定量的生物物理学的測定のための低融解アガロースハイドロゲルにおけるタンパク質およびタンパク質—RNA凝縮の安定化

サマリー

ここでは、多孔質の低融点アガロースハイドロゲルマトリックス内で液体-液体相分離凝縮液を物理的に固定しつつ、内部の液体動力学を損なうことなく固定する堅牢な方法を提示します。このアプローチは、液滴の沈降、凝集、表面湿潤のアーティファクトを最小限に抑え、数時間にわたる再現可能な画像診断と定量的な生物物理解析を可能にします。

要約

液体-液体相分離によって形成される生体分子凝縮液は、RNA処理から応力顆粒組み立てまで、細胞の基本的な組織単位としてますます認識されています。精製タンパク質とRNAを用いた in vitro 再構成はモデルシステムを提供しますが、液体の滴は時間とともに粗化し、沈殿し、表面に広がり、実験期間内の定量的測定に大きな変動をもたらします。これらの凝縮液を、低融点アガロース(LMA)を0.3〜1.0% w/vで調製したまばらで光学的に透明かつ化学的に不活性なハイドロゲルに埋め込むことで、液滴を三次元的に安定化させ、より長い測定時間の方法論や繰り返し測定を行う実験装置の利用が可能になります。本論文では、LMAストックの準備、液滴形成、埋め込みに関する詳細なステップバイステッププロトコルを提示し、特定の下流生物物理的測定値の例を示します。また、分子拡散などの特定の液滴特性が、LMA埋め込み後も代表的なシステムで保持されることも示しました。この手法は、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡、超分解能顕微鏡、光漂白後の蛍光回復、核磁気共鳴分光法などと互換性があるため、健康や疾患に関連する生体分子凝縮物の定量的特徴付けを支援できます。

概要

液体–液体相分離(LLPS)は、細胞内で膜のない小器官や生体分子凝縮体(ストレス顆粒、P体、核小体1,2,3,4,5)の形成を促進します。これらの凝縮液は特定のタンパク質や核酸を濃縮しつつ、周囲の細胞質や核質との急速な交換を維持します。これは液体様挙動の特徴です(^1,2,3,4,5)。LLPSの調節障害は神経変性疾患^3,6,7など様々な疾患と関連しており、SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12など複数のウイルスの複製にも関与しています。

限定されたバッファー条件下で精製されたタンパク質とRNAを用いた凝縮液のin vitro再構成は、LLPSメカニズムを研究する基盤的なアプローチとなっています^3,4。しかし、試験管内やガラス表面の水滴は、3つの主要な現象に影響を受けやすいです。(i) 重力による沈降により、水滴が底に蓄積すること;(ii) 水滴が時間をかけてより少なく大きな構造に融合する凝集;(iii) 表面湿潤、つまり液滴が広がり、部分的にカバースリップに吸着する現象。これらの現象は定量的測定の再現性を低下させ、個々の飛沫を生理学的に重要な寸法で追跡することを困難にします¹³。これらの現象は、数分から数時間に及ぶ測定時間を延ばす方法(例:核磁気共鳴[NMR]分光法やSTORMのような超分解能顕微鏡技術)の使用をさらに制限し、長時間にわたる繰り返し測定を禁止しています。

ハイドロゲルネットワーク内の物理的固定は、これら3つのアーティファクトすべてを同時に処理します。アガロースは34〜38°C以下の温度で物理的に架橋ゲルを形成します。 0.3〜1.0%のw/v濃度では、アガロースのメッシュサイズは完全なマイクロメートルスケールの液滴を封じ込めるのに十分な大きさであり、液滴内の分子動態を妨げないほど十分に多孔質を保つことができます¹³。さらに、アガロースマトリックスの多孔性により、高分子や小分子が埋め込まれた液滴の内外に拡散することが可能です。特に温度感受性の高い系で、折りたたみドメインを持つタンパク質や、上位/下限臨界点(UCST/LCST)型の相分離に従う場合、代わりに26〜30°Cのゲリング点を持つ低融点アガロース(LMA)を使用できます。表面不動化などの代替的な防湿法は凝縮水の付着や濡れを減らすことができますが、専門的な準備が必要で、液滴の沈殿や凝集を防ぐことはできません。これに対し、アガロース埋め込みは凝縮液を空間的に固定するための簡潔で広く利用可能な方法を提供します。重要なのは、アガロースが肉腫融合(FUS)やその他のRNA結合タンパク質の立体構造を、液滴形成時に1.0%のアガロース濃度w/v¹³まで影響しないことが検証されていることです。このプロトコルは、アガロース埋め込み法を多くの相分離タンパク質系やタンパク質-RNA系で一般的に標準化し、試薬調製およびサンプル調製の段階的な指導を提供します。

