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研究記事

ラットにおける小胞体ストレスに関連したクロピドグレル誘発性胃粘膜傷害

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DOI:

10.3791/72097

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2026年8月28日

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1Gastroenterology Department, Dagang Hospital of Binhai New Area, 2Clinical Laboratory, Tianjin Adicon Clinical Laboratories Co., Ltd.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、ラットおよび胃上皮細胞におけるクロピドグレル投与に伴う胃粘膜損傷を調査し、小胞体ストレスに関連する分子変化、アポトーシス、および全身性炎症との関連性を明らかにします。

要約

クロピドグレルは、動脈血栓性疾患の予防および治療のための抗血小板剤として広く使用されていますが、胃粘膜損傷を含む胃腸管への副作用により、その臨床応用が制限される可能性があります。上皮細胞の生存は胃粘膜の完全性を維持するために不可欠であるため、私たちはクロピドグレル誘発性の胃上皮損傷に、小胞体（ER）ストレスおよびアポトーシス関連マーカーの変化が伴うという仮説を立てました。この仮説を検証するため、ヒト胃上皮細胞株GES-1に異なる濃度のクロピドグレルを処置し、Cell Counting Kit-8 (CCK-8) アッセイ、フローサイトメトリー、定量リアルタイムPCR (qRT-PCR)、およびウェスタンブロッティングを用いて、細胞生存率、アポトーシス、細胞周期分布、および分子変化を評価しました。並行して、Sprague-Dawleyラットにクロピドグレルを経口投与し、in vivo 胃損傷モデルを作製しました。胃粘膜の病理学的変化をヘマトキシリン・エオジン染色により評価し、血清炎症性サイトカインレベルを酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) で測定しました。その結果、クロピドグレルはGES-1細胞の生存率を低下させ、アポトーシスを促進し、細胞周期の進行を変化させました。ラットでは、クロピドグレルにより胃粘膜のびらん、浮腫、および炎症細胞浸潤が誘発され、血清中のinterleukin (IL)-1β、IL-6、およびtumor necrosis factor-α (TNF-α) レベルの上昇が認められました。また、クロピドグレルは胃組織およびGES-1細胞の両方において、ERストレスマーカーであるC/EBP homologous protein (CHOP) およびactivating transcription factor 5 (ATF5) の発現を増加させ、Bcl-2-associated X protein (Bax) の発現を増加させ、B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) の発現を減少させ、Bax/Bcl-2比を上昇させました。これらの知見は、本研究においてERストレスからミトコンドリアアポトーシスに至る直接的な因果経路は立証されなかったものの、クロピドグレル誘発性の胃粘膜損傷が、ERストレス関連マーカーの発現増加およびBax/Bcl-2バランスの崩壊に関連していることを示唆しています。

概要

上皮細胞、免疫細胞、およびシグナル分子から構成される胃粘膜の自然免疫および獲得免疫系は、相互に作用して粘膜の完全性を維持し、有害因子に対する重要な生理学的バリアとして機能している1,2。この保護機能は胃腸のホメオスタシスに不可欠であり、その破綻は胃炎を含む胃疾患の発症に寄与し得る3。臨床的に、薬剤誘発性の胃粘膜損傷は一般的な合併症であり、非ステロイド性抗炎症薬や抗血小板薬が最も頻繁な原因となっている4。胃粘膜の完全性は、細胞増殖とアポトーシスの動的なバランスに依存している5。薬剤を含む環境因子に慢性的に曝露されると、このバランスが崩れてアポトーシスが促進され、粘膜損傷が引き起こされる可能性がある6,7。小胞体は、細胞内ホメオスタシスの維持において中心的な役割を果たす。細胞ストレス条件下では、ミスフォールドまたはアンフォールドタンパク質の蓄積により、PERK/eIF2α/ATF4/CHOPシグナル伝達を含む小胞体ストレス応答（UPR）が活性化され、これがアポトーシスを促進し、B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ファミリータンパク質の発現を変化させる可能性がある8。ATF5もまた、ミトコンドリアストレス応答およびミトコンドリア機能不全と小胞体ストレスとのクロストークに関与している9。最近の臨床的エビデンスでは、クロピドグレルを含む抗血小板療法の継続が、進行性の胃および小腸粘膜損傷に関連していることが示されている10。

