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方法論記事

基質ベースの免疫組織化学染色を用いた免疫能を有する膠芽腫幹細胞様細胞モデルにおける腫瘍内免疫細胞抗原の検出

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DOI:

10.3791/72193

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2026年8月21日

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1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

この記事について

サマリー

本研究では、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された膠芽腫幹細胞由来の腫瘍組織切片において、単一および二重抗原を安定して検出するための、詳細で再現可能な基質ベースの免疫組織化学ワークフローを提示します。このプロトコルは、技術的な課題に対処しつつ、さまざまな免疫マーカーおよび腫瘍マーカーの同定を可能にするものであり、他の腫瘍モデルへの応用の可能性も有しています。

要約

膠芽腫（GBM）は、最も一般的で致死的な原発性脳悪性腫瘍であり、有効な治療法が存在しません。GBMは、治療抵抗性を持つGBM幹細胞様細胞（GSC）によって部分的に駆動される、高度に免疫抑制的な腫瘍微小環境を特徴としています。本稿では、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）脳腫瘍切片において、腫瘍浸潤免疫細胞に関連する表面および細胞内抗原を検出するための、再現性のある基質ベースの単色および二色免疫組織化学（IHC）プロトコルについて解説します。脳腫瘍は、免疫十分マウスに正位移植したマウスGSCから誘導しました。単色IHCのワークフローでは、個々の免疫細胞抗原を可視化するために西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ベースの発色検出システムを使用します。一方、二色IHCのワークフローでは、同一の宿主由来一次抗体を使用する場合を含む、同一組織切片内での2種類の免疫細胞抗原の同時検出のために、連続的なアルカリホスファターゼ（AP）ベースの染色戦略を採用しています。これらの手法は、GBM組織における腫瘍浸潤免疫細胞関連抗原の発色分析のための実用的かつ再現可能な枠組みを提供し、他の前臨床腫瘍モデルや、潜在的にヒトFFPE検体にも適用可能です。

概要

膠芽腫（GBM）は、侵襲性が非常に高く不均一な原発性悪性脳腫瘍であり、現在の標準治療にもかかわらず、患者の生存率は低い1。GBMの決定的な特徴は、高度に免疫抑制的な腫瘍微小環境（TME）であり、これが免疫療法の戦略に対する耐性に寄与している2,3。GBMにおける免疫抑制は、エフェクターT細胞の浸潤減少や、T細胞の機能不全および疲弊の誘導など、複数のメカニズムによって引き起こされる4。さらに、GBM細胞のサブポピュレーションであるGBM幹細胞様細胞（GSC）は、細胞傷害性免疫活性が限定的な、免疫学的に「cold」なTMEを維持することで、免疫逃避をさらに促進する5。これらの特徴は、GBMのTMEにおける腫瘍浸潤免疫細胞集団とその機能状態を正確に特性評価することの重要性を強調している。

免疫組織化学（IHC）は、組織構造を維持しながら、細胞マーカーのin situでの可視化、局在化、および半定量的な評価が可能であるため、腫瘍組織内の免疫細胞浸潤を評価するために最も広く用いられている手法の一つである6,7,8,9,10,11,12。これまでの免疫組織化学的および免疫プロファイリング研究により、GBMの免疫景観に関する理解が大幅に進展し、腫瘍の進行や治療反応に関連する免疫細胞集団が特定されてきた12,13,14,15,16。単色発色IHCは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み（FFPE）組織切片において個々の免疫マーカーを検出するのに特に有用である12,13,15,17,18,19,20。対照的に、二色発色IHCでは同一組織切片内で2つのマーカーを同時に可視化できるため、細胞の表現型、増殖、または活性化状態の評価が容易になる12,19,21。

これらの進展にもかかわらず、免疫能を有するGSC由来GBMモデルに適用可能な、実用的かつ標準化された基質ベースの発色IHCプロトコルは依然として限られています。さらに、GBMにおける発色IHCは、他の多くの固形腫瘍よりも困難です。これは、免疫細胞の浸潤が希薄で不均一であること、腫瘍内不均一性が広範であること、そして高度に免疫抑制的で複雑なTME（腫瘍微小環境）であるためであり、これらが同一組織切片内における複数の細胞集団の正確な可視化と解釈を困難にしています2,3,4。二重発色IHCではさらなる技術的課題が生じます。特に、両方の一次抗体が同一の宿主種で作製されている場合は、抗体の適合性の慎重な最適化、同一組織切片内で2つの抗原を同時に検出するための連続染色戦略、および光学顕微鏡下でマーカーを明確に識別するための発色基質の選択が必要となります。

ここでは、免疫能を持つ正位移植 005 GSC 由来 GBM モデル22,23,24において、代表的な腫瘍浸潤免疫細胞に関連する表面および細胞内抗原を効率的に検出できる、再現性のある基質ベースの単色および二色 IHC プロトコルについて解説します。これらの基質ベースの発色 IHC プロトコルは、他の前臨床腫瘍モデルや、潜在的にヒトの FFPE 腫瘍検体にも応用可能です。採取したマウス脳組織は、既報の通り19、標準的な組織処理およびパラフィン埋没を行う前に、10% 中性緩衝ホルマリンで一晩（約 12 h）固定しました。FFPE ブロックを正電荷付与顕微鏡ガラススライドに薄切（厚さ 5 µm19）し、使用まで室温で保存しました。単色 IHC では、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ベースの発色検出システムを用い、3,3′-ジアミノベンジジン（DAB）を基質として、光学顕微鏡下で個々の抗原を可視化するための茶色のシグナルを生成します。このワークフローは、FFPE 組織切片における膜結合抗原および細胞内抗原の両方の検出に適しています。

