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方法論記事

定量画像解析を用いた肺組織における弾性繊維プロファイリング

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DOI:

10.3791/72114

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2026年8月4日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

この記事について

サマリー

ここでは、マウス肺組織における弾性繊維の可視化と定量的プロファイリングのための組織準備に関するプロトコルを紹介します。この手法により、生理学的および病理学的条件下で組織構造、空間繊維の組織構造、細胞外マトリックスの再構築を強固に評価することが可能になります。

要約

肺細胞外マトリックス(ECM)の再構築は、肺損傷や疾患の重要な特徴です。弾性線維は肺ECMの中心的な構成要素であり、正常な呼吸機能に必要な弾力性と反動を提供しますが、その破壊は組織力学の障害に寄与します。このプロトコルは、弾性繊維の可視化と定量的プロファイリングに焦点を当てた、マウス肺組織の調製および解析のための堅牢で再現可能なワークフローを説明しています。エラスチン構造を保存・検出するための最適化された組織処理および組織学的染色法を概説しています。さらに、このプロトコルは、肺内の弾性繊維の存在量、組織、空間分布を定量的に評価できる画像解析パイプラインを詳細に示しています。ワークフローはさらに、QuPathでのステインベクトル推定、Fiji/ImageJでのカラーデコンボリューション、TWOMBLIベースの画像解析を取り入れ、弾性繊維の豊富さ、分岐、ネットワーク複雑度の定量的評価を可能にします。画像取得、関心領域選択、パラメータ最適化、品質管理の戦略が含まれ、再現性を確保しユーザー依存のバイアスを最小限に抑えます。このワークフローを用いて、肥満マウスの肺における弾性繊維組織とネットワーク構造の変化を成功裏に特定し、疾患関連のECM再構築の検出に応用できることを示しました。これらのアプローチは、生理学的および病理学的条件下で弾性繊維リモデリングと組織構造への貢献を調査するための包括的な枠組みを提供します。この方法は線維芽細胞駆動の構造変化の研究を促進し、肺疾患の基礎となるECM変化のメカニズム的知見を支援します。

概要

弾性繊維は肺細胞外マトリックス(ECM)の重要な構成要素であり、主にエラスチンと関連する微小線維タンパク質で構成され、高度に組織化された強靭なネットワークを形成します。肺では、弾性繊維が肺胞中隔や気管支周囲の構造に沿って配置されており、正常な呼吸力学に必要な弾性と反動を提供します1,2。肺、大動脈、子宮などの組織において最も豊富な構造的ECM成分の一つとして、その完全性は組織のコンプライアンスを維持するために極めて重要です1,2。線維症、肺気腫、慢性炎症性疾患など、さまざまな肺疾患において弾性繊維組織の乱れが観察されており、繊維構造の変化が肺機能や機械的特性の障害に寄与しています2,3。

肺マトリソームは最近解析され、コラーゲンやラミニンなどのコアECMタンパク質と、サイトカイン、ECM調節因子、ECM関連タンパク質(例:インテグリン配位子、ガレクチン)を含むマトリソーム関連成分が明らかになりました4,5。構造的支援を提供するだけでなく、これらの成分は組織機能を積極的に調節し、居住細胞および移動細胞を支える特殊なニッチを形成します 6,7。特に、肥満などの代謝状態が弾性繊維組織の有意な変化と関連し、全身代謝調節障害が肺ECM構造や線維芽細胞機能の変化と関連していることが最近の研究で明らかになっています。これらの発見は、弾性繊維のリモデリングを動的かつ疾患に関連するプロセスとして理解する重要性を強調しています。

