グルコース耐性障害ラットの鍼治療反応モニタリングのための酸化還元反応性表面強化ラマン散乱マイクロ針

サマリー

本探索的ラットモデル研究は、同時鍼治療介入と局所酸化能力および酸化還元電位に関連するSERS指数の比率追跡を行うために、酸化還元感受性ラマン散乱(SERS)活性マイクロニードルを提示します。

要約

耐糖耐性障害(IGT)は酸化還元恒常性の乱と酸化ストレスの増加と関連していますが、鍼治療介入中の酸化還元関連変化を動的にin vivo で追跡することは技術的に困難なままです。本研究では、IGTラットにおける鍼治療介入および酸化能力(OC)および酸化還元電位(RP)関連SERS指数の相対比的追跡のために、酸化還元感受性表面増強ラマン散乱(SERS)活性マイクロニードルシステムを開発しました。酸化反応性および酸化還元感受性のSERSプローブは、金ナノシェル(GNS)と、OP応答性のためにp-フェニレンジアミン(p-PDA)を、RP応答性を用いるアントラキノンを官能化することで製製されました。プローブは鍼の2本のエッチング溝に装填され、SERS活性マイクロニードルを構成しました。本研究では、特異病原体を持たないオスのSprague–Dawleyラットを用いています。3頭のラットが正常対照群として使用され、20頭のラットに高脂肪食を与え、IGTを誘導するためにストレプトゾトシン(STZ)を投与しました。スクリーニング後、18頭の適格なIGTラットを高脂肪食群と正常食群に分け、各群に9頭のラットが割り当てられました。各食事群はさらに鍼灸点ねじり、鍼灸部位ねじり、鍼灸直刺サブグループに分けられ、各サブグループに3匹のラットが割り当てられました。ニードリングは1日2回、7日間連続で実施され、空腹時血糖値(FPG)、食後2時間血糖値(2hPG)、およびOCおよびRP関連のSERS指数が記録されました。結果は、鍼穴でのひねりを伴う鍼治療がFPGおよび2hPG値の低下、そしてOCおよびRP関連のSERS指数の変化と関連していることを示しました。外部較正曲線、独立した生化学的酸化ストレスアッセイ、プローブ浸出試験、生体適合性アッセイが含まれていなかったため、SERS比率は絶対生化学的濃度や絶対酸化還元ポテンシャル値ではなく、相対的な酸化還元関連光学指標として解釈されるべきです。これらの発見は、鍼治療介入と局所比率的SERS追跡をIGTラットで組み合わせる探索的前臨床プラットフォームとしてのSERSアクティブマイクロニードルの実現可能性を支持しています。

概要

耐糖耐性障害(IGT)は、体がグルコースを耐受する能力の低下であり、正常血糖値と糖尿病性血糖値1の間の過渡期を表し^ます。したがって、IGTは2型糖尿病2の発症において重要な早期警告サインであり、可逆的な段階^です。臨床データによると、IGT患者の約30%が5〜10年以内に2型糖尿病に進行します。³;しかし、適時の介入により、この割合は10%未満にまで減少させることができます⁴。

IGTは動的かつ複雑なプロセスであり、持続的な高グルコース環境は酸化代謝障害の主要な引き金となります⁵。体が長期にわたる高血糖状態にあると、ミトコンドリア呼吸連鎖が異常に機能し、活性酸素種の生成速度が30〜50%増加し^、体内の酸化能力が直接的に高まります。同時に、高糖レベルはグルタチオン還元酵素などの主要な酵素の活性を抑制し、抗酸化物質系が過剰な活性酸素種をタイムリーに除去できなくなり、酸化・還元バランスをさらに乱します。さらに、IGTはインスリン抵抗性やβ細胞機能の軽度の障害などの病理学的変化を伴い、生物学的および生化学的応答の範囲を生じさせます^7,8。酸化還元状態の進化とともに、これらの変化はグルコース代謝の障害をさらに悪化させ、網膜症、腎症、心血管疾患などの糖尿病合併症のリスクを高めます(^9,10)。したがって、IGTを持つ個人や動物モデルにおける酸化能力(OC)および酸化還元電位(RP)のモニタリングは、IGT発生のメカニズムの理解を深め、標的治療戦略の設計を導く助けとなるでしょう。

鍼治療は3,000年以上の歴史を持ち、多くの病気の治療において優れた臨床効果を示しています¹¹.さらに、動物を対象とした多数の実験研究では、鍼治療が抗酸化酵素系の強化や脂質過酸化の低減を通じて、動物モデルにおける酸化ストレス状態の調節に有益な効果をもたらすことが示されています¹²。伝統的な中国医学の実践として、鍼治療は糖尿病やIGTの治療においても大きな効果を示しています。冠源(CV4)および三陰角鍼穴(SP6)は、骨格筋のSIRT1/PGC-1α経路を活性化し、肥満糖尿病マウスのインスリン抵抗性を緩和することが報告されています¹³。さらに、天舒鍼穴(ST25)は外側視床下部領域に位置するグルコース阻害ニューロンの活動を調節し、糖脂質代謝の調節に寄与します¹⁴。しかし、血管内鍼治療のメカニズムに関する研究の多くは、神経調節、免疫調節、消化管系に焦点を当てており、鍼治療は自律神経機能の調節を通じてグルコース代謝に影響を与えたり、腸内フローラのバランスを改善することで血糖値を間接的に調節したりすることがあります^15,16.鍼治療のIGT治療における効果の具体的なメカニズムと酸化ストレスへの影響については、詳細な調査や実験的データの裏付けが不足しています。