2色IHC（免疫組織化学染色）を用いることで、同一の組織切片内で2つの抗原を同時に検出できますが、抗体の適合性と明確な発色信号の分離を確保するために、追加の最適化が必要です。一次抗体が異なるホスト種で作製されている場合は、種特異的な二次抗体を使用できるため、2色IHC染色は比較的容易です。しかし、両方の一次抗体が同一のホスト種に由来する場合、同時検出は技術的に困難になります。この課題を解決するため、本稿で解説する2色IHCワークフローでは、異なる基質を用いたアルカリホスファターゼ（AP）ベースの逐次的な発色染色戦略を採用し、光学顕微鏡下で2つの抗原信号を明確に視覚的に区別できるようにしています。

どちらのワークフローにも、組織の脱パラフィン、親水化、抗原賦活化、ブロッキング、染色、脱水、透徹化、および封入の工程が含まれています。試薬の調製は、染色の品質と再現性において極めて重要です（Supplementary File 1を参照）。同様に、一次抗体の適切な希釈も染色の成功に不可欠であり、これは使用直前に、対応する二次抗体の宿主種に応じて2.5%の正常馬または山羊血清を用いて行います（Table 1を参照）。単色および二色染色に使用した種特異的な二次抗体の一覧は、Table 2に示されています。単色IHCではキシレンベースの透徹剤および封入剤を使用しますが、二色IHCでは基質がキシレンに一部可溶であるため、キシレンフリーの代替品（Histo-Clearなど）が必要です（基質のリストはTable 3を参照）。

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プロトコル

本プロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）（IACUCプロトコル番号：2004N000067およびLA24-0045）を含む、すべての関連する規制および機関のガイドラインに従って実施されました。

注：単色および二色 IHC プロトコルのいくつかのステップにおいて、エタノールや組織透明化剤などの可燃性試薬を使用します。したがって、脱パラフィン、親水化、脱水、透明化、封入など、可燃性化学物質を扱う手順は、適切な実験室安全基準に従い、認定済みの化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。可燃性試薬は、施設内の安全ガイドラインに従い、適切にラベルを貼付したねじ蓋付きのガラス容器に入れ、指定の可燃性物質保管庫に保管し、調製してください。材料および試薬の量は、最大 48 枚の顕微鏡スライド（染色ラック 2 個、1 ラックあたり 24 枚）の一括処理に合わせて構成されていますが、ワークフローは実験上の必要に応じて容易にスケールアップ可能です。

1. FFPE脳腫瘍切片の単色IHC染色

注：以下のプロトコルでは、正位移植005 GSCモデル由来のFFPE脳腫瘍切片における、代表的な細胞表面抗原および細胞内抗原を検出するための基質ベースの単色IHCについて説明します。

