哺乳類細胞における蛍光顕微鏡によるミトコンドリアClpXPの蛍光ペプチジル阻害剤標的化の実証

サマリー

このプロトコルは、共焦点顕微鏡を用いて蛍光ペプチジルClpP阻害剤FAM-FAPAL-CMK(カルボキシフルオレセイン-FAPAL-クロロメチルケトン)がミトコンドリアに選択的に局在し、ClpP阻害によってミトコンドリアに現れる形態変化を監視する定量イメージングワークフローを確立します。

要約

ミトコンドリアATP依存性プロテアーゼは、損傷または誤った折りたたみタンパク質の分解を通じてタンパク質の恒常性を維持するために不可欠です。その中で、ClpXPプロテアーゼ複合体はミトコンドリアマトリックスに位置し、生理的およびストレス条件下でのミトコンドリア品質管理に寄与しています。本研究は、蛍光ペプチジル阻害剤FAM-FAPAL-CMKのミトコンドリア標的化を評価する定量的蛍光顕微鏡のワークフローを示し、哺乳類細胞におけるClpXP阻害に関連するミトコンドリア形態変化を評価することである。HeLa細胞はFAM-FAPAL-CMKで処理され、ミトコンドリアマーカーの免疫蛍光染色および定量画像解析を組み合わせた共焦点顕微鏡で解析されました。コスト閾値測定とマンダースの重なり係数を用いた共局在解析により、阻害剤シグナルのミトコンドリア富集が示されました。その結果、ClpPの阻害はミトコンドリアの形態を変化させました。免疫ブロット解析では阻害剤治療後のClpPタンパク質の存在比に有意な変化は認められませんでした。本研究は、酸化ストレスなどの恒常性の乱れに応じて、完全な細胞内のミトコンドリアClpXP機能を検証できる再現可能な画像ベースのワークフローを説明しています。

概要

ミトコンドリアATP依存性プロテアーゼはタンパク質の恒常性の中心であり、誤った折りたたみや損傷したタンパク質1,2,3,4,5,6を分解します。その中でも、ClpXPはミトコンドリアマトリックス内に位置するヘテロオリゴマー質のAAA+プロテアーゼ複合体です。ClpX ATPaseはタンパク質を認識し展開し、それらをClpPプロテオリシスチャン^バー7,8,9に転座させます。他のミトコンドリアプロテアーゼとともに、ClpXPは正常およびストレス条件下、酸化ストレスや代謝の乱れ(^1,2,4)の両方でタンパク質の品質管理を維持します。ミトコンドリアタンパク質の恒常性の破壊は神経変性やがんなどの疾患と関連しており、これらのプロテアーゼ活性を理解することの重要性を強調しています。

この分野における大きな課題は、完全な細胞内で空間分解能を持つミトコンドリアプロテアーゼ活性を直接監視する方法が不足していることです。既存の手法は主に精製タンパク質や細胞溶解液を用いた生化学的アッセイに依存しており、詳細な動態情報を提供するものの、細胞内文脈を保持しない11,12,13,14。化学生物学的戦略は、フッ素生成ペプチド基質や有効部位指向阻害剤の開発によってこの制限に部分的に対処してきました。蛍光ペプチジル基質はATP依存性ペプチダーゼ活性の定量的測定を可能にし、一方でペプチジル阻害剤はプロテオリティック部位と可逆的な共有結合相互作用を形成し、選択的阻害13,15,16,17,18,19を実現します。これまでに、研究室で合成されたClpXP阻害剤FAPAL-CMKはClpP²⁰と共有結合を形成することが示されています。本研究では、FAPAL-CMKの蛍光標識誘導体であるFAM-FAPAL-CMKが、ClpPの機構に基づく阻害剤として開発され、その細胞内局在の可視化が可能になりました。

