方法論記事

複数種クマムシからのRNA抽出プロトコル

15 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/72120

⸱

2026年9月1日

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、少量の組織からRNAを抽出し、RNAシーケンシングや相補的DNA合成などのダウンストリームアプリケーションに十分な量の高品質なRNAを得るために設計されたカラム式RNA抽出キットを用いて、さまざまな緩歩動物種からRNAを単離する手順について詳述します。

要約

緩歩動物（クマムシ）は、環境ストレスに対する並外れた耐性を持つことで知られる微小動物です。これらの動物は、乾燥、極端な圧力、低温、および高レベルの電離放射線に耐えて生存することができます。しかし、これらの極限環境耐性を支える分子メカニズムは、まだ完全には解明されていません。RNAシーケンシング、RNA干渉（RNAi）、および細菌などの系における緩歩動物遺伝子の異種発現など、これらのメカニズムを調査するために用いられる分子生物学的アプローチでは、限られた生体試料から高品質なメッセンジャーRNA（mRNA）を単離する必要があります。本研究では、以下の特徴を持つ、緩歩動物からの全RNA単離のための再現可能なプロトコルについて述べます。(1) 異緩歩動物類を含む複数の種にわたって有効であること、(2) 体サイズに応じて25～200個体のみで十分であること、(3) 後続のアプリケーションに十分な量と質のRNAが得られること。本プロトコルにより、適正な個体数の緩歩動物から効率的にRNAを回収することが可能となり、さまざまな緩歩動物種におけるストレス耐性の分子生物学的研究が促進されます。

概要

緩歩動物（クマムシ）は、乾燥、極限圧、極端な温度、さらには化学療法剤や電離放射線などのDNA損傷剤に至るまで、他の動物では生存不可能な極限ストレス耐性を持つことでよく知られている1,2,3,4,5,6,7,8。近年、研究者はRNAシーケンシング、RNA干渉（RNAi）、およびヒト細胞や細菌を含む他系統への緩歩動物遺伝子の異種発現などの分子生物学的アプローチを用いて、緩歩動物の極限的な回復力の根底にあるメカニズムを調査してきた8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。これらの手法の適用により、緩歩動物がどのようにしてこのような極限的なストレス耐性を獲得しているのかについて、深い洞察を得るための強力なツールが得られた8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。しかし、緩歩動物のストレス耐性を理解するためのこれらすべての分子生物学的アプローチは、この微小な動物から、後続のプロセスで使用するのに十分な量と品質のRNAを単離できる能力に依存している。

クマムシからのRNA抽出における従来の手法は、Hypsibius exemplarisを用いる研究において有効であることが証明されていました23。しかし、H. exemplarisでこのプロトコルの再現を試みたところ、得られたRNAの濃度と品質に信頼性が欠けることが分かりました（未発表データ）。代わりのフェノールベースのRNA抽出法は、H. exemplaris、Ramazzottius varieornatus、および異クマムシ類の一種において有効であることが示されています13,21,22,24,25,26。このプロトコルは、単個体および個体群（約50匹）の両方から、後続のプロセスに十分な品質と量のRNAを提供することが示されています。ただし、このプロトコルではフェノール含有試薬を取り扱う必要があります。フェノールは慎重な取り扱いを要する有害化学物質であり、このプロトコルの不適切な実施は、フェノールのキャリーオーバーを招き、RNAの純度や後続のアプリケーションに影響を及ぼす可能性があります。クマムシからのRNA抽出に関して以前に発表された別のプロトコルは、単個体からRNAを抽出できる能力に重点を置いています27。これは定量PCR（qPCR）などのアプリケーションには有用なプロトコルですが27、動物があるストレス要因や条件にどのように反応するかをより包括的に把握することを目的とするRNAシーケンシングなどの後続アプリケーションには不適切です。