クロピドグレルは広く処方されている抗血小板薬であり、代謝的に活性化された後に血小板のP2Y12受容体に不可逆的に結合し、それによってアデノシン二リン酸介在性の血小板凝集を抑制し、抗血栓効果を発揮します11。このバイオアクティベーションは、主に肝臓のシトクロムP450酵素によって行われます。したがって、培養した胃上皮細胞にクロピドグレルの親化合物を直接曝露させても、in vivoにおけるクロピドグレル治療の完全な代謝および薬物動態的背景を再現することはできません。しかし、クロピドグレル治療が再発性胃潰瘍や胃腸出血に関連している可能性を示す根拠が増えており、抗血栓効果と胃腸の安全性のバランスを維持することの重要性が浮き彫りになっています12,13,14。これらの副作用は報告されていますが、クロピドグレルに関連する胃粘膜損傷の根底にあるメカニズムは十分に解明されておらず、標的を絞った予防および治療戦略の開発を制限しています。本研究では、Sprague–DawleyラットおよびGES-1細胞を用いて、クロピドグレルが胃粘膜に及ぼす影響を調査しました。ラットには経口ゾンデでクロピドグレルを投与し、相補的なin vitro実験をGES-1細胞を用いて実施しました。クロピドグレル誘発性の胃粘膜損傷が小胞体ストレスおよびアポトーシスに関連しているかどうかを調べるため、組織病理学的、分子生物学的、および細胞学的解析を行いました。したがって、本研究では因果関係のあるシグナル伝達経路の構築よりも、クロピドグレル誘発性胃損傷に関連する分子変化の特性評価に焦点を当てました。我々の知見は、クロピドグレル誘発性胃粘膜損傷に関連する分子変化についてさらなる洞察を提供し、これらの副作用の予防および管理を目的とした今後の研究に寄与する可能性があります。

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プロトコル

すべての動物実験手順は、Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd.の動物実験倫理審査委員会によって審査および承認されました。本研究は、実験動物の飼育および使用に関する施設ガイドラインに従って実施されました。動物倫理承認番号はDRK-20251015210です。

動物および細胞株

倫理承認により、SPFグレードのSprague–Dawleyラット20匹の使用が認められた。本研究では、実験開始時に体重280–300 g、日齢6–8週のSPFグレードのSprague–Dawleyオスラット計12匹を用いた。ラットはHangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（中国、杭州；製造ライセンスNo. SCXK [Zhejiang] 2024-0004）から購入し、対照群とクロピドグレル投与群に各6匹ずつランダムに割り当てた。ラットは、温度約22°C、12時間の明暗サイクルに制御された環境下で飼育し、標準飼料および滅菌飲料水を自由的に摂取させた。すべてのラットを実験前に1週間馴化させた。硫酸クロピドグレルを0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC-Na）に0.781 mg/mLの濃度で懸濁した。クロピドグレル投与群のラットには、硫酸クロピドグレルを10 mL/kg体重（体重100 gあたり1 mLに相当し、用量は7.81 mg/kg）の量で、3日間連続して1日1回経口投与した。対照群のラットには、同量の0.5% CMC-Naを投与した。投与量および3日間の投与期間は、既報のクロピドグレル経口投与によるラット短期モデルに基づいて選択した。3日目の最終投与後、水はad libitumで与えたが、飼料は12時間絶食させた。ラットを導入チャンバー内で酸素中の3%イソフルランにより麻酔し、その後ノーズコーンから1.5%–2.0%のイソフルランを投与して麻酔を維持した。角膜反射および足底逃避反射の消失により、十分な麻酔深度を確認した。深い麻酔下で心穿刺により採血を行った。深い麻酔状態を維持したまま、放血および両側開胸により安楽死させた。自発呼吸および心拍の停止が少なくとも5分間続き、かつ角膜反射および足底逃避反射が消失していることで死亡を確認した。その後、速やかに胃を摘出し、大弯に沿って切開し、氷冷生理食塩水で穏やかに洗浄した。

