ミクログリア置換および生体内系統解析のための新生児脳内移植

サマリー

このプロトコルは、定義されたミクログリア集団の効率的な新生児内脳移植を可能にし、複数のドナーやレシピエントモデルをまたぐミクログリア系統の堅牢な長期移植と解析、 生体内 統合を支援します。

要約

骨髄細胞移植によるミクログリア置換は、神経学的プロセスや疾患の研究において有望な実験的アプローチとして浮上しています。しかし、既存の移植戦略は、非効率的な移植、照射に基づく調整への依存、ドナーと受容者間の柔軟性の制限により制限されることが多いです。ここでは、発生中のマウス脳に精製されたミクログリア集団(Hoxb8 および非Hoxb8 マイクログリア)を導入するための新生児脳内移植プロトコルについて説明します。この方法は、生理学的に許容される条件下で、脳実質内で効率的なドナー細胞の移植と統合を可能にします。重要なのは、このプロトコルが胚性造血前体や出生後脳由来のマイクログリアを含む複数のドナー供給源に対応し、条件付き Csf1r欠損マウスや Csf1r^ΔFIRE マウスを含む、内因性マイクログリアが減少または欠如した異なる受容者モデルにも適用可能である点です。ドナー細胞は蛍光活性化細胞選別によって精製され、ガラスマイクロピペットを用いて両側性で新生児マウスの脳に送達され、効率的かつ低侵襲な送達を実現します。レシピエントマウスは、ドナー細胞が拡大しミクリアニッチを形成できるように年齢を加わらせ、ドナー細胞分布とマーカー発現の組織学的解析によって結果が評価されます。このアプローチは、多様な実験文脈におけるミクログリアの発生発生と 生体 統合を研究するための堅牢かつ拡張可能なプラットフォームを提供します。

概要

骨髄細胞移植によるミクログリア置換は、ミクログリア生物学を探る強力な戦略として、また神経疾患の治療パラダイムとして浮上しています。ここ数年で、この分野は中枢神経系における広範なミクログリア置換を可能にする戦略へと進展しました^。最近の研究では、ドナー由来のマクロファージや前駆細胞が脳を移植し、ミクログリア様転写プログラムを採用し、場合によっては疾患関連表現型2,3,4,5,6,7,8を改善することが示されています。これらの発見は、脳マクロファージ置換を神経疾患の研究や潜在的に修正するために活用できるという考えを支持しています。

ミクログリア移植における中心的な課題は、実験的な混絡を最小限に抑えつつ、強固な植着を達成することです。多くの確立された置換戦略は、照射、化学療法、またはミクログリア枯渇パラダイムに依存して、刻み付け可能なニッチ(6,9,10,11,12,13)を作り出しています。これらのアプローチは効果的であるにもかかわらず、ミクログリアの老化を誘発し、血液脳関門を破壊し、炎症シグナル伝達を変化させることがあり、ドナー細胞の挙動の解釈を複雑にすることがあります(^9,14)。近年では、調整に依存しないまたは毒性低減のアプローチによるミクログ^リア置換の研究が始まりました^5,8,15。

発達時期は移植成功の重要な決定要因です。新生児の脳は、構造的障壁の低下と内因性ミクログリアの継続的な確立により、ドナー細胞の拡張と長期的な統合を支える許容的な環境を提供します。早期出生後分娩(P0–P5)を用いた最近の移植研究では、強固な実質移植とミクログリア様の同一性の獲得が示されており、^{効率的な置換}のための発達的文脈の重要性を強調し^{ています。}

Hoxb8ミクログリアは、系統特異的なミクログリア生物学への貢献を研究するための特に有益なシステムを提供します。これらの細胞は胚性造血前体から生じ、機能不全時の行動に影響を与える実質ミクグリアの明確なサブセットを構成します ^{17,18,19,20,21}。最近の一次Hoxb8前体とミクログリアおよびエストロゲン受容体(ER)-Hoxb8前駆細胞システムを用いる研究では、これらの細胞が増殖、遺伝操作、そして脳に成功裏に移植され、そこでミクログリア様転写プロファイルや^{機能的特徴}を採用できることが示されています^7,8,17.これらの進展は、ミクログリアの系統や異質性を解剖する移植アプローチの有用性をさらに浮き彫りにしています。