表面強化ラマン散乱(SERS)は高い感度と特異性を提供し、多様な分析対象物の検出を可能にします。ナノファイバー光学¹⁷、キトーサン膜¹⁸、および過去の研究により、鍼針¹⁹は生体内でバイオマーカー、神経伝達物質、その他の細胞生化学の側面を検出するために用いられることが示されています。特に鍼は、低侵襲のin situモニタリングと生外分析を可能にする深部組織検査の有望なツールです。鍼治療は確立された治療法として非常に幅広い臨床応用を持っています。最近の研究では、SERS対応の光ファイバー、創傷ドレッシング、マイクロニードルデバイスが、生物学的に関連した環境において、レドックス関連信号の現地または低侵襲追跡を支援できることが示されています(^20,21)。同時に、SERSアクティブ鍼治療針および関連するマイクロニードルシステムは、組織介入¹⁹と感知能力を統合する有望なキャリアとして浮上し、生体内応答およびin vitro SERS検出能力を持つSERSアクティブマイクロニードルが実現しています。

本研究は、以前に報告されたSERSアクティブマイクロニードル戦略を基盤とし、グルコース誘発ストレスモデルにおける酸化能力および酸化還元電位関連シグナルの検出に用いています。しかし、本研究は生物学的文脈や実験目的の両面で前回の研究とは異なります。具体的には、本研究はSERSアクティブマイクロニードルプラットフォームをグルコース耐性障害のあるラットモデルに適用し、局所的な比率測定によるSARS追跡と鍼治療介入を統合しています。本研究では、鍼穴と隣接する非鍼治療部位を比較し、異なる針操作を評価し、7日間の介入期間中に酸化還元関連SERS指数をモニタリングしています。これまで報告されていた単一部位または単機能生化学的検出を目的としたSERSベースの光ファイバー、創傷ドレッシング、SERS活性マイクロニードルと比較して、本プラットフォームは2つの進歩をもたらします。まず、OCおよびRP応答プローブを単一の鍼灸針の独立したエッチング溝に統合し、補完的な酸化還元パラメータの同時モニタリングを可能にします。第二に、鍼はSERSプローブキャリアとしてだけでなく治療機器としても機能し、治療後ではなく鍼治療中に酸化還元モニタリングを行うことを可能にします。 図1に示すように、マイクロニードルを組織に挿入した後、微細な傷ができ、2つの溝のプローブが組織と反応して、 生体内で OCおよびRPのレベルを検出できるようになります。本研究の目的は、これらのSERS活性マイクロニードルを用いてIGTラットにおけるOCおよびRPの変化を調べ、鍼治療がこれらの動物の鍼灸ポイントに適合する効果を明らかにすることで、鍼治療のIGT治療効果メカニズムや、酸化還元と異常な高血糖状態との関係について貴重な知見を得ることでした。

プロトコル

動物とIGTのモデル

すべての動物処置は東南大学蘇州研究所動物倫理委員会(承認番号)によって承認されています。SEU-IACUC-20250318007)および実験動物のケアおよび使用に関する機関ガイドラインに従って実施されました。ラットは採取され、25°Cの特定病原体フリー(SPF)条件下で12時間の光と12時間の暗いサイクルで飼育されました。麻酔を必要とする手技では、誘導チャンバーを通じて酸素で投与されたイソフルランを用いてラットに麻酔をかけ、鼻錐で維持しました。イソフルランは誘発時に3%、維持時に1%で使用され、濃度は呼吸数と手技反応に応じて調整されました。

針刺しや注射前に、正しい反発の喪失と足指のつまみへの反応の欠如により、十分な麻酔深度が確認されました。麻酔中は呼吸パターン、体位、回復状況が監視され、体温を維持するために動物は温めパッドの上に置かれました。動物は1ケージに2頭ずつ収容され、血糖値検査のために断食が必要な場合を除き、自由に食事と水を得られていました。到着後、モデル導入前に1週間の順応が行われました。動物福祉は毎日監視され、一般的な活動、グルーミング、食事摂取、体重、注射部位の状態、麻酔後の回復状況が含まれていました。研究終了時に、ラットは承認された動物プロトコルに従って安楽死されました。安楽死は、徐々に充填式CO₂を吸入し、その後頸椎脱臼法による死亡確認が行われました。重度の体重減少、持続的な動けなさ、異常呼吸、食事や水分の困難、または重度の苦痛など、人道的エンドポイント基準を満たす動物は、予定されたエンドポイントまで維持されるのではなく、直ちに安楽死されました。本研究では、体重200±20gの特異病原体フリーグレードのオスSprague–Dawleyラットが使用されました。1週間の順応後、ラットはランダムに2つのグループに分けられました。正常群の3匹は正常な食事を与えられ、モデル群の20匹は高脂肪のチャウ(50%基礎チャウ+10%ラード+25%ショ糖+15%黄身粉末)を3週間与えました。モデル群の動物は、12時間の断食後、20 mg/kgの2% STZ溶液(0.1 mol/L、pH 4.4 シトレートバッファーに溶解)を腹腔内注射し、水分制限なしに12時間の断食を行った。正常群の患者は、通常の食事を与えた後、対応する量のシトレートバッファー溶液の腹膜内注射を受けました。1週間後に腹膜内ブドウ糖負荷試験(IPGTT)が実施されました。本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

各グループのラットの尾端から水分制限なしで12時間の断食後に空腹時血糖値(FPG)を測定し、腹膜内注射20%デキストロース2g/kg後2時間の食後血糖値(2hPG)を記録しました。通常群ではFPGの範囲が5.1〜6.6 mmol/L、2hPGのグルコース範囲は7.3〜9.4 mmol/Lでした。これはモデル群のFPGが≤7.0 mmol/L、2hPGが10〜16 mmol/Lであるのに対し、IGTモデル誘導に割り当てられた20頭のうち、18頭がIPGTT後に事前に定められたIGT基準を満たし、その後の介入実験に含まれました。2匹のラットは、FPGまたは2hPGの値があらかじめ定められたIGT範囲外であったため除外されました。18頭の適格なラットは高脂肪食群と正常食群にランダムに割り当てられ、それぞれ9頭のラットが割り当てられました。各食事群はさらに3つのサブグループに分けられました:鍼灸部位ねじり、非鍼灸部位ねじり、鍼灸直刺しで、各サブグループに3匹のラットが配置されました。これは、前臨床IGTラットモデルにおいて鍼治療介入とSERSベースの比率計追跡を組み合わせることの実現可能性を評価することを目的とした探索的な方法開発研究でした。正式な統計的検出力計算は行われていません。3匹のラットのサブグループサイズは、実現可能性、予備的なSERSマイクロニードル研究、および動物還元原理に基づいて選定されました。実験者はラットをランダムに割り当てました。正式な割り当て、隠蔽、ブラインドは行われませんでした。

