方法論記事

外傷誘発性出血性凝固障害、炎症、および生存率の定量化を簡便にするマウス肝裂傷モデル

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DOI:

10.3791/72215

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2026年9月25日

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1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

この記事について

サマリー

私たちは、出血、外傷誘発性凝固異常、および生存転帰を統合した、深刻な出血を伴う再現性のあるマウス肝裂創モデルを提示します。このモデルにより、凝固能、線溶能、および死亡率の評価とともに、リコンビナント第VIIa因子やトラネキサム酸を含む止血介入の評価が可能となり、出血に関する機序研究およびトランスレーショナル研究のための費用対効果が高く拡張可能なプラットフォームを提供します。

要約

制御不能な出血は依然として外傷患者における予防可能な死の主要な原因であり、外傷性凝固障害（TIC）は早期死亡の決定的な要因となっています。出血およびそれに伴う凝固障害反応を確実に再現できる実験モデルは、機序の解明や標的治療の評価に不可欠です。本稿では、再現性のある肝裂傷（LL）により出血を誘発し、その出血量を正確に定量化できると同時に、全身性の凝固障害、炎症マーカー、および死亡率を同時に追跡することが可能な、重度出血の標準的なマウスモデルについて説明します。

マウスに標準的な正中線開腹術を行い、続いてLLを施行し、血液吸収スポンジを用いて失血量を定量化します。凝固、線溶、および炎症の全身性マーカーは、処置前および処置後にあらかじめ規定された連続的な間隔で、後眼窩採血により収集します。失血を伴うLLは、一貫してTIC（活性化部分トロンボプラスチン時間 (aPTT) の延長、トロンビン-アンチトロンビン (TAT) 複合体の増加、凝固因子 (F) VおよびVIIIの選択的な枯渇、および線溶の活性化によって特徴付けられる）を誘発します。並行して、インターロイキン-6 (IL-6) の増加により炎症活性化が証明されます。さらに、このモデルでは正中切開部位の縫合後の生存解析も可能です。

トランスレーショナルな応用として、rhFVIIaおよびTXAを用い、凝固および線溶パラメータの薬理学的調節による出血救済に対して本モデルが感受性を有することを証明します。大型動物モデルと比較して、このマウスシステムは、外傷性出血に対する革新的で標的を絞った介入策を研究するための、経済的で汎用性が高く、容易にスケールアップ可能な機会を提供します。

概要

外傷は、若年成人（年齢 < 45歳）1,2、制御不能な出血が早期死亡の主要な原因となっている3重症外傷患者における予後不良の決定的な要因は、外傷誘発性凝固障害（TIC）の発症である。4,5TIC（血栓性微小血管症に伴う消費性凝固障害）は、凝固因子VおよびVIIIの枯渇を特徴とする、止血機構の複雑かつ多因子的な調節不全である。6,7、調節不全のフィブリン溶解7,8,9、および全身性炎症活性化10TICは持続的な出血に寄与し、輸血必要量の増加と関連している。11, 臓器不全5、およびダメージコントロール蘇生術や治療的介入が進歩したにもかかわらず、依然として高い死亡率が報告されている5.

したがって、凝固障害を伴う出血性ショックを確実に再現できる実験モデルは、メカニズムの解明や標的止血介入法の評価において不可欠である。制御出血モデルでは標準化された採血が行われるが、これでは組織損傷が誘発されない可能性があり、臨床的な外傷で見られる全身性の凝固障害反応を十分に再現できない12。そのため、持続的な出血と全身反応を定量的に評価できるのであれば、実質臓器損傷を組み込んだ出血モデルの方がより高い臨床的妥当性をもたらすと考えられる13,14,15,16。より複雑なTICモデルでは、重症外傷の多面的な構成要素を再現するために、外傷性脳損傷、長管骨または四肢の骨折、軟部組織損傷、開腹術、および制御出血性ショックを組み合わせて用いる17,18。これらのアプローチは多発外傷をより包括的に表現できるが、多重な損傷処置と生理学的操作により、技術的な複雑さと実験的なばらつきが増大する可能性がある。