弾性繊維の従来の評価は、質的組織学的評価、半定量的スコアリングシステム、またはエラスチン存在比の測定に依存しており、繊維の組織、結合性、ネットワークの複雑性に関する限られた情報しか提供しません 8,9。これらの手法はエラスチン含有量の大きな変化を検出するのに有用ですが、組織の再構築に伴う微妙な構造的変化を捉えきれない場合があります。定量的な画像解析は、弾性繊維ネットワークの客観的かつ再現性のある特性評価を可能にし、実験条件や研究間の比較を促進することで、これらの制約を克服する可能性があります。これに対処するため、ここで述べるプロトコルは、弾性繊維構造に特に焦点を当てた肺ECM組織の統合解析を可能にします。ECM特性評価4,5の確立された手法に加え、このワークフローにはElastica染色法とTWOMBLIベースの10画像解析パイプラインが組み込まれています。Elastica染色と定量的ネットワーク解析を組み合わせることで、このワークフローは従来の組織学的評価を超え、繊維の豊富さ、断片化、空間的組織、構造的複雑さの詳細な特徴付けを可能にします。このプロトコルは、線維症、肺気腫、肥満に関連する肺のリモデリング、炎症性肺疾患、加成、そして肺の細胞外マトリックスリモデリングを特徴とするその他の疾患の研究に特に適しています。

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プロトコル

ここで述べるすべてのマウス実験は、ドイツ・ノールトライン・ヴェストファーレン州動物倫理委員会(AZ: 81-02.04.2021.A221)の承認に従って実施されました。

注意:処置中は適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用してください。

1. マウス肺組織のサンプリングおよび調製

注:マウスは組織採取前に機関および政府のガイドラインに従い、イソフルラン過剰摂取により安楽死されました。

  1. 胸腔を慎重に開き、中央線切開を行い、その付着部に沿って横隔膜を切り、肺を優しく露出させます。
  2. 右葉と左葉を同時に切除し、すべての葉を保ちながら全ての肺を切除します。
  3. 肺葉を個別に5mLチューブに入れ、10%中性緩衝ホルマリン2mLを入り、4°Cで15〜20時間培養します。
    注:固定は組織構造を保存し、その後の組織学的および弾性繊維解析のために機能します。このワークフローの主な目的は肺胞形態計測解析ではなく、弾性繊維の組織の可視化と定量的評価であったため、組織処理前に肺は膨張固定されていませんでした。
    注意:中性緩衝ホルマリンにはホルムアルデヒドが含まれており、これは有毒で発がん性があり、皮膚や目、呼吸器の刺激を引き起こす可能性があります。ホルマリンは認定された化学用排気フード内で取り扱い、適切な個人用防護具(手袋、白衣、安全メガネなど)を着用してください。
  4. 固定された肺組織を標準組織学的埋め込みプロトコル11を用いてパラフィンに埋め込みます。
    注意:組織形態を維持するために完全な脱水とパラフィン浸透を確実にしてください。サンプル間のばらつきを最小限に抑え、実験条件間の適合性を確保するために、各解析に必ず同じ肺葉を使用します。組織学検査では左葉の使用が推奨されます。
  5. FFPE肺組織をミクロトームで5〜7μmの厚さの断片に切り分け、標準のガラススライドに取り付けます。スライドを60°Cで1時間焼き、その後下流の施布に進みます。スライドはRTで数週間、ほこりのない環境で保管することも、長期保存のために4°Cで保管できます。
    注意:保管中は湿気にさらさないようにしてください。湿気はパラフィンの酸化を引き起こし、染色の品質を損なう可能性があります。長期保存が必要な場合は、乾燥剤を入れた密封されたプラスチック製スライドボックスに保存してください。
    一時停止:スライドはRTまたは4°Cでステインするまで保存します。