鍼治療プロトコルは、伝統中国医学のエビデンスに基づく臨床実践ガイドラインおよび動物実験の実現可能性を踏まえてスクリーニングされました²²。選定された経穴は中婉(RN12/CV12)、水芬(RN9/CV9)、陰嬌(RN7/CV7)、両側の天舒(ST25)、両側の水道(ST28)、両側の祖三梨(ST36)でした。RN12、RN9、RN7は前正中線に位置し単一の正中点として扱われたが、ST25、ST28、ST36は両側で治療された。鍼灸のポイントの組み合わせは、IGT²³の臨床治療に用いられたものに基づいています。適応は文献^24,25に基づき、二分法を用いました。ラットの場合、経穴は解剖学的ランドマークと標準的な人間の経位からの比例変換に基づいて局所化されました。腹部のRN/CVポイントは、歯突起、臍、恥骨結合を解剖学的ランドマークとして用いて前正中線に沿って特定されました。ST25は臍のレベルで両側に、ST28は前正中線から同じ側方距離の下腹部に両側に標示されました。ST36は脛骨結節の外側にある脛骨前部の前外側後肢で確認されました。隣接する非鍼治療比較部位は、対応する経穴から5mm外側かつ認知された経絡線の外側に位置し、目に見える血管、瘢痕、過去の穿刺部位を避けて示しました。ニードリングの前に、ラットは承認された動物プロトコルに従ってイソフルランで麻酔され、温めパッドの上で仰向けに置かれました。各標的部位の腹部および後肢の皮膚は剃られ、75%エタノールで消毒されました。SERS活性マイクロニードルは皮膚に対してほぼ垂直に約10mmの深さで挿入されました。鍼穴のねじりグループでは、選択された経位にSERS活性マイクロ針を挿入し、20分間の保持期間中に優しく両方向に回転させました。鍼治療部位を除いたグループでは、同じ手順が5mm隣接する非鍼治療比較部位でも実施されました。直接挿入群では、SERS活性マイクロニードルを経穴に挿入し、ねじれずに20分間保持しました。すべてのニードリング手順は、オペレーター間のばらつきを最小限に抑えるため、同じ訓練を受けたオペレーターによって行われました。

ニードリングは1日2回、10時と15時に7日間連続で実施されました。各日の処置前に、水分制限なしで8時間の断食後にFPGを測定しました。毎日の針刺しの後、OCおよびRPの反応を記録しました。鍼治療後7日目にIPGTTが行われ、2hPG値が記録されました。

注意事項

ストレプトゾトシンは有害であり、有害な化学物質として扱うべきです。ストレプトゾトシン溶液は、化学用フムフードまたは認証されたバイオセーフティキャビネットで準備し、実験用コート、ニトリル手袋、保護メガネ、マスクを着用してください。ストレプトゾトシンに汚染された注射器、注射器、ワイプ、寝具、ケージ、動物性廃棄物は、機関の有害生物廃棄物および化学廃棄物手順に従って取り扱うべきです。使用済みの針や注射器は、キャップを交換せずにすぐに刺しにくい鋭利器に捨ててください。

OCおよびRP検出のためのSERSアクティブマイクロニードルの製造

鍼は以前報告された通り²⁶件準備されました。SERSアクティブマイクロニードルは、研究期間中、同じ種類の市販ステンレス鍼(0.25mm×26mm)を使用して製造されました。針は皮膚に対してほぼ垂直に10mmの深さで挿入されました。ツイストグループでは、同じ訓練を受けたオペレーターによって保持期間中に20分間、優しく一貫した手動の双方向回転が適用されました。操作は計器による制御ではなく、したがって、正確な回転周波数や振幅は定量化されていません。この制限は議論でも認められています。

最初は、針をMMAで20%(w/v)PMMA溶液に浸し、その後室温(25°C)で1日間乾燥させました。次に、PMMA保護層に均一なサイズで形状と深さの平行な2つのへこみ(間隔5mm)を、エタノールで洗浄した小さなクラフトナイフの刃を使って作りました。その後、針は0.5 Mの硫酸に浸され、電解質として10秒間12Vの電圧で電気化学エッチングを受け、スコア部位にほぼ円形の溝が2つ形成されました。第三に、3回の洗浄後、針を室温で0.1 mol L⁻¹ MPTESおよび0.3mol L⁻¹ APTESを含むエタノール溶液に24時間浸け、これにより溝のある表面に硫黄化ドリルの機能性が付与されました。第四に、MMAに針を浸してコーティングを剥がしました。以前に報告された方法²⁷に基づいて、酸化還元電位応答性のSERS活性マイクロニードルを製製しました。SERS基質は各鍼針のエッチング溝の一つに吸着され、その後、得られたSERS活性マイクロニードルを1× ^10-4 mol/Lの水溶液に37°Cで60分間浸すことで、酸化反応性のあるSERS活性マイクロニードルを生成しました。金ナノシェルに基づくSERS基板は、前述の²⁸号で合成されました。本研究では、これらのマイクロニードルを各鍼のもう一方の溝に滴り込み、自然乾燥させました。これにより、OCおよびRP応答を持つSERS活性マイクロニードルが得られました。