ここでは、ドナーとレシピエントの両系をまたいで多用途に最適化された新生児脳内移植プラットフォームについて説明します。放射線照射や全身的条件付けに依存するアプローチとは異なり、この方法は新生マウスに直接的な両側脳内送達を行い、発達的に許容される脳環境にドナー細胞を配置しつつ全身的乱れを最小限に抑えます。この技術は胚性造血前体や出生後の脳由来ミクログリアなど複数のドナー源に適合し、内因性ミクログリアが減少または欠如する異なる受容者モデルにも適用可能です。大きな実用的利点は、薄い新生児頭蓋骨によりガラスマイクロピペットによる迅速な手動注入が可能であり、ドリルや立体定位固定を不要にしつつ、広い実質の移植を実現していることです。

このアプローチは、多様な実験文脈におけるミクログリアの発生、異質性、 生体内 統合を研究するための堅牢で柔軟かつ拡張可能なシステムを提供します。これにより、新生児内脳移植は全身性ミクログリア置換戦略の補完的かつ実験的に管理された代替手段として位置づけられています。

プロトコル

本研究のすべての方法と実験はマウスで行われています。実験的手順はユタ大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)により承認されました。公衆衛生サービス保証 #D16-00018(A3031-01)。

1. ドナーとレシピエントの子犬のための繁殖ペアの準備

1. 夕方にブリーダーペアを同じケージに入れて、タイミングを合わせて交尾を始めましょう。
2. 毎朝メスに膣プラグの有無を確認し、交尾が成功しているか確認しましょう。
3. 詰まったメスはオスから取り除き、出産まで個別に飼育します。出産には約18〜20日かかります。
4. 妊娠中のダムは、出生の7〜10日前から1日5分間優しく扱い、新生児の扱いに伴うストレスを軽減します。
5. 手術後に子犬が戻った際の母親のストレスを軽減するため、毎日の取り扱いの際にベタジン臭いを含む綿棒にダムを曝露してください。
6. 妊娠中のメス用に、出産前に巣材を用意した清潔なケージを用意しましょう。

2. 新生児脳の採取と処理

1. 新生児ドナーマウス(P0–P4)は、麻酔薬との直接接触を防ぐために、ベルジャーや同様の密閉チャンバーを仮の床で設置し、イソフルラン過剰投与で安楽死させます。
2. 呼吸が止まり反射がなくなったら、直ちに首を切断します。
3. 小脳や嗅球を含む脳全体を収穫してください。脳を冷たい1×ハンクスバランス塩溶液(HBSS)を3mLの冷たい液体に、プラスチック製のペトリ皿に氷に入れます。
4. 滅菌メスと鉗子を使い、脳を約1〜2 mmの³ 片に粉砕します。
5. 細かく砕いた脳組織(1本の脳を組織解離チューブにつき1つ)を、製造元の推奨プロトコルに従って神経組織解離システムに付属する酵素消化試薬を含む組織解離チューブに移します。
6. 加熱機能付きの機械的解離装置にチューブを入れ、製造元推奨の神経組織解離プログラムに従って37°Cで30分間培養します。
7. 400μLの1×HBSSを用いて70μmセルストレーナーをプリソークします。
8. 解離した組織を、氷の上に50mLの円錐形チューブをかけて浸したストレーナーに通します。
9. チューブは10mLの1×HBSSで洗浄し、フィルターを通して細胞の回復を最大化します。
10. フィルターを捨て、300 × g で室温で10分間スピンします。上清液を吸引してください。
11. 細胞を1mLの赤血球溶解バッファーに、無菌超純水に再懸浮させ、4°Cで10分間培養します。
12. 溶解反応を1× HBSS/1% BSA/5% FBS 10 mLで消融します。
13. フィルターを捨て、セルを300 × g で4°Cで10分間スピンダウンします。 上清液を吸引してください。
14. ヘモサイトメーターを使って細胞数を測定します。細胞収率の典型的な範囲は、選別前の3.2〜4.0×10〜⁶ です。
15. 細胞を5% FBSに1×HBSSで再懸濁し、下流抗体染色のために所定濃度で行います。