プロトコル

1. アガロースストックの調製

重要:相分離サンプル(以下「ドロップレットバッファー」と呼ばれる)と同じバッファーでアガロースストックを準備し、バッファーの^{ミスマッチ}を防ぎます。例:核カプシドサンプルはバッファーA(25 mM HEPES、50 mM NaCl、pH 7.2)で調製され、アガロースストックの調製にも使用されます。
注:バッファー組成、タンパク質濃度、添加剤の使用、最終サンプル量など最終的な実験条件は、調査対象の特定の生物システムおよび特定の下流応用に大きく依存します。同様に、取得パラメータ、機器の設定、データ解析もサンプルや実験内容に大きく依存します。例えば、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドのポリ(A)を用いた調製は図 1A (共焦点蛍光顕微鏡)に記述されています。

1. 適切な量のLMA(通常のアガロース)を1.5mLの液滴緩衝管に計量します。例:2%のw/vストックの場合、20 mgのアガロースを1 mLのバッファーAに溶かします。
   注:最終アガロース濃度は、サンプル中の最終アガロース濃度に応じて1〜2%のw/vであるべきです。2%を超えるw/vは推奨されません。ピペット化がますます難しくなるためです。ピペットの先端を細く切り、ピペッティングを楽にし、特にアガロースの割合が高い場合は良いです。サンプルにLMAか通常のアガロースかはディスカッションセクションを参照してください。
2. アガロースストックを加熱ブロックまたは水浴で80〜90°Cまで加熱し、渦巻きでアガロースを完全に溶解させます(約10分かかります)。
   注意:溶けたアガロースは熱いです。慎重に扱ってください。
3. アガロースストックを加熱ブロックまたは水浴で37°C(LMA)または55°C(通常のアガロース)に平衡させます。この温度で溶液が透明で液体のままであることを確認しましょう。必要なら温度計でアガロースストックの温度を確認してください。
   一時停止点:溶融アガロースストックは30〜60分間温めておくことができます。
   より均一な加熱を確保し、目標温度を十分な精度で維持するために、アガロースを水浴で加熱することが強く推奨されます。特にLMAを扱う際には重要で、温度のわずかな差が早期ゲル化を引き起こすことがあります。
4. サンプルの準備(セクション2)後、残ったアガロースストックを+4°Cで保存します。 上記のステップ1.2および1.3に従って、使用前にアガロースストックを再度溶かし、再平衡させてください。
   注意:アガロースストックは最大2週間+4°Cで保管し、固化・融化サイクルは2〜3回以内に行うことを推奨します。汚染を防ぐために適正製造手順を遵守しましょう。再溶融や再固化に失敗した場合、または目に見える汚染が発生した場合は、早期にストックを廃棄してください。