SERS活性マイクロニードルに対するOCおよびRP反応の体外評価

OCおよびRPプローブの反応は、SERS活性マイクロニードルを体外組織に挿入することで評価されました。酸化変化に対するOCプローブの応答性を検証するため、p-PDAのSERSスペクトルを酸化前後に記録しました。酸化還元SERSプローブのスペクトルは、強還元性NaBH4溶液および強酸化性のHAuCl4溶液でも取得されました。OCプローブの選択性は、還元剤(^10-4 M FeSO₄ 1××、^10-4 M Na₂SO₄、^10-4 M アスコルビン酸×1×、^10-4 M CuSO₁、10-4 M H₂O₂、1 ×× 10-4 M FeCl₃ 1 などを用いて評価されました。 1×^10-4 M HAuCl₄。すべての溶液は20 mM PBS(pH 7.4)で調製され、プローブは各溶液と共に37°Cで20分間インキュベートされました。 SERS活性マイクロニードルの堅牢性は、室温で反応前後のOC反応を記録し、1× ^10-4 mol/L_FeCl3を投与することで評価されました。これらのエクスビブおよび溶液ベースの試験は、制御条件下でのプローブ応答性を確認するために用いられました。しかし、局所的なpH変動、タンパク質吸着、細胞外マトリックス成分、その他の生物学的物質がSERS信号に影響を与える可能性のある生体内組織微小環境の複雑さを完全に再現することはできません。したがって、in vivoでのOCおよびRPの読み取り値は、マトリックス非依存の生化学的測定ではなく、相対的な酸化還元関連SERS指数として解釈されました。

鍼治療および非鍼治療部位におけるOCおよびRP検出

鍼灸点および非鍼治療点におけるOCおよびRPプローブの性能を評価するため、SERS活性マイクロニードルを健康なラットにST36およびRN12の鍼穴に、それぞれ隣接する約10mmの深さでそれぞれ5mmずつ同じ時間挿入しました。

針ねじりがOCおよびRP検出に与える影響

異なる針打ち技術下でのOCおよびRPプローブの応答性を評価するため、健康なラットではST36およびRN12の鍼穴にSERS活性マイクロニードルを挿入し、これらの点の隣接5mmに約10mmの深さまで挿入しました。各鍼穴で1本の針がねじられ、隣接する針はねじられず、その逆も同様です(鍼灸のポイント隣接の針はねじられ、鍼の隣の針はねじられませんでした)。プローブからのSERS信号は、各針の挿入時刻で同じタイミングで収集されました。

IGTラットにおける鍼灸ポイント、針ねじり、食事条件に関するOCおよびRPの変化

鍼治療、針ねじり、食事条件がIGTラットのOCおよびRPに与える影響を評価するため、高脂肪食群のラットはランダムに3つのグループ(A1、A2、A3、各グループ3匹)に割り当てられ、正常な食事群(B1、B2、B3群、各グループ3匹)に割り当てられました。A1およびB1群のラットでは、鎮静後に鍼穴にSERS活性マイクロ針を挿入し、20分間ねじりました。同じ手順はA2およびB2群のラットにも行われましたが、マイクロニードルは鍼の穴に隣接して5mm挿入されました。A3およびB3のラットでは、SERS活性マイクロニードルをねじることなくラットの鍼灸点に挿入しました。針は20分間そのままにしていました。ニードリングは1日2回、10時と15時に7日間行われました。毎日の手順の前に、血糖計を使って各ラット群のFPG値を記録しました(断食後、8時間の水分制限なし)。毎日のニードリング後、OCおよびRP反応を測定・記録しました。鍼治療後の7日目に各ラット群に対してIPGTTが実施され、2hPG値が記録されました。

特徴付けと測定

SERS活性マイクロニードルの形態は走査型電子顕微鏡(SEM)で調査されました。SERSスペクトルは25°Cで取得され、50×長距離対物レンズ(NA:0.5)と785nmレーザーを備えたラマン分光計を用いました。すべての測定で取得時間は10秒で、同じ光学構成のままラマンシステムは標準的なレーザー出力600μWで動作しました。本研究では組織表面に照射された実際のレーザー出力は直接測定されていません。したがって、同一の取得環境下でグループ間の相対比較にはSERSスペクトルを使用し、絶対的な組織光熱安全性に関する結論は出ませんでした。2つのSERプローブの強度比は以下の方法で計算されました。1450 cm⁻¹ の強度値と1500 cm⁻¹ の強度の比率をOCの指標として指定し(I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹)、2つのピークそれぞれから1700 cm⁻¹ (背景)の強度を差し引いた結果です。 それぞれ、前述報告書と同様に ^17名、また、RPの指標としてI₁₆₀₆ cm−¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ を用いて、1700 cm⁻¹ (背景)の強度をそれぞれ2つのピークから差し引いた。計算されたI₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ およびI₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ の値は、それぞれOC関連反応の相対的なSERS由来指標として解析されました。これらの比率は、同一の獲得環境下でグループ間および時間点間の変化を比較するために用いられました。

本研究では、これらの比率を酸化物質の絶対濃度や絶対電気化学的酸化還元ポテンシャル値に変換するための外部校正曲線は設定されていません。各スペクトルは、SERSプローブの5つの異なる地点で3つの複製サンプルで2回記録されました。Originはデータの処理やチャート作成に使われていました。取得関連の変動を最小限に抑えるため、すべてのグループに同じレーザー波長、対物レンズ、取得時間、レーザー出力設定、スペクトル処理ワークフローが適用されました。レーザー照射による潜在的な光熱的または光化学的影響は独立して定量化されておらず、制限として認められています。統計データは平均±標準誤差(SEM)として提示されます。各実験や図のパネルで使用されるサンプルサイズと統計検定は、対応する図の凡例で明示されています。 生外 プローブ検証実験では、解析ユニットとしてSERSプローブまたは独立調製されたマイクロニードルが使用されました。生 体内 血糖値およびSERS指数解析では、ラットを生物学的分析ユニットとして使用しました。同じプローブの複数点から収集されたスペクトルは技術的測定として扱われ、グループレベルの解析前に平均化されました。統計解析はSPSSソフトウェアを用いて実施されました。グループ間の比較は、対応する図の凡例に示された統計的検定を用いて行われました。7日間の介入期間における連続空腹時血糖およびSERS指数測定は、サブグループ規模が小さいため探索的縦断的傾向と解釈され、正式な反復測定や混合効果モデルは適用されませんでした。統計的有意は p < 0.05と定義されました。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