3. ミクログリア集団のFACS選別のための細胞抗体染色

1. 細胞を1mLの染色バッファー(5% FBSを1×HBSSに含む)に再懸浮させ、Fc受容体遮断抗体(精製CD16/32、1:2000)を含み、細胞を4°Cで10分間培養します。
2. 240 × g で4°Cで3分間スピンセルを下します。 上清液を吸引してください。
3. 蛍光共役抗体(CD45 APC, 1:160;CD11b Alex Fluor 700、1:160)を1mLの染色バッファーに、暗い場所で氷の上で30分間浸しています。
4. 240 × g で4°Cで3分間スピンセルを下ろします。 上清液を吸引してください。
5. 死細胞を除外するために生存性染料(例:3 μM DAPI in 1×HBSS)を加えます。
6. DAPI、GFP、tdTomato、CD45-APC、CD11b-Alexa Fluor 700検出に適したレーザーを備えた高速細胞選別機を使用してFACS選別を行います。
7. 可能な限り、細胞の生存率を最大化するために、100μmのシース圧力を低くしたノズルを使用してください。検査中はサンプル採取チューブや選別された細胞を氷の上に保管してください。
8. 必要に応じて、着色されていないセル、単色補正制御、蛍光マイナス1制御を用いて電圧、補正、ゲートを設定します。
9. 最初のゲートセルは、前方散乱面積と側面散乱面積で区別して、破片を排除します。
10. サイド散乱高さと横散乱幅を用いるゲートシングレット。
11. DAPI⁻細胞にゲートをかけて死んだ細胞を除外します。
12. 生きたシングルレットから、CD45で^低 CD11b⁺ミクログリアをゲートします。
13. CD45^の低CD11b ⁺ミクログリアゲート内で、GFPとtdTomato蛍光を用いてドナーのミクログリア集団を分離します(Hoxb8 ミクログリア:DAPI⁻ CD45^低CD11b ⁺ tdTomato⁺ GFP⁺、非Hoxb8 ミクログリア:DAPI⁻ CD45^低CD11b ⁺ tdTomato⁻ GFP⁺)。
14. 各集団を冷たい1×HBSSを含む無菌採取チューブに分類します。
15. 選別後、少量の細胞を再分析し、移植前に純度と生存可能性を確認します。
16. 選別した細胞を無菌1×HBSSで採取し、移植まで暗闇の氷に保管してください。
    注: Hoxb8 ミクログリアの典型的な収量は、新生児脳あたり3.70〜4.60×10^4細胞、非Hoxb8 ミクログリアは1.10〜1.14×10⁵ 細胞(P0–P4)ですが、年齢、遺伝子型、組織処理効率によって収量は異なる場合があります。移植はできるだけ早く、理想的には細胞選別から60分以内に精製してください。

4. 胎児肝臓造血前身の採取および処理

1. 妊娠中のダムは、精密蒸気器で酸素を投与した5%イソフルランを用いて、呼吸が止まり反射が消失するまで安楽死させてください。
2. イソフルラン過剰摂取後は、施設の動物ケアおよび使用ガイドラインに従い、子宮頸部脱臼による二次的な物理的手法を行って死亡を確実にしてください。
3. 妊娠中のマウスの子宮角を取り出し、冷たい3mLの1×HBSSをプラスチック製ペトリ皿(60mm×15mm)に入れます。
4. 子宮からE12.5胚を解剖し、プラスチック製のペトリ皿に1× HBSSを3mLの冷たいものに入れます。
5. 胎児肝臓を細かい鉗子で剥離し、新鮮な3mLの冷たい1×HBSSに5%のFBSを含むペトリ皿に入れます。
6. 26Gの針と3mLの注射器を用いて、溜まった胎児肝組織を機械的に解離します。
7. 240 × g で4°Cで5分間スピンセルを下ろします。 上清液を吸引してください。
8. 1×HBSSでセルを洗浄します。
9. 細胞懸濁液を80μmのセルストレーナーに通します。
10. 細胞を赤血球溶解バッファー20μL(0.15 M塩化アンモニウム、1 mM KHCO3)に5分間インキュベートし、その後1× HBSSを13 mL加えてクエンチングします。
11. 赤血球を溶かすために5分間の潜伏を続けます。
12. 細胞を200 × g で4°Cで5分間沈めます。