2. サンプルの準備

1. アガロースに直接接触するすべての材料(例:ピペットの先端、チューブ、顕微鏡スライド)を加熱ブロックまたはインキュベーターに置き、約37°Cまで予温します。
2. アガロースストックはセクション1で示した通りに準備します。
3. 標準プロトコルに従い、液滴バッファー、相分離成分(例:タンパク質やRNAストック)、および他の添加剤(例:クラウディング剤、染料)を試料に準備します。室温(RT)に平衡。例:バッファーA(25 mM HEPES、50 mM NaCl、pH 7.2)、ヌクレオカプシドタンパク質ストック(60 μM、バッファーA中)、ポリ(A)ストック(30 μM、バッファーA中)。
   注:光漂白後の蛍光回復(FRAP)、共焦点蛍光顕微鏡、または確率的光学再構築顕微鏡(STORM)では、それぞれ蛍光標識タンパク質またはRNAを少量またはRNAストックに加えます(推奨:<%標識割合)。
4. 液滴バッファー、アガロースストック、相分離成分(例:関心のあるタンパク質やRNA)、およびサンプルに必要な補助添加剤(例:クラウディング剤)の体積を計算します。例:バッファーA6μL、2%アガロースストック5μL(最終0.5%)、ヌクレオカプシドタンパク質5μL(最終15μM)、ポリA4μL(最終6μM)。最終体積 20 μL。
   注:実験に使用される皿、チューブ、プレート、その他の容器に大きく依存しますが、一般的に使われる容量は、3 mm NMRチューブで150 μL、6チャンネル顕微鏡スライドでの顕微鏡やFRAP実験で20 μL、18ウェル顕微鏡スライドのSTORM実験で20〜30 μLです(材料表参照)。
   1. 標準的な生物物理アッセイでは最終0.3–0.5% w/vアガロース、長期安定化(例:老化実験)には0.8–1.0% w/vを基準にします。
      注:長期的なサンプルの安定化および保管のためには、サンプル脱水を防ぐ対策(例:サンプル容器の密封、加湿チャンバーでの保管、蒸発バリアの追加)および緩衝剤組成とpHの長期培養時に安定を保つ必要があります。
   2. NMRサンプルの場合、ロックのために最後の5% v/v D2Oを試料に加えます。
      注:他のすべての成分の濃度や総試料量は、具体的な用途や実験環境によって大きく異なります。
5. バッファー、相分離成分、アガロースストック、添加剤の該当する体積を予温した1.5 mLチューブに加えます。
   注意:まずバッファーとアガロースを加え、その後に補助添加物を加えることを推奨します。さらに、凝縮液形成を引き起こすために相分離成分を最後に添加することを推奨します。しかし、最適な混合順序はシステムによって異なり、事前に決定しておくべきです。これは特に、化学量論や付加の次数が液滴の大きさや区画化に強く影響するシステムに重要です。例:ヌクレオカプシドサンプルの混合順序は、ステップ2.4で記載された体積を用いて、まずバッファーA、次にアガロースストック、第三にヌクレオカプシドタンパク質、最後にポリ(A)です。このサンプルでは、LLPSはpoly(A)の追加によってトリガーされます。LLPSが可視の濁度を生じるシステムでは、濁度が定性的QC指標として機能します。しかし、発症時間や視界はシステムに依存しており、即時の濁度の欠如だけではプロトコルの失敗を示すものではありません。
   1. チューブを加熱ブロックや水浴に置きながら、ピペットを数回上下に動かしてください。気泡の発生は避けてください。
      注意:アガロースがまだ液体のままですが、滴が融合することもあります。したがって、ゲル化を開始する前に加熱ブロックや水浴での前キュベーション時間を変化させることは、異なるサイズの液滴を調査する際に有用なツールとなります。アガロース不在時にインキュベーション前の時間間隔を選択する前に液滴成長速度論を特徴付けることで、研究者は特定の液滴サイズ範囲を再現性的に標的化することが可能になります。
6. 顕微鏡/FRAP試料の場合:
   1. 通常のピペットを使って、サンプルを選んだ顕微鏡スライド(例:カバースリップボトム付きのチャネル顕微鏡スライド)に素早く移します。
   2. RTでゲル化を5〜10分間許可してください(議論の注参照)。
      注意:この期間中は顕微鏡スライドを動かさないでください。蛍光サンプルを光から守りましょう。
   3. 標準プロトコルに従ってサンプルを測定してください。例:回転円盤共焦点顕微鏡、100×1.45平面APOオイル対物レンズ、Cy3染料の励起波長561 nm、30%レーザー出力(Cy3)で100 ms、6%光強度(明視野)で50 msの取得。FRAPの場合:液滴^直径の1 /10の漂白領域を液滴の中央に配置し、漂白前フレーム25枚(遅延なし取得)、漂白後60フレーム(1秒間隔で撮影)、70%レーザー出力で15msのレーザーパルスを漂白します。オープンアクセスソフトウェアにおけるフルスケール正規化によるFRAP回復を分析すること;フィッティングが行われた場合にのみ運動学的フィッティングパラメータを報告してください。
7. STORMサンプルについて:
   1. 通常のピペットを使って、サンプルを素早くSTORMスライド(例:カバースリップボトム付きの18ウェルチャンバースライド)に移します。サンプルを滴として配布します。
   2. RTでゲル化を5〜10分間許可してください(議論の注参照)。
      注意:この期間中は顕微鏡スライドを動かさないでください。蛍光サンプルを光から守りましょう。
   3. 井戸全体にSTORMバッファーを充填してください。標準手順に従って井戸を封閉してください。
   4. 測定前に少なくとも1〜2時間、サンプルを平衡させてSTORMバッファーがアガロースハイドロゲルに拡散できるようにします。
      注:蛍光染料がSTORM取得中に点滅すれば、STORMバッファーの試料への拡散が成功することは容易に確認できます。試料の仕様によっては、より長い平衡時間が必要になることもあります。
   5. 標準プロトコルに従ってサンプルを測定してください。例:Ti2倒立顕微鏡、SRアポクロマット TIRF 100x 1.49油対物レンズ、高傾角薄型照明。1サンプルあたり20,000フレームの取得、64×64ピクセルの視野、Cy5染料用125 mW 647 nmレーザーでの露光時間10ms、長寿命のダーク状態から基底状態への移行を支援するために20 mW 405 nmレーザーを使用します。画像は多発光フィッティングを用いた最尤推定を用いて処理されました。ドリフト補正を適用し、最終的な可視化には25 nm以上の定位精度を持つデータ点のみが含まれました。最終画像は平均シフトヒストグラム法を用いて20倍(最終画像では1ピクセル=8 nm)で生成されます。
8. NMRサンプルの場合:
   1. 長くて細いガラスピペット(予温済み)を使って、サンプルをNMRチューブに素早く移します。サンプルはチューブの底から抽出します。
   2. RTでゲル化を5〜10分間許可してください(議論の注参照)。
      注意:この期間中はNMRチューブを振らないでください。
   3. 標準プロトコルに従ってサンプルを測定してください。例:PATXI室温プローブを用いたNMRの場強度750 MHz、3 mm管、25°Cでの取得、拡散実験用の標準パルスシーケンス(stebpgp1s19)、パラメータ:32回のスキャンで4,096ポイント、勾配強度2–95%、拡散時間0.08秒、勾配パルス12 ms、緩和遅延(d1)5秒。

