本研究では、血清中の carcinoembryonic antigen、squamous cell carcinoma antigen、および carbohydrate antigen 125 を測定し、食道扁平上皮癌におけるこれらの組み合わせによる診断的および予後的な価値を検証するための、2施設共同によるアンビスペクティブ（過去方向および将来方向）なワークフローを提示します。
研究記事
食道扁平上皮細胞癌における診断および予後評価のための血清バイオマーカー複合パネル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
食道扁平上皮癌は、早期診断および治療前の正確な層別化が依然として困難な疾患である。従来のTNM病期分類は不可欠な解剖学的情報を提供するが、循環生物学的な不均一性を完全には反映していない。本2施設共同アンビスペクティブ観察研究では、食道扁平上皮癌における診断的識別および予後リスク評価のため、 carcinoembryonic antigen、squamous cell carcinoma antigen、およびcarbohydrate antigen 125を組み込んだ血清バイオマーカーパネルを開発し、外部妥当性を検証した。三次病院および地域ヘルスケアセンターから、食道扁平上皮癌患者167名、良性食道疾患患者55名、および健常対照群55名の計277名の参加者を登録した。三次病院のコホートをモデル開発および内部妥当性検証に使用し、地域センターのコホートを外部妥当性検証に使用した。治療前の血清バイオマーカーを初回治療前に測定し、対数変換後、トレーニングコホートのパラメータを用いて標準化し、診断的ロジスティック回帰モデルおよび予後Cox比例ハザードモデルに投入した。複合パネルは個々のマーカーよりも高い診断識別能を示し、受信者動作特性曲線の下面積（AUC）はトレーニングコホートで0.869、外部妥当性検証コホートで0.842であった。複合バイオマーカー値の高値は、5 cm以上の腫瘍長、pT3–4病変、リンパ節転移、およびTNMステージIII–IVの疾患と関連していた。生存分析において、複合バイオマーカー値の高値は、主要な臨床病理学的因子の調整後、全生存期間および無増悪生存期間の悪化を独立して予測した。バイオマーカー値と臨床病理学的変数を組み合わせた統合予後モデルは、TNM病期のみよりも優れた性能を示し、C-indexはトレーニングコホートで0.792、外部妥当性検証で0.761であった。これらの知見は、血清 carcinoembryonic antigen、squamous cell carcinoma antigen、およびcarbohydrate antigen 125パネルが、食道扁平上皮癌における治療前評価および個別化リスク層別化のための実用的かつ非侵襲的な補助手段として有用であることを支持している。
概要
食道扁平上皮癌は、食道癌の主要な組織学的サブタイプであり、東アジア、特に中国において依然として大きな臨床的負担となっています1。内視鏡診断、画像評価、手術、化学放射線療法、および全身治療によって臨床管理は向上しましたが、多くの患者にとって予後は依然として不十分です2。その重要な理由の一つは、局所浸潤またはリンパ節転移が既に発生した後に疾患が検出されることが多いことです3。もう一つの理由は、同じTNMステージ（腫瘍・リンパ節・転移ステージ）の患者であっても、治療反応性、再発リスク、および生存転帰が異なる場合があることです4。これらの相違は、解剖学的ステージングだけでは、食道扁平上皮癌の生物学的多様性を完全に説明できないことを示しています。
現在の臨床評価は、主に生検を伴う内視鏡検査、放射線学的病期診断、および術後の病理学的評価に依存しています。これらの手法は不可欠ですが、反復的なモニタリング、治療前のリスク推定、または広範なスクリーニングに使用する場合、限界があります。内視鏡検査は侵襲的であり、頻繁なフォローアップには適しておらず、一方でコンピュータ断層撮影や超音波内視鏡では、微細な浸潤や小さな転移病変を見逃す可能性があります5。画像ベースおよび分子予後モデルにより、食道扁平上皮癌におけるリスク予測は向上しましたが、その多くは、すべての臨床検査室で日常的に利用可能ではない専門的なプラットフォーム、画像後処理、組織シーケンシング、または計算ワークフローを必要とします6,7。したがって、低コストで再現可能な血液ベースのアプローチは、特に臨床医が根治的治療の前に治療前のリスク層別化を必要とする場合に、有用な補完的情報を提供できる可能性があります。
血清腫瘍マーカーは、日常的に利用可能で低侵襲であり、繰り返し検査が容易であるため、このような状況において有用です。癌胎児性抗原は腫瘍量と異常な細胞分化を反映し、一方で鱗状細胞癌抗原は扁平上皮の悪性転換とより密接に関連しています8。糖鎖抗原125は、いくつかの悪性腫瘍において、全身性の炎症活性、漿膜への浸潤、および疾患の進行に関連していることが示されています9。これらのマーカーは同一の生物学的シグナルを示すものではありません。むしろ、腫瘍量、扁平上皮表現型、全身性反応、および宿主・腫瘍相互作用という、重複しつつも異なる側面を捉えている可能性があります。そのため、食道扁平上皮癌の同定および臨床的リスクの推定を目的とする場合、単一のマーカーよりも複合パネルの方が高い性能を示す可能性があります10。
これまでの研究では、食道扁平上皮癌および関連する胃腸癌において、血清腫瘍マーカー、炎症指標、画像診断的特徴、分子プロファイル、および複合的な予後モデルの評価が行われてきました11,12。しかし、公表されている多くのモデルは、診断または予後のいずれかに焦点を当てているか、単一施設でのコホートを用いており、独立した外部検証を欠いているか、あるいはマーカーの変換、カットオフ値の選択、キャリブレーション、およびモデルの再現性に関する詳細な記載が不十分です。本研究の新規性は、日常的に測定される癌胎児性抗原（CEA）、扁平上皮癌抗原（SCC）、および糖鎖抗原125（CA125）を用いた実用的な3種類のマーカーによる血清パネルを開発し、単一の2施設共同ワークフロー内で、診断的な鑑別と予後のリスク層別化の両方をサポートした点にあります。本モデルは三次救急病院のコホートで開発され、その後、再最適化を行うことなく独立した地域センターのコホートで検証されたため、異なる臨床設定間での安定性を評価することが可能となりました。
本研究では、癌胎児性抗原（CEA）、扁平上皮癌抗原（SCCA）、および糖鎖抗原125（CA125）に基づく血清バイオマーカーの複合パネルを開発し、その妥当性を検証した。解析は、相互に関連する2つの目的の下で行われた。第一に、複合パネルを用いることで、個々の血清マーカーと比較して、食道扁平上皮癌と非悪性コントロールとの診断的な識別能が向上するかを評価することである。第二に、治療前の複合バイオマーカー負荷が、従来の臨床病理学的変数およびTNM分類（腫瘍・リンパ節・転移）によるステージングを超えて、予後情報を提供できるかを判断することである。このような構成により、日常的に利用可能な血清バイオマーカーパネルが、治療前の臨床評価における病理診断、画像診断、および解剖学的ステージングを補完する非侵襲的な補助手段として機能し得るかを評価することが可能となった。
プロトコル
ヒト被験者、臨床記録、および血清サンプルを用いた本研究は、ヘルシンキ宣言およびヒト被験者研究に関する施設基準に従って実施されました13。研究プロトコルは、承認番号CJ28J12-45の下で、Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicineによって審査および承認されました。遡及的に収集された匿名化済みの臨床データおよび残余血清サンプルについては、施設の倫理規定に基づき、追加の書面によるインフォームドコンセントの要件が免除されました。前向きに収集されたサンプルについては、登録前に書面によるインフォームドコンセントを得ました。すべての被験者情報および血清サンプルは、解析前に匿名化されました。データの連携には研究識別子が使用され、解析データセットに個人を特定できる情報は含まれていません。
研究デザインおよびコホート割り当て
この2センター共同によるアンビスペクティブ（回顧的および前向き的）観察研究では、食道扁平上皮癌（ESCC）における、癌胎児性抗原（CEA）、扁平上皮癌関連抗原（SCC-Ag）、および糖鎖抗原125（CA125）を組み合わせた血清バイオマーカーパネルの診断的および予後的価値を評価した。適格な診療録および治療前の残存血清サンプルから回顧的データを取得し、同一の研究枠組み内で追加の治療前血清サンプルの収集およびフォローアップを完了させるために前向き的な登録を行った。参加者は、2021年1月から2024年12月の間に、1つの三次病院と1つの地域ヘルスケアセンターから募集され、フォローアップは2025年12月31日まで継続された。センターAは三次病院であり、モデル構築、係数の推定、カットオフ値の選択、および内部検証のためのトレーニングコホートとして機能した。センターBは地域ヘルスケアセンターであり、外部検証コホートとして機能した。本研究は、個人の予後または診断のための多変数予測モデルの透明な報告（TRIPOD）ガイドライン14に従って報告された。
合計277名の参加者が含まれ、そのうち194名がセンターA、83名がセンターBから選出された。トレーニングコホートは、ESCC患者114名、良性食道疾患のコントロール40名、および健康なコントロール40名で構成された。外部検証コホートは、ESCC患者53名、良性食道疾患のコントロール15名、および健康なコントロール15名で構成された。情報の漏洩を低減し、独立した臨床設定におけるモデルの安定性を検証するため、ランダム分割ではなくセンターベースの割り付けが用いられた。診断解析では、ESCC患者、良性食道疾患患者、および健康なコントロールの間で、血清CEA、SCC-Ag、およびCA125レベルを比較した。予後解析はESCC患者に限定し、バイオマーカーの複合的な負荷が全生存期間（OS）および無増悪生存期間（PFS）のリスク層別化を改善するかどうかを評価した。研究デザイン、参加者のスクリーニング、コホートの割り付け、血清バイオマーカーのワークフロー、診断モデルの開発、外部検証、および予後モデルの比較を図1にまとめる。
参加者のフローには、スクリーニング、除外、診断グループ分け、および施設ベースの割り当てが含まれていた。合計326名がスクリーニングを受けた。除外されたのは49名であり、その内訳は、採血前に抗腫瘍治療を受けた者が12名、別の原発性悪性腫瘍がある者が8名、血清腫瘍マーカーに影響を与える可能性のある重篤な感染症、自己免疫疾患、または制御不能な併存疾患がある者が9名、溶血、乳糜、黄疸による干渉、血清量の不足、または処理間隔の延長が見られた者が11名、および主要な臨床的、病理学的、またはフォローアップデータが欠落していた者が9名であった。最終的な解析対象集団は277名の参加者で構成され、ESCC患者167名、良性食道疾患対照群55名、および健康対照群55名であった。
サンプルサイズの根拠
サンプルサイズは、あらかじめ定義された研究期間中に得られた、適格な参加者、治療前の血清サンプル、およびフォローアップ情報の連続的な利用可能性に基づいて決定された。診断モデルでは、3つの連続的な血清バイオマーカーを候補予測因子として用いた。トレーニングコホートでは、ESCC症例114例と非ESCC対照群80例が利用可能であり、これは候補バイオマーカー予測因子1つあたり、ESCC症例38.0例および非ESCC対照群26.7例に相当する。これにより、低次元のロジスティック回帰が支持され、過学習のリスクが軽減された。外部検証コホートにはESCC症例53例と非ESCC対照群30例が含まれ、係数の再推定を行わず検証のみに使用された。サンプルサイズの根拠は、ランダムなデータの分割よりも、アウトカムの頻度、候補予測パラメータ数、予想されるモデル性能、および独立した検証を重視する現在の予測モデルの原則に準拠している。15.