  1. 脱パラフィン処理（20分）：
    1. スライドをポリオキシメチレン（POM）製スライドラックに入れ、スライドラックを染色容器に浸します。まずキシレンIに10分間、次にキシレンIIに10分間、それぞれドラフトチャンバー内で浸漬させます。脱パラフィン処理の間、組織切片が完全にキシレンに浸ったままであることを確認してください。
      注意：この操作は、白衣、保護メガネ、フェイスマスク、手袋などの適切な個人用保護具（PPE）を着用し、化学薬品用フード内で行ってください。この段階および以降のステップにおいて、切片を乾燥させないでください。乾燥すると組織の損傷や切片の紛失につながる可能性があります。キシレン溶液は密閉ガラス容器に保存し、汚れがない場合は再利用してください。
  2. 緩やかな再水和（15分）：
    1. 切片を100%、90%、70%のエタノールに順に5分ずつ浸漬し、再水和させます。具体的には、染色容器内でスライドを100%エタノールに5分間浸漬し（その後、100%エタノールを再利用のためガラス瓶に戻します）、続いて90%エタノールに5分間浸漬し（その後、瓶に戻します）、最後に70%エタノールに5分間浸漬します（その後、瓶に戻します）。
      注意：この手順は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行い、ステップ1.1と同様の個人用保護具（PPE）を着用してください。これらのエタノール溶液は、気密性のあるガラス容器に保存され、外観的に清潔である場合に限り、複数の実験で再利用することが可能です。
  3. 水洗（5分）：
    1. スライドを蒸留水に5分間浸し、これで再水和工程を完了します。
      注：このステップの実行中に、1倍（1スライドラック分）につき600 mL、または2倍（2スライドラック分）につき800 mLの1（溶液/試薬名）を準備してください。× 記載された手順に従い、2 Lの電子レンジ対応ガラスビーカーに抗原賦活化緩衝液（10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液）を用意する。 補足ファイル1に.
  4. 抗原賦活化（約20分）：
    1. あらかじめ調製した10 mMクエン酸ナトリウム抗原 retrieval（回帰）緩衝液を入れた2 Lビーカーをプラスチックラップで覆い、予熱および長時間のマイクロ波加熱中の過度な蒸発を防ぎます。
    2. 組織切片を煮沸する際に発生する過剰な圧力によってバッファーが吹き出さないよう、プラスチックラップに数箇所穴を開けます。
      注： ステップ1.1に従い、個人用保護具（PPE）を着用してください。
    3. 調製したばかりの10 mMクエン酸ナトリウム抗原回帰バッファー溶液を3分間予熱する。再水和させた組織切片を載せたスライドラックを、予熱した抗原回帰溶液に入れる。
    4. その後、 組織切片を最高出力（例：P10）の電子レンジで15分間加熱する。その際、切片が浸漬したままであり、蒸発によって乾燥しないよう、ビーカーの状態を注意深く監視すること。
      注： あるいは、スチームクッカー内に設置したプラスチック製染色槽で約15分間抗原賦活化を行います。この方法は、より緩やかな加熱が可能であり、監視の手間も少なくなります。クエン酸ナトリウム緩衝液（10 mM, pH 6.0）が、以下に挙げるすべての一次抗体に対する抗原賦活化緩衝液として検証され、有効であることが確認されました。 表1. 一次抗体および製造元の推奨事項によっては、本研究で評価されていない抗体に対しては、EDTAやTris-EDTAなどの他のバッファーが必要になる場合があります。 
  5. 冷却（10～20分）：
    1. ビーカーを電子レンジから取り出してワークベンチに置き、室温で20分間冷却する。冷却を早める場合は、ビーカーを氷冷した水道水に約10分間浸す。
      注意：極めて高温になります。取り扱う際は、適切な耐熱手袋またはビーカー用トングを使用してください。ステップ1.1に従い、個人用保護具（PPE）を着用してください。
  6. Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）による洗浄（約10分）：
    1. ビーカーからスライドラックを取り出し、スライドを1に浸します。× 染色容器内のDPBS溶液。
    2. 切片を1で2回洗浄します。× 組織の剥離を防ぐため、穏やかな静置洗浄を用いて、それぞれDPBSで5分間洗浄する。
  7. 疎水性バリア（<1分/スライド):
    1. DPBSによる洗浄（ステップ1.6）の際、スライドを1枚ずつ慎重に取り出し、組織切片自体に触れないよう注意しながら、切片の周囲を低発塵ワイパー（Kim Wipesなど）で優しく拭き取ります。
    2. ペルオキシダーゼ-抗ペルオキシダーゼ（PAP）ペンなどの疎水性バリアを用いて、各組織切片の周囲に液反発性バリアを描き、その後、スライドを染色容器内のDPBS洗浄液に戻します。すべてのスライドに対してこれらの手順を繰り返します。
      注：組織の周囲に疎水性バリアを形成することで、切片間での試薬の混入を防ぎ、組織上の抗体を保持しやすくします。
  8. 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング（5分）：
    1. 廃棄1× 染色容器からDPBSを取り除き、3% H₂O₂ 溶液に浸し、スライドまたは組織切片が5分間完全に浸漬されるようにする。
      注：3% H2O2中での長時間のインキュベーションは₂O₂ 組織を損傷させる可能性があります。発色時に内因性ペルオキシダーゼによって生じるバックグラウンドを防ぐため、内因性ペルオキシダーゼ活性のブロッキングが重要な工程となります。ステップ1.1と同様に個人用保護具（PPE）を着用してください。
  9. DPBSによる洗浄（〜12分）：
    1. 3% H2O2を廃棄します。₂O₂ 溶液で洗浄し、スライドを再度1回すすぎます。× DPBSで2回、各5分間洗浄する。
    2. 2回目の洗浄後、スライドをスライドラックから取り出し、加湿チャンバー内に水平に配置して、チャンバーの縁に蒸留水を加えます。
    3. 切片を乾燥させないよう、直ちにステップ1.10のブロッキングに進んでください。
      注：以下に記載されている各加湿チャンバーの 材料表 30枚のスライドを収容可能です。
  10. 血清ブロッキング（約70分）：
    1. 50を添加する µ各セクションにつき5%牛血清アルブミン（BSA）溶液を〇〇L添加し、組織セクションからのブロッキング緩衝液の蒸発を防ぐため、加湿チャンバーの蓋を閉じた状態で室温で30分間インキュベートする。
    2. 30分後、ワークベンチ上に敷いたリントフリーワイプにスライドを軽く叩きつけ、BSAを除去します。
    3. 次に、二次抗体の宿主種に合わせて、2.5%正常馬血清または正常山羊血清を（切片1枚につき1滴）加え、加湿チャンバーの蓋をした状態で室温でさらに30分間インキュベートする。その後、スライドを吸収紙またはリントフリーワイプの上で軽く叩いて血清を除去し、直ちにステップ1.11に進む。
      注：切片を乾燥させないようにしてください。適切なブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を用意します（参照 表1ブロッキング工程の終盤に準備しておくことで、ブロッキング完了後のステップ1.11ですぐに使用できる状態にします。
  11. 一次抗体反応（約16時間）：
    1. 約50を適用する µ適切なブロッキングバッファーで最適に希釈した一次抗体溶液（～ L）（参照： 表1）、組織切片に塗布し、4℃で一晩（約16時間）インキュベートする。 °加湿チャンバー内でのC。