2. 弾性繊維染色

  1. 肺胞および血管構造内の弾性繊維を可視化するために、5〜7μmのパラフィン埋め込み肺組織切片にエラスティカ(レゾルシン・フクシン)染色を行います。
    注意:染色の強度とサンプル間での再現性を一貫させるために、同時に扱えるだけのスライド数のみ染色してください。
    1. デパラフィネートスライドは、スライドをキシレン(混合異性体)に2回、それぞれ5分間浸して行う。
      注意:キシレンは有毒で可燃性です。化学換気フードで取り扱い、適切な防護具を着用してください。
    2. 降下エタノール系列でスライドを80%エタノールまで再水和します。
      1. スライドをRTで3分間、100%エタノールで満たした染色チャンバーでキュベートします。
      2. スライドを新鮮な100%エタノールに移し、RTで3分間培養します。
      3. スライドを95%エタノールに移し、RTで3分間培養します。
      4. スライドを80%エタノールに移し、RTで3分間培養します。
    3. スライドを新しい染色室に移し、レゾシン・フクシン溶液を含み、RTで20〜30分間培養します。
      注:レゾシン・フクシン染色液は複数回使用可能で、RTで安定しています。
      注意:レゾシンフクシン染色液には、濃縮酸や染料などの潜在的に有害な化学物質が含まれており、皮膚や目の刺激を引き起こす可能性があります。換気の良い場所や排気フードで溶液を取り扱い、施設の安全ガイドラインに従って適切な個人用防護具を着用してください。
    4. スライドをステンディングチャンバーに入れ、流れる蒸留水の下で1分間洗います。
    5. 95〜96%エタノールで15〜60秒で分化し、顕微鏡で観察します。
      注意:弾性繊維が深い紫紫色のままで、背景が十分にクリアになったら停止してください。染みがついた弾性繊維は濃い紫色に見えます。コラーゲン繊維は染色されず、通常は淡色に見えます。過剰染色は背景を強めることがあります。組織の厚さや固定度に応じて潜伏時間を調整してください。
    6. 分離を止めるために、スライドを直ちに蒸留水に移し、30秒洗浄します。オプション:必要に応じてカウンタスティネーティングを行うことができますが、繊維分断効率が低下する可能性があります。隣接する切傷の肺を評価するためにH&E染色を行うことをお勧めします。
    7. スライドを95%エタノールで1〜2分間順次脱水し、その後100%エタノールを2回1〜2分間乾燥させて残留水分を除去します。
    8. 組織が光学的に透明になるまで、キシレンで切片を2回3分間クリアします。
    9. ジレン適合の永久合成樹脂でカバースリップを取り付け、RTでスライドを平らに乾かします。
      注意:濁りを防ぎ、染色部分の長期保存のためには完全な脱水とクリアリングが不可欠です。
      一時停止:染色されたマウントスライドは画像検査までRTで保管してください。