参加者の募集、適格性、およびデータ収集
参加者は研究期間中に継続的に登録された。センターAでは、胸部外科、消化器内科、および腫瘍科からESCC患者を募集した。センターBでは、地域ベースのスクリーニング、フォローアップ記録、または紹介経路を通じてESCC患者を特定し、病理学的確認および治療前の血清サンプルが入手可能な場合のみ対象に含めた。良性食道疾患コントロールは、嚥下困難、逆流症状、または食道の異常が疑われ、胃内視鏡検査を受けた個人のうち、病理学的所見が非悪性であった者から募集した。健康コントロールは、同時期の定期健康診断から、悪性腫瘍の既往、活動性感染症、重度の肝機能または腎機能障害がなく、画像診断または内視鏡検査で食道に占拠性病変が認められない者を選択した。
胃内視鏡生検または術後病理診断により原発性ESCCであることが確認され、採血前に抗腫瘍治療を受けておらず、ベースラインの臨床データ、病理記録、および治療前血清サンプルが完全に揃っているESCC患者を適格とした。他の原発性悪性腫瘍がある場合、採血前に抗腫瘍治療を受けていた場合、重度の急性感染症、活動性の自己免疫疾患、血清腫瘍マーカー値に影響を及ぼす可能性のあるコントロール不良の併存疾患、明らかな溶血、乳糜、黄疸による干渉、血清量の不足、主要な臨床変数の欠如、またはフォローアップデータの不在が認められた参加者は除外した。予後解析は、TNMステージが判明しており、生存または進行のアウトカムが測定可能なESCC患者に限定した。フォローアップ期間が6か月未満の患者であっても、その期間内に死亡または進行が認められた場合は解析対象に含めた。
ベースライン変数には、年齢、性別、喫煙歴、飲酒歴、BMI、参加センター、診断群、病変の種類、およびCEA、SCC-Ag、CA125の血清レベルが含まれた。ESCC患者については、さらに腫瘍の部位、腫瘍の長さ、組織学的分化度、浸潤深さ、リンパ節転移の有無、TNMステージ、リンパ管・静脈浸潤、初回治療法、再発、進行、生存状況、および最終フォローアップ日を変数として追加した。喫煙歴は、現在喫煙しているか、または生涯に少なくとも100本のタバコを定期的に喫煙していたことと定義した。飲酒歴は、6か月以上にわたり週1回以上の飲酒があることと定義した。TNMステージングは、食道癌に関する米国合同がん委員会/国際対がん連合（AJCC/UICC）の第8版ステージングシステムに基づいて判定した16。ESCCおよび良性病変症例の病理スライドは、2名の熟練した病理医が独立して検討し、不一致がある場合は3人目の病理医によって解決した。
トレーニングを受けた2名の研究者が、定義済みのデータディクショナリーを用いて、電子カルテ、病理報告書、臨床検査情報システム、治療記録、追跡調査記録、および死亡届から臨床情報を独立して抽出した。不一致が生じた場合は原本を確認して解決し、必要に応じて3人目の研究者が最終決定を下した。腫瘍の部位は、胸部食道の上部、中部、または下部に分類した。組織学的分化度は、高分化、中分化、または低分化に分類した。解析前に、参加した両センター間で連続変数の単位を統一した。
採血、血清処理、およびバイオマーカー測定
すべての血液検体は、初回治療前、病理学的確定診断後7日以内、かつ治療開始の少なくとも3日前までに採取した。血清分離管を用い、一晩の絶食後、午前7時から9時の間に5–8 mLの末梢静脈血を採取した。採取前72時間以内に輸血、大量のアルブミン投与、または侵襲的処置を受けた参加者は、サンプリングを延期した。検体を室温で30分間静置して凝固させた後、1,500 × g で10分間遠心分離した。血清を分離し、バーコードラベルを貼付した3～5本のチューブに1本あたり300–500 µLずつ分注した。分注した検体は検査まで−80°Cで保存し、凍結融解サイクルは1回以内に制限した。明らかな溶血、乳糜、黄疸による干渉が認められる検体、容量不足の検体、または採取から凍結までの間隔が2時間を超えた検体は除外した。
血清CEA、SCC-Ag、およびCA125を、製造者の指示に従い、自動化学発光免疫測定システムを用いて測定した。血清分注検体は検査前に4°Cで解凍し、緩やかに混合した後、可能な限り1回のランで分析した。バッチ検査が必要な場合は、疾患状態、施設、病期、またはフォローアップの結果による系統的なグループ化を避けるように検体順を調整した。分析測定範囲を超えた検体は、試薬の指示に従って希釈し、再検査した。検査担当者は、参加グループ、病期、治療状況、およびフォローアップの結果について盲検化されていた。
臨床的な閾値は、地域の検査室基準および製造業者の参照範囲に基づき、CEAは5.0 ng/mL、SCC-Agは1.5 ng/mL、CA125は35 U/mLとした。これらの閾値を用いて、臨床病理学的関連性および生存層別化解析のためのマーカー上昇および高複合バイオマーカー負荷を定義した。診断分類については、トレーニングコホートにおいてのみYouden指数を用いてデータ駆動型のカットオフ値を決定し、それを外部検証コホートにそのまま適用した。検査前に装置の校正および内部精度管理を実施した。検査日ごとに高濃度および低濃度のコントロールを含め、精度管理の結果が許容範囲内にある場合にのみ検査を進行した。
最終的なモデル解析の前に、ブラインド化したブリッジング血清分注検体および日常的な品質管理物質を用いて、アッセイ間およびセンター間の再現性を評価しました。30検体のブラインド化されたブリッジング血清分注セットを、2つのラボラトリーワークフローでテストしました。センター間の変動係数は、CEAで4.8%、SCC-Agで5.6%、CA125で5.1%でした。 correspondingなクラス内相関係数は、CEAで0.94、SCC-Agで0.92、CA125で0.93でした。あらかじめ設定したラボラトリー品質管理範囲を超える系統的な偏差は認められなかったため、センター固有のアッセイ再校正は行いませんでした。最終的なバイオマーカー値は、モデル構築の前に、単位の標準化およびトレーニングコホートに基づく統計的標準化を用いて整合させました。
複合バイオマーカーの定義およびモデル構築
血清バイオマーカーの複合パネルは、CEA、SCC-Ag、およびCA125で構成されました。 clinicopathological（臨床病理学的）相関分析およびKaplan-Meier生存層別化において、各マーカーはあらかじめ定義された臨床閾値に基づき、上昇または非上昇に分類されました。複合バイオマーカー負荷が高い状態は、3つのマーカーのうち少なくとも2つが上昇していることと定義されました。診断および予後モデル構築においては、これら3つのバイオマーカーを連続変数として保持し、自然対数を用いて変換した後、トレーニングコホートの平均および標準偏差を用いて標準化しました。同様の変換パラメータを外部検証コホートにも適用しました。
標準化された対数変換バイオマーカーは、以下のトレーニングコホートのパラメータを用いて算出されました：
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0.28)/0.57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3.05)/0.62
トレーニングコホートにおいて、多変量ロジスティック回帰を用いて複合診断パネルを構築しました。診断線形予測量は次のように算出されました：
LPdiagnostic = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag+0.42 × zlnCA125
ESCCの個別の予測確率は、次のように算出されました：
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
複合パネルの最適な診断カットオフ値は0.57であり、これはトレーニングコホートにおいてYouden indexを用いて選定され、外部バリデーションにおいても変更せずに適用された。
予後バイオマーカースコアは、Cox比例ハザードモデルを用いて構築されました。解剖学的病期分類の比較対象として、TNMステージのみのモデルを使用しました。バイオマーカーモデルでは、複合バイオマーカー負荷を用いました。臨床病理学的モデルでは、年齢、腫瘍の長さ、組織学的分化度、pTステージ、リンパ節転移の状態、および初回治療法を用いました。統合モデルでは、臨床病理学的モデルに高い複合バイオマーカー負荷を追加しました。OSについて、統合予後線形予測量は次のように算出されました：