ヒト胃粘膜上皮細胞株GES-1は、iCell Bioscience Inc.（中国、上海；Cat. No. iCell-h062）より入手し、サプライヤーによるショートタンデムリピート（STR）解析によって認証された。細胞は、10%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地を用い、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で培養した。実験には継代数3から10の早期継代細胞を用いた。細胞密度が約80%～90%に達した時点で、1:3の分割比で継代した。その後の実験には、対数増殖期の細胞を用いた。CCK-8アッセイでは、細胞を96ウェルプレートに6 × 103 cells/wellで播種した。アポトーシスおよび細胞周期解析では、細胞を6ウェルプレートに約5 × 105 cells/wellで播種し、クロピドグレル処理前に細胞を接着させた。

試薬および溶液

動物および細胞実験には、クロピドグレル硫酸塩（Cat. No. C874834; 純度 ≥ 99%）を使用した。クロピドグレルのストック溶液は、100 mg のクロピドグレル粉末をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して 1 M のストック溶液として調製した。このストック溶液を、使用前に必要な作業濃度までさらに希釈した。1 M のストック溶液を DMSO で連続希釈し、10, 100, 200, 400, 600, 800, および 1000 mM の濃度の 1000×投与溶液を調製した。処理の直前に、各 1000×投与溶液を完全培地に 1:1000 (v/v) の割合で添加し、最終的なクロピドグレル濃度をそれぞれ 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, および 1.0 mM とした。ビークル対照群には、クロピドグレルを含まない同容量の DMSO を投与した。これにより、すべての群において最終的な DMSO 濃度を 0.1% (v/v) に維持した。培養 GES-1 細胞では、肝臓のシトクロム P450 介在性のクロピドグレル生物学的活性化は再現されない。したがって、探索的な親化合物曝露モデルとして、クロピドグレルによる直接処理を用いた。濃度範囲は、実験条件下での濃度依存的な細胞応答を特徴づけるために選択したものであり、臨床的に達成可能な血漿または胃組織濃度と同等であると解釈されるべきではない。

細胞の継代

基礎培地にFBSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを添加して完全培地を調製した。細胞のコンフルエンスが約80%に達した時点で、培地を除去し、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を3回洗浄した。その後、トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を用いて細胞を約1–2分間消化した。細胞が一部剥離した後、完全培地を加えて消化を停止させた。細胞懸濁液を1,200 × gで3分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを1–2 mLの完全培地で再懸濁し、実験条件に応じて新しい培養皿に播種した。

CCK-8細胞生存率アッセイ

対数増殖期のGES-1細胞を、6 × 103 cells/wellの密度で96ウェルプレートに播種し、細胞を接着させるため一晩培養した。接着後、細胞を異なる濃度のクロピドグレル（0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, および 1.0 mM）で24時間処理した。対照群には、同濃度の溶媒を添加した。処理後、各ウェルにCCK-8溶液を加え、キットの説明書に従って37°Cでインキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて450 nmにおける吸光度を測定した。細胞生存率は対照群に対する割合（%）として算出した。濃度反応結果に基づき、その後のアポトーシス、細胞周期、qPCR、およびウェスタンブロット解析には、0.1 mMのクロピドグレルによる24時間の処理を選択した。