結果

OCおよびRP検出のためのSERSアクティブマイクロニードルの製造

OCおよびRPの変化を特定するために、対応するプローブを含むSERSアクティブマイクロニードルが製造されました。代表的なSEM画像は、SERS活性マイクロニードルの2溝構造を確認しました。図2Aは鍼灸針の本体に2本の刻印溝を示し、図2BはGNSを充填した溝を示し、図2Cは溝内に分布したGNSの拡大図を示しています。これらの画像により、エッチング溝がOC応答型およびRP応答型SERSプローブの局所的な負荷点として機能できることが確認されました。ピーク強度の比率 I₁₄₅₀ cm⁻¹ / I₁₅₀₀ cm⁻¹ は、p-PDA が酸化された程度を表すために用いられました。図3Aは、1× 10^⁻⁶ M FeCl3との相互作用前後のp-PDAのSERSスペクトルを示し、図3Bは1 × 10^⁻³ M NaBH4および1 × 10^⁴ M HAuCl₄水溶液中の酸化還元プローブのスペクトルを示しています。RPプローブの応答はピーク強度比(I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1)として表され、RPが増加するにつれて減少しました。

酸化能力応答性プローブの選択性を評価するため、異なる還元剤および酸化剤への曝露後に、I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹の比率を測定しました。独立したプローブ測定はグループごとにn=3個で行われ、解析ユニットとしてはSERSプローブまたは独立準備されたマイクロニードルが使用されました(図3C)。CK群(クルスカル–ウォリス検定およびダンの多重比較検定)と比較して、還元剤FeSO₄およびNa₂SO₄はIの₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹の比率に有意な変化を与えませんでした(p > 0.05)。アスコルビン酸(AA、p < 0.001)も還元剤として含まれているにもかかわらず、現在のアッセイ条件下で比率が増加しました。したがって、この溶液ベースのアッセイではAA応答を酸化挙動の証拠ではなく、プローブ特異的スペクトル応答として慎重に解釈しました。これに対し、酸化性または酸化関連試薬は比率を程度の差はあれ増加させました。CuSO₄(p < 0.0001)、H₂O₂(p < 0.0001)、_FeCl3(p < 0.0001)、HAuCl4(p < 0.0001)への曝露後に比率が増加しました。室温でのOCプローブの安定性を評価するため、1 × 10⁻⁴ M FeCl₃と反応する前の6時間にわたり、1時間ごとにSERSスペクトルを取得しました(図3D)。 対応する_I1450 cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹の比率が計算されました。プローブ吸着後、初期値は約0.20±0.02で安定し、_FeCl3との反応も約0.9±0.10で6時間にわたり安定しました。これらの結果は、GNS上のp-PDAが空気中で安定であることを示唆しています。

鍼治療および非鍼治療のポイントにおけるOCおよびRP反応

過去^の29 件の研究では、OCプローブは挿入後10分で最大の応答を達成することが示されています。 図4AおよびBは 、健康なラットにおけるST36およびRN12鍼穴、ならびに5mm隣接した鍼の反応を示し、10分間の反応を示しています。これらの実験では、1グループあたりn=3ラットを対象とし、同じプローブの複数点から収集したスペクトルを技術的再現として扱い、グループレベルの解析前に平均化しました。SERS活性マイクロニードルは 、生体内でOCおよびRPの変化に効果的に反応し、鍼治療ポイント群で非鍼灸群と比べてOCおよびRPに有意な差はありませんでした(独立標本t検定、 p > 0.05)。

針ねじりが局所的なOCおよびRPに与える影響をin vivoでさらに明らかにするため、健康なラットのST36およびRN12の鍼位、さらにこれらから5mm先まで10mmの深さまでSERS活性マイクロニードルを挿入しました。各鍼の点でのねじり動作中、その点に隣接する針はねじれておらず、その逆も同様で、刺点でのOC値とRP値の変化が記録されました(図4C–F)。健康なラットにおいて鍼穴または非鍼治療点のいずれかでねじりを行った場合でも、OCおよびRPに有意な変化はなく、隣接する点でのねじりの影響もなかった(p > 0.05)。

鍼治療、針ねじり、食事異常に関連するIGTラットにおけるOCおよびRPの変化

IGTのラットモデル確立に成功したことを確認するため、FPGおよび2hPG値はそれぞれモデルラットおよび対照ラットのIPGTTアッセイを用いて記録しました。対照群にはn=3匹のラット、モデル群にはあらかじめ定められたグルコース耐性の基準を満たすn=18匹のラットが含まれていました。モデルラットは対照ラットよりも空腹時血糖値が高いことが示されました(6.92 mmol/L 対 5.54 mmol/L;Mann–Whitney Uテスト、 p < 0.01)および食後2時間の血糖値は対照ラットより高く(11.52 mmol/L 対 7.92 mmol/L;Mann–Whitney Uテスト、 p < 0.001)(図5)で、モデル動物におけるIGTの成功した誘導を示しています。

