. 両方のチューブを12,074 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後、チューブの底に見えるペレットが形成されているか確認してください。
  4. ペレットを10mLの95%エタノールで、12,074 × g で遠心分離し、4°Cで10分間洗浄します。 この洗浄を3回繰り返し、ペレットを超音波処理で約3〜5分間再懸浮させ、または完全に分散するまで続けます。
  5. ペレットを蒸留水5mLで洗浄し、遠心分離機で12,074 × g で4°Cで10分間洗浄します。 この洗浄を2回繰り返し、約3〜5分間、または完全に分散するまで超音波処理でペレットを再懸浮させます。
  6. ペレットを5mLの蒸留水に超音波検査で再懸浮させ、完全に分散するまで(分散を確認するための固体断片は観察されません)。粒子懸濁液が完全に分散した後、目に見える青色に見えるか確認してください。
  7. 懸濁液をガラスのバイアルに移し、光から守るためにアルミホイルで包み、室温で保存します。
  8. イン ビビ イメージングシステム(IVIS)を用いて粒子の分散と蛍光を評価します。Cy5.5には励起波長680 nm、発光波長710 nmを使用します。

4. Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いた エクスビブ 標識を用いた子宮内膜症誘導

  1. 8週間齢のメスのドナーマウス(株:C57Bl6J X129Sv)にE2(100μL、100μL、ごま油入り)を1日1日連続で皮下注射し、ホルモン同期を促します。
  2. 最終的なE2注射から6時間後に子宮頸部脱臼でドナーマウスを安楽死させ、子宮を摘出します。
  3. 子宮組織を約1mm×3の破片に切り分け、ペトリ皿でメスを使います。
  4. 子宮組織断片(45 mg)を、20%(v/v)Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を、完全なRPMI-1640培地(10% FBS)を含む24ウェルプレートで、3時間、37°C、5%CO2で培養します。
  5. 受容マウス(株:C57Bl6J X129Sv)に3%イソフルランを酸素で麻酔し、腹部中央に0.5cmの切開を行います。
    注意:麻酔が得られるまで、マウスを3%イソフルランの誘導チャンバーに入れてください。腹部を剃り、マウスを手術台に移します。手術開始前に麻酔鼻のコーンを位置づけてください。
  6. 体 外で標識された子宮組織断片を、380 ×g で遠心分離し、室温培養培地で2分間洗浄します。洗いを3回繰り返します。
  7. 麻酔下で、受け付けマウスの腹部中央に1cmの切開を入れます。Cy5.5標識組織断片45mgを500μLのPBSに懸浮させ、20ゲージの針で腹膜腔に注入します。
  8. 腹膜は吸収性縫合糸で閉じ、皮膚は創傷クリップで閉じます。マウスを温かい環境に置き、麻酔からの回復まで様子を見てください。
  9. 選択された実験的エンドポイントで子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、子宮内膜病変を採取します。

結果

染色ドープされたシリカナノ粒子は、細胞標識用途のイメージングプローブとして使用できます。Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子(Cy5.5-SiNPs)は、シリカソルゲルプロセスを用いて2段階で合成され、蛍光シアン染料Cy5.5でシラン化学を用いて官能基化されました(図1)。透過電子顕微鏡(TEM)では直径156.67 nm±15.23 nmの均一な球状ナノ粒子が明らかになりました(図1A)。動的光散乱(DLS)により、合成されたナノ粒子(SiNPsおよびCy5.5-SiNPs)がコロイド的に安定していることが示されました。流体力学的直径(Hd)はそれぞれ130.67 ± 3.20 nm(PDI = 0.152 ± 0.009)、185.9 ± 5.44 nm(PDI = 0.14 ± 0.009)です(図1B参照)。裸のSiNPとCy5.5-SiNPのゼータポテンシャルは、それぞれ3.55 mV±−32.39、−50.53±2.47 mVでした(図1C)。光発光分光法(励起波長=680 nm;発光波長=710 nm)により、Cy5.5がシリカナノ粒子に成功裏に組み込まれたことが確認され、Cy5.5-SiNPは特徴的な蛍光を示しました(図1D)。さらに、光発光スペクトルによって染料共役の成功が確認されました。さらに、Cy5.5-SiNPsの量子収率(QY)(φ=0.31)は遊離Cy5.5染料と同等でした(φ = 0.23)36。