既存のRNA抽出プロトコルの制限により、緩歩動物（クマムシ）からRNAを抽出するための代替法の検討が必要となりました。本プロトコルで使用するカラムベースのRNA抽出キットは、少量の組織からRNAを抽出することを目的として市販されているものです。このキットは、下流のRNAシーケンシング解析に向けて昆虫組織からRNAを抽出するために以前に使用されており、緩歩動物のような他の小型のクチクラを有する動物からの抽出にも適していることが示唆されています。28本研究では、緩歩動物（クマムシ）を用いたこのカラムベースのRNA抽出キットの使用に関するステップバイステップのプロトコルを概説し、緩歩動物で本プロトコルを実施する際に注意すべき具体的な留意点について説明します。本記事では、6種の緩歩動物において本プロトコルが有効であったことを報告します（H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, *Paramacrobiotus gadabouti*、および異緩歩動物 Viridiscus celatus). 本研究により、わずか25匹の動物からでも、十分な品質と量のRNAが得られることが検証された。得られたRNAの濃度および品質データの例も提供されており、RNAシーケンシング（バイアスを最小限に抑えた指数関数的ライブラリ増幅）や相補的DNA（cDNA）合成などのダウンストリームアプリケーションに適したものである。このRNA抽出プロトコルは、以下の放射線耐性メカニズムを解明する上で、すでに有用であることが証明されている。 *H. exemplaris*8本プロトコルがさまざまな緩歩動物種において成功したことは、ストレス耐性メカニズム、発生メカニズム、および進化プロセスの研究に、より幅広く適用可能であることを示唆している。

プロトコル

無脊椎動物はこの要件から除外されているため、以下のプロトコルに機関の動物倫理委員会の承認は必要ありません。使用した試薬および機器は材料表に記載されています。

1. RNA抽出のための器具および作業エリアの準備

  1. RNA抽出の準備として、ヒートブロックまたはウォーターバスを42 °Cに設定して電源を入れます。
  2. マイクロチューブラック、ピペット（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）、および適切なサイズのフィルターチップを用意します。
  3. 残留しているRNaseを失活させるため、ベンチトップ、チューブラック、ピペット、およびチップボックスをRNase Away、希釈漂白剤溶液（10%）、または70%エタノールで清掃します。
    注意：機器やRNA抽出を行うエリアに過剰なRNaseが存在すると、抽出後のRNAが分解され、品質が不十分になる可能性があります。RNase失活剤を十分に作用させ、作業を開始する前にエリアと機器を完全に乾燥させることで、このリスクを軽減してください。
  4. 本プロトコルのすべてのステップで手袋を着用し、RNAのRNase分解を防ぐため、プロトコル全体を通して頻繁に手袋にRNase失活剤を塗布してください。

2. RNA抽出のための動物サンプルの採取

  1. ガラスキャピラリーを装着したアスピレーターチューブアセンブリチャンバーに接続したピペットバルブ（図 1A）、Irwinループ、またはマイクロピペットを用いて、25～200匹の個体（種のサイズによる）を培養皿から清潔な湧水を入れた皿に移し、非クマムシ物質（藻類や、種に応じた線虫や輪虫などのその他の餌）の量を減らします。
  2. 1.5 mLのRNaseフリーチューブとペスルを用意します。
  3. ガラスキャピラリーを装着したアスピレーターチューブアセンブリチャンバーに接続したピペットバルブ、またはIrwinループを用いて、個体を1.5 mL RNaseフリーチューブの底に移します。この際、個体と共に移動させる水の量を最小限にするよう細心の注意を払ってください。
  4. 4,500 gで3分間遠心分離し、クマムシをマイクロ遠心チューブの底にペレット化させます。
  5. クマムシがペレット化したチューブを解剖顕微鏡下で観察しながら、20 µLピペット、またはRNAを単離するクマムシよりも開口部の小さいガラスキャピラリーを装着したアスピレーターチューブアセンブリチャンバーに接続したピペットバルブを用いて、クマムシのペレットを乱さないように注意しながら、可能な限り多くの水を除去します。許容される残水量については図 1Bを参照してください。
    注：水を除去してから抽出バッファー（XB）を添加するまでの短い時間に個体が乾燥しないよう、少量の水を残すように注意してください。個体が乾燥すると、単離後のRNA品質が低下する可能性があります。
  6. クマムシが入ったチューブに、100 µLの抽出バッファー（XB）を加えます。