      注：チャンバー内を一夜の間加湿状態に保つため、加湿チャンバーの指定箇所に蒸留水を満たしてください。また、組織スライド用の指定箇所およびチャンバーに蒸留水を入れないよう注意してください。ここに水が入ると、組織切片が浸水する原因となります。
  12. DPBS (0.1% Tween 20)による洗浄（約18～20分）：
    1. スライドラックを染色容器に入れ、洗浄バッファー (1× DPBS、0.1% Tween 20)
    2. 一晩インキュベーションした後、加湿チャンバーからスライドを取り出し、吸水紙の上にスライドを軽く叩いて一次抗体を拭き取り、洗浄バッファー（1× 染色容器にDPBS（0.1% Tween 20含有）を入れ、洗浄バッファーを廃棄します。
    3. 次に、切片を1回洗浄します。× DPBS（0.1% Tween 20含有）で3回（各5分間）洗浄し、その後、スライドをスライドラックから取り出して加湿チャンバー内に平らに置き、直ちにステップ1.13へ進む。
      注：ステップ1.15の発色後に背景染色のレベルが高く観察される場合は、各洗浄時間を10〜15分まで延長できます。組織のスライドからの脱落を防ぐため、洗浄は穏やかに、静的な状態（ロッキングやシェーキングをしない）で行ってください。
  13. 二次抗体反応（約32～35分）：
    1. 適切なHRP結合二次抗体（状況に応じて抗ウサギまたは抗ラットIgGを選択。参照： 表2）後、加湿チャンバーの蓋をした状態で、組織切片を室温で30分間インキュベートします。
      注：ステップ1.15におけるバックグラウンドを低減させるため、二次抗体をPBSで1:1に希釈して使用することができます。
  14. DPBS（0.1% Tween 20）による洗浄（約18～20分）：
    1. 二次抗体でのインキュベーション後、スライドを加湿チャンバーから取り出し、吸収紙の上でスライドを軽く叩いて二次抗体を除去する。
    2. その後、スライドを洗浄バッファー（1× 染色容器内にある0.1% Tween 20含有DPBSを用いて短時間洗浄し、洗浄バッファーを廃棄する。
    3. その後、組織切片を1で3回洗浄します。× DPBS（0.1% Tween 20）で各5分間。
      1. 発色工程（すなわちステップ1.15）を開始する前に、クロモゲン反応を停止させるためのステップ1.16の準備として、蒸留水を満たした染色容器に別のスライドラックを用意しておく。
      2. 最終洗浄の間に、DAB作業溶液を調製します（基質1mLに対し、発色剤を1滴加します。参照： 補足ファイル1).
  15. 発色反応（30秒〜5分）：
    1. ステップ1.14の3回目の洗浄後、スライドをスライドラックから取り出し、白い背景のワークベンチ上に平らに置きます。
    2. 50を適用する µ各切片にDAB作業溶液を（指定の量）L加え、白色背景下または光学顕微鏡下で、褐色への発色を視覚的に確認する。
      注：ステップ1.1に従い、個人用保護具（PPE）を着用すること。白い吸収紙を使用すると、DAB発色段階における茶色の発色を確認しやすくなる。発色に要する時間は、マーカーによって20〜60秒、あるいは2〜5分となる場合がある（詳細はステップ1.16を参照）。
  16. 反応停止（1〜2分）：
    1. ステップ1.15で目的の茶色のシグナルが現れたら直ちに、ステップ1.14.3.1で準備した蒸留水の容器にスライドを浸し、反応を停止させる。
    2. スライドを蒸留水で1分間すすぎ続ける。蒸留水を捨て、ステップ1.17（対比染色）に進む。
      注：スライドは、染色の結果に影響を与えることなく、最長1時間まで蒸留水に浸しておくことができる。 発色のに必要な時間は、反応停止ステップを開始するタイミングを決定します。さらに、（本研究のように）同一のスライド上に2〜3種類のマーカー（CD3、CD4、CD8など）が存在する場合、反応時間は異なる可能性があります。例えば、本システムでは、CD8の発色には通常約30秒かかります。+ 細胞、CD3に対して1〜3分+ またはCD4+ 細胞、またはグランザイムBの場合はより長い時間（3～5分）+ およびKi67+ 細胞。発色のタイミングが異なるため、反応を停止させるためにスライド全体を蒸留水に浸すことはできない。代わりに、各セクションごとに200〜300μLを添加して、個別に反応を停止させる。 µ各セクションに、蒸留水 L を直接加えます。
  17. 対比染色（<1分):
    1. 褐色の染色のコントラストを高めるため、希釈したヘマトキシリン（蒸留水で1:3に希釈）を染色容器に加え、スライドを希釈ヘマトキシリンに10～20秒間浸漬させる。
      注：DABのバックグラウンドが強い場合は、対比染色の時間を長くする（最大1分まで）か、希釈していないヘマトキシリンを短時間使用してください。
  18. 水道水による洗浄（6分）：
    1. 染色容器からヘマトキシリンを廃棄し、再利用のためにガラス瓶に戻してください。
    2. スライドを水道水で1分間すすぎ、次に、切片に直接水流が当たらないようにしながら、弱く流れる水道水で5分間すすぎます。水道水を捨て、ステップ1.19に進みます。
      注：封入までの残りの工程は、ドラフトチャンバー内で行ってください。
  19. 段階的脱水（15～17分）：
    1. 染色容器内でスライドを70%エタノールに5分間浸し（その後、70%エタノールを再利用するためにガラス瓶に戻す）、続いて90%エタノールに5分間（その後、ボトルに戻す）、最後に100%エタノールに5分間浸す（その後、ボトルに戻す）。
    2. ステップ 1.20へ進んでください。
      注：この操作は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。この脱水ステップでは、ステップ1.2で使用したエタノール溶液を使用します。溶液が清潔に見える場合は、何度も再利用することが可能です。
  20. 透明化：
    1. 脱パラフィン化（ステップ1.1）で使用したときと同じキシレンIおよびII溶液を用いて、組織切片およびスライドを洗浄してください。
    2. まず、染色容器内のキシレンI溶液にスライドを10分間浸し（その後、キシレンIをガラス瓶に戻して再利用する）、次にキシレンII溶液にさらに10分間浸します。
    3. 封入（ステップ1.21）が完了するまで、スライドをキシレンIIに浸漬させたままにしておく。
      注：このステップでは、切片を絶対に乾燥させないでください。切片が乾燥すると脆くなるため、必要に応じて、封入までキシレンIIに長く浸漬させておくことができます。
  21. 封入：
    1. キシレンIIからスライドガラスを1枚ずつ取り出し、化学薬品用ドラフトチャンバー内に平らに置く。適切なサイズのカバーガラスの上にキシレン系封入剤を1滴滴下し、封入剤が組織切片に接するようにカバーガラスをスライドガラス上に載せる。
    2. 親指でカバーガラスを軽く押し、封入剤を3つの切片すべてに均一に広げ、気泡を除去します。
      注：24 × スライド上の3つの切片を覆うために、24×50 mmのカバースリップが必要です。 × 2つの切片用に40 mmのカバーガラス、および24 × 1枚の切片につき24 mmのカバーガラスを使用します。ドラフトチャンバー内では常に気流があるため、封入剤がすぐに乾燥し、スライドからXylene IIが速やかに蒸発して切片が脆くなる可能性があります。そのため、1枚のスライドにつき30秒以内に封入を完了させることが重要です。
  22. 風乾および光学顕微鏡観察：
    1. 評価および光学顕微鏡を用いたイメージングを行う前に、ドラフトチャンバー内でスライドを少なくとも2時間自然乾燥させる。乾燥後、マウントしたスライドをスライドボックスに入れ、室温で数年間保存できる。