ナノ粒子の生体適合性を評価するため、12Zの子宮内膜上皮細胞をCy5.5-SiNPsと共にDMEMで37°C、5% CO₂で一晩培養しました。細胞生存率は、処理後のMTTアッセイを用いて、ナノ粒子濃度は0、0.5、1、2.5、5、10μg/mLで評価されました(図1E)。10 μg/mLまでの濃度では細胞毒性は観察されませんでした。5 μg/mLのCy5.5-SiNPsでインキュベートされた細胞は効率的なナノ粒子取り込みを示し、蛍光顕微鏡により核周囲領域での粒子局在が示されました(図1F)。対照細胞では未処理のCy5.5蛍光は検出されませんでした。調製されたCy5.5-SiNPsは、脱イオン水中で170〜190 nmの流体力学的直径を持ち、DLSおよび蛍光イメージングにより7日間安定した蛍光強度を維持する水性安定性も示しました(図1G、H)。

Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子の 体外 組織標識の適合性を確立するため、子宮内膜症誘導前にその蛍光特性が検証されました。IVISイメージングではナノ粒子懸濁液からの強力な蛍光放出が示されましたが、水のみを含む陰の対照では検出可能な蛍光信号は観察されず、Cy5.5蛍光検出の特異性と感度が確認されました(図2)。

その後、子宮組織断片の 体外 標識のための濃度と潜伏期間が最適化されました。20%(v/v)Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子と共に3時間、37°Cで5% CO235の下で子宮組織断片を検出しました。IVISイメージングにより、標識組織断片からの強く一貫した蛍光信号が確認されました。これらの結果は、Cy5.5染色ドープシリカナノ粒子が遺伝子改変なしに子宮組織断片を効率的に標識できることを示しています(図3)。

次に、Cy5.5染色ドープシリカナノ粒子標識された子宮組織断片が子宮内膜症を誘発し病変の特定を促進する能力を評価しました。標識された組織断片を受容マウスの腹腔に注入し、1か月間疾患の進行を監視しました。実験的エンドポイントでは、腹膜腔内で子宮内膜病変が容易に特定されました。Cy5.5陽性病変はIVIS画像および蛍光顕微鏡により周囲の宿主組織と明確に区別され、迅速かつ明確な病変の特定が可能となった。病変内のCy5.5蛍光は蛍光顕微鏡検査でさらに確認されました。

これらの結果は、Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いた エクスビボ 標識が子宮内膜症の成功誘導を支持し、 生体内 での子宮内膜病変の信頼できる可視化を可能にすることを示しています(図4)。