3. クマムシの機械的破砕およびRNA抽出

  1. RNaseフリーのペッスルを使用し、チューブの底でペッスルを優しく、かつしっかりと約30秒間すり潰し、緩歩動物を破砕します。計20～30回すり潰せば、緩歩動物を十分に破砕できるはずです。
  2. チューブからペッスルを取り出します。この際、可能な限り多くの液体がチューブの底に残るよう注意してください。
  3. 解剖顕微鏡下でマイクロ遠心チューブの内容物を確認し、無傷の個体が残っていないことを確かめます。
  4. 混合物を、穏やかに振盪（300 rpm）させたシェイキングヒートブロックを用いて、42 °Cで30分間インキュベートします。
    注：抽出バッファー（XB）がRNAを安定化させ、この温度での分解を防ぎます。

4. RNA単離カラムのコンディショニング

  1. 抽出インキュベーションの最後の10分間に、RNA回収および精製用のカラムを組み立てます。精製カラムを回収チューブにセットし、カラムに適切にラベルを貼ります。
  2. 250 µLのコンディショニングバッファー（CB）をカラムに直接加えます。
  3. 室温で5分間インキュベートします。
  4. 16,000 × g で1分間遠心分離し、ろ液を廃棄します。これで、次のステップでRNA上清を導入する準備が整いました。
  5. 10x DNase I 反応バッファーとヌクレアーゼフリー水をフリーザーから取り出し、以下のステップ6までに完全に融解させます。

5. コラムへのRNAの結合

  1. 抽出のインキュベーション後、機械的に破砕したクマムシと抽出バッファー (XB) が入ったチューブを3,000 × gで2分間遠心分離する。
  2. 新しいRNaseフリーチューブを用意し、適切にラベルを貼る。
  3. フィルターチップを装着した200 µLピペットを使用して、ペレット化したクマムシの角質層から上清を慎重に回収する。この際、角質層のペレットを乱さないよう注意し、上清のみを回収すること。
    注：以降のステップに角質層が混入すると、カラムが物理的に詰まり、RNAの回収効率が低下する。この潜在的なエラーを避けるため、上清を含むピペットチップを顕微鏡で観察し、角質層が含まれていないことを確認することができる。もし角質層が見られる場合は、上清をチューブに戻し、遠心分離ステップを繰り返す。
  4. 回収した上清を、ラベルを貼った新しいRNaseフリーチューブに移す。
  5. RNAを含むチューブに70%エタノールを100 µL加え、ピペッティングを繰り返して十分に混合する。このステップにおいて、エタノールを加えた際に透明で粘性のあるフィラメントが見られれば、上清にRNAが存在している良い兆候である。
  6. 混合液全体（200 µL）を、ステップ4で準備したカラムにピペットで分注する。
    注：本ステップおよび以降のステップで溶液をカラムに分注する際は、液をカラムの中央に滴下するようにし、ピペットチップがカラムに物理的に接触しないように注意すること。カラムに機械的な穴が開くと、その後のRNAの品質および量に影響を及ぼす。
  7. RNAをカラムに結合させるため、100 × gで2分間遠心分離し、続いて16,000 × gで30秒間遠心分離してフロースルーを除去する。

6. DNase I溶液の調製

  1. 溶液を調製する前に、10x DNase I Reaction BufferとNuclease-Free Waterを完全に融解させます。
  2. RNA抽出1回につき、別の1.5 mLマイクロ遠心チューブを用いて、Nuclease-Free Water 32 µL、10x DNase I Reaction Buffer 4 µL、DNase I Enzyme 4 µLからなる40 µLの溶液を調製します。この溶液は、ステップ7.3でカラムに添加するまで氷上で保持してください。