LPOS = 0.33 × 年齢 ≥65歳 + 0.36 × 腫瘍長 ≥5cm + 0.25 × 低分化 + 0.31 × pT3
- 4stage + 0.66 × リンパ節転移
-0.58 × 根治術ベースの治療
+0.81 × highcombinedbiomarkerburden
PFSについて、統合予後線形予測因子は次のように算出されました：
LPPFS = 0.27 × 年齢 ≥ 65歳 + 0.31 × 腫瘍の長さ ≥ 5cm + 0.24 × 低分化 +0.25 × pT3
-4stage + 0.55 × lymphnodemetastasis
- 0.46 × 根治手術に基づく治療
+0.71 × 高複合バイオマーカー負荷
予後予測方程式におけるすべての二値変数は、存在する場合を1、存在しない場合を0としてコード化した。すべての係数、標準化パラメータ、およびカットオフ値はトレーニングコホートで推定し、再最適化を行うことなく外部検証コホートに直接適用した。
診断および予後エンドポイント
病理診断を診断の基準標準とした。主要診断エンドポイントは、食道扁平上皮癌（ESCC）と、良性の食道疾患および健常コントロールを含む非ESCCコントロールとの識別とした。副次診断エンドポイントには、ESCCと良性食道疾患の識別、ESCCと健常コントロールの識別、および早期ESCCと非悪性コントロールの識別を含めた。早期ESCCは、TNM病期 I–II の疾患と定義した。診断性能は、受信者動作特性曲線、曲線下面積、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、正診率、F1スコア、適合率-再現率曲線、キャリブレーション曲線、ブライアスコア、キャリブレーション切片、キャリブレーション傾き、および決定曲線分析を用いて評価した。
予後分析はESCC患者のみを対象に実施した。主要予後評価項目はOSとし、これは最初の根治的抗腫瘍治療日からあらゆる原因による死亡までの期間と定義した。副次予後評価項目はPFSとし、これは治療開始から確認された疾患の進行、再発、または死亡までの期間と定義した。根治手術を受けた患者で、術後に残存病変が認められない場合は、局所再発、遠隔転移、または腫瘍関連死をPFSイベントとしてカウントした。根治的化学放射線療法または緩和治療を受けた患者における進行は、画像所見、内視镜的評価、および臨床的評価に基づいて判定した。
追跡データは、外来受診、入院記録、地域追跡記録、紹介状、および電話連絡を通じて取得した。患者は治療後最初の2年間は3か月ごと、3年目から5年目までは6か月ごと、それ以降は年1回追跡調査を行った。最終追跡日までに死亡、再発、または進行が認められなかった患者は、最後に確認できた連絡時点で打ち切った。アウトカムイベントは2名の研究者が独立してレビューした。情報源によってイベント発生日が異なる場合は、画像診断レポート、退院記録、内視鏡レポート、紹介状、および死亡届を照合して最終的なイベント発生日を決定した。追跡調査のカットオフ日は、両参加施設とも2025年12月31日とした。
統計解析
統計解析にはR 4.3.2およびSPSS 27.0を使用した。連続変数は、分布に応じて平均値 ± 標準偏差または中央値（四分位範囲）としてまとめた。カテゴリー変数は、件数およびパーセンテージとしてまとめた。群間比較には、適宜、独立標本t検定、Mann–Whitney U検定、一元配置分散分析、Kruskal–Wallis検定、カイ二乗検定、またはFisherの直接確率検定を用いた。モデル構築前に欠損データの評価を行った。主要な診断ステータス、治療前のバイオマーカー値、TNMステージ、または生存/進行アウトカムデータが欠損している参加者は、あらかじめ定義された適格性基準に従って除外した。欠損率が5.0%未満の非主要共変量は、20個の補完データセットと20回の反復を用いた連鎖方程式による多重代入法を用いて処理した17。代入モデルには、診断グループ、施設、年齢、性別、喫煙歴、飲酒歴、バイオマーカー値、TNMステージ、治療法、OSステータス、PFSステータス、および追跡期間を含めた。感度分析として、完全ケース解析を実施した。
診断モデルはトレーニングコホートを用いて開発された。受信者動作特性（ROC）曲線を用いて、曲線下面積（AUC）、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、正診率、およびF1スコアを算出した。AUCの比較にはDeLongテスト18を用いた。補助的な診断評価として精度-再現率曲線を用いた。キャリブレーションは、キャリブレーション曲線、Brierスコア、キャリブレーション切片、およびキャリブレーションスロープを用いて評価した。臨床的有用性は、決定曲線分析19を用いて評価した。内部妥当性の検証は、1,000回のブートストラップ再サンプリングを行い、楽観度補正後の識別能およびキャリブレーションを推定することで実施した。外部妥当性の検証は、トレーニングコホートで得られた方程式、標準化パラメータ、およびカットオフ値を、再フィッティングすることなく直接センターBに適用することで実施した。
予後解析では、バイオマーカー負荷量群間でOSおよびPFSを比較するためにKaplan–Meier曲線を作成し、生存率の差を評価するためにログランク検定を用いた。ハザード比および95%信頼区間の推定には、Cox比例ハザード回帰を用いた。臨床的意義のある変数および単変量解析でアウトカムに関連した変数を、多変量モデルの検討対象とした。モデルの性能は、HarrellのC-index、時間依存性受信者動作特性（ROC）曲線、キャリブレーション曲線、Brierスコア、および決定曲線分析を用いて評価した20。予後のキャリブレーションは1年、3年、および5年で評価した。比例ハザード性の仮定は、Schoenfeld残差およびlog-minus-log生存プロットを用いて評価した21。全般的Schoenfeld検定のP値は、OSモデルで0.42、PFSモデルで0.37であった。最終的なモデルの解釈前に分散拡大係数（VIF）を用いて多重共線性を評価し、最終的な診断および予後モデルに含まれるすべての候補変数の分散拡大係数は2.1未満であった。TNMステージおよび従来の臨床病理学的モデルに対する上乗せの予後予測能は、純再分類改善度（NRI）および統合識別改善度（IDI）を用いて評価した。トレーニングコホートで推定されたモデルパラメータを、再適合させることなく外部検証コホートに適用した22。すべての検定は両側検定とし、P < 0.05を統計学的に有意とみなした。
結果
参加者のフローとアッセイの再現性
合計326名がスクリーニングされ、49名が除外された。除外の内訳は、採血前に抗腫瘍治療を受けた者が12名、別の原発性悪性腫瘍を有していた者が8名、血清腫瘍マーカーに影響を及ぼす可能性のある重篤な感染症、自己免疫疾患、またはコントロール不良の併存疾患を有していた者が9名、溶血、乳糜、黄疸による干渉、血清量の不足、または処理間隔の長期化が認められた者が11名、主要な臨床的、病理学的、または追跡調査データが欠損していた者が9名であった。最終的な解析対象集団は277名で構成され、その内訳は食道扁平上皮癌（ESCC）患者167名、良性食道疾患患者55名、および健康対照者55名であった。トレーニングコホートにはセンターAから194名が、外部検証コホートにはセンターBから83名が割り当てられた。参加者のフロー、コホートの割り当て、バイオマーカー検査のワークフロー、診断モデルの開発、外部検証、および予後予測モデリングの枠組みを図1に示す。また、スクリーニングおよび除外の詳細を付録表1にまとめた。
30検体の盲検化ブリッジング血清分注検体を用いて、アッセイ間および施設間の再現性を評価した。施設間変動係数は、癌胎児性抗原（CEA）で4.8％、扁平上皮癌抗原（SCC-Ag）で5.6％、糖鎖抗原125（CA125）で5.1％であった。対応するクラス内相関係数は、それぞれ0.94、0.92、0.93であった。統計的な標準化およびモデル構築に先立って、施設固有の再キャリブレーションは不要であった。アッセイ再現性の結果は、以下に提示されている。 補足表2.