2. FFPE脳腫瘍切片を用いた2色免疫組織化学（IHC）染色

注：以下のプロトコルでは、同一のFFPE脳腫瘍切片内で2つの抗原を同時に検出するための、基質ベースの2色クロモゲン免疫組織化学（IHC）ワークフローについて説明します。単色IHCと比較して、2色ワークフローは、各染色ラウンドでのオーバーナイト培養を含む独立した一次抗体培養による連続的な染色サイクルが必要となるため、より多くの時間を要します。しかし、この拡張ワークフローにより、組織の形態を維持し、光学顕微鏡下で明確なクロモゲン信号の分離を保ちながら、同一組織切片内での信頼性の高い同時抗原検出が可能になります。

  1. 脱パラフィン処理（20分）：
    1. 化学ドラフトチャンバー内で、ステップ1.1の単色IHC（免疫組織化学染色）で概説した手順と同様の脱パラフィン工程を行う。ただし、キシレンの代わりに非キシレン系透徹剤（例：Histo-Clear IおよびHisto-Clear II）を使用すること。
      注意：ステップ1.1に従い個人用保護具（PPE）を着用し、この操作は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。発色剤はキシレンに一部可溶であるため、Histo-Clearの使用が推奨されます。また、キシレンフリーの処理を行うことで、2色染色の免疫組織化学（IHC）における染色の強度が維持されます。切片を乾燥させないでください。これらの透明化溶液は、密閉されたガラス容器に保存され、外観が清潔である場合は再利用可能です。
  2. 段階的な再水和（15分）：
    1. ステップ1.2で説明した単色IHCと同様に行う。エタノール濃度を段階的に下げ（100%、90%、70%）、各段階で5分間ずつ浸漬し、切片を順次再水和させる。
      ​注：ステップ1.2の単色IHCに使用した段階エタノールは、キシレンIIで汚染されている可能性があるため、ここではそれとは別に、キシレン不使用の段階エタノールを使用します。
  3. 水洗い（5分）：
    1. ステップ1.3の単色IHCと同様に行い、スライドを蒸留水に5分間浸して再水和プロセスを完了させます。
      ​注：ステップ1.3と同様です。この5分間の間に抗原賦活化溶液を調製してください。
  4. 抗原 retrieved（約20分）：ステップ1.4で詳述した単色IHCと同じ抗原 retrieved 手順に従う。
  5. 冷却（10～20分）：ステップ1.5で説明した単色IHCと同様の冷却手順に従ってください。
  6. DPBS洗浄（10分）：ステップ1.6の単色IHCで説明されている手順に従い、抗原賦活化溶液を洗い流す。
  7. 疎水性バリア（<（1分/スライド）：
    1. ステップ2.6のDPBSによる洗浄の際、ステップ1.7と同じ手順/プロトコルに従って、組織切片の周囲に疎水性バリアを作成してください。
    2. 疎水性バリアペンを用いて、各組織切片の周囲に撥水性のバリアを描き、その後、スライドを染色容器内のDPBS洗浄液に戻します。すべてのスライドに対してこれらの手順を繰り返します。
  8. アルカリホスファターゼのブロッキング（5分）：
    1. すべての組織切片の疎水性バリアの作成が完了後、スライドを染色容器から取り出し、加湿チャンバーに水平に配置する。切片1枚につき内因性アルカリフォスファターゼブロッキング溶液（例：BLOXALL）を1滴滴下し、5分間インキュベートする。直ちにステップ2.9へ進む。
      ​注：2色染色IHCプロトコルではAP標識二次抗体を使用するため、赤色または青色の発色時の背景シグナルを低減させるには、内因性アルカリフォスファターゼ活性をブロックすることが不可欠です。ここでは、内因性アルカリフォスファターゼを抑制するためにBLOXALLブロッキング溶液を使用しています。このブロッキング溶液は内因性ペルオキシダーゼも抑制するため、単色染色IHCプロトコルにおいて、3% H2O2の代わりに内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために使用することも可能です。₂O₂ 溶液
  9. DPBS洗浄（10分）：
    1. スライドを1回洗浄します。× 染色容器内で、DPBS溶液を用いて2回、各5分間洗浄する。
    2. 2回目の洗浄後、染色容器からスライドを取り出し、加湿チャンバー内に水平に配置し、加湿チャンバーの端に蒸留水を加える。
      注意：切片を乾燥させないよう、直ちにステップ2.10の非特異的抗原抗体結合のブロッキングに進んでください。
  10. 血清ブロッキング（約70分）：
    1. ステップ1.10で概説した単色IHCプロトコルと同様の血清ブロッキング工程に従ってください。
      1. まず、ユニバーサルブロッキングバッファー（5% BSA; 50 µ（1枚あたり〇〇 $\mu$L/切片）を用いて室温で30分間処理し、続いて二次抗体であるAP標識抗ウサギIgG抗体のホスト種と一致する2.5%正常馬血清（1切片につき1滴）を用いて、加湿チャンバーの蓋をした状態で室温でさらに30分間処理します。
      2. この期間が経過した後、スライドを吸収紙で軽く叩いて血清を除去し、ステップ2.11に進みます。
        注：一次抗体Iを調製する（参照 表1ステップ1.10で説明したブロッキング工程の最後の1分間に行います。
  11. 一次抗体反応（約16時間）：
    1. ステップ1.11と同様の一次抗体によるインキュベーション工程を行います。例えば、約50を加え、 µ2.5%正常馬血清で1:100に希釈したウサギ抗CD3抗体（～を参照） 表1）、を各組織切片に添加する。
    2. 4℃で一晩（約16時間）インキュベートする。 °加湿チャンバー内でのC。
  12. DPBS (0.1% Tween 20)による洗浄（約18～20分）：
    1. ステップ1.12の単色IHCプロトコルで概説したのと同じ洗浄手順（5分間を3回）に従ってください。
    2. 3回目の洗浄後、スライドを加湿チャンバー内に水平に配置する。直ちにステップ2.13へ進む。
      注：ステップ1.12と同様の注意点に従ってください（例：各洗浄時間を10～15分に延長可能。洗浄は緩やかに、静的に行うこと）。切片を乾燥させないでください。
  13. 二次抗体1回目インキュベーション（約32–35分）：
    1. 各セクションにAP標識抗ウサギIgG二次抗体を1滴ずつ滴下する（参照： 表 2）後、加湿チャンバーの蓋を閉めた状態で、組織切片を室温で30分間インキュベートする。
      注：ステップ2.15におけるバックグラウンドを低減させるため、二次抗体をPBSで1:1に希釈してもよい。
  14. DPBS（0.1% Tween 20）による洗浄（約18～20分）：