7. RNAの洗浄およびDNase I処理

  1. RNAが結合した精製カラム（ステップ5.7より）に、Wash Buffer 1 (W1) 100 µLを直接ピペットで加える。
  2. 8,000 × gで1分間遠心分離し、ろ液を取り除く。
  3. ステップ6で調製したDNase I溶液 40 µLを精製カラムに直接ピペットで加え、室温で15分間インキュベートしてDNAコンタミネーションを除去する。
  4. Wash Buffer 1 (W1) 40 µLを精製カラムにピペットで加え、8,000 × g で30秒間遠心分離する。
  5. Wash Buffer 2 (W2) 100 µLを精製カラムにピペットで加え、8,000 × gで1分間遠心分離する。
  6. さらにWash Buffer 2 (W2) 100 µLを精製カラムにピペットで加え、16,000 × gで2分間遠心分離する。ろ液は廃棄する。
  7. カラムを乾燥させるため、16,000 × gで1分間遠心分離する。

8. RNAの溶出

  1. RNA抽出回数分だけ0.5 mLチューブ（キットに同梱）を用意し、適切にラベルを貼ります。このチューブが、抽出後のRNAを保持するチューブになります。
  2. RNAが結合され洗浄済みのカラムを、ラベルを貼った0.5 mLチューブに移します。カラムがチューブにしっかりと固定されるまで差し込んでください。
  3. チューブを側面から見ながら、ピペットチップをカラムメンブレンの直上に配置し、11 µLの溶出バッファー（Elution Buffer; EB）をカラムに滴下し、室温で1分間インキュベートします。
    注意：溶出バッファー（EB）を直接カラムに分散させなかった場合、RNAの回収量が低下します。カラムの周囲に液滴が見られる場合は、溶出バッファー（EB）が適切に分散されていません。その場合は、ステップ8.5のフロースルーを用いて、溶出バッファー（EB）を確実にカラムの中央に滴下して、この工程を繰り返すことを推奨します。
  4. 遠心分離時に適切に固定するため、カラムが入った0.5 mLチューブをキット付属のコレクションチューブにセットします（図2）。
  5. 1,000 × gで1分間遠心して溶出バッファー（EB）を分散させ、次に16,000 × gで1分間遠心してRNAを溶出させます。
  6. RNAを含む0.5 mLチューブを直ちに氷上に置きます。

9. マイクロボリューム分光光度計によるRNAの量および質の検証

注：RNAの量および品質を評価するために、他の方法を用いることも可能です。ここでは、マイクロボリューム分光光度計を用いた方法を使用します。また、フルオロメーターやマイクロ流路ゲル電気泳動ツールを使用することもできます29。

  1. マイクロボリューム分光光度計のペデスタルを糸くずの出ないワイプで拭き、他の液体が付着していないことを確認してください。
  2. 選択してください RNA 分析のための分光光度計の設定。
  3. 分光光度計を～でブランク調整します。 1 µL ステップ 8.3 で使用した溶出バッファー（EB）の。
  4. ブランキング後、ペデスタル上の溶出バッファー（EB）をリントフリーワイプで拭き取ります。
  5. RNAを含む0.5 mLチューブを氷上で保持したまま、ピペットで 1 µL RNAを分光光度計のペデスタル上に滴下します。分光光度計のアームを下げてサンプルの吸光度を測定し、単離したRNAの定量および品質評価を行います。
    注：ダウンストリームアプリケーションにおける許容される品質および量に関する詳細は、以下の「結果（Results）」セクションをご参照ください。