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図1:Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子(Cy5.5-SiNPs)の物理的特性評価。 (A) Cy5.5-SiNPの代表的な透過電子顕微鏡(TEM)画像。粒子径 = 156.67 ± 15.23 nm。スケールバー=100nm。(B) SiNP(130.67 ± 3.20 nm、PDI = 0.152 ± 0.009)およびCy5.5-SiNP(185.9 ± 5.44 nm、PDI = 0.14 ± 0.009)の流体力学直径の動的光散乱(DLS)測定。(C) SiNPs(−32.39 ± 3.55 mV)およびCy5.5-SiNP(−50.53 ± 2.47 mV)のゼータ電位測定。これはCy5.5共役後のゼータ電位の低下を示しています。(D) Cy5.5-SiNPsの蛍光プロファイル(励起波長=680 nm;発光波長=710 nm)。挿入図:水中に分散したCy5.5-SiNPの明視野および蛍光画像。(E) Cy5.5-SiNPsで処理した12Z細胞のMTT細胞生存能力アッセイ(濃度0、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL)。(F) 12Z細胞によるCy5.5-SiNPsの細胞取り込み。細胞はPBS(対照)またはCy5.5-SiNPsで処理されました。青 = DAPI;赤 = Cy5.5-SiNPs。スケールバー = 200 μm(G)水に7日間保存されたCy5.5-SiNPのサイズ安定性、流体力学的直径の有意な変化は認められませんでした。(H) Cy5.5-SiNPsの蛍光安定性は水中に7日間保存され、蛍光強度に有意な変化は認められませんでした。挿入:1日目、3日目、6日目に取得した代表的な蛍光画像。NS = 有意なし。値は±平均標準差(SD)として表示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子の確認。 (A) Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子の代表画像。(B) IVISイメージングを用いたCy5.5染料ドープシリカナノ粒子からのCy5.5蛍光検出。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いた子宮組織断片の エクスビブ 標識。 左パネルは未処理の対照子宮組織断片を示し、右パネルはCy5.5染料ドープシリカナノ粒子で標識された子宮組織断片を示しています。IVISイメージングを用いてCy5.5蛍光を検出しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:Cy5.5色素ドープシリカナノ粒子で標識された子宮内膜病変の検出。 (A) 腹膜腔のIVIS画像。(B) Cy5.5標識された子宮内膜病変の蛍光顕微鏡検査により、腹膜腔内で明確に同定できます。(C) 子宮内膜病変の代表的な蛍光顕微鏡画像。黄色い蛍光はCy5.5信号を示し、核はDAPIで染色されました。(D) 子宮内膜病変の代表画像。矢印はCy5.5の染料ドープシリカナノ粒子を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

本研究では、マウスモデル35における子宮内膜病変の可視化に有用かつ効率的な方法として、Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子ベースのアプローチを導入します。この戦略は、そのシンプルさ、柔軟性、そして遺伝子に依存しない性質など、いくつかの利点を持ち、遺伝子組み換えのレポーター動物を生成する必要がなくなります。蛍光リポーターマウスモデルなどの従来の可視化手法と比較して、この方法は技術的な複雑さを軽減しつつ堅牢な標識効率を維持し、子宮内膜症研究へのアクセスを広げています。さらに、シリカナノ粒子は蛍光染料の組み込みと組織内での効率的な保持のための安定したプラットフォームを提供し、再現性のある病変同定を支援します。

子宮内膜病変を周囲の宿主組織と区別することは、マウスモデルにおける疾患の発症と進行の研究に不可欠です。 Rosa26mTmG レポーターマウスは、特定の標的組織でCre媒介切除後に膜標的緑色蛍光タンパク質(mT)に変換される膜標的タンデム二量体トマト蛍光タンパク質(mT)を遍在的に発現します。子宮内膜症の遺伝子機能を調査するために多くのトランスジェニックマウスモデルが利用可能ですが、蛍光リポーター動物の生成は労力と時間の要約が大きいです。これに対し、Cy5.5染料ドープシリカナノ粒子を用いた 生前 標識は、病変の可視化において迅速かつ柔軟かつ非遺伝的な代替手段を提供しつつ、既存のマウスモデルの幅広い互換性を保ちます。

このプロトコルの成功した実装は、いくつかの重要な実験パラメータの慎重な制御に依存しています。ナノ粒子合成中、触媒濃度、溶媒組成、TEOS添加率、混合条件、洗浄効率は粒子のサイズ、蛍光強度、標識の再現性に直接影響します。シュテーバー法は、粒子サイズと安定染料の取り込みを正確に制御し、蛍光シリカナノ粒子を合成するためのシンプルで拡張性が高く再現性のあるアプローチを提供します。38,39,40,41。逆マイクロエマルジョン法と比較して、シュトーバー法は界面活性剤関連の精製課題を最小限に抑えつつ、Cy5.5蛍光を温和な反応条件下で保持します。反応条件39,40,41,42です。触媒濃度を上げると一般的に粒子サイズは40、一方でTEOS付加速度が速くなると核生成が促進され、粒子は小さくなります。未反応試薬を除去し、保管中のナノ粒子の安定性を向上させるためには、徹底的な洗浄が不可欠です。