3. 弾性ファイバーイメージングおよびネットワーク解析

  1. 画像取得
    1. 40×対物レンズを持つスライドスキャナーを用いて肺組織断片の高解像度明視野画像を取得します。すべてのサンプルで露出とホワイトバランスの設定を一貫させてください。
      注:画像は研究全体を通じて同一のスキャナー設定で取得され、拡大率、空間分解能(0.25 μm/ピクセル)、照明、露出などが含まれます。
    2. スキャン中に完全なカバーを確保するために、肺組織全体を対象とした関心領域(ROI)を描いてください。
    3. 画像解析時に背景強度を測定・差し引くために、組織を含まない背景基準領域を定義します。
    4. スキャナーの自動フォーカス検出機能を使って、組織全体に最適な焦点数を割り当て、均一なシャープさと画質を確保します。
    5. 均一な照明と露出設定で画像を取得します。
      注意:自動フォーカスが高密度または不均一な領域で失敗した場合は、人工の微調整を行い、肺胞や血管領域を含むすべての組織構造を鮮明に捉えてください。
  2. 画像の解畳み込み:QuPath12における染色ベクトル推定。染色ベクトルは各組織学的染料の特定のRGB吸光度を表し、色のデコンボリューション時に重なり合う染色の分離を可能にします。
    注意:このプロトコルでは、リゾシンフクシン用のあらかじめ定義された染色ベクターがフィジーでは利用できないため、染色ベクターはQuPathで定義されました。
    1. QuPathで画像を開き、ブライトフィールド画像タイプを選択します。
      注意:バイアスを最小限に抑えるために、データセットの代表的な画像を使ってステインベクターを計算し、すべての画像に同じ値を適用してください。
    2. 主に弾性繊維を含む関心領域(ROI)を描き、最初の染色成分を定義します。
    3. 画像タブでステインベクターセクションに移動します。
    4. ステイン1をクリックし、ROIからステインベクターを設定して、弾性繊維(通常は紫と紫)の色ベクターを定義します。
    5. 非弾性組織(例:背景やコラーゲン)を含むROIを選択し、ステイン2をクリックし、ROIのステインベクターをセカンダリーカラー成分として設定します。
    6. QuPathは背景に対応するステイン3を自動的に計算します。
    7. フィジーで計算・適用されたベクターの例:Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553;不特定信号 R:0.31585205;G:0.815618;B:0.48477295;背景 R:-0.105005614、G:-0.4780256、B:0.87204665。
      注:これらの値は、レゾシンフクシンのみで染色された画像に対して染色したものです。カウンターステインが存在する場合は、新たなステインベクトルを計算する必要があります。
    8. これらをカスタムステインベクターとして保存し、すべてのサンプルで一貫した色のデコンボリューションを適用してください。
      注意:代表的な領域からカスタムステインベクターを定義することで、特にエラスチンや背景色がバッチごとに異なるレゾシン・フックス染色において、色のデコンボリューション精度が向上します。
  3. フィジーのカラー解畳み込み画像13,14。
    1. Fiji(ImageJ)を開き、染色組織断片の明界画像を読み込みます。
    2. オプション:画像がすでにRGBでない場合(例:8ビット画像)でのみRGB形式(画像→タイプ→RGBカラー)に変換すること。このステップで新しい画像ウィンドウが開きます。元の生データを保存するために保存してください。
    3. 画像>色>色の解畳み込み>ユーザー値を選択して色のデ畳み込みを実行します。
    4. QuPathから取得したカスタムステインベクターを入力します。
    5. プラグインを実行して、弾性繊維、弾性繊維を除く組織、背景に対応する3つの別々のグレースケール画像を生成します。
    6. 追加の前処理なしにTWOMBLIで直接画像を使用してください。TWOMBLIは十分な解像度でシャープな画像を必要とします。構造的な詳細を保つために平滑化(例:ガウスのぼかし)は避けるべきです。
      注意:QuPathでベクター推定に選ばれた領域が典型的な染色を代表していることを確認してください。これらのカスタムベクトルは一貫した比較のためにすべての画像に均一に適用されます。
    7. 弾性ファイバーチャネルをTIFFファイルとして保存し、後続の定量化と解析に用いてください。
  4. ファイバー分析のためのROI選択
    1. 各肺切片に対して、肺胞領域に5つの偏りのない正方形ROI、気管支周囲領域に5つのROI(それぞれ100μm x 100μm)を選択します。
    2. 元のデータを保存するために、生画像の各ROIを複製(画像>複製)してください。
    3. 同じROIをデコンボリュート弾性繊維分析で再現します。
    4. すべての重複したROIを個別のTIFFファイルとして保存し、下の分析用に活用してください。
      注:組織褶皺、切片アーティファクト、裂孔、大きな血管、または保存不良の肺胞構造を含む領域は解析から除外されました。TWOMBLI分析の入力としては、デコンボリューションされた弾性ファイバーROIのみを使用し、対応する生画像複製は品質管理および目視検査の参考ファイルとして保持されました。関心領域(ROI)は、組織の偏りのない表現を確保するために、体系的なランダムサンプリングを用いて選択すべきです。オペレーターバイアスをさらに最小化するため、QuPathと互換性のある自動ROI選択スクリプトが補 足ファイル1 および 補足ファイル2に提供されており、その実装はセクション3.5で説明されています。
  5. QuPathで自動ROI選択スクリプトを使って適用しています。