結果

このプロトコルは、FUS N末端ドメイン(FUS NTD)またはSARS-CoV-2ヌクレオカプシド(N)タンパク質によって形成される凝縮体に適用され、タンパク質単独およびタンパク質RNAドロップレットの代表例としてポリ(A)またはs2mRNAが挙げられました。試験条件下でアガロースが凝縮液形成に検出可能に影響を与えるかどうかを評価するため、0.5% w/v LMAの有無でNタンパク質とポリ(A)を組み合わせて液滴を形成しました。LMAはRTで約5分後に固化するため、この時点で蛍光顕微鏡画像を記録し、両者とも液滴の大きさがほぼ同じであることを観察しました(図1A,B)。アガロースの液滴湿潤および融合に対する予防効果を示すため、サンプル準備から60分後に別の画像セットを記録しました。アガロースに埋め込まれた液滴の大きさは変化しませんでしたが、LMAがない場合の凝縮液は融合と表面湿潤により大きく増加しました(図1A,B)。核生成後比較的早く液滴を埋め込みましたが、埋め込み前のインキュベーション時間を変化させることで異なるサイズの液滴を埋め込むことができます。アガロースハイドロゲルに液滴を埋め込んだにもかかわらず、測定された凝縮液の動態は検出されなかった。FRAP回収率およびそれに伴う見かけの液滴拡散は、試料中のLMA有無に非常に類似していました(図1C)。さらに、FUS NTD凝縮液を用いた従来の拡散順序NMR分光法(DOSY)実験では、アガロース濃度によって拡散速度が検出可能に影響を受けないことが示されており、少なくとも0.25〜1% w/vの範囲では(図1D)(Emmanouilidisら¹³より引用)。これらの結果は、アガロースハイドロゲルが位相分離凝縮液を空間と時間で捕捉するのに適しており、長期間にわたる繰り返し測定が可能であることを示しています。