数十年にわたる研究にもかかわらず、臨床的に関連し再現性のあるTICの実験モデルは、依然として限定的かつ不均一である。レビューでは、組織損傷と出血性ショックの臨床的経過をより正確に再現し、治療的介入の評価をサポートする堅牢なモデルの必要性が強調されてきた17,19。心カテーテル法や持続的な血行動態モニタリングなど、広範な器具を必要とする複雑なモデルは、詳細な生理学的情報を提供できるが、専門的な装置と追加の手技的な操作を必要とする。外傷研究への障壁を取り除くためには、TICの主要な特徴を保持しつつ、実験的アプローチを簡素化することが極めて重要であると思われる。本稿では、再現性のあるLLを用いて制御不能な出血性ショック14を誘発し、深刻な出血を引き起こしてTICの主要な特徴を再現する、標準化されたマウスモデルについて記述する。このモデルにより、一般的な凝固指標（aPTTおよびトロンビン生成）、TICの特徴である凝固因子の選択的枯渇（FVおよびFVIII）、フィブリノリシスのマーカー、およびサイトカインプロファイリングを含む、凝固および炎症反応の評価が可能となる。本モデルのヒト外傷に対する感度と関連性を実証するため、外傷蘇生に使用されるrhFVIIa（止血剤）およびTXA（抗フィブリノリシス剤）が、出血の重症度、凝固障害の進行、および生存転帰に及ぼす影響を評価する。

このモデルはさらに、連続的および終末的な採血を可能にし、外傷の重症度や治療介入に関連した凝固および炎症の経時的な推移の評価を実現します。総合的に見て、本モデルは、深刻な出血条件下でのTICの研究、ならびに失血量、凝固障害、線溶、炎症、生存率といった臨床的に関連のあるエンドポイントを用いた止血処置および標的薬理学的介入を評価するための、再現性と拡張性を備えたマウスシステムを提供します。

Dyerら13によって記載されたプロトコルを含む、以前に報告されたマウス肝裂傷モデルと比較して、本手法はいくつかの重要な方法論的進歩を導入している。これには、出血量の定量的な重量測定、裂傷肝重量を体重で正規化することによる損傷程度の標準化、およびTIC、線溶、炎症の包括的なプロファイリングが含まれる。さらに、本モデルでは連続サンプリング、薬理学的調節、および腹腔閉鎖術の詳細を含む生存分析が可能であり、安楽死ではなく身体的な回復を実現している。これらすべての手順は単一の実験的アプローチ内で実施可能であり、出血および標的止血介入を研究するための、拡張性とトランスレーショナルなプラットフォームを提供する。

プロトコル

カリフォルニア大学サンディエゴ校（UCSD）の施設動物ケアおよび使用委員会によって、すべての動物実験プロトコルが承認されました。C57BL/6Jマウスは、UCSDの内部繁殖施設で繁殖および飼育されました。実験には、8週齢から10週齢の雄および雌のマウスの両方が使用されました。実験ワークフローとタイムラインの概略図は、付録図1に示されています。

注：サンプルサイズは、予備実験、個々のエンドポイントの予想変動、およびマウス肝裂傷モデルに関する過去の経験に基づいて決定されました。個々の実験エンドポイントおよび実験群の最終的なサンプルサイズは、対応する図の説明に記載されています。肝重量の測定については、実験コホート間の整合性を評価するために、複数の独立した実験からのデータを統合しました。個別の実験ランで実施された凝固アッセイについては、アッセイ間の整合性と再現性を監視するため、以前に分析したサンプルを各ランに含めました。

1. 実験前準備

  1. ベースラインサンプルの採取（-1日目）
    1. ベースラインパラメータを確定させるため、実験の24時間前に、各マウス（8〜10週齢）から後眼窩静脈叢経由で血液を約200 µL採取する。
    2. 採血後、滅菌注射用生理食塩水を約200 µL皮下投与する。
    3. 実験当日まで、温度20–24 °C、相対湿度30%–70%、12時間明期/12時間暗期の制御された標準的な実験室条件下で、清潔なケージ内で飼育し、餌と水は自由摂取とする。
  2. ケージの準備（0日目）
    1. 実験当日に、マウスを新しいペーパータオルを敷いた清潔なケージに移す。
    2. 実験の15分前に餌と水を取り除き、手術後に吸収スポンジを回収するまで与えない。