    1. QuPathで画像を開き、画像タイプをBrightfieldに設定します。
    2. ツールメニューから、希望する注釈ツールを選択して初期注釈を作成します。四角い注釈を推奨します。
    3. 肺組織内に正方形の注釈を描く。各注釈は分析のために1つの関心領域(ROI)のみを含み、肺胞領域または気管支周辺領域のいずれかを含みます。
    4. 注釈が作成されたら、注 釈 に移動して「 ロック注釈 」を選択して誤って移動や改変を防ぎます。
    5. 注釈パネルのクラスリストの横にある「+」ボタンをクリックして、「肺胞」と「気管支周辺」のクラスを追加してください。
    6. 各注釈を適切なクラスに割り当てます。注釈を選択し、対応するクラスを選択し、「 選択設定」をクリックします。注釈の色が変わり、割り当てられたクラス(「肺胞」または「気管支周辺」)が注釈プロパティパネルに表示されます。
    7. 対応するスクリプトを開いて実行します。完了すると、ROIが正常に生成されたことを示すメッセージが表示されます。新たに作成されたROIは、元のクラス定義注釈の子注釈として注釈階層に現れます。
    8. ROIをエクスポートするには、選択して「ファイル」→「オリジナルピクセル画像→エクスポート」へ移動してください。エクスポートしたROIをTIFFファイルとして保存してください。
      注意:スクリプトは「肺胞」と「気管支周囲」のクラス名のみを認識するよう設計されています。これらの名前は指定された通りに正確に入力しなければなりません。デフォルトでは、スクリプトは各注釈内で100μm×100μmの重複しない5つの正方形ROIをランダムに生成します。候補ROIは、その角と中心が注釈の範囲内に完全に収まっていて、選択された領域に完全に含まれている場合にのみ受け入れられます。ROIの数と寸法はスクリプト内で特定の実験要件に合わせて変更可能です。分析には少なくとも3回の生物学的複製と最低5回のROI/サンプルが推奨されます。
  6. トゥウォンブリ解析
    1. 弾性繊維のROI画像はすべて専用フォルダに保存して分析してください。
    2. ワーキングディレクトリ内に2つのサブフォルダを作成します:a.マスクフォルダ – TWOMBLIによって生成されたバイナリマスク用。b. HDMフォルダ – TWOMBLIが生成した高密度マトリックス(HDM)画像用。
    3. TWOMBLIプラグインを実行する:Fijiを開いてTWOMBLI(プラグイン -> マクロ ->実行)を起動します。
    4. 適切な解析パラメータファイルを選択します。以下のTWOMBLIパラメータが弾性繊維解析に使用されており、 表1に記載されています。
      注意:これらのパラメータは染色の強度によって異なる場合があります。パラメータは、標準化された条件下で染色された肺組織切片の複数の代表画像を用いて経験的に最適化されました。最適化は、生成されたマスクと元の染色パターンを比較し、セグメント化されたマスクと基礎の弾性ファイバーネットワークとの間に最も重なり合う設定を選択することで行われました。確立されると、データセット内のすべての画像に同じパラメータが適用されました。
    5. 「明るい背景の上に暗い繊維」オプションを選びましょう。
    6. Maskフォルダにバイナリマスクを生成し保存します。
    7. バイナリ画像を生成し、HDMフォルダに保存します。
    8. ファイバー長、分岐点、曲率、密度、整列などの定量的なネットワークパラメータを抽出します。
      注:TWOMBLI解析にはシャープで高解像度の画像(>1ピクセル/μm)が必要です。色の反転込みが不十分、ピントが合わない領域、画像圧縮はファイバーネットワークの定量化の精度を損なう可能性があります。
  7. 定量化と統計解析
    1. TWOMBLIのネットワークパラメータをCSVファイルとしてエクスポートしてください。
    2. 生のCSVデータをGraphPad Prismにインポートし、統計分析と可視化を行います。
      注意:以下のパラメータが推奨されます:マスク総長(Mask Total Length)。これはROI内の弾性繊維の総量を反映し、繊維の存在比と損失を定量化できます。ファイバーエンドポイントはファイバー断片の度合いを示します。エンドポイントの数が増えた場合、線維の断裂や断裂が示唆されます。ファイバーブランチポイントは、ECMネットワークの構造的複雑さと完全性を反映したファイバー間の相互接続度を測定します。分岐点の数が多いほど、より複雑で絡み合ったネットワークを示します。ラクナリティはROI全体における繊維分布の均一性を定量化します。低い欠損性は同じ大きさのギャップを持つ均一なネットワークを示し、高い欠損性はより複雑な構造を示す異質なギャップサイズのネットワークを反映します。ボックスカウンティング-フラクタル次元はファイバーアーキテクチャの複雑さを捉えています。フラクタル次元値が高いほど、より複雑で詳細なネットワークを示し、低い値は単純または乱れた構造を反映しています。
    3. 各定量化されたネットワークパラメータ(例:ファイバー長、分岐、曲率、密度)に対する平均SEM±の列グラフを作成します。
    4. シャピロ・ウィルク検定を用いたデータ正規性の検定。パラメトリックデータには、両側のペアなしStudent氏t検定を適用します。ノンパラメトリックデータの場合は、マン・ホイットニーU検定を適用します。2つ以上の実験群を含む比較では、一方移動分散解析(ANOVA)と、その後適切な事後多重比較検定、または非パラメトリックデータに対してはKruskal–Wallis検定を適用すべきです。
      注意:再現性とデータのトレーサビリティを確保するために、すべての生のCSVファイルは変更せずに保管してください。図の凡例に各条件で分析されたROIおよび生物学的複製数を報告してください。