5. 造血前駆細胞のFACS選別のための細胞抗体染色

1. 蛍光共役抗体で胎児肝細胞をインキュベートします(Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50;キットPE-Cy7、1:100)で5%FBS/1%BSAを1×HBSSを暗い氷上で30分間泳いでいます。
2. 1× HBSSでセルを洗浄し、240 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
3. 死細胞を除外するために生存性染料(例:3 μM DAPI in 1×HBSS)を加えます。
4. DAPI、Ter119 PerCP-Cy5.5、Kit PE-Cy7、tdTomato、GFP検出に適したレーザーとフィルターを備えた高速セルソーターを用いてFACS選別を行います。
5. 可能な限り、細胞の生存率を最大化するために、100μmのシース圧力を低くしたノズルを使用してください。検査中はサンプル採取チューブや選別された細胞を氷の上に保管してください。
6. 必要に応じて、着色されていないセル、単色補正制御、蛍光マイナス1制御を用いて電圧、補正、ゲートを設定します。
7. 最初のゲートセルは、破片を排除するために前方散乱面積と側面散乱面積を区別します。
8. ゲートシングレットは、前方散乱の高さと前方散乱幅を用い、続いて横散乱の高さと横散乱幅を比較します。
9. DAPI⁻細胞にゲートをかけて死んだ細胞を除外します。
10. 生シントレットからは、Ter119⁻細胞にゲートを付けて赤血球系譜細胞を除外します。
11. Ter119⁻集団内では、Kitの^{ゲートは高} 造血前駆細胞を持っています。
12. DAPI⁻ Ter119⁻ Kitの^高 集団内で、tdTomato⁺細胞にゲートをかけて Hoxb8 系統陽性の前身を分離します。
13. ドナー系統が Cx3cr1-GFP報告体も持っている場合は、GFP蛍光を用いて、この段階で選別された胎児肝前身集団がGFP⁻または^GFPが低い ことを確認し、前駆細胞と分化した Cx3cr1発現骨髄細胞を区別します。
14. 最終的なDAPI⁻ Ter119⁻キットで^td トマト⁺ GFP^- の高濃度集団を、冷たい1×HBSSを含む滅菌採取管に仕分けします。
15. 選別後、少量の細胞を再分析し、移植前に純度と生存可能性を確認します。
16. 選別した細胞を無菌1×HBSSで採取し、移植まで暗闇の氷に保管してください。
    注:典型的な収量は胚の大きさや選別効率に応じて、E12.5胎児肝製剤あたり約5.0〜7.0 ×10個4 Hoxb8造血前駆体の範囲です。精製した生細胞はできるだけ早く移植し、理想的には選別後60分以内に行ってください。

6. 注射針の準備

1. ホウケイ酸ガラス毛細管(外径1.0mm、内径0.58mm、フィラメント付き)をマイクロピペットプラーに充填します。
2. 新生児脳内移植に適した長くテーパー状の針を生成するよう最適化された2本線プルプログラムで毛細血管を抜きます。
   1. 典型的な設定には、熱=645、プル=30、速度=120、遅延=オフ、圧力=200があります。特定のガラスの種類、環境条件、プラーキャリブレーションに合わせて最終設定を最適化します。その後、完成した針をトリミングし、面取りをして最終的な外側直径約30μmにします。
3. 引き抜いた針を大きなプラスチック製ペトリ皿の中の2本のパテの上に置き、先端を損傷から守ってからトリミングや面取りをします。
4. 引き抜いた針を約10×〜20×倍率の解剖ステレオ顕微鏡の下に置き、柔らかいブレースで支えます。
   注意:先端検査時には、適切なテーパー形成を確認し、トリミングや面取り前に欠陥を特定するために、より高い倍率(20×–40×)を使用することがあります。
5. 滅菌カミソリの刃を使って針先をトリミングし、外径約30μmにします。
6. トリミングした針をマイクログラインダーホルダーに固定します。
7. ベベル角度を30°〜35°に調整します。
8. グラインダーと照明をつけてください。
9. 蒸留水を約4〜5秒ごとに1滴の一定速度で研磨石に滴らせます。
10. 針先を回転する研削石に優しく当て、面取りの縁ができるまで続けます。
11. 利用可能な場合は、先端測定装置を使って面取り先端の外径を測定してください。
12. 移植には外径約30μmの針を選びます。
13. 針に滅菌バッファーを入れ、液体を優しく排出して先端が開いて障害がないことを確認します。