結果

上述の通り、本プロトコルにおける重要なステップは、RNA抽出用の抽出バッファー（XB）を添加する前に、回収した緩歩動物から適切な量の水を除去することです。水が多すぎると、抽出バッファー（XB）が希釈され、個体からのRNA抽出結果が不十分（すなわち、RIN < 7、260/280比 < 1.8、260/230比 < 1.8、および/または濃度 < 5 ng/µL）となり、溶出後のRNA濃度と品質が低下します。逆に水を除去しすぎると、個体が急速に乾燥し、死後のRNase活性の上昇によって死に至る可能性やRNA品質の低下を招く恐れがあります。本プロトコルを適切に完了させるための補助として、抽出バッファー（XB）を添加する前に緩歩動物と共にチューブ内に残しておくべき適切な水量を示す視覚的な例を提示しています（図1B）。

現在まで、このプロトコルはヘテロタルディグラダ（異類緩歩動物）を含む6種類の異なる緩歩動物種で試みられています。V. celatus）。これらの抽出により、11 ng/µL 106.6 ng/までµL （マイクロボリューム分光光度計で確認済み、 表1) および 9 ng/µL 113 ngまでµL （マイクロ流体ゲル電気泳動により確認済み、 表2）。RNA分離に必要な個体数は、分離対象となる種の大きさに応じて異なります。例えば、大型の緩歩動物などの場合は、 Paramacrobiotus 種および Milnesium sp.、わずか25匹の動物からでも十分なRNA濃度を得ることができ（表1）。より小型の種などの場合は、 H. exemplaris および *V. celatus*、100匹以上の動物から分離を行う方が成功率が高くなります（表1）。分離したサンプルの大部分は260/280比が2前後であり、RNAが高純度であることが示されている。30一部の種からの分離株（*V. celatus* および *H. exemplaris*、および パラマクロビオトゥス （種）によっては、260/230比が低くなることがあり、これは試薬による汚染が示唆されます。30これは、より少ない動物数（100匹の）を使用した場合にしばしば発生しました。 *V. celatus* および *H. exemplaris*、および25を〜に使用し Paramacrobiotus属の種）、動物数が少なすぎると、最終的に溶出されたRNAに試薬が混入するリスクが高まる可能性が示唆されました。RNA品質の評価を通じて ～経由で マイクロ流体ゲル電気泳動により、RNA整合性番号（RIN）を算出することができる。RINが9～10の間であれば、分解がほとんどない高品質なRNAであることが示唆される。31 一般的に、RINが7未満の場合は、RNAシーケンシングなどのダウンストリーム工程に進まないことが推奨されます。マイクロ流路ゲル電気泳動の結果の例を以下に示します（図 3) RIN値が高いサンプルおよび低い/検出不能なサンプルから。これらのサンプルのいくつかは、以降の解析から除外された（表2, 図 3A,D）。しかしながら、RINが低いか検出不能であったサンプルの一部をRNAシーケンシング用のライブラリ調製に進めたところ、それでも質の高いRNAシーケンシング結果が得られた（表2, 図3B,F、未発表データ。詳細は「考察」を参照）。

figure-results-1
図1: RNA抽出のセットアップ. 動物の移動および水の除去に使用する、ガラスキャピラリーを備えたアスピレーターチューブアセンブリチャンバーに取り付けられたピペットバルブの画像 (A)、および Paramacrobiotus クマムシに抽出バッファー (XB) を添加する前に許容される残留水分量の例 (B)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-2
図 2: 最終溶出のための溶出チューブのセットアップ. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3: H. exemplarisおよびP. gadaboutiの代表的なマイクロフルイディクスゲル電気泳動結果. (A) 電離放射線に曝露させたH. exemplarisのRNAゲル. (B) 対照条件下でのP. gadaboutiおよびH. exemplarisのRNAゲル. (C–F) 代表的なピークプロファイル：高品質なH. exemplarisRNAサンプル (C)、品質に疑義があるH. exemplarisサンプル (D)、良好な品質のP. gadaboutiサンプル (E)、および明らかな分解が認められるH. exemplarisサンプル（147 bpにピーク） (F). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1：マイクロボリューム分光光度計を用いて測定した、様々な緩歩動物種からの代表的なRNA濃度および品質情報。*マイクロボリューム分光光度計で検出された20 ng/µL未満の濃度では、吸光度比が不正確になる場合があります。**ステップ5.7における不適切な遠心分離速度により、260/230比が低下しました。こちらをクリックして、この表をダウンロードしてください。