研究集団のベースライン特性
全集団の年齢中央値は59歳（IQR, 53–66歳）であり、参加者の198名（71.5%）が男性であった。現在または過去の喫煙歴は141名（50.9%）、現在または過去の飲酒歴は127名（45.8%）に認められた。コホートの内訳は、ESCC患者167名（60.3%）、良性食道疾患患者55名（19.9%）、および健康対照者55名（19.9%）であった。血清CEA、SCC-Ag、およびCA125の中央値は、それぞれ3.9 ng/mL (IQR, 2.0–6.6 ng/mL)、1.4 ng/mL (IQR, 0.8–2.3 ng/mL)、および22.8 U/mL (IQR, 13.9–35.7 U/mL)であった。年齢、性別、喫煙歴、飲酒歴、診断グループ、およびベースラインの血清バイオマーカーレベルは、トレーニングコホートと外部検証コホートの間で同等であった（表1）。
167例のESCC患者において、年齢の中央値は61歳（IQR, 55–68歳）であり、133例（79.6%）が男性であった。腫瘍の部位は胸部食道中部が最も多く（89/167例, 53.3%）、次いで胸部食道下部（56/167例, 33.5%）、胸部食道上部（22/167例, 13.2%）であった。中分化および低分化腫瘍は、それぞれ81例（48.5%）および66例（39.5%）であった。腫瘍長が5 cm以上の患者は68例（40.7%）、pT3–4の疾患は121例（72.5%）、リンパ節転移ありは100例（59.9%）、TNMステージIII–IVの疾患は111例（66.5%）に認められた。脈管侵襲は65例（38.9%）で確認された。一次治療は、術後補助療法を併用または併用しない根治手術を113例（67.7%）、根治的化学放射線療法を32例（19.2%）、緩和的な全身療法または支持療法を22例（13.2%）が受けた。主要な臨床病理学的変数は、トレーニングコホートと外部検証ESCCコホートの間で同等であった（表2）。
研究グループ間における血清バイオマーカーの多次元分布
血清CEA、SCC-Ag、およびCA125の分布は、ESCC患者、良性食道疾患コントロール、および健康コントロールの間で異なっていました（図2）。対数変換後、これら3つのバイオマーカーはいずれも、2つの非悪性グループよりもESCCグループで高い値を示しました。CEAの中央値は、ESCC患者で5.2 ng/mLであったのに対し、良性食道疾患コントロールでは2.4 ng/mL、健康コントロールでは1.9 ng/mLでした。SCC-Agの中央値は、ESCC患者で1.9 ng/mLであり、他のグループでは0.9 ng/mLおよび0.7 ng/mLでした。CA125の中央値は、ESCC患者で28.9 U/mLであり、他のグループでは18.7 U/mLおよび16.1 U/mLでした。グループ別の血清バイオマーカー分布は、補足表3にまとめられています。
CEAおよびSCC-Agは、CA125よりもESCCと非悪性対照群との間でより明確な分離を示した。対数変換したCEAおよびSCC-Agの二次元分布において、ESCC検体は高値領域に集中する傾向があり、一方で健康対照群は低値領域に集簇する傾向があった。3つのマーカーのうち少なくとも2つが上昇している状態と定義した複合バイオマーカー負荷の高い例は、ESCC患者167例中61例（36.5%）、良性食道疾患対照群55例中8例（14.5%）、および健康対照群55例中4例（7.3%）で観察された。バイオマーカー負荷上昇の分布は、Supplementary Table 3に報告されている通り、3群間で有意に異なっていた（P < 0.001）。
トレーニングコホートにおける複合診断シグネチャーの開発
統合診断シグネチャーは、対数変換したCEA、SCC-Ag、およびCA125の値を用いてトレーニングコホートで開発されました（図3）。ペアごとの相関分析では、これら3つのマーカー間に中程度の正の相関が認められました。最も強い相関はCEAとSCC-Agの間（r = 0.58）に観察され、次いでSCC-AgとCA125（r = 0.47）、CEAとCA125（r = 0.41）の順でした。この結果は、各マーカーを互換可能な測定値として扱うことなく、共同モデリングを行うことを支持するものです。
単変量ロジスティック回帰分析において、CEA、SCC-Ag、およびCA125はそれぞれESCCの状態と関連しており、オッズ比はそれぞれ2.81、3.94、および2.14であった。多変量診断モデルでは、SCC-Agが最大の調整済み効果量（OR: 2.87; 95% CI: 1.62–5.09; P < 0.001）を示し、次いでCEA（OR: 1.80; 95% CI: 1.19–2.72; P = 0.006）、CA125（OR: 1.52; 95% CI: 1.03–2.25; P = 0.034）の順であった。診断モデルの係数は補足表4にまとめられている。最終的な診断線形予測子は以下の通りであった：
LPdiagnostic = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag +0.42 × zlnCA125
ESCCの個別の予測確率は、次のように算出されました：
PESCC = 1/1 + exp( -LPdiagnostic )
統合診断モデルによる予測確率分布は、ESCC参加者と非ESCC参加者の分離を示しました。最適なカットオフ値は0.57でした。このカットオフ値において、統合モデルはトレーニングコホートで0.869（95% CI, 0.817–0.921）の受信者動作特性曲線下面積（AUC）を達成し、陽性的中率は85.8%、陰性的中率は73.0%でした。
複合バイオマーカーパネルの診断性能および外部妥当性検証
トレーニングコホートにおいて、3つの個別のバイオマーカーの中でSCC-Agが最も高い診断能を示し、AUCは0.802（95% CI, 0.735–0.869）であった。CEAおよびCA125のAUCは、それぞれ0.711（95% CI, 0.635–0.786）および0.668（95% CI, 0.591–0.744）であった。複合パネルは、AUC 0.869（95% CI, 0.817–0.921）、感度 79.8%、特異度 81.2%、陽性的中率 85.8%、陰性的中率 73.0%、正診率 80.4%、F1スコア 82.7%となり、全体として最高の識別能を達成した（表3）。
受信者動作特性（ROC）曲線により、個々のバイオマーカーと比較して、複合パネルの方が診断識別能が高いことが確認されました（図4A）。最適カットオフ値0.57において、複合パネルは感度79.8%、特異度81.2%を示しました。複合パネルのAUCは、SCC-Ag単独の場合よりも有意に高い値を示しました（P = 0.032）。1,000回の再サンプリングによるブートストラップ内部検証では、楽観度補正後のAUCが0.856、楽観度補正後の較正スロープが0.97、楽観度補正後のブライアスコアが0.154でした。内部検証の推定値は付録表4に記載されています。
外部検証コホートにおける適合率-再現率解析では、ESCCと健康な対照群を区別する場合に最高の平均適合率が示されました（AP = 0.912; 図 4B）。平均適合率は、ESCC対非ESCCで0.863、ESCC対良性食道疾患で0.841でした。早期ESCC対非悪性対照群の平均適合率は0.535でした。キャリブレーション解析では、両コホートにおいて予測確率と観察された結果との一致が示されました（図 4C）。トレーニングコホートにおけるBrierスコアは0.148で、キャリブレーションスロープは1.02、切片は0.01でした。外部検証コホートでは、Brierスコアは0.164、キャリブレーションスロープは0.93、キャリブレーション切片は−0.04でした。決定曲線分析では、ほとんどの確率閾値において、統合パネルが「すべて治療」および「誰も治療しない」戦略よりも高いネットベネフィットを示すことが確認されました（図 4D）。
外部妥当性検証の結果をTable 4にまとめる。ESCC（食道扁平上皮癌）対非ESCCにおいて、複合パネルはAUC 0.842（95% CI, 0.753–0.930）を達成し、閾値確率0.30における感度は75.5%、特異度は76.7%、正診率は75.9%、Brierスコアは0.164、キャリブレーション・スロープは0.93、ネットベネフィットは0.218であった。AUCは、ESCC対良性食道疾患で0.801（95% CI, 0.686–0.916）、ESCC対健常対照群で0.889（95% CI, 0.800–0.979）、早期ESCC対非悪性対照群で0.818（95% CI, 0.704–0.932）であった。最も高い特異度はESCC対健常対照群（86.7%）で観察され、一方で早期ESCC対非悪性対照群では感度70.6%、特異度78.3%であった。
ESCCにおける複合バイオマーカーパネルの臨床病理学的関連プロファイル
血清バイオマーカーの上昇と臨床病理学的特徴との関連をESCC患者において評価した(表5)。年齢および性別は、個々のバイオマーカーの上昇との関連は限定的であった。65歳以上の患者は、65歳未満の患者よりも複合バイオマーカー負荷が高い割合が高かった (47.6% vs. 29.8%; P = 0.028)。一方、性別は個々のバイオマーカーの上昇または複合バイオマーカー負荷との関連は認められなかった。
腫瘍関連の変数は、バイオマーカーの上昇とより強い相関を示しました。複合バイオマーカー負荷が高い患者の割合は、腫瘍長が5 cm以上の患者では50.0%であったのに対し、5 cm未満の患者では27.3%でした（P = 0.004）。また、複合バイオマーカー負荷の高い症例は、高分化または中分化の患者よりも低分化の患者で（50.0% vs. 28.2%; P = 0.006）、pT1–2期の患者よりもpT3–4期の患者で（42.1% vs. 21.7%; P = 0.011）、リンパ節転移のない患者よりもリンパ節転移のある患者で（43.0% vs. 26.9%; P = 0.038）、およびTNM stage I–II期の患者よりもTNM stage III–IV期の患者で（43.2% vs. 23.2%; P = 0.009）より頻繁に認められました。
