このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

造影磁気共鳴画像法による脳脊髄液輸送のイメージング 経由で げっ歯類における脳室内注入

85 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/72175

⸱

2026年8月28日

 ,  , 
1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

この記事について

サマリー

本記事では、げっ歯類におけるダイナミック造影MRI（DCE-MRI）研究に最適化した、脳室内カニュレーションおよびトレーサー注入プロトコルを紹介します。このプロトコルにより、画像取得中の持続的なトレーサー投与が可能となり、単一の連続したイメージングセッション内で、脳全体のトレーサー輸送および脳からの除去のマッピングを行うことができます。

要約

脳室内（ICV）カニュレーションにより、脳脊髄液（CSF）循環経路の起点である側脳室へ、外来のトレーサーや治療薬を直接投与することが可能になります。注入された分子は、CSFのバルクフローによって脳室区画を通りくも膜下腔まで輸送され、その後、血管周囲腔をvia（経由して）脳実質へと浸透します。しかし、従来のICVカニュレーション法では通常、強磁性カニューレが使用されるため、MRI研究とは適合せず、スキャナーの外で注入を行い、撮像前にカニューレを除去する必要があります。動物の移動や撮像セットアップに要する時間により、トレーサー輸送の初期段階という、おそらく最も重要な局面を逃してしまうことが多々あります。本編では、ダイナミックMRI撮像中のスキャナー内での連続的なトレーサー投与を可能にする、げっ歯者向けのMRI適合ICVカニュレーションおよび注入プロトコルについて説明します。注入ラインはすべて非磁性材料で構成されており、1回のセッション内で中断することなく画像取得が可能です。このアプローチは、CSFダイナミクス、グリンパティック輸送、溶質クリアランス、および髄腔内薬物投与のダイナミック造影MRI研究に非常に適しています。

概要

脳は体内で最も代謝活性が高くダイナミックな臓器の一つであり、正常な神経機能を維持するために効率的に除去されなければならない老廃物を絶えず生成しています1。代謝廃棄物の蓄積は、神経変性および脳老化の特徴です2。グリンパティック系はこの除去プロセスにおいて中心的な役割を果たしており、脳脊髄液（CSF）のバルク流と、CSFと間質液（ISF）との交換を通じて、代謝副産物や毒性廃棄物の除去を促進しています3,4,5。このプロセスは、アストロサイトの足突起に位置するアクアポリン4（AQP4）水チャネルによって促進されます6。さまざまなCSFトレーサーの輸送を研究することで、CSFダイナミクスに関する深い理解が得られてきました。ガドリニウム造影剤（GBCA）を用いたダイナミック造影MRI（DCE-MRI）は、脳全体のトレーサー輸送を評価するのに特に適しています7,8。このアプローチの臨床的妥当性は、ヒトでのトランスレーショナル研究によって実証されています。ヒトの脳におけるCSFダイナミクスを評価するために、GBCAの髄腔内投与とそれに続く連続的なMRI撮影が行われました9。その後の研究により、脳全体のトレーサー輸送と、それに続く一晩での除去が示されました10。この手法は最近、頭蓋内圧-容積予備能が低下した被験者や、特発性正常圧水頭症の患者において、周動脈性のトレーサー輸送が損なわれていることを明らかにするために適用されました11。これらの研究により、CSFトレーサー輸送のDCE-MRIは臨床的に応用可能なアプローチとして確立され、CSFダイナミクスおよび廃棄物除去の調節に関するメカニズム解明のための、厳格で再現性のある前臨床法の開発が促されています。

トレーサーの送達を目的としたグリンパティック系の研究では、一般的に大槽内（ICM）カニュレーションが用いられている。12しかしながら、送達されたGBCAsの約20%のみが 〜経由で これらの経路で脳実質へと輸送され、その大部分は脊髄またはリンパ系へと直接排出される。8この手法には、小脳や脳幹を損傷させるリスクが伴い、また長期的な研究のためにカニューレを固定することは技術的に困難なままである。より堅牢な代替案として、脳室内（ICV）カニューレ挿入法が登場している。13,14,15最近の研究により、本手法の再現性と、蛍光トレーサー投与における主要な利点が実証された。これには、動物が自由に動き回ることが可能で、縦断的研究における繰り返しのトレーサー注入を可能にする安定したカニューレ固定が含まれる。13.