7. 注射装置の準備

1. 柔軟なチューブ、マウスピース、インラインフィルター、毛細管ホルダーからなる手動マウス制御ピペットを組み立てます。
   注意:口中制御ピペッティング装置にはインラインフィルターが組み込まれており、汚染防止のためです。
2. 針に2mmごとにマーキングしてください(1針あたり最大2つ)。2 mmごとに ~2 μL に相当します。
3. 準備済みのガラス注入針を毛細管ホルダーに~1.5cm挿入し、アセンブリが確実かつ気密であることを確認します。
4. マウスピースに優しく吸引をかけて、空気の流れが妨げられず、適切な抵抗が適切か確認してください。
5. ドナー細胞を装填する前に、吸引と注入の円滑な制御が可能であることを確認してください。
6. 細かいピペットチップを使って、準備済みのドナー細胞懸濁液(合計4.5μL)をガラス注入針に逆充填します。
   注意:移植を始める前に針内に気泡が残っていないことを確認してください。マウス1本に針を1本使う。

8. 新生児受領者の麻酔と手術領域の準備

1. 新生児マウスを手術台上で仰臥させ、精密蒸気器を通じて酸素で投与した2.0%–5.0%イソフルランを用いて麻酔を誘導します。
2. マウスの鼻を鼻のコーン内に置き、イソフルランと酸素の継続的な供給を維持します。
3. 呼吸を監視しながら麻酔誘導に約1分の時間を設けてください。
4. 手足に優しく触れ、離脱反射がないか確認して適切な麻酔を行ってください。
5. 適切な麻酔面が得られたら、イソフルラン濃度を0.5%〜2.0%に下げて維持し、移植中は最大10分間麻酔を継続します。
6. 新生マウスは手術台の下に置かれた温熱パッドで約38°Cに保ちます。
7. 頭部の注射部位は、ベタジンと70%エタノールを交互に塗布し、滅菌綿棒で洗浄してください。
8. 最後のベタジンを塗り、皮膚を乾かしてから注射します。
   注意:イソフルランは有害な麻酔薬です。適切な麻酔除去システムを使用し、施設の安全ガイドラインに従い十分な換気を確保してください。

9. 新生児脳内移植の実施

1. 注射中の動きを最小限に抑えるため、手袋をした指や柔らかいサポートで頭部を優しく安定させてください。
   注:受容マウスはP1からP4の間に移植されます。
2. 前背側末脳(後の前頭野領域)に両側注射部位を特定し、矢状体正中線から約1〜2 mm外側、嗅球のすぐ後方に位置します。注射部位は両半球の左右対称に配置され、表面血管は目に見えないようにしてください。
   注:新生マウスは頭蓋骨が薄く小型であるため、注射は立体座標ではなく視覚解剖学的ランドマークを用いて行われます。
3. 頭蓋骨を目視で確認し、針を目に見える血管の近くに刺さないようにしてください。
4. 斜めガラスマイクロピペットを皮膚と進行中の頭蓋骨に優しく挿入します。
5. 針を頭蓋骨表面から約1〜2 mm下に導き、前頭半球に導きます。
6. 口内制御ピペット装置を通じて手動圧力を制御してドナー細胞を送達します。
   注意:精製された造血前駆細胞や新生児マイクログリアを移植する際は、1半球あたり2〜3μLを注射し、1回の注射あたり約2.5 × 10^4細胞に 相当します。これにより、マウスの脳あたり約5×10個の⁴ 細胞が存在します。
7. マイクロピペットを脳からゆっくりと引き抜き、注射された細胞の逆流を最小限に抑え、組織損傷を軽減します。
8. 対側注射を行います。
   注意:マウス間の交差汚染を避けるため、1匹のマウスに針を1本ずつ使ってください。

10. 移植された新生児の回復

1. 処置後はすぐに各子をウォーミングパッドに置きましょう。
2. 子犬の体色が正常になり、自然な動きができるようになり、全体的な活動が戻るまで観察してください。
   注意:回復時間は5分から10分の範囲です。
3. 子犬をダムに戻せ。
4. 子犬を自宅のケージの寝具や巣材でしっかりこすりつけてください。
5. 子犬はダムと一緒にケージに戻してください。
6. ダムが返還された子犬を回収し受け入れているか確認してください。