患者レベルの可視化により、複合リスクスコアが高いほど、より進行した臨床病理学的特徴を伴うことが示された（図 5A）。スコアが高い患者は、pT3–4、リンパ節陽性、低分化、またはTNMステージIII–IVに分類される頻度がより高かった。ボックスプロット解析では、腫瘍長がより長く、分化度が低く、pT3–4であり、リンパ節陽性で、TNMステージIII–IVである患者において、バイオマーカーの分布が上昇していることが示された（図 5B）。サンキーダイアグラムでは、2つまたは3つのバイオマーカーが上昇している患者はTNMステージIII–IVに分類される割合が高く、一方でバイオマーカーの上昇が見られない患者はTNMステージI–IIに分類される割合が高いことが示された（図 5C）。複合バイオマーカー負荷とTNMステージ分布との関連は、統計的に有意であった（P < 0.001）。
複合血清バイオマーカーパネルに基づく予後層別化
ESCC患者の追跡期間の中央値は34ヶ月であった。追跡期間中に、78例の死亡と96例の無増悪生存イベントが記録された。追跡およびイベントの詳細は付録表5にまとめられている。複合バイオマーカー負荷が高いことは、生存転帰の悪化と関連していた。単変量Cox回帰分析において、高い複合バイオマーカー負荷は、死亡リスクの増加（HR, 2.91; 95% CI, 1.89–4.46; P < 0.001）および増悪または死亡のリスク増加（HR, 2.63; 95% CI, 1.80–3.84; P < 0.001）と関連していた。年齢、腫瘍長、分化度、pTステージ、リンパ節転移、および治療法で調整した後も、高い複合バイオマーカー負荷は、全生存期間（OS; HR, 2.24; 95% CI, 1.41–3.54; P = 0.001）および無増悪生存期間（PFS; HR, 2.03; 95% CI, 1.35–3.05; P = 0.001）と独立して関連していた。対照的に、CEA、SCC-Ag、およびCA125の上昇は、多変量モデルに個別に組み込んだ場合、統計的に有意ではなくなった。Cox回帰の結果は表6にまとめられている。
カプラン・マイヤー分析の結果、複合バイオマーカー負荷の高い群と低い群の間で明確な差が認められた（Figure 6A,B）。OSの中央値は、低負荷群で38か月、高負荷群で19か月であった（ログランク P < 0.001）。PFSの中央値は、低負荷群で28か月、高負荷群で13か月であった（ログランク P < 0.001）。統合予後モデルは、TNMステージ単独よりも高い時間依存的識別能を示し（Figure 6C）、1年、3年、5年時点のAUCはそれぞれ0.829、0.806、0.781であったのに対し、TNMステージ単独では0.701、0.676、0.648であった。TNMステージ単独に対するC-indexの改善度は、トレーニングコホートで0.130、外部検証コホートで0.120であった。フォローアップのランドマークヒートマップでは、リスク層間で累積死亡率の上昇が示された（Figure 6D）。低リスクの3分位群における累積死亡確率は、6、12、24、36、60か月時点でそれぞれ6%、12%、24%、37%、52%であった。対応する確率は、中リスクの3分位群で14%、26%、44%、59%、74%であり、高リスクの3分位群では28%、47%、68%、82%、91%であった。
統合モデルの外部妥当性確認および増分予後予測能
統合モデルは、両コホートにおいて評価したモデルの中で最も高い予後判別能を示した。トレーニングコホートでは、統合モデルのC-indexは0.792であり、 clinicopathologicalモデルの0.736、バイオマーカーパネル単独の0.703、TNMステージ単独の0.662と比較して高かった。外部検証コホートにおいて、統合モデルのC-indexは0.761であり、他のモデルの0.708、0.681、0.641と比較して高かった。時間依存性AUCにおいても統合モデルが優れていた。トレーニングコホートでは、統合モデルは1年、3年、5年でそれぞれ0.829、0.806、0.781のAUCを達成した。外部検証コホートにおける対応するAUCは、0.801、0.774、0.748であった。TNMステージ単独と比較して、統合モデルは+0.274のNRIおよび+0.102のIDIを示した。ブートストラップ法による内部検証では、統合モデルの楽観度補正後C-indexは0.779であった。モデルの性能指標をTable 7に、追加の予後検証結果をSupplementary Table 5に示す。
モデル比較プロットでは、両方のコホートにおいて統合モデルが最高のHarrell’s C-indexを示しました（図7A）。ノモグラムには、1年、3年、および5年のOS（全生存期間）確率を推定するために、年齢、腫瘍の長さ、組織学的分化度、pTステージ、リンパ節の状態、初回治療法、および高Combined Biomarker Burdenが組み込まれました（図7B）。外部検証コホートにおいて、1年、3年、および5年のOSのキャリブレーション曲線は、理想的な参照線に近い結果となりました（図7C）。Brierスコアはそれぞれ0.141、0.164、0.178であり、キャリブレーションスロープは0.97、0.93、0.91でした。決定曲線分析（DCA）により、主要な閾値確率の範囲において、統合モデルはTNMステージのみ、臨床病理学的モデル、および「全員治療」または「誰もしない」戦略よりも高いネットベネフィットを持つことが示されました（図7D）。閾値確率0.30におけるネットベネフィットは、統合モデルで0.181であり、臨床病理学的モデルの0.139およびTNMステージのみの0.117と比較して高い値でした。これらのキャリブレーションおよび決定曲線の結果は、付録表5にまとめられています。
データの利用可能性：
本研究で生成および解析されたデータセットは、Figshareリポジトリ（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33154580.v1）で公開されています。
図 1: 研究デザインおよび解析ワークフロー。参加者のスクリーニング、コホートへの割り当て、血清バイオマーカーの測定、診断モデルの開発、外部検証、および予後モデルの構築に関する概略図。センターAをトレーニングコホートとし、センターBを外部検証コホートとした。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 2: 研究グループ間における血清CEA、SCC-Ag、およびCA125の分布。(A) ESCC患者、良性食道疾患コントロール、および健常コントロールにおける、対数変換した血清バイオマーカーレベルを示すバイオリンプロットおよびボックスプロット。 (B) 対数変換したCEAおよびSCC-Agの二変量分布。 (C) 診断グループ全体の複合バイオマーカープロファイルをまとめたレーダーチャート。 (D) 診断グループ間におけるバイオマーカー上昇負荷の分布。 CEA = 癌胎児性抗原; SCC-Ag = 扁平上皮癌関連抗原; CA125 = 糖鎖抗原125; ESCC = 食道扁平上皮癌。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 3: トレーニングコホートにおける複合診断シグネチャーの開発。(A) 対数変換したCEA、SCC-Ag、およびCA125の相関ヒートマップ。(B) 個々のバイオマーカーおよび複合診断モデルに対する単変量および多変量ロジスティック回帰の結果。(C) 複合診断モデルに基づく、ESCC患者および非ESCC参加者の予測確率分布。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 4: 複合バイオマーカーパネルの診断性能および外部妥当性検証。(A>) トレーニングコホートにおける個々のバイオマーカーと複合パネルを比較した受信者動作特性（ROC）曲線。(B>) 外部妥当性検証シナリオにおける精度-再現率曲線。(C>) トレーニングコホートおよび外部妥当性検証コホートのキャリブレーションプロット。(D>) 閾値確率における正味の利益を示す決定曲線分析。ROC = receiver operating characteristic。 こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。
図 5: ESCCにおける複合バイオマーカーパネルの臨床病理学的関連プロファイル。(A) 複合リスクスコア、血清バイオマーカーレベル、および臨床病理学的特徴の患者レベルでの概況。(B) 主要な臨床病理学的サブグループ間におけるバイオマーカー分布を示す箱ひげ図。(C) バイオマーカー負荷の上昇とTNMステージとの関係を示すサンキープロット。TNM = tumor-node-metastasis（腫瘍・リンパ節・転移）。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 6: 複合バイオマーカー負荷に基づく予後層別化。(A) 複合バイオマーカー負荷に応じた全生存期間のカプランマイヤー曲線。 (B) 複合バイオマーカー負荷に応じた無増悪生存期間のカプランマイヤー曲線。 (C) 統合モデルとTNMステージ単独を比較した時間依存性受信者動作特性（ROC）曲線。 (D) リスク三分位およびフォローアップランドマークにおける累積死亡確率を示すヒートマップ。 OS = 全生存期間; PFS = 無増悪生存期間。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 7: 統合予後モデルの外部検証および臨床応用。(A) トレーニングコホートおよび外部検証コホートにおける予後モデル間のHarrell’s C-indexの比較。(B) 年齢、腫瘍の長さ、組織学的分化度、pTステージ、リンパ節の状態、初回治療法、および高バイオマーカー複合負荷を組み込み、1年、3年、および5年の全生存期間を推定するノモグラム。(C) 1年、3年、および5年の全生存期間に対する外部検証キャリブレーションプロット。(D) 統合モデルを、TNMステージ単独、 clinicopathological（臨床病理学的）モデル、ならびに全例治療または全例非治療戦略と比較した決定曲線分析。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