鍼灸点、針ねじり、食事条件の組み合わせがIGTラットに与える影響を検証するため、典型的な鍼灸ポイントペアを選定しました。対象となる18頭のモデルラットは高脂肪食群と正常食群に分けられ、各群にn=9匹のラットが割り当てられました。各食事群はさらに3つの介入サブグループに分けられました:鍼灸部位ねじり、非鍼灸部位ねじり、鍼灸直刺で、各サブグループにn=3匹のラットが割り当てられました。各グループでニードリングの各日の前にFPG値を記録し(図6A–C)、2hPG(図6D)値は7日間のニードリング後にIPGTTアッセイで測定されました。この探索的データセットでは、鍼治療穴での針治療後の高脂肪食モデル群と正常食群の間でFPGや2hPGに明確な差は観察されませんでした。鍼灸部位と非鍼灸部位のニードリングの比較では、鍼灸のツイストリングは現在の実験条件下で血糖値の低下と関連していることが示唆されました(独立した標本t検定、 p < 0.05)。サブグループの規模が小さく、食事、経穴の位置、ねじり操作を完全に統計的に分離できなかったため、これらの結果は予備的な動物モデル観察として解釈されました。

IGTラットにおける鍼治療介入の1週間中に、酸化能力関連および酸化還元電位関連SERS指数の変化をモニタリングしました。これらの解析では、各サブグループにn=3頭のラットが含まれ、各ラットは生物学的分析単位として扱われました。高脂肪食ラットでは、鍼灸部位ねじり群および鍼灸直刺群では酸化能力関連のSERS指数が時間とともに低下したのに対し、鍼灸部位をねじる非群では比較的高いままでした(図7A)。鍼灸の点ねじり群および鍼灸直刺群では、酸化還元電位関連のSERS指数が時間とともに増加したのに対し、鍼灸部位ねじり群は比較的弱い増加を示した(図7B)。同様の傾向は正常な食事のIGTラットでも観察されました。鍼灸部位ねじり群および鍼灸直刺群では酸化能力関連のSERS指数が時間とともに低下し、非鍼灸部位ねじり群では変化が小さい(図7C)。酸化還元電位関連のSERS指数は、鍼灸部位ねじり群および鍼灸直刺群で時間とともに上昇したのに対し、鍼灸部位ねじり群は比較的低く残りました(図7D)。

同じ鍼治療による食事条件をさらに比較するため、高脂肪食群と正常食群の鍼穴ねじりサブグループを比較しました。この比較では、両食事条件下で酸化能力関連のSERS指数が時間とともに低下し、通常の食事鍼灸ツインストィストグループでは7日目までにより大きな減少が観察されました(図7E)。両食事条件下で酸化還元電位関連のSERS指数は時間とともに上昇し、正常な鍼治療のツイスト下位群では7日目値が高くなりました(図7F)。これらの発見は、鍼灸のポイントねじりと食事の正常化がIGTラットにおける局所酸化還元関連SERS指数の変化と関連していることを示唆しています。各サブグループには3匹のラットのみが含まれ、独立した生化学的酸化ストレスアッセイは行われなかったため、これらの結果は酸化ストレス改善の決定的な生化学的証拠というよりは、探索的な動物モデルの観察として解釈されるべきである。

データの利用可能性:

血糖値測定、SER由来比率値、定量図パネルのソースデータを含む図の作成および統計解析に使用されるすべての数値生データは、 補足表1として整理・アップロードされています。分析機器が直接生成する連続プローブモニタリング実験の場合、プローブ性能評価に用いられるエクスポート値および代表的な機器生成出力は 補足ファイル1に含まれています。

図1:二重溝SERSアクティブマイクロニードルを用いた鍼治療介入および局所比率的SERS追跡の方法論的ワークフロー。 回路図は、2溝のSERSアクティブマイクロ針を鍼穴または隣接する非鍼治療部位に挿入し、その後ラマンスペクトル取得を行う様子を示しています。この図はWPSソフトウェアを使用して作成されており、著作権ライセンスは必要ありません。略称:SERS = 表面強化ラマン散乱。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:SERS活性マイクロニードルの代表的なSEM画像。 (A) 鍼の本体は2本の溝を持つ;スケールバー=200μm;倍率=77×。(B) GNSと統合された溝;スケールバー=20μm;倍率=1,000×。(C) Bの溝の拡大像;スケールバー=2μm;倍率=30,000×。略称:SEM = 走査型電子顕微鏡;GNS=金ナノシェル。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:OC応答型およびRP応答型SERSプローブの特徴付け。(A)_FeCl3との相互作用前後におけるp-PDAの正規化スペクトル。(B) NaBH₄溶液中のRPプローブの正規化されたSERSスペクトル(C) OCプローブの比率は₁₄₅₀ cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹で、さまざまな酸化および還元溶液で使用されます。n=グループあたり3回の独立したプローブ測定。クルスカル–ウォリス検定の後、ダンの多重比較検定をCK群と比較して行います。データは平均±標準誤差(SEM)として提示されます。(D) FeCl₃反応前後のOC応答プローブの6時間安定性評価。略称:SERS = 表面強化ラマン散乱;CK = コントロールチェック;p-PDA = p-フェニルネジアミン;AA = アスコルビン酸。p < 0.001, ****p < 0.0001.この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:健康なラットにおける鍼治療部位および非鍼治療部位における異なる針治療法を用いたOCおよびRP関連SERS指数。 (A) 鍼灸点および隣接する非鍼治療部位への直接挿入後のOC関連SERS指数。(b) 鍼灸ポイントおよび隣接する非鍼治療部位への直接挿入後のRP関連SERS指数。(C) 鍼以外の部位での直接挿入および鍼灸部位での針ねじり後のOC関連SERS指数。(D) 鍼以外の部位での直接挿入および鍼灸点での針ねじり後のRP関連SERS指数。(E) 鍼灸ポイントへの直接挿入および隣接する非鍼灸部位での針ねじり後のOC関連SERS指数。(F) 鍼穴への直接挿入および隣接する非鍼灸部位での針ねじりによるRP関連SERS指数。OCはI₁₄₅₀ ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1と計算され、RPはI₁₆₀₆ ^cm-1/_{I 1666} ^cm-1と計算されました。n=3 ずつのグループです。データはSEM±平均として提示されています。ペア比較間に有意な差は認められませんでした。略称:OC = 酸化能力;RP = 酸化還元電位。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:モデル・コントロール(CK)ラットにおけるIPGTTアッセイによるFPGおよび2hPG値。 FPGと2hPGを測定し、障害性グルコース耐性ラットモデルの確立を検証しました。n = コントロール群に3匹、モデル群にn = 18匹のラット。統計解析はマン・ホイットニーU検定で行われ、結果はSEMの平均±を示します。**p < 0.01、***p < 0.001。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:鍼治療中のIGTラットのFPGおよび2hPG値。 (A) 鍼治療を受けたグループのFPG値(鍼穴で針をねじり、鍼に直接針を挿入するグループ)(グループあたりn=3件)。(B) 鍼穴および非鍼穴でねじりを伴う針治療を受けるグループのFPG値(グループごとにn=3)。(C) 高脂肪食群および正常食群のFPG値(n=3個ずつ)。(D) 高脂肪食および正常食ラットにおける7日目の2hPG値は、鍼灸部位ねじり、鍼灸部位ねじり、鍼灸直刺条件下で行われました。(n = グループあたり3個)結果はSEMの平均±示されます。パネルDの計画的なペアワイズ・エンドポイント比較は、ペアリングされていない両側の学生t検定を用いて解析されました。*p < 0.05。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:各グループのラットのOCおよびRPの1週間の鍼治療期間中の変化。 (A) 高脂肪食IGTラットにおけるOCの変化。(B) 高脂肪食IGTラットにおけるRPの変化。(C) 正常な食事中のIGTラットにおけるOCの変化。(D) 正常な食事のIGTラットにおけるRPの変化。(E) 鍼灸ポイントねじりサブグループにおける高脂肪食と正常食の状態のOC関連SERS指数比較;(F) 鍼灸ポイントねじりサブグループにおける高脂肪食と正常食の状態のRP関連SERS指数比較。n = 1つの部分グループあたり3匹のラット。データはSEMの平均±として提示されます。連続測定は探索的な縦断的傾向として解釈されました。略称:OC = 酸化能力;RP = 酸化還元電位。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足ファイル1:プローブ応答評価のための代表的な機器生成出力。 このファイルには、解析機器が直接生成し、プローブ応答性能を評価するために使われる代表的な連続モニタリング出力が含まれています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表1:定量分析のための生データ表。 このファイルには、血糖値測定、SER由来比率値、定量図パネルデータを含む数値生成および統計解析に使用される数値ソースデータが含まれています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