11. 術後の健康状態のモニタリング

1. 移植後最初の3日間は、毎日10分間、子犬を観察してください。
2. 子犬の正常な活動、授乳行動、ダムとの相互作用を評価してください。
   注意:この期間中はネズミケージを触らないでください。これによりダムへの負荷が増加します。
3. 最初の3日間の離乳期間が終わるまで、子犬の様子観察を続けてください。
4. 子犬の正常な発達、摂食行動、活動量、母親のケアを評価してください。
5. 術後初期の期間中は毎日体重を測定・記録してください。
6. 子犬の苦痛、異常な姿勢、無気力、摂食障害の兆候を評価してください。
7. 必要に応じて、施設の動物ケアガイドラインに従って人道的な安楽死を行います。
   1. 新生児マウスの場合は、麻酔薬との直接接触を防ぐために、ベルジャーや同様の密閉型チャンバーを用いてイソフルラン過剰投与で安楽死させます。呼吸が止まり反射がなくなったら、直ちに首を切断します。
   2. 成マウスの場合、呼吸が停止し反射がなくなるまで酸素で5%イソフルランを酸素投与し、反射が確認されるまで安楽死させ、その後頸部脱臼を二次的な物理的手段として確実に死に至らせます。
      注:実験的評価項目で術後死亡率を示す動物や、検出可能なドナー細胞移植が検出されない動物は分析から除外されました。新生児内膜移植は低侵襲とみなされ、術後鎮痛は行われませんでした。

12. クライオセクテーションおよび免疫蛍光染色のための脳組織の採取

1. 脳を慎重に取り出し、凍結切片分析の準備をしてください。
2. 出生後の脳組織を冷凍解剖のために処理し、前述の手順に従ってクリオスタットを用いて冠状切片を切断します。
   注:各マウスに対して、体性感覚皮質にまたがる9〜12の冠状切片を解析します。
3. 切片を顕微鏡スライドに取り付け、染色するまで-20°Cで保存します。
4. 0.2%トリトンX-100および1%デオキシコール酸ナトリウムを含む透過バッファーで短時間切片を培養します。
5. 一次抗体(鶏用抗GFP1:500;モルモット抗tdトマト抗体1:250;ウサギの反Iba1;適切な抗体希釈バッファーで希釈した1:500。
6. 組織切片を一次抗体で4°Cで一晩培養します。
7. リン酸塩緩衝生理食塩水で切片を洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。
8. フルオロフォア結合二次抗体(ヤギ抗ウサギ用Alexa Fluor 647、1:500、ヤギ抗モルモットAlexa Fluor 555、1:500、ヤギ抗鶏用Alexa Fluor 488、1:500)を室温暗闇で2時間インキュベートします。
9. 細胞核を可視化するためにDAPIでカウンターステイン切片を行います。
10. アンチフェードマウントメディウムでセクションを取り付け、ガラスカバースリップを貼ります。

13. 共焦点顕微鏡画像の取得

1. 10×または20×対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で蛍光画像を取得します。
2. 200〜400Hzのスキャン速度で、512×512または1024×1024ピクセル解像度で画像を取得します。
3. 組織内で2〜5μmのzステップ間隔で光学断片を収集します。

結果

精製されたミクログリア集団の新生児脳内移植は、長期生存と受容者の脳実質内でドナー由来細胞の広範な移植をもたらします。精製されたドナーミクログリア集団は、蛍光系統レポーター(Hoxb8 ミクログリア:tdTomato⁺ GFP⁺;非Hoxb8 ミクログリア:tdTomato⁻ GFP⁺)を用いた蛍光活性化細胞選別により移植後に分離されました(図1A)。新生児脳内移植後、ドナー由来の細胞は長期生存し、受容者の脳実質全体に広範囲に着床を示しました。移植後5か月時点で、精製された新生児 のHoxb8 ミクログリア、非Hoxb8 ミクログリア、およびE12.5培養した Hoxb8 胎児肝由来の前身細胞を蛍光系譜報告者によって容易に同定し、成熟した実質ミクグリアの特徴的な分岐形態を示しました(図1B)。図1および図2に示された代表画像は、n=3匹の受容マウスから導き出されてい...