生化学的アッセイと比較して、共焦点蛍光顕微鏡法は、溶解液だけでは得られない情報を、完全な細胞におけるプローブ分布やミトコンドリア形態を空間的に解析的に評価することを可能にします。しかし、酵素アッセイとは異なり、蛍光局在は触媒活性や分子結合イベントを直接測定するものではなく、プローブの取り込み効率、ミトコンドリアの動態、イメージング条件の影響を受けることがあります。さらに、成功する実装は十分なプローブ蓄積と十分に解消されたミトコンドリアネットワークに依存しており、このワークフローは明確に区別可能なミトコンドリア形態を持つ付着培養細胞に最適です。

本研究の目的は、メカニズムベースの蛍光プローブと共焦点顕微鏡を統合し、未保存細胞におけるミトコンドリアプロテアーゼの局在と機能を監視する定量的ワークフローを確立することです。選択的化学プローブと高解像度共焦点イメージングを組み合わせることで、このワークフローは、完全な細胞におけるミトコンドリアの局在、プローブ分布、形態学的応答の評価を可能にします。既存のプロテアーゼ活性を直接測定する生化学的アッセイを補完できますが、空間分解能は乏しいです。

プロトコル

市販のHeLa細胞を用いて実験が行われました。人間の参加者、脊椎動物、または主要なヒトまたは脊椎動物由来の生物材料は使用されませんでした。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 細胞培養と処理

1. 5%_CO2を含む加湿インキュベーターで、37°Cで10%胎児用牛血清(FBS)を補足したDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中のHeLa細胞を培養します。
2. 細胞を無菌ガラスのカバースリップにプレートし、24時間培養して細胞の付着を許可します。
3. 阻害剤FAM-FAPAL-CMKをDMSOに溶かし、50μMのストックを準備し、-20°Cで凍結して保存します。
4. 処理された細胞サンプルの細胞培養培地に50 nM FAM-FAPAL-CMKを加えます。
5. 抑制剤処理試料の最終溶媒濃度に等量のDMSOを加え、DMSOによる影響がないようにします。
6. 同じ培養条件下でさらに18時間培養し、その後下流処理に移ります。
   注:FAM-FAPAL-CMK 阻害剤は実験室で設計・合成されており、合成法はこれまで^に20回報告されています。

2. 固定と透過化

1. 細胞をあらかじめ温めておいたD-PBSで5分間洗浄し、これを1回繰り返します。
2. 室温で15分間、PHEMバッファー(68 mM PIPES、25 mM HEPES、15 mM EGTA、3 mM MgCl₂、pH 6.9)を用いて固定します。そのバッファーには2.4%(v/v)、グルターアルデヒド0.05%(v/v)、0.5%(w/v)サポニンが含まれています。
3. 新鮮なホウ水素化ナトリウム溶液(D-PBSで5 mg/mL)を準備します。
4. 細胞を室温で15分間ホウ化ナトリウム溶液で培養し、残留グルターアルデヒドを中和します。
5. 染色前にD-PBSで細胞を3回、それぞれ5分間洗浄します。
   注:ホルムアルデヒドとグルターアルデヒドは有毒な固定剤です。フード内で固定作業を行い、適切な個人用防護具(手袋、白衣、目の保護具)を着用してください。ホウ化ナトリウムは反応性還元剤であり、慎重に取り扱う必要があります。ホルムアルデヒド、グルターアルデヒド、サポニンを含むPHEMベースの固定バッファーが選択され、免疫染色時に抗原の利用性を維持しつつミトコンドリア形態を保持しました。ホルムマルデヒドとグルターアルデヒドは構造保存のためのタンパク質架橋を提供し、PHEMの緩衝組成とpHはミトコンドリア^超構造の安定化に寄与します。サポニンは膜の透過を促進し、固定液の浸透速度を向上させます。この固定戦略はミトコンドリアネットワークの歪みを最小限に抑え、特にミトコンドリア形態の定量的解析に適しています。