表 2：マイクロ流体ゲル電気泳動システムを用いて収集した2種の緩歩動物における代表的なRNA濃度および品質情報。 こちらのリンクからこの表をダウンロードしてください。

ディスカッション

本プロトコルの目的は、クマムシのストレス耐性の研究に資する下流工程への適用が可能な、十分な量と品質のRNAをクマムシから単離することを容易にすることである。本プロトコルでは、抽出バッファー（XB）を添加する前の十分な除水（ステップ2.5）、クマムシ個体の破砕（ステップ3.1～3.3）、精製用カラムへの上清の転移（ステップ5.3）、およびRNAの溶出（ステップ8.3）など、ユーザーが問題に直面する可能性のある箇所を概説している。これらのステップのいずれかでエラーが発生すると、得られるRNAの濃度や品質が低下する可能性がある。得られたRNA濃度が5 ng/µL未満である場合は、µL （マイクロボリューム分光光度計で確認後）、ユーザーは（1）開始時の動物数を増やすなどして、RNA抽出をやり直すことを検討してもよい（>小型種の場合は100、または >（大型の種の場合は50）、または(2) 水分の除去、緩歩動物の破砕、および溶出のステップに特に注意してプロトコルを繰り返す。

本記事では、RNAシーケンシングに適している、あるいは不適切であると判断されたRNA品質評価（RIN、260/280比、260/230比）の例を提示します。表1, 表2, 図3）。時折、低（<1.0) 本プロトコルを用いた一部のRNA抽出において、260/230比が観察されます（表1）、残留有機化合物の存在が示唆されます。通常、これは動物個体数の少なさと関連していました。動物の投入量を増やすことができない場合、あるいは260/230比が常に低い場合は、Wash Buffer 2 (W2) を用いた追加の洗浄ステップ（ステップ7.6を繰り返す）を組み込むこと、および／または、これらの汚染物質を確実に除去するためにステップ7.7のドライスピン遠心分離時間を延長することが推奨されます。さらに、代表的な1つの *H. exemplaris* 260/230比が低い状態で抽出された表1）は、本プロトコルを初めて使用した学部生によって行われましたが、後になって、ステップ5.7（RNAをカラムに結合させた後、エタノールを除去するための遠心分離）において、遠心速度が不適切（低すぎた）であったことが判明しました。これにより、エタノールがカラム内に残留して以降の工程に持ち込まれ、結果として260/230比の低下を招いたと考えられます。このユーザーによるその後の抽出では、260/230比は妥当な範囲内（1.5以上）となりました。したがって、こうした潜在的な問題を避けるため、すべてのユーザー、特に初めて使用する方は、プロトコルに従って操作を行う際に遠心速度に細心の注意を払う必要があります。時折、260/230比やRINが低くなることがありましたが、 H. exemplaris、同様の品質値を示すRNAは、電離放射線やその他のストレス要因への曝露後における遺伝子発現の変動を調べるための、後続のRNAシーケンシングに使用することが可能です。8 (表1, 表 2、および未発表データ）。同様に、～から単離したRNAは P. gadabouti このプロトコルを用いた結果、高いRNA濃度と品質が得られた（RINにより確認）。 表2, 図3）であり、有意義なRNAシーケンシングデータが得られた（未発表データ）。逸話的な報告として、本研究では以下のRNAを正常に使用できた。 H. exemplaris 低濃度（5–9 ng/µL) 後続のクローニングを成功させるためのcDNAを調製する H. exemplaris 遺伝子8RNAから H. exemplaris 濃度が低く、または検出不能であり、RIN（マイクロフルイディクスゲル電気泳動で測定）も低かったため、RNAシーケンシング用のライブラリ調製に進む前に、この処理についてRNAを再抽出した。表 2, 図3A,D）。このサンプルのRNA抽出をやり直すという決定（図3A,D）、他のサンプルのようにシーケンシングに進めるのではなく H. exemplaris 検出不可能なRIN（図3B,F）、マイクロフルイディクスゲル上に明瞭なバンドが見られなかったことに基づいて判断されました。これは、ローディングエラー、RNAの分解、またはRNA濃度の不足を示唆している可能性があります。対照的に、〜から単離したRNAでは *H. exemplaris* 濃度が比較的低く、RINが検出不能であり、また小サイズRNAのレベルが高いことからRNA分解の兆候が認められたが、ライブラリ調製後には利用可能なRNAシーケンシングデータが得られた（未発表データ、 表2, 図3B,F）。したがって、RNAサンプルが後続のアプリケーションに適しているかを判断するためのガイドラインをここにいくつか提示しますが、RNAの品質および量が次段階に進むのに十分であるかを評価する際は、ユーザー自身の判断に基づき、具体的な後続アプリケーションを考慮する必要があります。