ディスカッション

精製されたミクログリア前体または特定されたマイクログリアサブポピュレーションの新生児内内移植は、 生体内 でミクログリアコンパートメントを再構築し、脳マクロファージの系統特異的特性を調べるための堅牢なアプローチを提供します。この方法は遺伝的に定義されたドナー細胞を用いて選択的再構成を可能にし、脳環境内でのドナー細胞の着床や成熟を直接評価することを可能にします。

この戦略の大きな利点は、複数のドナー供給源や受領システムとの互換性です。本研究および^{先行研究8,17}では、胎児肝由来のHoxb8前身と新生児脳由来のミクログリアの両方が成熟した実質ミクログリアの接着と生成に成功しました。この移植戦略により、ドナー由来細胞は長期の着床後にTmem119およびP2ry12を含む標準的なミクログリアマーカーを発現し、成熟した実質ミクリアと一致する転写的特徴を獲得しることが示されま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベルジャー	様々な	N/A	安楽死に使用
ボロシリケートガラス毛細管 フィラメント付き	Sutter Instrument	BF100-78-15	注射針に使用
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma Aldrich	A8806	PBバッファーを調製するために使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
CD11b Alexa Fluor 700	BioLegend	101222	骨髄系細胞
CD45 APC	BioLegend	103112	造血細胞
セルストレーナー (70 µm)	Falcon	352350	単一の セルサスペンションを生成するために使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
チキン抗GFP抗体	Aves Labs	GFP-1020	免疫蛍光 染色
c-Kit PE-Cy7抗体	BioLegend	105814	造血前駆細胞
共焦点顕微鏡	Leica	TCS SP5	蛍光 イメージングに使用
コニカルチューブ (15 mL/ 50 mL)	Eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301	組織/細胞処理。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
クライオスタットマシン	Leica	https://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/	凍結組織 断面を生成。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
DAPI核染色	Thermo Fisher Scientific	D1306	生存率と 核染色に使用
解剖用顕微鏡	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/	注射針のトリミングと準備に使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
FACSAriaフローサイトメーターソーター	BD Bioscience	FACSAria	細胞の精製
Fcブロック (精製CD16/32)	Biolegend	101302	Fc受容体を発現するマウス細胞への望ましくない抗体結合をブロック
胎児ウシ血清 (FBS)	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.html	細胞調製 バッファーに使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
口用ピペット用フレキシブルチューブ	様々な	N/A	手動 注射装置の構成要素
フローサイトメトリ分析ソフトウェア	FlowJo	v10.8.1	FACSデータ 分析に使用
フローサイトメトリセルソーター	BD Biosciences	FACSAria	細胞精製に使用
gentleMACS Octo Dissociator with ヒーター	Miltenyi Biotec	130-096-427	脳組織の 解離に使用
ヤギ抗チキンAlexa Fluor 488 二次抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11039	二次抗体
ヤギ抗モルモットAlexa Fluor 555二次抗体	Thermo Fisher Scientific	A-21428	二次抗体
ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 647 二次抗体	Thermo Fisher Scientific	A-21245	二次抗体
ヤギ抗ラットAlexa Fluor 647 二次抗体	Thermo Fisher Scientific	A-48265	二次抗体
モルモット抗tdTomato抗体	Frontier Institute	AB_2631185	免疫蛍光 染色
Hanksの調整塩基溶液 (HBSS)	Gibco	14175-079	細胞 調製中に使用
ヘモサイトメーター	様々な	N/A	細胞数え
口用ピペット用インラインフィルター	様々な	N/A	汚染を防ぐ
マイクログラインダー	Narishige	EG-400	ガラス 注射針のベベリングに使用
マイクロピペットプラー	Sutter Instrument	P-1000	細かい 注射針を生成するために使用
口用ピペットマウスピース	様々な	N/A	注射の 手動制御に使用
神経組織解離キット (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	脳組織の酵素解離に使用
ペトリ皿	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022	抜かれた針や組織の収穫物を保管するために使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
ウサギ抗Iba1抗体	Wako	019-19741	ミクログリアマーカー
ウサギ抗TMEM119抗体	Abcam	209064	ミクログリア特異的マーカー
ラット抗CD206抗体	BioLegend	141712	マクロファージ集団を識別するために使用
ラット抗P2RY12抗体	BioLegend	848002	ミクログリアマーカー
剃刀刃/メス	様々な	N/A	針の先端をトリミングしたり 組織の収穫に使用
RBC溶解バッファー	ChemCruz	sc-296258	赤血球の 除去に使用
ステレオタキシー装置	Kopf Instruments	https://kopfinstruments.com/	外科的 移植に使用。様々なブランドが利用可能です。ここにリストされているのは単なる例です。
Ter119 PerCP-Cy5.5抗体	BioLegend	116228	赤血球系細胞