耐糖障害は2型糖尿病の前の可逆的な移行期を示し、代謝バランスの乱れ、インスリン抵抗性、酸化ストレス関連の調節障害と密接に関連しています。生活習慣介入やその他の早期治療法は、耐糖障害から糖尿病への進行リスクを低減できますが、介入中の局所生化学反応を動的にモニタリングするツール^{は依然として}限られています。鍼治療は実験的および臨床試験でグルコース代謝および酸化ストレス関連経路に影響を与えることが報告されています。しかし、鍼治療の多くの機構的研究はエンドポイントの血液や組織測定に依存しており、鍼治療介入中の局所酸化還元関連反応を低侵襲で追跡できる方法も比較的少数です。IGT治療の過去の臨床試験では、食事の修正、体重減少、身体活動の増加などの生活習慣の介入によって糖尿病リスクを大幅に低減できることが確認されています³¹。鍼治療は血糖代謝指数の改善や空腹時血糖値および2hPGの低下に効果があることが示されています。したがって、鍼治療、酸化還元、IGTの関係を解明することで、IGTを逆転させたり進行を妨げたりするアプローチが提供され、糖尿病の発生率を低減するとともに、IGTの病理学やその発生メカニズムについての洞察も得られる可能性があります。

本研究は、鍼治療介入と局所比率的SERS追跡を組み合わせて、グルコース耐性障害モデルにおいて鍼治療介入と局所比率SERS追跡を組み合わせる、二重溝酸化還元感受性表面強化ラマン散乱活性マイクロニードルプラットフォームを提案します。このシステムでは、1本の鍼治療針に刻印された2本の溝を用いて、酸化能力応答型および酸化還元電位応答型プローブを搭載しました。この設計により、鍼は介入ツールとしてだけでなく、局所的な酸化還元に関連する光学的読み取りを感知するキャリアとしても機能しました。結果は、ツイストを伴う鍼穴でのニードリングが、空腹時血糖値および2hPG値の低下、さらにグルコース耐性障害ラットにおける酸化能力関連および酸化還元電位関連SERS指数の変化と関連していることを示しました。これらの発見は、鍼治療介入時に局所的な酸化還元関連反応を探るためにSERS活性マイクロニードルを用いる可能性を支持しています。全体として、鍼穴へのひねりはIGTラットにおけるFPGおよび2hPG値の低下、OCおよびRP関連SERS指数の変化と関連していることを示唆しています。これらの発見は、鍼治療介入時に局所的な酸化還元に関連する光学反応を追跡するためにSERSアクティブマイクロニードルを使用することの実現可能性を支持しています。しかし、標準的な生化学的酸化ストレスアッセイ、プローブ浸出解析、組織生適合性試験が実施されなかったため、観察されたSERS指数の変化を酸化ストレス改善の決定的な生化学的証拠と解釈すべきではありません。

同じ仮説をさらに調査するためには、いくつかの代替アプローチが用いられる可能性があります。活性酸素種、マロンジアルデヒド、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド比率の測定を含む標準的な生化学的酸化ストレスアッセイは、SERS由来指数の変化が従来の酸化ストレスバイオマーカーに対応するかどうかを検証するために用いられます^32,33.電気化学的酸化還元プローブ、蛍光ベースの酸化還元センサー、化学発光アッセイ、微小透析と生化学分析、組織ベースの免疫組織化学的または組織学的検証も補完的な情報を提供する場合があります。これらの独立したアプローチとSERSアクティブマイクロニードルセンシングを組み合わせることで、観察される光学的変化が特定の生化学的酸化還元変化を反映しているのか、それともニードリングや代謝状態に対するより広範な局所組織反応を反映しているのかを明らかにする助けとなる³⁴。