| 変数 | 全体（n = 277） | トレーニングコホート、センターA (n = 194) | 外部検証コホート、センターB (n = 83) | P値 |
| 年齢（歳）、中央値（四分位範囲） | 59 (53–66) | 59 (52–65) | 60 (54–67) | 0.284 |
| 男性、n (%) | 198 (71.5) | 137 (70.6) | 61 (73.5) | 0.622 |
| 現在または過去の喫煙者、n (%) | 141 (50.9) | 95 (49.0) | 46 (55.4) | 0.321 |
| 現在または過去の飲酒習慣、n (%) | 127 (45.8) | 87 (44.8) | 40 (48.2) | 0.603 |
| 診断群、n (%) | 0.701 | |||
| 食道扁平上皮癌 | 167 (60.3) | 114 (58.8) | 53 (63.9) | |
| 良性食道疾患 | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| 健常対照群 | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| 血清CEA値、ng/mL、中央値（四分位範囲） | 3.9 (2.0–6.6) | 3.8 (1.9–6.4) | 4.1 (2.1–6.8) | 0.367 |
| 血清SCC-Ag値（ng/mL）、中央値（四分位範囲） | 1.4 (0.8–2.3) | 1.4 (0.8–2.2) | 1.5 (0.9–2.4) | 0.418 |
| 血清CA125、U/mL、中央値（四分位範囲） | 22.8 (13.9–35.7) | 22.4 (13.5–34.9) | 23.6 (14.6–36.8) | 0.447 |
表1：トレーニングコホートおよび外部検証コホートにおける参加者のベースライン特性。人口統計学的特性、コホート構成、およびベースラインの血清CEA、SCC-Ag、CA125値について、全集団、トレーニングコホート、外部検証コホートごとにまとめている。
| 変数 | ESCC全体（n = 167） | トレーニングコホート (n = 114) | 外部検証コホート (n = 53) | P値 |
| 年齢（歳）、中央値（四分位範囲） | 61 (55–68) | 61 (55–67) | 62 (56–68) | 0.386 |
| 男性、n (%) | 133 (79.6) | 91 (79.8) | 42 (79.2) | 0.931 |
| 現在/過去の喫煙者、n (%) | 110 (65.9) | 74 (64.9) | 36 (67.9) | 0.701 |
| 現在/過去の飲酒歴、n (%) | 95 (56.9) | 66 (57.9) | 29 (54.7) | 0.688 |
| 腫瘍の部位、n (%) | 0.879 | |||
| 上部胸椎 | 22 (13.2) | 15 (13.2) | 7 (13.2) | |
| 中 thoracic（中胸） | 89 (53.3) | 60 (52.6) | 29 (54.7) | |
| 下位胸椎 | 56 (33.5) | 39 (34.2) | 17 (32.1) | |
| 組織学的分化、n (%) | 0.944 | |||
| 高分化 | 20 (12.0) | 14 (12.3) | 6 (11.3) | |
| 中分化 | 81 (48.5) | 56 (49.1) | 25 (47.2) | |
| 低分化の | 66 (39.5) | 44 (38.6) | 22 (41.5) | |
| 腫瘍長 ≥5 cm, n (%) | 68 (40.7) | 45 (39.5) | 23 (43.4) | 0.621 |
| pT3–4期、n (%) | 121 (72.5) | 82 (71.9) | 39 (73.6) | 0.821 |
| リンパ節転移、n (%) | 100 (59.9) | 68 (59.6) | 32 (60.4) | 0.924 |
| TNMステージIII–IV、n (%) | 111 (66.5) | 75 (65.8) | 36 (67.9) | 0.785 |
| 脈管侵襲、n (%) | 65 (38.9) | 42 (36.8) | 23 (43.4) | 0.404 |
| 主要治療法、n (%) | 0.753 | |||
| 根治手術 ± 術後補助療法 | 113 (67.7) | 79 (69.3) | 34 (64.2) | |
| 根治的化学放射線療法 | 32 (19.2) | 21 (18.4) | 11 (20.8) | |
| 緩和的全身療法／支持療法 | 22 (13.2) | 14 (12.3) | 8 (15.1) |
表 2：トレーニングコホートおよび外部検証コホートにおけるESCC患者の臨床病理学的特徴。トレーニングコホートと外部検証コホートのESCC患者間で、腫瘍の部位、組織学的分化度、腫瘍の長さ、pTステージ、リンパ節の状態、TNMステージ、脈管侵襲、および一次治療法を比較している。
| モデル | 最適カットオフ値 | AUC (95% CI) | 感度 (%) | 特異度 (%) | 陽性的中率 (%) | 正味現在価値 (%) | 精度 (%) | F1スコア (%) |
| 癌胎児性抗原 | 4.85 ng/mL | 0.711 (0.635–0.786) | 58.8 | 76.2 | 77.9 | 56.6 | 66.2 | 67.1 |
| SCC抗原 | 1.52 ng/mL | 0.802 (0.735–0.869) | 70.2 | 78.8 | 82.5 | 65.6 | 73.8 | 76.1 |
| CA125 | 31.8 U/mL | 0.668 (0.591–0.744) | 44.7 | 82.5 | 78.5 | 52.4 | 60.3 | 57 |
| 複合パネル | 0.57 | 0.869 (0.817–0.921) | 79.8 | 81.2 | 85.8 | 73 | 80.4 | 82.7 |
表3：トレーニングコホートにおける個々のバイオマーカーおよび複合血清バイオマーカーパネルの診断精度。診断能は、最適カットオフ値、受信者動作特性曲線下面積（AUC）、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、正診率、およびF1スコアを用いて報告されている。
| 比較 | AUC (95% CI) | 感度 (%) | 特異度 (%) | 精度 (%) | ブライアースコア | 検量線傾斜度 | 閾値確率0.30における正味の便益 |
| ESCC 対 非ESCC | 0.842 (0.753–0.930) | 75.5 | 76.7 | 75.9 | 0.164 | 0.93 | 0.218 |
| 食道扁平上皮がん（ESCC）対良性食道疾患 | 0.801 (0.686–0.916) | 73.6 | 73.3 | 73.5 | 0.171 | 0.9 | 0.196 |
| ESCC対健常対照群 | 0.889 (0.800–0.979) | 77.4 | 86.7 | 79.5 | 0.122 | 0.97 | 0.252 |
| 早期食道扁平上皮癌（ESCC）対非悪性コントロール | 0.818 (0.704–0.932) | 70.6 | 78.3 | 76.3 | 0.153 | 0.89 | 0.173 |
表4：血清バイオマーカー複合パネルの診断性能の外部検証 モデルの性能を、ESCC対非ESCC、ESCC対良性食道疾患、ESCC対健常対照群、および早期ESCC対非悪性対照群の4つの診断シナリオについてまとめている。
| 特性 | カテゴリー | CEA高値 (n %) | SCC-Ag上昇（n %） | CA125高値 (n %) | 高い複合負荷（n %） | CEAのP値 | SCC-Ag用P | CA125用P | 複合的な負担に対するP値 |
| 年齢 | <65歳 (n = 104) | 40 (38.5) | 54 (51.9) | 29 (27.9) | 31 (29.8) | 0.129 | 0.108 | 0.151 | 0.028 |
| 65歳以上 (n = 63) | 32 (50.8) | 41 (65.1) | 25 (39.7) | 30 (47.6) | |||||
| 性別 | 女性（n=34） | 13 (38.2) | 17 (50.0) | 13 (38.2) | 12 (35.3) | 0.513 | 0.367 | 0.402 | 0.871 |
| 男性（n = 133） | 59 (44.4) | 78 (58.6) | 41 (30.8) | 49 (36.8) | |||||
| 腫瘍長 | <5 cm (n = 99) | 35 (35.4) | 49 (49.5) | 24 (24.2) | 27 (27.3) | 0.015 | 0.021 | 0.009 | 0.004 |
| ≥5 cm (n = 68) | 37 (54.4) | 46 (67.6) | 30 (44.1) | 34 (50.0) | |||||
| 分化 | 高分化/中分化 (n = 103) | 38 (36.9) | 52 (50.5) | 27 (26.2) | 29 (28.2) | 0.018 | 0.032 | 0.027 | 0.006 |
| 不良（n=64） | 34 (53.1) | 43 (67.2) | 27 (42.2) | 32 (50.0) | |||||
| pTステージ | pT1–2 (n = 46) | 13 (28.3) | 20 (43.5) | 9 (19.6) | 10 (21.7) | 0.016 | 0.028 | 0.036 | 0.011 |
| pT3–4（n = 121） | 59 (48.8) | 75 (62.0) | 45 (37.2) | 51 (42.1) | |||||