3. 免疫蛍光染色

1. 室温でブロッキングバッファーに1時間ブロック細胞を置き、3%(w/v)牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4)を0.1%(v/v)Triton X-100で使用しました。
2. 一次抗体を遮断バッファーで希釈した細胞を室温で1時間培養します。マウス用anti-TOMM20(1:500)とラビット用anti-ClpP(1:500)を使います。
3. 細胞をPBSで3回、各5分間洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。
4. 室温で2次抗体をブロッキングバッファーで希釈した細胞を1時間培養します。CF405S結合マウス二次抗体(1:500)とAlexa Fluor 647結合ウサギ二次抗体(1:500)を使用します。
5. 二次抗体培養中およびその後、サンプルを光から保護します。
6. ステップ3.3を繰り返します。
7. マウントカバースリップをガラススライドに取り付けるためのマウンティングメディアを使っています。
   注:ClpPおよびTOMM20はFAM信号とのスペクトル重なりを避けるため、405nmおよび647nmで可視化されました。

4. 画像取得

1. 高開口油浸入対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得します。
2. 405nmおよび633nmのレーザーラインを用いて蛍光色素を励起します。適切な二色性ビームスプリッターを使用して励起光を反射し、蛍光を検出器に伝達します。
3. ピクセルサイズを35.3 nm(X, Y)に、Zステップを0.1 μmに設定し、ミトコンドリア構造の十分な軸方向サンプリングを確保します。
4. 1900×1900ピクセル(X, Y)のフレームサイズの画像を取得し、上部ミトコンドリア信号からミトコンドリア信号の下までZスタックあたり5つの光学断片を収集し、主要なミトコンドリア信号を確実に収集します。
   注:代表的な顕微鏡取得設定は 補足図1に示されています。HeLa細胞の場合、ミトコンドリアは通常直径約0.5〜1μmの細い管状構造^です。したがって、0.5μmのZ体積は個々のミトコンドリアマトリックスのかなりの割合を捕捉するのに十分ですが、必ずしも細胞全体を捉えるわけではありません。細胞イメージング中の運動関連アーティファクトを最小限に抑えるために、ミトコンドリア構造の十分なサンプリングと迅速な画像取得のバランスを取るために、5セクションのZスタックが選ばれました。

5. 生細胞処理と画像診断

1. HeLa細胞を35mmガラス底皿でDMEMで培養し、10% FBSを37°Cで加湿インキュベーター(_CO25%を含む加湿インキュベーター)で培養します。
2. シードから24時間後に阻害剤(最終濃度:50 nM)または同等量のDMSOを細胞に加えます。標準培養条件下でさらに18時間細胞を培養します。
3. 阻害剤またはDMSOを含む培地を取り出し、予備温めたD-PBSで5分間細胞を一度洗い流します。
4. 20 nM MitoTracker DeepRedを含む生細胞イメージング液を追加します。
5. 上記の顕微鏡設定を用いて室温でライブセルイメージングを行います。1フレームスキャンモードで画像を取得可能で、光学セクションあたり約4.72秒(5セクションZスタックあたり約24秒)で撮影します。
   注:1つのZスタックにつき5つの光学セクションが設置されており、十分なミトコンドリア構造のサンプリングと管理可能な取得時間をバランスさせることができます。さらに、室温のライブセルイメージングソリューションを用いて、37°Cでの撮影に比べてミトコンドリア運動性を低減します。 生細胞イメージング中のミトコンドリアの動きは共局在測定のばらつきに寄与することがありますが、すべてのサンプルで一貫した取得設定を用いることで、系統的バイアスを減らすのに役立ちます。代表的なソフトウェア設定は 補足図2に示されています。

6. ミトコンドリア形態解析

1. Fiji²³で画像ファイルを開き、Zスタックから最大強度の投影を生成するには、Zプロジェクト→→画像スタック画像を選択し、最大強度を選択します。
2. 画像→→「しきい値を調整」にナビゲートし、しきい値オプションから「Otsu」を選択してOtsuを適用してください。閾値をセグメントミトコンドリアに適用します。
3. Mitochondria Analyzerプラグイン²⁴ を実行し、2D解析モードをミト単位で選択してください。
4. ミトコンドリア解析装置の出力を使ってミトコンドリアの大きさ(面積)と周囲を測定します。
5. ミトコンドリア形状因子の値はミトコンドリアアナライザーの出力から直接取得します。フォームファクター^はP2/(4πA)として計算され、Pは周囲、Aは面積を表します。
6. プラグイン内のネットワーク解析機能を用いて、ミトコンドリアの連結性を評価するためにミトコンドリアごとの総枝長を測定します。
7. データを、3つの独立した生物学的複製にまたがる各条件あたり30個の細胞から導き出された平均値とともに、個々のミトコンドリア測定値の分布として提示します。
8. 統計解析ソフトウェアでウェルチの t検定 を用いて統計的有意性を評価します。