    1. 1を用いて同様の洗浄手順を行う。× ステップ1.14で用いたDPBS/0.1% Tween 20。
    2. 注：最終洗浄ステップの間に、基質作動液（推奨量 5 mL、参照： 表 3）製造者の指示に従って（「試薬の調製」を参照。 付随ファイル 1).
  15. 赤色の発色（12～15分）：
    1. ステップ2.14を完了した後、ステップ1.15で説明したように、白い吸収紙などの白い背景を持つワークベンチ上にスライドを平らに置いてください。
    2. freshly prepared red substrate working solutionを十分に混ぜ合わせ、その後50を添加します。 µ各組織切片にLを加え（余った溶液は廃棄すること）。
    3. 組織切片を室温で赤色が出現するまでインキュベートし、2〜3分ごとに白色背景下または光学顕微鏡下で定期的に確認してください。
      注：赤色の発色に必要な時間はマーカーによって異なり、20〜30分かかる場合があります。ただし、CD3の染色の場合は+ AP検出システムを用いて005脳腫瘍切片内の細胞を染色の際、通常12〜15分以内に赤色の発色が起こります。
  16. バッファーによる洗浄（5分間）：
    1. ステップ2.15で目的の赤色のシグナルが現れたらすぐに、切片を1で洗浄します。× 染色容器内でDPBS/0.1% Tween 20を用いて5分間処理する。
    2. この洗浄時間中に、適切なブロッキングバッファーを用いて一次抗体IIを調製します（例：2.5%正常馬血清で1:100に希釈したウサギ抗Ki67抗体。参照： 表1).
      注：単色IHCで使用した蒸留水による洗浄（ステップ1.16）とは異なり、ここでは反応を停止させるだけでなく、過剰な発色剤を徹底的に洗い流し、2回目の染色サイクルの準備を整えるためにDPBS/0.1% Tween 20を使用します。
  17. 一次抗体IIの反応（約16時間）：
    1. スライドを加湿チャンバーに入れ、約50μLを添加する。 µ各組織切片に、調製したばかりのウサギ抗Ki67抗体をL加え、4℃で一晩（約16時間）インキュベートする。 °C.
  18. DPBS（0.1% Tween 20）による洗浄（約18–20分）：
    1. ステップ 1.12と同様の手順に従ってください。
    2. 3回目の洗浄後、スライドを染色容器から取り出し、加湿チャンバー内に平らに置きます。直ちにステップ2.19に進んでください。
  19. 二次抗体II反応（約32～35分）：
    1. ステップ2.13と同様の手順に従ってください。各セクションにAP結合抗ラビットIgGを1滴ずつ加えてください（参照 表2）その後、加湿チャンバーの蓋をした状態で、組織切片を室温で30分間インキュベートする。
  20. DPBS (0.1% Tween 20) による洗浄（約18〜20分）：
    1. 1を用いて、同様の洗浄手順に従ってください。× ステップ1.14で用いたDPBS/0.1% Tween 20。
      注：最終洗浄ステップの間に、基質調製液（推奨量は5 mL、参照： 表3) メーカーの指示に従って（以下の試薬調製を参照） 補足ファイル1).
  21. 青色の発色（10～12分）：
    1. ステップ2.20を完了した後、スライドを白い背景のワークベンチの上に平らに置いてください。
    2. 調製直後の青色基質作業溶液を十分に混ぜ合わせ、その後50μLを添加します。 µ各組織切片にLを加え（余った溶液は廃棄する）。
    3. 組織切片を室温で、青色が出現するまでインキュベートする。その際、2～3分ごとに白い背景上で、または光学顕微鏡下で定期的に確認すること。
      注：ステップ2.15における赤色の発色と同様に、青色の発色に要する時間は20～30分かかる場合があります。ただし、Ki67の染色の場合は+ AP検出システムを用いて005脳腫瘍切片内の細胞を染色すると、10〜12分以内に青色に発色します。
  22. バッファー洗浄（5分）：
    1. ステップ2.21で目的の青色のシグナルが現れたらすぐに、切片を1に浸します。× 染色容器内で、DPBS/0.1% Tween 20を用いて5分間洗浄する。洗浄液は廃棄する。
  23. 水洗浄（1分）：切片を蒸留水で1分間洗浄する。洗浄後、蒸留水を捨てる。
  24. 緩やかな脱水（15～17分）：
    1. 染色容器内で、スライドを70%エタノールに5分間浸漬し（その後、70%エタノールを再利用のためガラス瓶に戻す）、次に90%エタノールに5分間浸漬し（その後、瓶に戻す）、最後に100%エタノールに5分間浸漬する（その後、瓶に戻す）。
    2. 各ステップをドラフト内で行ってください。ステップ2.25に進みます。
      注：この脱水工程では、ステップ2.2で使用したものと同じ（キシレンフリーの）エタノール溶液を使用します。溶液が清浄である場合は、繰り返し使用することが可能です。
  25. 非キシレン系透明化法：
    1. 組織切片およびスライドの洗浄には、ステップ2.1で使用したものと同じキシレンフリー溶液（例：Histo-Clear）を使用してください。
      1. まず、スライドを染色容器に入れ、キシレンフリー溶液Iに10分間浸漬させます（その後、キシレンフリー溶液Iは再利用のためガラス瓶に戻します）。続いて、キシレンフリー溶液IIにさらに10分間浸漬させます。
      2. 封入（すなわちステップ2.26）が完了するまで、スライドをキシレンフリー溶液IIに浸して保持してください。
        注：必要に応じて、封入まで切片をキシレンフリー溶液IIに長時間浸漬させても差し支えない。
        注意：ステップ1.1と同様に個人用保護具（PPE）を着用し、この操作は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。
  26. 非キシレン系封入：
    1. キシレンフリー溶液IIからスライドガラスを1枚ずつ取り出し、ドラフトチャンバー内に平らに置く。適切なサイズのカバーガラスの上に非キシレン系封入剤を1滴滴下し、封入剤が組織切片に接するようにして、カバーガラスをスライドガラスの上に載せる。
    2. 親指でカバーガラスを軽く押し、封入剤を3つの切片すべてに均一に広げ、気泡を取り除きます。
      注：封入剤は乾燥しやすいため、1枚のスライドにつき30秒以内に封入を完了させてください。ステップ1.1に従い個人用保護具（PPE）を着用し、この操作は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。
  27. 風乾および光学顕微鏡観察：光学顕微鏡による評価および撮像を行う前に、ドラフトチャンバー内でスライドガラスを少なくとも2時間風乾させる。乾燥後、マウントしたスライドガラスはスライドボックスに入れ、室温で数年間保存することが可能である。