フローサイトメトリー解析

GES-1細胞を6ウェルプレートに播種し、細胞接着後に0.1 mMのクロピドグレルで24時間処理した。処理後、浮遊細胞および接着細胞の両方を回収した。接着細胞をEDTA不含のトリプシンで消化し、冷PBSで2回洗浄した後、バインディングバッファーに再懸濁した。メーカーの指示に従い、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kitを用いて細胞を染色した。室温・暗所でのインキュベーション後、RaiseCyte 2L6Cフローサイトメーターを用いてアポトーシス細胞を検出した。データはRaiseFlower解析ソフトウェアを用いて取得し、FlowJoソフトウェア（バージョン10.8.1）を用いて解析した。FlowJoソフトウェアを用いて、初期アポトーシス、後期アポトーシス、および総アポトーシス細胞集団を定量化した。

フローサイトメトリーによる細胞周期分布の解析

GES-1細胞を6ウェルプレートに播種し、0.1 mMのクロピドグレルで24時間処理した。処理後、細胞を回収してPBSで洗浄し、4°Cで予冷した70%エタノールで固定した。固定した細胞を洗浄して残留エタノールを除去した後、製造元の指示に従い、暗所でRNase Aおよびプロピジウムヨード染色液とともにインキュベートした。細胞周期分布をフローサイトメーターを用いて解析した。データは専用の取得ソフトを用いて収集し、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。細胞周期分布はWatsonモデルを用いてフィッティングし、G0/G1期、S期、およびG2/M期にある細胞の割合を算出した。

定量リアルタイムPCR (qPCR)

RNA抽出キットを用い、キットの説明書に従ってGES-1細胞およびラット胃組織サンプルから全RNAを抽出した。組織サンプルの場合、胃粘膜組織を迅速に採取し、低温条件下でホモジナイズした後、RNA抽出に供した。RNA濃度と純度は、260 nmおよび280 nmにおける吸光度を測定することで決定した。等量のRNAを、ゲノムDNA除去機能付きの逆転写キットを用いて相補的DNA（cDNA）に逆転写した。SYBR GreenベースのPCRマスターミックスを用いて定量リアルタイムPCRを行った。各反応は、10 µLの2×マスターミックス、1 µLのcDNA、0.4 µLのフォワードプライマー、0.4 µLのリバースプライマー、および8.2 µLのRNaseフリーddH₂Oを含む、合計20 µLの容量で実施した。サーマルサイクリング条件は以下の通りとした：95°Cで10分間の初期変性後、95°Cで10秒間の変性、60°Cで30秒間のアニーリング、72°Cで30秒間の伸長を40サイクル繰り返した。CHOP、ATF5、Bcl-2、およびBaxの発現レベルを測定した。内部標準遺伝子としてGAPDHを用いた。相対的遺伝子発現量は2−ΔΔCt法を用いて算出した。プライマー配列はSupplementary Table 1に記載している。

ウェスタンブロッティング

GES-1細胞およびラット胃組織サンプルから全タンパク質を抽出した。細胞サンプルの場合、処理後のGES-1細胞を冷PBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含むラジオ免疫沈降法（RIPA）溶解バッファーを用いて溶解させた。組織サンプルの場合、胃粘膜組織を低温条件下でRIPAバッファーを用いてホモジナイズし、遠心分離して上清を回収した。タンパク質濃度はBCAタンパク質定量法を用いて決定した。1レーンあたり合計20 µgのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。牛血清アルブミン（BSA）でブロッキングした後、膜をCHOP（1:1000）、ATF5（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、およびβ-actin（1:5000）に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、膜を対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（1:10000）でインキュベートした。タンパク質バンドは化学発光増強試薬を用いて可視化し、化学発光イメージングシステムでキャプチャした。バンド強度は画像解析ソフトウェアを用いて定量し、β-actinで標準化した。

組織病理学的評価

クロピドグレル投与後のSprague–Dawleyラットから胃組織サンプルを採取し、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。サンプルを脱水、透徹し、パラフィンに包埋した後、厚さ4 µmで切片を作成した。パラフィン切片をヘマトキシリン・エオジン染色した。粘膜の形態、上皮の完全性、浮腫、および炎症細胞浸潤に基づき、光学顕微鏡下で組織病理学的変化を定性的に評価した。代表的な画像を撮影した。組織学的スコアリングシステムは適用していない。