7. 共局在解析

1. フィジーで画像ファイルを開き、3D画像スタックから最大強度の2D投影を生成できます。一貫性を保つために、すべてのサンプルを同じ予測と取得戦略で分析してください。
2. 画像→カラー→分割チャネルを選択して蛍光チャンネルを分割できます。
3. Coloc 2プラグインを起動するには、Coloc 2→→Plugins共ローカリゼーションを選択してください。
4. 適切な解析チャネルを割り当て、プラグイン設定でコストの閾値回帰を有効にしてください。分析は細胞ごとに実行してください。
5. マンダースの重なり係数(M1およびM2)を記録し、各チャネルで空間的に一致する信号の割合を評価します。
6. Coloc 2の設定でCostesランダム化を有効にし、ランダム化の数を50に設定して統計的有意性を評価します。

8. 細胞分解液生成

1. HeLa細胞をDMEMに10% FBSで播種し、5%_CO2の加湿インキュベーターで37°Cで培養します。
2. シードから24時間後に細胞に50 nM阻害剤または同等のDMSOを添加し、標準培養条件下でさらに18時間培養します。
3. 培地を取り出し、予め温めたD-PBSで細胞を5分間洗い流し、トリプシン化して剥離します。
4. トリプシン化を新鮮な細胞培養培地で冷却し、室温で300 x g で遠心分離機で3分間処理します。上清液は捨てる。
5. 細胞ペレットをD-PBSに再懸浮させ、300 x g で遠心分離機で3分間細胞を洗浄します。上清液は捨てる。
6. 細胞ペレットを予備冷却済みのリシスバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM 塩化ナトリウム、0.1% SDS、0.5% デオキシコールレートナトリウム、2% CHAPS、10 mM TCEP、1 mM PMSF、1x プロテアーゼ阻害カクテル)に再懸浮させます。
7. 氷上で20分間溶解液を培養し、氷水浴で2分間ソニック酸分解して完全な溶解を確保します。
8. 遠心分離機は13,000 x g、4°Cで20分間溶解します。
9. クリアした上清液を新しい予備冷却チューブに移し、下流の分析を行います。
   注意:PMSFは有毒であり、適切な個人用防護具を着用してフルームフードで取り扱うべきです。SDSは刺激物であり、超音波検査は熱やエアロゾルを発生させます。氷上で溶解および超音波検査を行い、施設の安全ガイドラインを遵守してください。

9. ブラッドフォード分析

1. 0.15 M塩化ナトリウムのBSAを用いて標準溶液を準備します。濃度は以下の通りです:0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL。
2. 未知の細胞を0.15 M塩化ナトリウムに50倍および100倍ずつ希釈します。
3. ピペットは標準曲線溶液と未知のサンプルを96ウェルプレートに複製します。
4. 各井戸にブラッドフォード試薬を加えます。各ウェルごとに、160μLのタンパク質溶液と40μLの5倍ブラッドフォード試薬(市販)を使用します。ピペッティングで優しく混ぜます。
5. プレートを室温で10分間インキュベートし、プレートリーダーを使って595 nmの吸収を測定します。
6. BSA濃度をx軸にプロットし、595nmの平均吸収をy軸にプロットして標準曲線を作成します。
7. 標準曲線を使ってサンプルのタンパク質濃度を決定します。計算値に希釈係数を掛けて元の濃度を得ます。