この手法の応用は、現行の障害性耐糖モデルを超えて広がっています。レドックス不均衡は代謝疾患、組織損傷、炎症、創傷修復に関与するため、SERSアクティブマイクロニードルは糖尿病関連モデル、創傷治癒研究、炎症性疾患モデル、その他の低侵襲介入環境における局所的なレドックス関連反応の監視に役立つ前臨床ツールとなり得ます。³⁵.鍼治療研究においては、鍼治療ポイント、非鍼治療部位、異なるニードリング操作、異なる介入スケジュールの比較に役立つ場合があります。しかし、これらの応用は探索的な段階にとどまり、さらなる技術的・生物学的検証が必要です。

いくつかの制限点に注意が必要です。まず、OCおよびRPの値はSERS由来の比率指標として計算され、標準的な酸化物質濃度や絶対電気化学的酸化還元ポテンシャル値に対して較正されませんでした。したがって、本成果は絶対的な生化学的測定ではなく、同一取得条件下での相対的な酸化還元関連光学応答として解釈されるべきです。第二に、生物組織の微小環境は局所的なpH変化、タンパク質の吸着、細胞外マトリックス成分、その他のマトリックス効果など、追加のシグナル変動源をもたらす可能性があります。これらの因子は血清含有または組織模倣培地では十分に評価されていません。第三に、組織表面に送られる実際のレーザー出力やラマン取得時の局所温度変化は直接測定されていません。したがって、光熱的または光化学的な影響の可能性を完全に排除することはできません。第四に、溝の形状やプローブ負荷のバッチレベルの再現性は、多針SEMイメージングや荷重効率解析による定量的評価が行われませんでした。最後に、独立した生化学的検証、プローブ浸出解析、局所生体適合性試験は実施されませんでした。今後の研究では、生物学的に関連性の高い行列における較正曲線の確立、標準的な酸化ストレスおよび酸化還元アッセイとのSERS指数の相関、プローブ浸出の定量化、繰り返し挿入後の局所組織適合性の評価、そしてより大きな動物コホートでの装置の検証が求められます。SERS活性マイクロニードルは、鍼治療介入と局所酸化還元関連指標の相対比率測定によるSERS追跡を組み合わせる有用なプラットフォームとなり得ます。絶対的な定量的モニタリングや翻訳応用を主張するには、さらなる校正、生化学的検証、プローブ浸出評価、生体適合性研究が必要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APTES, 98%)	天津Heowns生物化学技術有限公司	A800524
(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン (MPTES, 95%)	天津Heowns生物化学技術有限公司	M742544
アスコルビン酸	中国薬業化学薬品株式会社	CFAD310554
血糖計	Cofoe医療技術有限公司	Cofoe A03
血糖試験用ストリップ	Cofoe医療技術有限公司	Cofoe-A03-C
硫酸銅 (CuSO4)	中国薬業化学薬品株式会社	PHR1477
エチルアルコール (≥99.7%)	中国薬業化学薬品株式会社	XW00641752
硫酸第一鉄 (FeSO4)	中国薬業化学薬品株式会社	XW01772078701
グルコース (Glu)	天津Heowns生物化学技術有限公司	D9434
過酸化水素 (H2O2)	中国薬業化学薬品株式会社	P-17-0500
塩化鉄 (FeCl3)	中国薬業化学薬品株式会社	CP81015228
メチルメタクリレート (MMA)	上海アダマス生物化学技術有限公司	M109626
マイクロラマン分光計	レニショー	InViaラマン顕微鏡
p-フェニレンジアミン (p-PDA)	上海TCI化学工業開発有限公司	P128784
ポリメチルメタクリレート (PMMA)	天津Heowns生物化学技術有限公司	P742581
走査型電子顕微鏡	ツァイス	ULTRA Plus
ホウ化ナトリウム (NaBH4)	上海アダマスベータ試薬有限公司	S432207
亜硫酸ナトリウム (Na2SO4)	中国薬業化学薬品株式会社	S572396
ステンレス製鍼灸針	蘇州天峻鍼灸器械有限公司	X-20-03
統計分析ソフトウェア	IBM	バージョン 2021
ストレプトゾトシン (STZ)	上海アダマス生物化学技術有限公司	S408311
四塩化金酸 (HAuCl4)	天津Heowns生物化学技術有限公司	A124024
SPSSソフトウェア	IBM, アメリカ合衆国ニューヨーク州アーモンク	バージョン 26.0
ラット	江蘇青龍山バイオテクノロジー有限公司	特定病原体フリーのオスのスプレーギュー・ドーリー
基礎飼料	安楽康バイオテック	SY10001
ラルド	MCE	HY-W127601
ショ糖	MCE	HY-B1779
卵黄粉末	MCE	HY-B2235B
クエン酸一水和物	Sigma-Aldrich	C1909
クエン酸ナトリウム二水和物	Sigma-Aldrich	S4641
クエン酸緩衝液	beyotime	P0086
リン酸緩衝生理食塩水	beyotime	ST448-1L
イソフルラン	Bioss	D54468
小動物用イソフルラン麻酔システム	RWD生命科学	R500
誘導チャンバーとノーズコーン	RWD生命科学	R500互換アクセサリー
温熱パッド	上海玉彥生命科学	Y69020
75%エタノール	ボーユーバイオ	YB60401
CO2安楽死チャンバー	ラボアニマルテクノロジー株式会社	LAT-10-0090
WPS	北京金山オフィスソフトウェア	WPS365