免疫組織化学

パラフィン包埋した胃組織切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的なエタノール系列を用いて再水和させた。クエン酸緩衝液を用いて熱誘起抗原賦活化を行った。3% 過酸化水素で10分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、室温で正常ヤギ血清を用いて30分間処理して非特異的結合をブロックした。その後、切片をCHOP、ATF5、Bcl-2、およびBaxに対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、切片を対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体とともにインキュベートした。免疫反応信号をDAB発色溶液を用いて可視化し、続いてヘマトキシリンで対比染色を行った。切片を脱水、透徹、封入し、光学顕微鏡下で観察した。代表的な画像を撮影し、画像解析ソフトウェアを用いて陽性染色領域を定量化した。

免疫蛍光染色

パラフィン包埋した胃組織切片を脱パラフィン化および親水化し、クエン酸緩衝液を用いて熱誘起抗原賦活化を行った。正常ヤギ血清で30分間ブロッキングした後、CHOP (1:50)、ATF5 (1:100)、Bcl-2 (1:50)、およびBax (1:200)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、対応する蛍光二次抗体 (1:500)を用いて室温・暗所で1時間インキュベートし、次いでDAPIで対比染色した。蛍光顕微鏡を用い、×200倍の倍率で画像をキャプチャした。各動物からランダムに選択した重複のない3つの視野をImage-Pro Plus 6.0を用いて解析し、蛍光強度はIOD/Areaとして算出した。1群あたり3匹の動物を解析に含めた。

酵素結合免疫吸着法 (ELISA)

処置後、Sprague–Dawleyラットから血液サンプルを採取し、室温で凝固させた。遠心分離により血清を分離し、分析まで−80°Cで保存した。IL-1β、IL-6、およびTNF-αの血清レベルを、キットの説明書に従ってELISAキットを用いて測定した。吸光度はマイクロプレートリーダーを用いて測定し、標準曲線に基づいてサイトカイン濃度を算出した。

統計解析

統計解析には統計解析ソフトウェアを使用した。データは平均値 ± SD で的に示す。正規性と分散の均一性は、それぞれ Shapiro–Wilk 検定および Levene 検定を用いて評価した。2群間の比較には Student の t 検定を用いた。多群間の比較には、一元配置分散分析の後、Dunnett のポストホック検定を行った。 P < 0.05 を統計的に有意であると見なした。すべての細胞実験は、少なくとも3回の独立した生物学的反復を用いて実施した。

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結果

クロピドグレルはGES-1細胞の生存率を低下させ、in vitroでアポトーシスを増加させる

まず、クロピドグレルがGES-1細胞の生存率およびアポトーシスに影響を与えるかどうかを検討した。CCK-8アッセイの結果、クロピドグレル処理によりGES-1細胞の生存率が有意に低下したことが示され（Figure 1A,B）、細胞生存率の減少が認められた。テストした濃度範囲全体で細胞生存率が低下したことに基づき、以降のすべての細胞実験には0.1 mMのクロピドグレルを24時間処理する条件を選択した。続いて、アポトーシスおよび細胞周期分布を分析するためにフローサイトメトリーを行った（Figure 1C–F）。フローサイトメトリー分析では、S期の細胞割合が増加し、それに伴いG0/G1期の集団が減少した一方、G2/M期の集団に明らかな増加は見られず、G2/M期停...