顕微鏡測定とFRAP測定は記録が比較的速く(数秒から数分)ですが、一部の実験では数分(例:STORM、1D ^1HNMR)や数時間(例:2D [¹⁵N 1 H] HSQC NMR)を要します。このような実験では、液滴が獲得過程で静止し、時間とともに沈殿しないことが極めて重要です。ここでは、L-M.A.T.n.T.+s2mのRNA滴をLMA中に安定化させ、STORM画像を取得するまで十分に確保したことを示しています(図1E)。さらに、アガロースの有無におけるFUS NTD液滴のNMRスペクトルは線幅がほぼ一致しており、これらの条件下でアガロース水素ゲルとタンパク質の間に検出可能な相互作用は存在しないことを示唆しています(図1F)(Emmanouilidisら¹³より適応)。対照的に、アガロース埋め込み凝縮液のスペクトルは信号強度が高かった。これは、取得中にNMR管内に沈降した非安定化液滴が測定対象になくなったためと考えられる(図1F)(Emmanouilidisら¹³より引用)。結論として、アガロースハイドロゲル中の凝縮液の安定化は、時間経過実験を可能にするだけでなく、測定された液滴特性を保持しつつ、取得時間を延ばす方法論の適用も可能にします。

図1:測定された液滴特性を検出せずにアガロース埋め込みによる凝縮液安定化。(A) 15 μM ヌクレオカプシドタンパク質の蛍光顕微鏡検査で、バッファーA(25 mM HEPES、50 mM NaCl、pH 7.2)をバッファーA(25 mM HEPES、50 mM NaCl、pH 7.2)で、0.5% w/v LMAの有無(アガロースなし)の有無にといった場合に実施。画像は混合/アガロース埋め込みから5分または60分後に取得されました。画像は、n=2の独立した実験で取得された7枚の画像を代表しています。スケールバー=5μm。 (B) 凝縮液の液滴半径の定量化(A)。データはボックスプロットとして表示されます(ボックス=四分位差範囲、中心線=中央値、ウィスカー=残りデータの範囲、点=外れ値)。各条件±平均半径(標準偏差)および解析された滴数がグラフ上に直接示されています。データは正規分布に従っています。個々の滴は統計的推論のために独立した生物学的複製として扱われませんでした。統計的検定は行われませんでした。分布は記述的に示されています。 (C) 時刻5分時点に示された(A)の液滴のFRAP。光漂白は561nmレーザー(Cy3)で行われました。データは正規化された強度(平均±SDがn=3回の独立複製を条件ごとにn=3回)で示しており、漂白信号を漂白前の値、同じ試料の未漂白領域、背景蛍光に正規化することで得られます。 (D) バッファーB中の200 μM FUS NTDタンパク質の減衰されていないDOSYシグナル(30 mM HEPES、200 mM KCl、600 mM 尿素、pH 7.3)が、0.25、0.5、または1.0% w/v 通常のアガロースを存在した場合に検出。N = 1。 (E) 15 μM Cy5-ヌクレオカプシドタンパク質(5%標識)と6 μMウイルスs2m RNAをバッファーA(0.5% w/v LMA)で共焦点蛍光顕微鏡およびSTORM画像。n=3つの独立した実験の代表例。両方の画像でスケールバー=1μmです。 (F) 1D ^1HNMRスペクトル(左)および2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMRスペクトル(右)は、バッファーB中の200 μM FUS NTDで、0.5% w/v通常のアガロースの有無にかかわらず。N = 1。パネル(D)および(F)はEmmanouilidisらからの再現です。¹³ この 図の拡大版はこちらをクリックしてください。

ディスカッション

生体分子凝縮液のアガロース埋め込みの成功は、いくつかの要因に依存しています。まず、アガロースは早期ゲル化を防ぐのに十分な温度を維持しつつ、生体分子構造や相互作用を乱さない温度でなければなりません。低融点アガロースはゲル点が26〜30°C、融点が60〜65°Cであるのに対し、通常のアガロースはゲリング点が34〜38°C、融点が90〜95°Cです。 次に、迅速な混合と最終反応容器(例:NMRチューブ)への移動が極めて重要であり、タイミングや温度のわずかなずれが埋め込みの不均一を引き起こし、再現性が損なわれることがあります。