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結果

HRPベースの発色検出システムを用いた単色IHCにより、FFPE 005脳腫瘍切片において明瞭で再現性のある染色が得られた。表面抗原染色の代表的な画像を図1に示す。これにより、T細胞マーカー（CD3, CD4, CD8）、腫瘍関連マクロファージ（TAM）マーカー（CD68, F4/80）、および免疫チェックポイント分子であるprogrammed death ligand 1（PD-L1）の検出に成功したことが示されている。いずれの場合も、DABを発色剤として用いることで、陽性染色は明瞭な茶色の発色シグナルとして可視化され、組織形態が保持され、背景染色は最小限であった。このことは、本単色IHCプロトコルが多様な膜結合抗原に適応可能であることを示している。

細胞内抗原検出における単色IHCプロトコルの適用性が図2に示されている。代表的な染色像では、T-bet、FoxP3、リン酸化STAT1 (pSTAT1)、Ki67、グランザイムB、および切断型caspase-3を含...

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ディスカッション

本研究では、正位GSCモデル由来のFFPE脳腫瘍組織における表面および細胞内抗原の単色および二色検出のための、詳細で再現性のある基質ベースの発色IHCワークフローについて記述します。本研究の主な目的は、免疫能を有するGBM組織において、信頼性の高い発色抗原検出を行うための実用的かつ段階的なプロトコルを確立するという手法的な点にあります。

発色 IHC は、TME 内における抗原の空間的局在を可能にしつつ組織構造を維持できるため、FFPE 組織における細胞マーカーの評価に広く用いられている手法である15,16。再現性のある発色染色の実現には、抗原賦活化、ブロッキング条件、抗体濃度、発色時間、および染色・封入時の組織取り扱いを含む、複数の技術的パラメータの慎重な最適化が必要である。これらの工程におけるわずかな偏差が、組織の脱落、シグナル強度の低下、過剰な背景染色の発生、あるいは形態保持の不備につながる可能性がある。本プロトコルでは、染色の整合性と再現性を向上させるための...

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開示事項

S.D.R.は、ジョージタウン大学およびマサチューセッツ総合病院が所有・管理し、AmgenおよびActiVec Inc.からロイヤリティを得ている腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに関する特許の共同発明者であり、またReplimune、Cellinta、Greenfire Bioのコンサルタントとして報酬を得たほか、EG 427から報酬および株式を得ている。その他の著者は、潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的な関係がない状態で本原稿が作成されたことを宣言する。