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結果

このプロトコルは、異なる肺領域および実験条件における弾性繊維ネットワークの定量的パラメータを提供します。前述のTWOMBLI解析では、細胞外マトリックス評価のために繊維長、分岐密度、欠損度、フラクタル寸法などのパラメータが得られます。この枠組みを基に、我々のアプローチは弾性繊維組織の包括的な特徴付けを可能にし、生理的および病理的肺組織における繊維の存在量、結合性、均一性、構造的複雑性の変化を評価することを可能にします。

健康な肺組織では、弾性繊維が肺胞隔や気管支周囲の構造に沿って長く連続的かつ整列したネットワークを形成します。対照的に、肥満マウスのような病理的または代謝的に変異した肺は、しばしば枝分かれの増加とネットワークの複雑さを示し、弾性繊維組織の変化を反映しています。代表的な出力(バイナリマスクや定量的パラメータを含む)は 図1A、B

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ディスカッション

このプロトコルは、特に線維芽細胞駆動の弾性線維再構築に焦点を当て、マウスの肺細胞外マトリックス(ECM)構造を研究するための堅牢で再現可能なワークフローを提供します。弾性繊維は肺のコンプライアンスと反動を維持するために不可欠であり、その障害は線維症、肺損傷、加成、代謝障害など複数の肺疾患の特徴です。中心的な機能的役割を果たしているにもかかわらず、弾性繊維の組織化や組み立ての定量的評価は限られています。このワークフローは、弾性ファイバーネットワークアーキテクチャの体系的かつ定量的な特徴付けを可能にすることで、このギャップを埋めています。

この手法の大きな強みは、定量的画像ワークフローと構造組織学分析を統合していることにあります。従来の手法ではECMの組成や組織学的特徴を個別に評価することが多いですが、このプロトコルは線維の長さ、分岐、ネットワークの複雑さを含む弾性繊維の組織を客観的に定量化することを可能にします。これにより生理的状態と病理的状態の直接比較が可能となり、線...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

ボン大学医学部の組織学コア施設に感謝申し上げます。さらに、iFET動物施設のダニエラ・クラウス氏とチーム全体の支援活動にも感謝いたします。V.L.K.はドイツ研究財団(DFG)の資金提供を受けており、ドイツの卓越性戦略(EXC 2151)の390873048のもとで支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Axio CS2 スライドスキャナー Carl Zeiss
Coplinガラス染色ジャーSigma-AldrichS6016
DPXマウンタントSigma-Aldrich6522
組織学用エタノール（100%）Carl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/バージョン 1.54t
ホルマリン溶液、中性緩衝10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I組織処理/埋め込みカセットSigma-AldrichH0542
マイクロトームThermo Fischer ScietificHM355S
顕微鏡スライドVWR631-0108
マウス：C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664系統 #:000664 
パラフィン埋め込みシステムEpredia HistoStar埋め込みモジュール
Prismhttps://www.graphpad.com バージョン 11
Qupathhttps://qupath.github.ioバージョン 0.7.0
レゾルシン・フクスインWaldeck2.00E-30
TWOMBLIプラグインhttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
キシレンApplichem GmBH14020172

参考文献

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