これらの重要な点にもかかわらず、この方法はさまざまな実験ニーズに容易に適応可能です。本質的に無秩序なタンパク質を持つ相分離系や熱変性に弱い系では、コスト削減のためにLMAの代わりに通常のアガロースを使用できます。折りたたみドメインを持つタンパク質を含む試料や、熱変性が起こりやすい他の温度感受性(生体)分子を製製する場合、変性を防ぐためにLMAを用いるべきです。加熱のみ/アガロースなしの対照試料は、アガロース埋め込みの影響と一時的な試料加熱の影響を分離するために作成できます。これらの温度依存的な変性効果のリスクを減らすために、低融点のアガロースは特に温度に敏感な試料に適しており、アガロース濃度はメッシュのサイズや機械的閉じ込め度を調整することができます。最近開発されたLLPS REDIFINE^15,16のような高感度拡散測定では、沈殿を防ぐ最低アガロース濃度が通常望ましく、通常は0.3〜0.5%のw/vが推奨されます。数週間から数か月の安定性を要する成熟実験では、0.8〜1%のw/vが望ましい。これらのパラメータは、凝縮液の形態や動力学を検出的に変化させることなく効果的な安定化を確保するよう最適化され、常に特定のシステムに合わせて適応されるべきです。この検証には、アガロース埋め込みの有無(および同一条件)のサンプルの比較や、濃度依存的なメッシュ効果を除外するための異なるアガロース濃度の比較が必要であり、例えば顕微鏡による液滴形態の評価、FRAPによる拡散の評価、または研究者にとって重要な液滴特性を評価する他の方法を用いることが含まれます。

ゲル化時間も重要な考慮事項です。アガロースが固まるまでの時間は、バッファーの種類、pH、最終アガロース濃度、開始温度、低融点アガロースか通常のアガロースかなど、いくつかの要因によって異なります。通常、アガロースは5〜10分以内に固まります。アガロースストックのゲル化は、試料のゲル化の指標として利用できます。同様に、アガロース埋め込み前の培養前時間を変化させることで、異なる液滴サイズの再現可能な特性評価が可能になります。バッファの選択^{も非常に重要です。}アガロースストックは、サンプルの不一致を防ぐために、サンプル準備に使われる同じバッファーで準備することが非常に重要です。バッファは、系が位相分離することが知られているものであるべきです。

温度感度は各系ごとに考慮すべきです。多くの位相分離系は、UCST/LCST型LLPSとして知られる熱可逆位相挙動を示します。したがって、アガロース混合中にわずかに高温にさらされることを検証し、相の挙動や測定された液滴特性に影響を与えないか確認する必要があります。問題が発生した場合は、温度条件の精製、取り扱い時間の短縮、アガロース濃度の調整で通常対処できます。例えば、LMAストックは理想的には37°Cまで加熱されますが、LMAストックは33〜35°Cでも液体のままです。

トラブルシューティングは、試料や実験環境によって異なる故障モードが発生する可能性があるため重要です。アガロースと混合した際に液滴が溶ける場合、これはLMAが温かすぎるかバッファーの不一致が原因かもしれません。この場合、LMAストックは目標温度の正確に数度低い温度に保ち、対象のタンパク質/RNAと同じバッファーで準備する必要があります。ピペット先端で早期ゲル化が起きた場合、それはLMAが冷えすぎているか、先端が予熱されていないことが原因かもしれません。これを避けるため、チップとチューブは37°Cまで予温され、オペレーターは迅速に作業し、加熱ブロックは目標温度に保たれるべきです。濡れ、凝集、沈殿が時間とともに起こる場合、それはゲルがまばらすぎるか、ゲル化が不均一であることが原因かもしれません。この場合、LMA濃度を上げることができ、室温でも均一なゲル化が保証されるべきです。アガロース溶液に可視粒子が含まれている場合、それはアガロース溶解が不完全であることが原因かもしれません。この場合、アガロースは完全に透明になるまで加熱し、使用前に十分に混合(例:ボルテックス処理)する必要があります。混合やピペッティング中に気泡が入ると、イメージングに干渉し、凝縮液の分布が不均一になる可能性があります。気泡の発生を最小限に抑えるために、溶液はゆっくりピペットで上下に混ぜて優しく混ぜます。ゲル化の不均一や凝縮液分布の不均一が観察された場合、それはゲル化中の混合不足や局所的な温度勾配が原因である可能性があります。この場合、サンプルは加熱ブロック(または水浴)に置き、すべての成分が加えられ、即座にしかし優しく混合され、均一な温度条件で固化させる必要があります。急な温度勾配は避けるべきです。室温での固化が推奨されており(冷蔵庫での固化は避けるべきです)。長期実験では、試料の蒸発が溶質濃度や凝縮液の性質を変化させることがあります。蒸発を最小限に抑えるために、サンプルは適切に密封し、可能な限り湿度管理された環境で保管されるべきです。