これらの利点があるにもかかわらず、既存のICVカニュレーションプロトコルはMRI研究に直接的に適用することはできません16。ICVカニュレーションには脳実質の貫通が必要であるため、通常は強磁性カニューレが使用されますが、これはMRI画像において深刻な磁化率アーチファクトの原因となります。その結果、トレーサーの注入はスキャナーの外で行う必要があり、動物をイメージングのために移動させる前にカニューレを抜去しなければなりません。一般的なワークフローでは、ベースラインスキャンを取得し、動物を外に出してカニュレーションとトレーサー注入を行い、その後、後続のダイナミックスキャンのために動物を再び配置するという手順になります。このような中断を伴うワークフローでは、ベースラインに基づいた連続的なデータ取得ができず、再配置による位置ずれが生じるため、ボクセル単位のキネティック解析に影響を及ぼす可能性があります。さらに重要な点として、初期取り込み相は通常、トレーサーキネティクスにおいて最もダイナミックかつ一過性の期間であるため、この時間枠の中で動物の移動やスキャナーのセットアップを行うと、最も有益なデータが失われることになります。

ここでは、MRI互換のICV注入ラインと、スキャナー内での造影剤投与機能を統合することで、げっ歯類における連続的なダイナミックMRI撮像を可能にし、これらの限界を解消するプロトコルを提示します。この手法により、単一の連続した撮像セッション内で、脳全体のCSFトレーサー輸送の定量的なマッピングが可能になります。本プロトコルは、脳全体のCSFダイナミクス、グリンパティック輸送、および溶質クリアランスキネティクスの研究に適しています。ここでは成体ラットについて記述していますが、カニューレ挿入座標および注入パラメータを適切に調整することで、マウスにも適用可能です15。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

以下に記載するプロトコルは、実験動物の飼養および使用に関するガイドラインおよび公衆衛生サービス（PHS）の実験動物の人道的な飼育および使用に関する方針に基づき、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認されました（A-3145-01-2023-0015）。使用した試薬および器具は材料表に記載されています。

1. 輸液ラインの準備

  1. ギザ刃のハサミを使用して、30 mmの銅製カニューレセグメントと2 mのポリエチレン（PE）チューブを切り出します。
  2. 顕微鏡下で、30 Gの針を用いてPEチューブの一端を慎重に広げ、拡張した端に銅製カニューレを挿入し、接合部をシアノアクリレート系接着剤で固定します。PEチューブの反対側の端を30 Gの針に接続します。
    注：銅は延性が非常に高いため、切断時にルーメンを潰さないよう注意してください。組み立て時にカニューレを変形させたり、チューブに穴を開けたりしないでください。PEチューブの長さは、シリンジポンプをスキャナーの周辺磁場外に配置できる長さにしてください。
  3. カニューレとチューブのアセンブリに脱気したトレーサー溶液を満たし、50 µLのHamiltonシリンジに接続します。漏れを防ぐため、シリンジの先端をポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製シールテープで巻きます。この工程で気泡が混入しないよう十分に注意してください。
  4. Hamiltonシリンジをシリンジポンプに取り付け、さらに30 µLのトレーサー溶液をシリンジ内に吸引します。