緩歩動物（クマムシ）からRNAを単離したい研究者は、目的とする用途にどのプロトコルが最適であるかを決定する際に、複数の側面を考慮する必要があります。これまで報告されたすべてのRNA単離法（本手法を含む）では、RNAシーケンシング、cDNA合成、qPCRなどのダウンストリームアプリケーションをサポートするのに十分な量と品質のRNAが得られています8,12,13,17,21,22,25,27。コストはしばしば検討事項となり、特に予算の少ない研究室や教育目的のラボでは重要です。本プロトコルは、単離反応1回あたりのコストが以前に報告されたプロトコルよりも高くなります。しかし、このコスト増は、以前のプロトコルと比較してメリットがあると考えています。他のカラムベースのRNA単離プロトコル23と比較して、本プロトコルでは、より少量の投入試料（より少ない個体数）から、十分な品質のRNAを十分に得ることが可能です。さらに、「はじめに」で述べたように、以前に報告されたカラムベースのRNA単離プロトコルを我々が試みたところ、結果にばらつきがあり、ダウンストリームプロセスに不十分な極めて低いRNA収量になることが多々ありました（未発表データ）。また、本プロトコルは、ドラフトチャンバーを必要とする有害化学物質を扱う必要がないため、フェノールベースのRNA単離手法に比べて格段に安全です。さらに、フェノールベースのRNA抽出プロトコルでよくある問題はフェノールの残留であり、これがRNAの純度に影響し、ダウンストリームアプリケーションを妨げる可能性があります。これらの問題により、フェノールベースのRNA抽出は、学部生（研究室または教室のいずれにおいても）にとって利用しにくいものとなっています。ただし、コスト面ではフェノールベースの手法が最も効率的です。本プロトコルは、個体ごとのトランスクリプトーム応答を評価するために単一の個体からRNAを単離すること（Kirk et al. で発表された内容など）には適していませんが、ストレス要因に対する個体間の共通の変化を検討し、ストレス応答をより包括的に捉えるために有用です。したがって、利用者はコスト、個体の入手可能性、および既存プロトコルの利用しやすさの重要性を比較検討し、自身のニーズに最適なプロトコルを決定する必要があります。