| リンパ節の状態 | 陰性 (n = 67) | 21 (31.3) | 31 (46.3) | 15 (22.4) | 18 (26.9) | 0.012 | 0.025 | 0.021 | 0.038 |
| 陽性 (n = 100) | 51 (51.0) | 64 (64.0) | 39 (39.0) | 43 (43.0) | |||||
| TNM分類段階 | I–II (n = 56) | 16 (28.6) | 25 (44.6) | 11 (19.6) | 13 (23.2) | 0.008 | 0.021 | 0.014 | 0.009 |
| III–IV（n= 111） | 56 (50.5) | 70 (63.1) | 43 (38.7) | 48 (43.2) |
表5：ESCC患者における血清バイオマーカーの上昇と臨床病理学的特徴との関連。CEA上昇、SCC-Ag上昇、CA125上昇、および複合バイオマーカー負荷高値の割合を、人口統計学的および腫瘍関連のサブグループ間で比較している。
| 変数 | 全生存期間（OS）に関する単変量ハザード比（95% CI） | p値 | OSに対する多変量HR（95% CI） | P値 | PFSの単変量HR（95% CI） | p値 | PFSに関する多変量ハザード比（95% CI） | P値 |
| 年齢65歳以上 | 1.52 (1.01–2.31) | 0.046 | 1.39 (0.90–2.14) | 0.138 | 1.41 (0.97–2.06) | 0.074 | 1.31 (0.88–1.95) | 0.186 |
| 雄性 | 1.18 (0.67–2.08) | 0.566 | — | — | 1.13 (0.69–1.84) | 0.632 | — | — |
| 腫瘍の長さ ≧5 cm | 1.89 (1.25–2.86) | 0.003 | 1.44 (0.93–2.23) | 0.103 | 1.76 (1.22–2.55) | 0.003 | 1.36 (0.92–2.01) | 0.122 |
| 分化不全 | 1.63 (1.07–2.47) | 0.024 | 1.29 (0.84–1.99) | 0.245 | 1.58 (1.09–2.28) | 0.016 | 1.27 (0.86–1.87) | 0.228 |
| pT3–4期 | 2.04 (1.19–3.49) | 0.009 | 1.36 (0.76–2.44) | 0.304 | 1.92 (1.18–3.11) | 0.009 | 1.29 (0.77–2.18) | 0.335 |
| リンパ節転移 | 2.46 (1.50–4.03) | <0.001 | 1.94 (1.15–3.28) | 0.013 | 2.12 (1.37–3.28) | 0.001 | 1.73 (1.08–2.79) | 0.023 |
| 根治手術に基づく治療 | 0.43 (0.28–0.65) | <0.001 | 0.56 (0.36–0.88) | 0.012 | 0.51 (0.35–0.74) | <0.001 | 0.63 (0.43–0.94) | 0.024 |
| CEA値の上昇 | 1.88 (1.24–2.85) | 0.003 | 1.34 (0.86–2.10) | 0.199 | 1.71 (1.18–2.49) | 0.005 | 1.26 (0.84–1.88) | 0.267 |
| SCC-Agの上昇 | 1.95 (1.25–3.03) | 0.003 | 1.29 (0.80–2.08) | 0.302 | 1.82 (1.22–2.72) | 0.004 | 1.25 (0.81–1.93) | 0.315 |
| CA125値の上昇 | 1.79 (1.16–2.78) | 0.009 | 1.21 (0.76–1.93) | 0.421 | 1.68 (1.13–2.50) | 0.011 | 1.18 (0.77–1.82) | 0.446 |
| 高い複合バイオマーカー負荷 | 2.91 (1.89–4.46) | <0.001 | 2.24 (1.41–3.54) | 0.001 | 2.63 (1.80–3.84) | <0.001 | 2.03 (1.35–3.05) | 0.001 |
表6：全生存期間および無増悪生存期間に関する単変量および多変量Cox回帰分析。 clinicopathological変数、個々のバイオマーカーの上昇、および複合バイオマーカー負荷の高値について、ハザード比および95%信頼区間を示す。
| モデル | トレーニングコホート C-index | トレーニング 1年 AUC | トレーニング 3年 AUC | トレーニング 5年 AUC | 外部検証 C-index | 外部検証 1年 AUC | 外部検証 3年 AUC | 外部検証 5年 AUC | NRI（TNM比較） | IDI（TNM比較） |
| TNMステージ単独 | 0.662 | 0.701 | 0.676 | 0.648 | 0.641 | 0.672 | 0.651 | 0.628 | — | — |
| バイオマーカーパネル単独 | 0.703 | 0.744 | 0.713 | 0.689 | 0.681 | 0.709 | 0.687 | 0.666 | 0.118 | 0.049 |
| 臨床病理学的モデル | 0.736 | 0.772 | 0.748 | 0.721 | 0.708 | 0.741 | 0.719 | 0.694 | 0.153 | 0.061 |
| 統合モデル | 0.792 | 0.829 | 0.806 | 0.781 | 0.761 | 0.801 | 0.774 | 0.748 | 0.274 | 0.102 |
表7：トレーニングコホートおよび外部検証コホートにおける異なる予後モデルの予測性能。 HarrellのC指数、時間依存性AUC、純再分類改善度、および統合識別改善度について、TNMステージのみ、バイオマーカーパネルのみ、臨床病理学的モデル、および統合モデルの間で比較を行う。
補足表 1：参加者のスクリーニング、除外および最終的なコホート割り当て。スクリーニング数、除外理由、最終的な解析対象集団、診断グループの分布、およびセンター別のコホート割り当てについてまとめている。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足表2：血清バイオマーカー測定のアッセイ間および施設間の再現性。CEA、SCC-Ag、およびCA125の施設間変動係数およびクラス内相関係数を用いて、盲検化されたブリッジング血清分注検体の試験結果をまとめている。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
補足表3：診断群別の血清バイオマーカー分布および複合バイオマーカー負荷。ESCC患者、良性食道疾患コントロール、および健康コントロールにおける血清CEA、SCC-Ag、CA125の群別分布と、高い複合バイオマーカー負荷を持つ割合をまとめたものである。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足表 4：診断モデル係数およびブートストラップ内部妥当性検証。診断モデルの切片、バイオマーカー係数、単変量および多変量ロジスティック回帰推定値、トレーニングコホートのカットオフ値、ブートストラップ再サンプリング数、楽観的バイアス補正後のAUC（曲線下面積）、キャリブレーション・スロープ、およびBrierスコアをまとめている。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足表5：予後検証におけるフォローアップ、ランドマーク生存率、キャリブレーション、および決定曲線の結果バイオマーカー負荷群別のフォローアップ期間、生存イベント数、OSおよびPFSの中央値、C-indexの改善度、楽観度補正済みC-index、ランドマーク累積死亡確率、外部検証Brierスコア、キャリブレーションスロープ、および決定曲線の正味の利益推定値をまとめている。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
この2施設共同研究では、食道扁平上皮癌（ESCC）の診断および予後評価のために、CEA、SCC-Ag、およびCA125を統合した複合血清バイオマーカーパネルを開発し、外部妥当性を検証しました。この複合パネルは、ESCCと非悪性コントロールを区別する能力において個々のバイオマーカーを上回り、外部検証コホートにおいても許容可能な識別能を維持しました。この知見は、血清腫瘍マーカーが臨床的に有用な診断および予後情報を提供できることを示した先行のESCC研究と一致していますが、単一マーカーの性能は、悪性疾患と非悪性疾患の間の生物学的な重複によって制限されることが多いことが示唆されています23,24。したがって、本研究の主な貢献は、治療前の診断、臨床病理学的相関、および生存層別化を単一の解析フレームワークに統合した、再現可能な3マーカーワークフローを開発したことにあります。
複合パネルの性能が向上したのは、CEA、SCC-Ag、およびCA125が、部分的に異なる腫瘍関連プロセスを反映しているためであり、生物学的に妥当である。SCC-Agは扁平上皮悪性腫瘍と密接に関連しており、本コホートにおいて単独での診断能が最も高かった。CEAは腫瘍量、浸潤型表現型、および全身性の悪性活動を反映している可能性があり、一方でCA125はESCC特異的な生物学的特性よりも、より広範な炎症、漿膜、または進行した疾患のシグナルを捉えている可能性がある25,26。これら3つのバイオマーカー間の相関が中程度であったことは、各マーカーが関連しつつも冗長ではないことを示唆しており、単一の血中測定値に依存するのではなく、共同モデリングを行うことを支持している。