パラホルマルデヒド固定法とは異なり、アガロース埋め込みは試料を化学的に固定しません。したがって、凝縮液は動的であり、機能的研究には有利ですが長期貯蔵は制限されます。長期の実験期間では、蒸発やpHシフトなどのバッファー変化を防ぐための予防措置が必要です。さらに、アガロースはこれらのアッセイで一般的に相互作用が少ないものの、拡散や局所環境への間接的な影響も考慮すべきです。アガロースと生体分子間の相互作用、例えばタンパク質の非特異的結合が疑われる場合は、メッシュサイズや多孔率が一致する光架橋ポリエチレングリコールジアクリレート(PEG-DA)などの代替ハイドロゲルマトリックスを検討できます。相互作用の不在は、行列の有無でFRAPを測定することで検証すべきです。

化学的固定に加え、BSA、PEG、界面活性剤被覆面や支持脂質二重層などの表面不動化戦略が一般的に用いられ、凝縮液の付着や濡れを軽減します。これらの方法は表面の相互作用を効果的に最小限に抑えますが、凝縮水の移動、堆積、融合を防ぐことはできません。したがって、アガロース埋め込みはこれらの手法を補完し、凝縮液の動態を維持しつつ物理的な固定性を提供し、長時間の実験、三次元イメージング、安定した試料位置決めを必要とする定量的測定に特に有用です。したがって、方法の選択は実験目的に基づいて判断されるべきです。

全体として、アガロースハイドロゲルは凝縮液を三次元で安定化させるシンプルかつ効果的な手段を提供します。これにより、液滴の濡れや融合を検出せずに、代表的なシステムの本質的特性を検出せずに防げ、NMR分光¹⁵のような長時間の取得時間を要する時間経過実験や技術を可能にします。この方法は多くの理由ですべての相分離系に適しているわけではありませんが、ここで提示した方法は複数の生体分子凝縮体の研究に適用可能であり、特に神経変性疾患のメカニズムに関連する成熟過程の調査に有用です¹⁷。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLチューブ	ブランドは問いません	N/A
18ウェルチャンバースライド	ibidi	81816	STORM用
アガロース、低凝固温度	Sigma-Aldrich	A9414	分子生物学グレード
アガロース、超純	Invitrogen	16500500
チャネルスライド	ibidi	80606	顕微鏡用
共焦点顕微鏡	Nikon	N/A
Cy5染料、NHSケミストリー	Jena Biosciences	FP-201-CY5	タンパク質のラベリング用
D2O（重水）	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORMバッファ	idylle	KMO|ETE+
FUS NTDタンパク質	N/A	N/A	参考文献13（Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021）で説明されているように、当研究室で組換え発現
ヒーティングブロックまたは水浴	ブランドは問いません	N/A	どのメーカーまたはモデルでも可
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
画像解析ソフトウェア	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR分光器	Bruker	N/A	750 MHz、PATXI室温プローブ、詳細は参考文献13を参照（Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021）
NMRチューブ	Bruker	N/A	3 mm、ガラス
P10、P20、P200およびP1000ピペット	ブランドは問いません	N/A
pCp-Cy3染料	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	RNAのラベリング用
poly(A) RNA	N/A	N/A	当研究室でインハウスでin vitro転写、長さ約50ヌクレオチド、Kathe et al. Mol Biol Cell 2024に記述あり
s2m RNA	N/A	N/A	当研究室でインハウスでin vitro転写、長さ45ヌクレオチド、配列：5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3'、Kathe et al. Mol Biol Cell 2024に記述あり
SARS-CoV-2核タンパク質	N/A	N/A	Kathe et al. Mol Biol Cell 2024に記述されているように、当研究室で組換え発現
プロット用ソフトウェア（例：R）	R-Project	バージョン4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM顕微鏡	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORMプラグイン	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
使用するピペットのチップ	ブランドは問いません	N/A
TopSpin	Bruker	バージョン3.2と4.1
尿素	Sigma-Aldrich	U5128