本報告により、本プロトコルを用いることで、Heterotardigradaの代表種を含む6種の異なる緩歩動物から、十分な量と質のRNAを抽出できることが検証されました。さらに、このRNA抽出法では、妥当な個体数（種のサイズに応じて25～200個体）から十分な量のRNAを得ることが可能です。複数の種においてこのRNA抽出プロトコルが検証されたことで、緩歩動物の生物学における魅力的な側面の解明への道が開かれました。これはストレス耐性の研究にとどまらず、耐性メカニズムの進化やその発達を含む、これらの動物の進化の理解にも及びます。本プロトコルは、バイオマスが限られており、標準的なRNA抽出法が確立されていない非モデル種や野外採集の緩歩動物種にとって特に有用です。最後に、本プロトコルは研究者が容易に導入でき、学部生でも再現性高く実施可能であるため、主に学部生を教育する機関の教育研究室においても有用な資産となります。

開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

本研究は、UNC Ashevilleからのスタートアップ資金（CCH宛）および、Jason Pienaar（PKのポストドクター・アドバイザー）へのNSFグラント 2225683による支援を受けて行われました。また、技術支援をいただいたUNC High Throughput Sequencing Facilityに感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロフュージチューブUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1.5 mL 刻み付きマイクロ遠心チューブ、ナチュラル、ポリプロピレン、500本/袋
70% エタノールVWR71001-654ベンチおよび器具の洗浄用
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204本論文で説明する単離プロトコルのためのコンポーネントを含むキット
遠心機Eppendorf5405000441Centrifuge 5425、ロータリーノブ、非冷却式、Rotor FA-24x2 付属、120 V/50-60 Hz (US)
Deer Park Spring WaterAny Grocery StoreN/Aクマムシ培養用の培地であり、RNA単離前にクマムシを洗浄するために使用
解剖顕微鏡ZeissN/AZeiss Stemi 305、ズーム比 5:1、総合倍率 8x-40x、透過照明ユニット M LED 付属
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I、RNase-free (1 U/uL)
フィルター付きピペットチップ 10 uLVWR76322-528任意のフィルター付きピペットチップで可
フィルター付きピペットチップ 1000 uLVWR76322-154任意のフィルター付きピペットチップで可
フィルター付きピペットチップ 20 uLVWR76322-134任意のフィルター付きピペットチップで可
フィルター付きピペットチップ 200 uLVWR76322-150任意のフィルター付きピペットチップで可
ガラスキャピラリーFisher50-821-811World Precision Instrument 標準ガラスキャピラリー - 1B120-6 (6 inch, OD 1.2 mm, フィラメントなし)。これをフレーム上で加熱し、先端を狭めた2本のガラスキャピラリーに引き伸ばした後、適切な直径に破断させ、目的のクマムシ種を口ピペットで採取する。
ヒートブロックEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C、サーモブロックなしの基本装置、100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581TapeStationシステムを用いた全RNAの高感度分析用ラダー
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579TapeStationシステムを用いた全RNAの高感度分析用
High Sensitivity RNA ScreenTape サンプルバッファーAgilent5067-5580TapeStationシステムを用いた全RNAの高感度分析用バッファー
マイクロ流体ゲル電気泳動装置AgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
マイクロボリューム分光光度計Fisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL、検出器タイプ：2048エレメント CMOSリニアイメージセンサー、ディスプレイ：10インチ高精細カラーディスプレイ、対応言語：中国語、英語、フランス語、日本語、ドイツ語、光源：キセノンフラッシュ、スペクトル帯域幅：1.8 nm 以下 (Hg 254 nmにおけるFWHM)、電圧：12 VDC
口ピペットMillipore SigmaA5177校正済みマイクロキャピラリーピペット用吸引管アセンブリ
ヌクレアーゼフリーウォーターFisherFERR0581Thermo Scientific Water、ヌクレアーゼフリー
ピペット (2.5 uL, 20 uL, 200 uL, 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus、4本セット
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY 表面除染剤
RNase-Free チューブおよびペッスルFisher12-141-368RNA単離用のRNaseフリーチューブおよびペッスル

参考文献

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

再版と許可

タグ

RNARNARNA
動画は近日公開
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。