2. 器具および手術野の準備

  1. 器具の滅菌
    1. 手術器具、綿、アプリケーター、およびフィルターペーパーをオートクレーブで滅菌する。
    2. 70% ethanolを用いて手術面を消毒する。
  2. 手術台のセットアップ
    1. 滅菌ドレープの上に滅菌器具を配置する。
    2. 器具の中間洗浄用に、70% ethanolと滅菌綿を入れたステンレス容器を用意する。
    3. マイクロビーズ滅菌器を起動し、個体間の滅菌のために150 °Cまで到達させる。

3. 温度維持の準備

  1. 等温パッドの準備
    1. 手術の直前に、製造元の指示に従って等温加熱パッドを起動させる。
    2. 麻酔および手術の間、マウスの体温を36–37 °Cの目標範囲内に維持するように等温加熱パッドを設定する。
    3. パッド表面全体に熱が均一に分散していることを確認する。
    4. パッドを手術台の上に配置し、滅菌ドレープで覆う。
    5. 手術用ボードをイソフルラン麻酔システムに接続する。

4. 麻酔および術前処置

  1. 麻酔導入
    1. 2 L/minの酸素に2%のイソフルランを混合した導入チャンバーにマウスを入れ、麻酔を導入する。
    2. 足指つまみ反射により、十分な麻酔深度を確認する。
    3. 手術前に体重を記録する。
  2. 鎮痛および治療剤の投与
    1. 鎮痛のため、ブプレノルフィン（3.25 mg/kg、皮下投与）を投与する。
    2. 必要に応じて止血剤を準備する。
    3. 治療群には、受傷の5分前に、リコンビナントヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）またはトラネキサム酸（10 mg/kg）を後眼窩静脈注射で投与する。
    4. 対照群には、同量（~100 µL）の注射用滅菌生理食塩水を投与する。

5. 外科的準備

  1. 手術部位の準備
    1. 麻酔をかけたマウスを、等温パッド上に配置した手術ボードへ移動させる。
    2. 手術の間、ノーズコーンを用いて1.5%–2% isofluraneを2 L/minの酸素で投与し、麻酔を維持する。
    3. マウスを仰臥位に配置し、四肢すべてをテープで固定する。
    4. 腹部を剃毛する。
    5. ポビドンヨード液と70% ethanolを交互に用いて、無菌的な処置を行う（3回繰り返す）。

6. 肝裂傷処置

  1. 材料の事前計量
    1. 生理食塩水 0.5 mL 入りのチューブ1本と空のチューブ1本の、計2本の 1.5 mL チューブをあらかじめ計量しておく。
    2. 動物1匹につき、一次吸収三角ガーゼ3枚と二次吸収三角ガーゼ2枚をあらかじめ計量し、それらの合計質量を記録する。
    3. 摘出した肝組織の後の計量のため、動物1匹につき秤量舟1枚をあらかじめ計量しておく。
  2. 肝損傷の誘発
    1. 肝臓を露出させるため、長さ約 0.5 inch (12.7 mm) の正中線腹壁切開を行う。
    2. 肝臓に触れないように注意しながら、腹壁の左右に吸収三角ガーゼ2枚を配置する。
    3. 肝左葉を体外へ出し、組織切除範囲を標準化するために葉の辺縁を確認する。意図しない組織損傷を避けること。
    4. 鋭い剪刀を用い、動物間での一貫性を確保するため、一度の制御された動作で葉の約 75% を裂傷させる。
    5. 損傷の程度を後で定量化するため、切除した裂傷組織をあらかじめ計量しておいた空のチューブに移す。
    6. 出血相において均一な血液回収を容易にするため、3枚目の吸収三角ガーゼを腹腔内に挿入する。
  3. 内出血を維持するための迅速な腹壁閉鎖（重要ステップ）
    1. 2個の外科用オートクリップを用いて、約 10–15 s 以内に直ちに腹壁を閉鎖する。
    2. 隙間なく完全に閉鎖するため、切開端を正確に合わせる。閉鎖が不完全な場合、血液が体外に漏れ、失血量が過小評価される可能性がある。
    3. 閉鎖時は、出血管の動態を変化させる可能性があるため、腹腔内コンテンツを圧迫しないよう、一定かつ緩やかなテンションをかける。
    4. 組織用接着剤（2–3 滴）で閉鎖部を補強し、腹腔内が完全に密封されていることを確認する。
  4. 損傷後のモニタリング
    1. 切除した肝組織を計量し、その測定値を体重で標準化して、肝損傷の程度を定量化し確認する。
    2. 等温パッドの上に置いたケージにマウスを戻す。
    3. エンドポイント群および生存群において、60 min 間出血を継続させる。