10. 免疫ブロッティング

1. 12%ポリアクリルアミドゲルに同量の細胞溶解液を積み込み、SDS-PAGEによってタンパク質を分離します。
2. PVDF膜をエタノールに短時間浸すことで活性化します。転送バッファー内の膜とブロッティングペーパーの両方を平衡にしてください。
3. ゼミドライトランスファーシステムを用いてゲルからPVDF膜へタンパク質を移します。
4. 膜を5%(w/v)無脂肪ドライミルクをTBS(20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.6)に浸し、室温で1時間優しく攪拌しながらブロックします。
5. 一次抗体を室温で薄めた一次抗体をブロッキングバッファーで1時間、穏やかに攪拌しながら培養します。ウサギ用抗ClpP薬(1:2000)とマウス抗ベータアクチン薬(ACTB、1:10,000)を使用してください。
6. 膜をTBST(20 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% (v/v) Tween 20、pH 7.6)で3回洗い、1回の洗浄で5分間洗浄し、結合していない抗体を除去します。
7. HRP結合の二次抗体をブロッキングバッファー(1:3000)で希釈させ、室温で1時間、穏やかに攪拌してインキュベートします。
8. 洗う工程を繰り返します。
9. 化学発光検出試薬を用いてタンパク質バンドを検出します。

11. デンシトメトリック解析

1. フィジーで西欧の染み画像を開いてください。
2. 画像タイプを8ビットに変更するには、 画像 → タイプ → 8ビットにしてください。
3. Processで画像の背景を差し引く→背景を差し引く。背景が明るいものを確認し、ローリングボールの半径を50.0ピクセルに設定してください。
4. 長方形ツールで最初のレーンでバンドを丸で描き、次に 「分析 」→ ゲル を選択し→ 「最初のレーン」を選択します。
5. 長方形ツールを2つ目のレーンに移動し、「解析」→ゲルを選択し→「次のレーン」を選択します。このステップを繰り返して、すべてのレーンが選択されるまで続けます。
6. →ゲル→プロットレーンを分析して帯域密度をプロットします。
7. 直線ツールでバンド密度ピークの下部に線を描き、ワンドツールでバンド密度を読み取ります。
8. 同じ手順を11.1–11.8の手順をロードコントロールブロット画像で繰り返します。
9. 相対バンド密度は密度(ClpP)を密度(ACTB)で割って報告します。

結果

ClpP阻害はミトコンドリアの形態とネットワーク組織を変化させます
ClpP阻害がHeLa細胞内のミトコンドリア組織を変化させるかどうかを判断するために、ミトコンドリア形態が評価されました。代表的な蛍光画像では、対照群とFAM-FAPAL-CMK処理細胞間でミトコンドリア組織に明確な違いが見られました(図1A)。定量解析の結果、ミトコンドリア面積は対照細胞で1.15±4.8μm^²(n=80¹³)から、阻害剤処理後±0.47μm^²(n=8516)に減少しました。この減少には、阻害時にミトコンドリア周囲長が8.1±20μmから4.6±6.4μmに減少しました(図1B,C)。さらに、ミトコンドリアの形状ファクターは対照細胞で5.9 ± 7.8から処理細胞では4.3 ± 3.6に減少し、抑制

ディスカッション

ペプチジルクロロメチルケトンFAPAL-CMK¹⁵は、ミトコンドリアATP依存性プロテアーゼClpXPのプロテアーゼサブユニット(ClpP)の不可逆的な阻害剤として示されています。動態実験では阻害剤の効力と作用機序が示されましたが、in vitroアプローチでは、FAPAL-CMKが未破の細胞で選択的ミトコンドリアClpP阻害剤として有効かどうか評価できませんでした。蛍光共焦点顕微鏡により、FAM-FAPAL-CMKはClpPが存在するミトコンドリアに選択的に局在していることが確認されました。ミトコンドリア局在だけでは直接的な標的結合を確立できないため、共局在測定値は共有結合の直接的な証明ではなく、ClpP局在と一致するミトコンドリア富集の証拠として解釈されます。FAM-FAPAL-CMKは他のミトコンドリアATP依存性プロテアーゼLonと反応しなかったため、FAM-FAPAL-CMKのミトコンドリア局在は、蛍光阻害剤がClpPのプロテオリティック残基に共有結合していることに起因するとしか考えられません。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3