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ディスカッション

クロピドグレルは心血管疾患の予防および治療に広く用いられていますが、その臨床使用は、消化管潰瘍、出血、穿孔を含む出血リスクおよび胃腸管合併症と関連しています19。したがって、クロピドグレル誘発性胃傷害に関連する分子変化を理解することは、これらの副作用の予防および管理を改善するために重要です。本研究では、胃上皮細胞およびラット胃組織に対するクロピドグレルの影響を調査し、細胞生存率、アポトーシス、炎症反応、ならびにERストレスおよびアポトーシス関連マーカーの発現の変化を観察しました。これらの知見は、クロピドグレル誘発性の胃粘膜傷害が、ERストレスおよびアポトーシス関連マーカーの発現変化に関連していることを示唆しています。ただし、薬理学的なレスキュー実験や遺伝的な機能喪失実験は行われていないため、これらの知見はERストレスとアポトーシスの間の因果関係を立証するものではありません。

先行研究により、クロピドグレルが胃粘膜の修復を損ない、胃潰瘍の治癒を遅らせる可能性が示唆されている20。本研究にお...

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開示事項

利益相反：

著者らは、本研究で報告された内容に影響を及ぼしたと思われる競合する資金的利益や個人的関係がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、プロジェクト「クロピドグレル誘発胃粘膜上皮細胞アポトーシスにおけるCHOP/ATF5/Bcl-2シグナリング経路に関する基礎研究」（プロジェクト番号：2023BWKY009）の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キットElabscienceE-CK-A211アポトーシス検出キット
ATF5抗体Proteintech67066-1-AP一次抗体
BCAタンパク質定量キットSolarbioPC0020タンパク質濃度測定法
Bax抗体Proteintech50599-1-AP一次抗体
Bcl-2抗体Proteintech26593-1-AP一次抗体
β$\beta$-アクチン抗体Proteintech66009-1-Ig一次抗体
ブロッキング緩衝液BeyotimeP0252ウェスタンブロッティング用ブロッキング溶液
CCK-8 細胞計数キットKeyGen BiotechKGA317細胞生存率測定法
cDNA合成キットTransGen BiotechAU341ゲノムDNA除去機能付き第一鎖cDNA合成キット
細胞周期検出キットLianke BiotechnologyCCS012細胞周期解析キット
CHOP抗体Proteintech15204-1-AP一次抗体
硫酸クロピドグレル（純度 ≥99%)マックリンC874834試験薬
DAB発色キットBeyotimeP0201M免疫組織化学染色基質
ジメチルスルホキシド（DMSO）MedChemExpressHY-Y0320C溶媒
化学発光増強（ECL）試薬MeilunbioMA0186化学発光基質
牛胎児血清 (FBS)Gibco10099-141細胞培養サプリメント
GES-1ヒト胃上皮細胞株iCell BioscienceiCell-h062ヒト胃上皮細胞株
ヘマトキシリン・エオシン（H&E）&E) 染色キットBeyotimeC0105S組織学的染色
西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体ProteintechRGAM001/RGAR001二次抗体
過酸化水素溶液アブシンABS9333-100mL内因性ペルオキシダーゼブロッキング試薬
IL-1β ELISAキットMEIMIANMM-0047R2血清サイトカインアッセイ
IL-6 ELISAキット美眠MM-0190R2血清サイトカインアッセイ
マイクロプレートリーダー北京六一生物技術WD-2102B吸光度測定
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液SolarbioP1400抗生物質溶液
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)ServicebioG4202-500ML1× リン酸緩衝生理食塩水
ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜MilliporeIPVH00010ウェスタンブロット膜
一次抗体希釈液BeyotimeP0023A抗体希釈液
タンパク質分子量マーカーYeasenWJ103プレステインタンパク質ラダー
定量リアルタイムPCRマスターミックス（SYBR Green）CWBioCW3008qPCR試薬
放射免疫沈降法（RIPA）ライシスバッファーSolarbioR0010タンパク質抽出バッファー
RNase ALianke BiotechnologyCCS012細胞周期解析試薬
RPMI-1640培地ServicebioG4535-500ML基礎細胞培養基材
Sprague-Dawleyラット杭州資源実験動物技術有限公司該当なしSPFグレード
TNF-α ELISAキット美眠MM-0180R2血清サイトカイン測定法
全RNA抽出キットTransGen BiotechER501-01RNA抽出キット
トリプシン-EDTA溶液SolarbioT1300細胞解離試薬

参考文献

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