謝辞

D.S.は、ノースカロライナ農業技術州立大学（NCA&T）の理系学部からの資金、NCA&TのFaculty Fellowship Grant（GRADS-4C）、およびNIHからの助成金（1R16NS147983-01）による一部支援を受けています。同様に、S.D.R.はThomas A. Pappas Chair in Neurosciencesによる一部支援を受け、R.H.N.はNIHの助成金（1R35GM153737）による一部支援を受けています。また、005 GSCsを提供してくださったInder Verma博士と soda Yasushi博士に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 L ガラスボトル CorningCORN1395-2L10の調製および保存に使用される× DPBS, 1× DPBS、蒸留水、およびクエン酸ナトリウム緩衝液
2 L Pyrex製ガラスビーカー Corning1000-2Lクエン酸ナトリウム緩衝液（600mM）を用いた、マイクロ波による抗原賦活化に使用。–（有効量 800 mL）
2.5%正常馬血清または正常山羊血清これらはVector Laboratories社の二次抗体に付属しています。二次抗体のホスト種（抗ウサギまたは抗ラットIgG）に応じた種特異的なブロッキングおよび抗体希釈に使用し、非特異的結合と背景染色を最小限に抑えます。
30%過酸化水素（H2O2)Fisher ScientificBP2633500
500 mL ガラスボトルVWR InternationalVWRU10754-818単色免疫組織化学（IHC）用の可燃性試薬、および二色免疫組織化学（IHC）用のキシレンフリー試薬の調製および保存に使用する。
キムワイプを添えた吸収性ベンチペーパー染色工程において、後続のインキュベーションの前に組織切片から過剰な抗体または洗浄液を除去するために使用され、試薬のキャリーオーバーおよびクロスコンタミネーションを最小限に抑える。
抗CD3eAbcamab5690
抗CD4 eBioscience14-9766-80
抗CD68Abcamab125212
抗CD8a抗体 eBioscience14-0808-80
抗切断型caspase-3抗体CST9661
抗F4/80抗体Abcamab111101
抗FoxP3抗体Abcamab54501
抗GFPAbcamab183734
抗グランザイムBAbcamab4059
抗Ki67抗体Abcamab16667
抗NeuN抗体CST24307
抗PD-L1Abcamab205921
抗pSTAT1抗体CST9167
抗T-bet抗体Abcamab91109
AP抗ウサギIgGVector LaboratoriesMP-5401
AP標識抗ラットIgG抗体Vector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALLブロッキング溶液Vector LaboratoriesSP-6000-100主に2色免疫組織化学（IHC）において、内因性ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ活性を抑制するために使用される
ウシ血清アルブミン (BSA)Bioworld22070007-2非特異的結合を低減するための5%ユニバーサルブロッキング緩液の調製に使用されます。
Cytoseal 60 永久封入剤 電子顕微鏡科学18006単色IHCに使用されるキシレン適合性封入剤
DAB基質および発色剤DAKOK346811-2HRPベースの単色発色検出に使用します。メーカーの指示に従い、1 mLのDAB基質に発色剤を1滴加えて、使用直前に調製してください。’指示に従ってください。調製後、使用しなかった作業溶液は廃棄してください。DABは潜在的な発がん性物質であるため、機関のバイオセーフティおよび化学物質安全ガイドラインに従って取り扱ってください。
蒸留水試薬の調製、洗浄、および緩衝液の調製に使用します。超純水またはMilli-Q水を使用しても差し支えありません。
DPBS（ダルベッコ’リン酸緩衝生理食塩水 (phosphate-buffered saline) Corning55-031-PC
エタノール、200プルーフ Decon Labs2701
Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライドグラスFisher Scientific12-550-15組織切片用正電荷処理マイクロスコープスライド
ガラスカバーガラスCorningまたはMilliporeSigmaスライド1枚あたりの組織切片数に基づいて、適切なサイズを選択してください。一般的なサイズには以下があります：24 mm × 24 mm（単一組織切片）、24 mm × 40 mm（組織切片2枚）、24 mm × 50 mm（組織切片3枚）
ヘマトキシリンFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)電子顕微鏡科学64111-012色 IHC（免疫組織化学染色）に使用するキシレンフリーの透明剤。Histo-Clear I および Histo-Clear II とラベルした 500 mL ボトルを2本用意する。
HRP標識抗マウスIgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP標識抗ウサギIgG抗体Vector LaboratoriesMP-7401
HRP標識抗ラットIgG抗体Vector LaboratoriesMP-7444-15
加湿チャンバー Stellar ScientificHS-120879組織切片の一次および二次抗体によるインキュベーションについて
疎水性バリアペン（PAPペン）Vector LaboratoriesH-4000組織切片の周囲に撥水性のバリアを形成し、インキュベーション中の抗体や試薬の保持および、同一スライド上の複数の組織切片間における相互汚染を防止するために使用されます。
キムワイプスKimtech Science34155組織切片から残留試薬および洗浄バッファーを緩やかに除去するために使用する
マグネチックスターラー IKAI-10001529クエン酸ナトリウムおよびDPBSストック溶液の調製
電子レンジPanasonic（モデル：NN-L931BF）SN: 6H61050036容量2.2立方フィート。2 Lガラスビーカーを用いた熱処理抗原賦活化に必要。
ニコン光学顕微鏡 NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798、Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787、ソフトウェア：NIS Elements BR 4.60.00 &NIS Elements BR Analysis 4.60.00、カメラ：Nikon DS-Fi3 sn: 110865（カラー） &Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/W)
pHメーター VWR International77619-152抗原賦活化緩衝液のpH調整用
プラスチックラップFisher Scientific01810マイクロ波加熱中の抗原賦活化バッファーの蒸発を最小限に抑え、組織の乾燥を防ぐため、緩やかに蓋をするのに使用する
ポリオキシメチレン (POM) スライドラック MopecSP234上記の染色容器に対応しており、各ラックに最大24枚の顕微鏡スライドを保持できます。
精密天秤 Mettler Toledo30697420クエン酸ナトリウムおよびDPBS粉末の秤量用
冷蔵庫Thermo ScientificTSG3005CA温度感受性試薬および抗体の保存用
スライド保存ボックスFisher Scientific22-267294
染色容器／ディッシュ MopecSP233各容器に24枚用の染色ラックを1つ収めることができます。
スターラーバー Fisher Scientific14-512-128クエン酸ナトリウムおよびDPBSストック溶液の調製
クエン酸三ナトリウム二水和物 Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
VectaMount PT 永久封入剤 Vector LaboratoriesH-5600-602色IHCに使用されるキシレンフリー永続封入剤
Vector Blue アルカリホスファターゼ基質キット Vector LaboratoriesSK-53002色APベースIHCにおける青色発色シグナルの検出に使用します。Vector Blueはキシレンに一部溶解するため、2色染色のワークフローではキシレンフリーの透明剤および封入剤を使用する必要があります。
Vector Red アルカリホスファターゼ基質キットVector LaboratoriesSK-51002色APベースIHCにおける赤色発色シグナルの検出に使用
キシレン (1 L) StatLab8400-1単色IHCの脱パラフィンおよび透明化剤として使用する。Xylene IおよびXylene IIとラベルを貼った500 mLボトルを2本用意する。

参考文献

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