2. カニューレ挿入手順

  1. ラットの体重を測定し、ケタミン (90 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) を腹腔内投与して麻酔をかける。足指つまみ反射により、麻酔深度が十分であることを確認する。必要に応じて初回投与量の3分の1を追加投与し、次へ進む前に再確認する。
  2. 頭部と頸部を剃毛し、浮いた毛を取り除いた後、70% エタノールパッドで露出した皮膚を滅菌する。
  3. ラットを脳定位固定装置に固定し、動物の下に吸水紙で覆ったヒーターパッドを設置する。角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼軟膏を塗布する。
  4. ノーズクランプを調整して頭蓋骨を水平にする。正中線に沿って切開し、4つの止血鉗子で皮膚を牽引してブレグマとラムダを露出させる。3% 過酸化水素を頭蓋骨に塗布し、残存する骨膜を除去して指標の視認性を高める。
    注：再現性のあるカニューレ留置には、正確な頭蓋骨の水平出しが不可欠である。実用的な品質管理措置として、ブレグマとラムダにおける内外側 (ML) および背腹側 (DV) 座標を比較する。頭蓋骨が適切に水平であれば、2つの指標間の差はMLおよびDV軸のいずれにおいても 0.2 mm を超えてはならない。
  5. 微細ドリルビットを装着した電動ドリルを定位固定アームに取り付け、アームがしっかりと固定されていることを確認する。
  6. ドリルビットをブレグマに合わせ、その後後方に 0.7 mm、右外側に 1.4 mm 移動させる。ドリルビットを頭蓋骨表面に接触するまで下げ、DV 座標を記録する。
  7. 顕微鏡下で、ドリルを 0.1 mm 刻みで進める。頭蓋骨を貫通した時点で直ちに停止する（成体ラットの一般的な頭蓋骨の厚さは 0.3–0.4 mm である）。
  8. 定位固定アームのドリルを、あらかじめロードしたカニューレに交換する。注入ポンプを短時間作動させ、カニューレの先端から液体がわずかに出現することを確認し、流路に閉塞がないことを確認する。
  9. カニューレが頭蓋骨表面に対して垂直に取り付けられていることを確認し、穿孔部位の上に合わせる。カニューレを 0.1 mm/s の速度で、硬膜表面から 3.5 mm 下の最終目標深度まで進める。
  10. カニューレと頭蓋骨の接合部に組織接着剤を1滴塗布する。硬化後、頭皮の切開部を縫合して閉じ、MRI コイルとの接触を避けるため、銅製カニューレを頭蓋骨表面と平行になるように緩やかに曲げる。

3. MRIのセットアップとダイナミック撮像

  1. ボリューム送信コイルをスキャナーのアイソセンターに配置します。
  2. 動物をMRI対応のクレードルに腹臥位で移動させる。呼吸センサーおよび直腸温度プローブを含む生理学的モニタリングシステムを接続する。循環式温水バスを起動し、体温を約〜に維持する。37 °C.
  3. 補充的に投与されるイソフルランを用いて、スキャンセッション中、適切な麻酔状態を維持してください。 ～経由で ノーズコーン。呼吸数を分間50〜70回に維持するため、イソフルラン濃度を0.25%から1.0%の間で調整する。
    注：カニュレーション手術前に投与したケタミン・キシラジン麻酔により、MRIクレードルへの最初の移動時には鎮静効果が持続します。イソフルランは徐々に導入し、スキャン中は呼吸数を継続的にモニタリングしてください。
    注意：イソフルランは吸入のリスクがある揮発性薬剤です。能動的な回収装置を使用し、人員の曝露を最小限に抑えてください。
  4. 輸液ポンプを磁場漏洩範囲外に設置し、輸液速度を〜に設定します。 1 µL/min また、注入時間を20分とし、これは全注入量として以下に相当します。 20 µL緊張やずれを防ぐため、注入ラインをクレードルに沿って慎重に配置し、固定します。
    注意：強磁性体はMRIスキャナーの近くに置かれると、危険な飛散物となる可能性があります。MRI非対応の機器はすべて、漏洩磁場（フリンジフィールド）の外に置いてください。
  5. サーフェスアレイコイルを、脳の中心に合わせて頭蓋骨背側に直接装着します。コイルと切開部位の間に少量の吸水紙を挟み、創部からの浸出液を吸収できるようにします。
  6. 脳がアイソセンターに位置するまで、クレードルを磁石の中へ進めます。輸液ラインおよび生理学的モニタリングリードに妨げがないことを確認してください。
  7. スキャナーの初期セットアップを行い、解剖学的画像を取得して、カニューレが正しく留置されていることを確認する。
  8. ベースライン画像の取得後、注入ポンプとダイナミックスキャンを同時に開始し、合計3時間まで撮像を継続する（参照 表 1 （取得条件の詳細については）。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