再現可能な 生前外 組織標識と病変確立を達成するためには、いくつかの追加要素が重要です。均一な子宮組織断片サイズ、均一なナノ粒子分散、一貫した培養条件により、標識効率が向上し、実験の変動性が低減されます。標識されていない対照組織を並行して処理することは、真のCy5.5蛍光と組織の自己蛍光および非特異的な背景信号を区別するためにも不可欠です。病変誘導時、ドナーマウスの一貫したホルモンプライミング、標識組織断片の優しい移植、適切な術後ケアにより、組織外傷や非特異的炎症を最小限に抑え、病変形成の再現性が向上します。

これらの利点にもかかわらず、いくつかの制限を考慮する必要があります。蛍光信号の体内 での 持続性と安定性は、着床後の組織の再形成、細胞増殖、免疫介在のクリアランスにより変動することがあります。外因性蛍光標識として、標識細胞の分裂に伴いCy5.5シグナルは徐々に減少すると予想されており、長期的な縦断研究の実現可能性を制限する可能性があります。さらに、組織の準備やナノ粒子の取り込みの変動が実験間の標識効率に影響を与える可能性があり、標準化された実験手順の重要性を強調しています。

本研究は体外病変検出に焦点を当てていますが、Cy5.5は組織の自己蛍光を最小限に抑え、光子をより深く浸透させることを可能にする遠赤外線/近赤外線蛍光染料です。これらの光学的特性により、Cy5.5は生体内イメージング応用に適しています。したがって、高量子収率のCy5.5染料ドープシリカナノ粒子標識戦略は、近外赤外蛍光および光音響イメージングを用いた非侵襲的な縦断病変追跡の堅牢なプラットフォームを提供します43,44。

今後の研究は蛍光の耐久性向上と実験条件下での標識一貫性のさらなる最適化に焦点を当てるべきです。シグナル保持の体系的な評価は、縦断的研究における最適なイメージングウィンドウの定義に役立ち、ナノ粒子設計や標識条件の継続的な改良により感度が向上し、他の疾患モデルへの適用可能性を拡大する可能性があります。総じて、このナノ粒子ベースの戦略は、子宮内膜病変の可視化において遺伝的ラベル付けアプローチに代わる迅速かつ再現性があり、汎用性のある代替手段を提供し、機序的研究や診断・治療戦略の前臨床評価を促進するはずです。

開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究はユーニス・ケネディ・シュライバー国立児童健康人間発達研究所(NICHD)(T.K.およびJ.W.J.R01HD108895)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン (APTES)Sigma-Aldrich440140純度 ≥99%
17&ベータ;エストラジオールMilliporeSigmaE8875純度 ≥98%
アンモニウム水Fisher ScientificA669S-50028% アンモニウム水溶液
BD オートクリップ創閉システムBD427631外科用創閉クリップ
透明ガラスねじ付きバイアルFisherbrandFS60910A-311.1 mL 透明ガラスバイアル
シアニン 5.5 NHS エステルSigma-AldrichGEPA15502近赤外蛍光色素
エタノール、無水Fisher ScientificBP2818分子生物学グレード
胎児ウシ血清 (FBS)Gibco16000044細胞培養補充剤
高速遠心機Beckman Coulter Life SciencesAvanti J-E高速遠心機
インビボイメージングシステムPerkinElmerIVIS Spectrum蛍光イメージングシステム
イソフルランBaxterNDC1001-9-360-60吸入麻酔薬
磁気撹拌バーFisherbrand14-513-648 mm
磁気撹拌プレートChelmsfordSP88854200可変速磁気撹拌器
冷蔵遠心機Eppendorf5427 RFA-45-48-11 ローター付き
RPMI-1640 培養液Gibco11835-030細胞培養培地
ゴマ油MilliporeSigmaS3547エストラジオール製剤の車両
テトラエチルオルトシリケート (TEOS)Sigma-Aldrich86578純度 ≥99%
トリエチルアミン (TEA)Sigma-AldrichT0886純度 ≥99%
超音波浴槽FisherbrandCPX1800Hナノ粒子の超音波分散用

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