複合バイオマーカー負荷が高いことは、腫瘍の増大、pT3–4病変、リンパ節転移、およびTNMステージIII–IV病変と関連しており、このパネルが単なる二値的な診断シグナル以上の情報を捉えていることが示された。このパターンは臨床的に重要である。なぜなら、ESCCの管理において解剖学的ステージが依然として中心的な役割を果たす一方で、同じステージの患者間であっても、腫瘍の悪性度、全身的な負荷、および生存転帰が異なる可能性があるためである27。したがって、血清ベースのバイオマーカープロファイルは、特に臨床医が手術、根治的化学放射線療法、全身治療、または強化フォローアップを行う前に追加情報を必要とする場合に、治療前のリスク評価を精緻化するのに役立つ可能性がある。生存分析において、主要な臨床病理学的変数で調整した後も、高い複合バイオマーカー負荷はOSおよびPFSの不良と独立して関連しており、統合モデルはTNMステージ単独よりも高いC-indexおよび時間依存性AUCを示した28。
画像ベース、ラジオミクス、遺伝子発現、またはマルチオミクスモデルと比較して、本パネルは実用的な利点を持つ一方で、生物学的な範囲は限定的である。ラジオミクスおよびトランスクリプトームモデルは、空間的な不均一性、腫瘍微小環境の特徴、および分子サブタイプを捉えることができ、ESCCにおいて有望な予後予測能を示したものもある29,30。しかし、これらのアプローチには、標準化された画像診断プロトコル、高度な計算パイプライン、高品質な組織サンプル、シーケンシングプラットフォーム、または専門的なバイオインフォマティクスのサポートが必要となることが多い。対照的に、CEA、SCC-Ag、およびCA125は多くの臨床検査室で日常的に測定されており、比較的安価で、フォローアップ期間中に繰り返し測定することが可能である。したがって、本パネルの臨床的価値は、そのアクセスの容易さとワークフローへの適合性にあり、画像診断、病理診断、分子プロファイリング、またはTNMステージングを代替することにあるのではない。
校正および決定曲線分析の結果は、慎重な臨床転用を支持しています。統合診断モデルは、トレーニングコホートと外部検証コホートの両方で許容可能な校正を示し、決定曲線分析では、臨床的に関連のある閾値範囲全体で正のネットベネフィットが示唆されました。また、統合予後モデルにおいても、外部検証において識別能の向上と許容可能な校正が示されました。これらの知見は重要であるなぜなら、識別能のみが高いモデルであっても、校正が不十分であったり、臨床的に有用でなかったりする場合があるためです31。AUC、C-index、校正、Brierスコア、および決定曲線の結果を報告することで、本研究は、識別指標やハザード比のみに依存した研究よりも、より包括的なモデル性能の評価を提供しています。
いくつかの限界を認める必要がある。本研究では外部検証を含めているが、2つの施設に限定されており、検証コホートはトレーニングコホートよりも小規模であった。バイオマーカー値は治療前のベースラインでのみ測定されたため、術前補助療法、化学放射線療法、術後 surveillance、または再発モニタリング中の経時的な変化は評価されなかったが、腫瘍マーカーの連続的な変動傾向はさらなる予後情報を提供する可能性がある32。血清パネルは、同一の患者集団においてラジオミクス、遺伝子発現、循環腫瘍DNA、またはその他のリキッドバイオプシーモデルと直接比較されておらず、炎症性疾患、良性疾患、または併存疾患において偽陽性の上昇が起こる可能性がある。要約すると、CEA、SCC-Ag、およびCA125を組み合わせた血清パネルは、個々のバイオマーカーよりも優れた診断識別能を示し、不良な臨床病理学的特徴と関連しており、従来の臨床変数に加えることで予後層別化を改善した。日常的な臨床導入には、さらなる多施設共同検証、連続的なバイオマーカー評価、および画像ベースのモデルや分子モデルとの直接比較が必要である。
開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
謝辞
著者らは、サンプル収集、臨床検査、およびデータ管理における支援をいただいた、南京中医学大学附属医院・江蘇省中医院検査医学科、および南京市南湖社区衛生サービスセンターのスタッフに感謝いたします。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Access CEAキャリブレーター | Beckman Coulter | 33205 | 血清CEAアッセイのキャリブレーション |
| CEA品質管理へのアクセス | Beckman Coulter | 33029 | 血清CEA測定における日次内部精度管理 |
| Access CEA試薬パック | Beckman Coulter | 33200 | UniCel DxI 800 Access免疫測定システムを用いた血清CEA測定 |
| 可変量マイクロピペット, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | 遠心分離後の血清分注 |
| ARCHITECT CA 125 II キャリブレーター | Abbott Diagnostics | 申し訳ございませんが、翻訳対象のソーステキストが提供されておりません。翻訳が必要なテキストをご提示ください。 | 血清CA125アッセイの校正 |
| ARCHITECT CA 125 II コントロール | Abbott Diagnostics | 02K4511 | 血清CA125測定における日次内部精度管理 |
| ARCHITECT CA 125 II 試薬キット | Abbott Diagnostics | 02K4529 | ARCHITECT i2000SR免疫分析装置による血清CA125の測定 |
| ARCHITECT i2000SR 免疫分析装置 | Abbott Diagnostics | i2000SR | SCC-AgおよびCA125検査のための自動化学発光微粒子免疫測定プラットフォーム |
| ARCHITECT SCC キャリブレーター | Abbott Diagnostics | 8D1801 | 血清SCC-Agアッセイの校正 |
| ARCHITECT SCCコントロール | Abbott Diagnostics | 8D1810 | 血清SCC-Ag測定における日常的な内部精度管理 |
| ARCHITECT SCC 試薬キット | Abbott Diagnostics | 8D1828 | ARCHITECT i2000SR免疫分析装置による血清SCC-Ag測定 |
| バーコードラベルプリンター | ブレイディ | BMP51 | 血清分注試料および極低温保存バイアルのバーコードラベル貼付 |
| 採血針 | BD Biosciences | 367286 | 末梢静脈血採取 |
| 極低温保存ボックス | Corning | 431131 | 凍結保存した血清分注サンプルの組織的な保管 |
| 凍結保存バイアル、2.0 mL、外ネジ式、自立型 | Corning | 430659 | バーコードラベルを貼付した血清分注検体の保存場所： −80 °C |
| データ抽出フォームおよび事前定義されたデータディクショナリ | 研究チーム | 該当なし | 臨床的、病理学的、検査的、および追跡調査変数の標準化された抽出 |
| dcurves パッケージ | Rパッケージ | バージョン 0.4.0 | 決定曲線分析および臨床的純便益の推定 |
| 電子カルテシステム | 参加病院 | 該当なし | 人口統計学的データ、臨床データ、治療データ、および追跡調査データの抽出 |
| フィルター付きピペットチップ, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | コンタミネーションを制御した血清分注 |
| ggplot2パッケージ | Rパッケージ | バージョン 3.5.1 | 統計的視覚化と図の作成 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | バージョン 27.0 | ベースライン比較および補完的な統計的検証 |
| ラボラトリー情報管理システム | 参加病院検査室 | 該当なし | 血清バイオマーカー検査記録の抽出および紐付け |
| miceパッケージ | Rパッケージ | バージョン 3.16.0 | 連鎖方程式による多重代入法 |
| nricensパッケージ | Rパッケージ | バージョン 1.6 | 純再分類改善分析 |
| 病理報告システム | 参加病院 | 該当なし | ESCC診断の確定、良性病理、腫瘍特性、および病期関連変数の確認 |
| pROCパッケージ | Rパッケージ | バージョン 1.18.5 | 受信者動作特性曲線の分析およびDeLong法による比較 |
| R統計ソフトウェア | R Foundation for Statistical Computing | バージョン 4.3.2 | 統計解析、モデル構築、検証、および図表の作成 |
| 冷却遠心機 | Eppendorf | 5810 R | 1,500 x gで10分間の遠心分離による血清分離 |
| rmsパッケージ | Rパッケージ | バージョン 6.8-1 | キャリブレーション分析、ノモグラム作成、および回帰モデルの検証 |
| 血清分離血液採取管、5 mL | BD Biosciences | 367955 | 血清バイオマーカー検査のための空腹時末梢静脈血の採取 |
| サバイバルパッケージ | Rパッケージ | バージョン 3.5-7 | Cox比例ハザード回帰および生存分析 |
| survminerパッケージ | Rパッケージ | バージョン 0.4.9 | カプラン–マイヤー曲線の可視化 |
| 電話追跡調査記録票 | 研究チーム | 該当なし | 生存、再発、進行および最終接触情報の収集と確認 |
| timeROCパッケージ | Rパッケージ | バージョン 0.4 | 時間依存性受信者動作特性曲線分析 |
| 超低温冷凍庫 | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | 血清分注試料の保存温度 −80 °C |
| UniCel DxI 800 Access免疫測定システム | Beckman Coulter | DxI 800 | 血清CEA測定のための自動化学発光免疫測定プラットフォーム |
参考文献
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