外科用ワークステーションは、側脳室（ブレグマから後方に0.7 mm、外側に1.4 mm；図 1A,D）を標的としてドリルを精密に配置できるように構成されています。注入ラインは、30 mmの銅製カニューレ、2 mのPEチューブ、およびHamiltonシリンジに接続された30 Gの針で構成されています（図 1B）。チューブを長くすることで、シリンジポンプをスキャナーのフリンジフィールドの外に配置することが可能です。穿孔後、あらかじめ準備した注入ラインをステレオタキシスアームに取り付け、カニューレを硬膜表面から3.5 mmの深さまで側脳室内に挿入します（図 1C）。固定後、MRIコイルとの接触を防ぐため、カニューレを頭蓋骨表面と平行に曲げます（図 1E）。

ICVカニュレーションの成功は、脳室系とカニューレの挿入経路が...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここで述べるプロトコルは、ICVカニュレーションをスキャナー内注入およびダイナミックMRI撮像と統合したものであり、単一のイメージングセッション内で脳全体のCSFトレーサー輸送の定量的な評価を可能にします。ICV注入の有用性と限界は、ICM注入と比較することで最も適切に評価できます。ICM注入は脳実質を貫通するカニュレーションを避けるため、侵襲性が低くなります。しかし、大槽（cisterna magna）はCSF循環経路の中流に位置しているため、特に高い注入速度でのICM注入は、CSF循環を駆動する圧力勾配の一時的な反転を誘発する可能性があります17。さらに重要な点として、ICMで投与されたトレーサーは、下流のクモ膜下腔、次いで血管周囲腔へと急速に分布します。アストロサイトの終足にあるAQP4チャネルはCSF-ISF交換を促進しますが、これらのチャネルはGBCAsの分子サイズが大きいため、GBCAsを透過させません。その結果、ICM投与によるトレーサーは、ICV注入と比較して脳実質における造影効果が著しく低下し15、脳からの溶質クリアランスの...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者に開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、米国立衛生研究所（NIH）の助成番号 R01NS124206 および RF1AG094791 による支援を受けて行われました。内容は著者の責任に帰するものであり、必ずしも国立衛生研究所の公式な見解を代表するものではありません。図4は BioRender.com を使用して作成されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プラスチックハブ付き皮下注射針（30 G x 1 in.）Exel26439
ガスタイトシリンジ、ルアーチップ (LT)（50 µL）Hamilton80901
解剖用ナローピンセットFine Science Tools11003-12
人工脳脊髄液 (Artificial CSF)TOCRIS3525
Attane Isofluran 1000 mg/gScanVet55226
銅製キャピラリーチューブ（外径 0.32 mm × 内径 0.16 mm）Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
銅製クリップIEUYOFEBA 1801
綿棒Puritan868-WCS
Dotarem (gadoterate meglumine) 注射液、0.5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
ドリルForedomModel SR
ドリルビットFine Science Tools19007-05
ドリルホルダーStoelting51630
Dumont メディカルピンセットFine Science Tools11252-00, 11253-20
眼軟膏RugbyNDC 0536
E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic SystemE-Z SystemsEZ-7000
Graefe ピンセットFine Science Tools11052-10,11152-10
ヒートパッドBraintree Scientific5381
高温電気焼灼キットFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine)Intervet International BV511519
KWIK-SIL 低毒性シリコン接着剤キットWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
使い捨て滅菌針（5/8 in., 26 G）BD305115
ポリエチレンチューブ（外径 0.61 mm × 内径 0.28 mm）ScandidactSKU252
Rompin Vet 20 mg/mL (xylazine)KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH148999
メス刃Fine Science Tools10023-00
剪刀（ハサミ）Fine Science Tools91460-11, 14007-14
スパチュラFine Science Tools10090-13
脳定位固定装置Stoelting51600U
外科用持針器AgnTho’s12502-12
シリンジポンプNew era pump systemNE-4000
Xylocain 20 mg/mL (lidocaine)AstraZeneca158543

参考文献

  1. Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
  2. Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
  3. Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
  4. Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
  5. Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
  6. Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
  7. Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
  8. Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
  9. Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
  10. Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
  11. Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
  12. Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
  13. Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
  14. Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
  15. Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
  16. DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
  17. Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
  18. Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
  19. Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
  20. Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
  21. Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
  22. Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
  23. Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
  24. Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

造影MRIげっ歯類脳イメージング髄液輸送MRI適合カニューレ留置グリンパ系輸送溶質クリアランスダイナミックMRI撮像髄腔内薬物投与

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。