7. 採血および失血量の定量

  1. 血液サンプルの採取および処理
    1. エンドポイントコホートでは、肝裂傷後60分にイソフルランでマウスを再麻酔する。
    2. 生存コホートでは、血液採取のため、肝裂傷後6時間および7日目にイソフルランでマウスを再麻酔する。
    3. 血漿調製のため、後眼静脈叢穿刺により血液を採取し、クエン酸ナトリウム溶液（血液対抗凝固剤比 9:1）を含むチューブに入れる。
    4. サンプルを2,000 × gで10分間遠心分離し、続いて12,000 × gで5分間2回目の遠心分離を行い、後続の凝固およびフィブリン溶解アッセイ用の血小板減少血漿を得る。
  2. 失血量の測定
    1. エンドポイントおよび生存コホートの両方について、肝裂傷後60分に腹部を再開腹し、血液を含む吸収スポンジを取り出す。
    2. 血液を吸収したすべてのスポンジを、滅菌生理食塩水を含むあらかじめ重量を量っておいたチューブに移す。
    3. 追加で重量を量った吸収スポンジを用いて、腹腔内の残存血液を回収する。
    4. 血液回収後、回収チューブの重量を量り、最終的なチューブ重量を得る。
    5. 以下の重量測定式を用いて失血量を算出する。
      失血量 (µL/g) = [(最終チューブ重量 − 初回チューブ重量 – 吸収スポンジ重量) / マウス体重] × 1000.
      注：すべての重量はグラムで表示する。係数1,000は、血液密度を約1 g/mLと想定し、血液のグラム数をマイクロリットルに変換するためのものである。
  3. 生存および縦断的アウトカムコホート
    1. 60分時の失血量測定後、直ちに外科用ステープラーと組織接着剤を用いて切開部を閉鎖し、腹腔内を完全に密閉する。
    2. 回復前に、滅菌生理食塩水 400 µLを皮下投与する。
    3. マウスを標準飼育ケージに戻し、麻酔からの回復を継続的にモニタリングし、手術後2時間、6時間、24時間後に評価を行い、その後7日目まで毎日モニタリングを行う。

8. 術後ケア

  1. 術後モニタリング
    1. 麻酔からの回復初期において、苦痛や疾患の兆候がないか、動物を継続的にモニタリングする。
    2. 予定された各評価時点で、生存状況および臨床観察結果を記録する。
  2. 支持療法
    1. 滅菌生理食塩水 400 µLを、3日間毎日皮下投与する。
    2. 承認済みの動物ケアプロトコルに従い、72時間ごとに鎮痛剤（ブプレノルフィン、3.25 mg/kg、皮下投与）を投与する。
    3. マウスを標準的な飼育環境で飼育し、餌と水に自由にアクセスできるようにする。
  3. 人道的なエンドポイント
    1. 重度または持続的な嗜眠、歩行不能、餌や水の摂取不能、重度の呼吸困難、無反応、または承認済みの施設動物ケアプロトコルに規定されたその他の重度の苦痛の兆候など、事前に定義された人道的なエンドポイントについて動物をモニタリングする。
    2. 事前に定義された人道的なエンドポイントに達した動物は、施設のガイドラインに従って安楽死させる。
    3. 7日目まで、または人道的なエンドポイントに達するまで生存モニタリングを継続する。

9. エンドポイント処置および組織採取

  1. あらかじめ設定した実験終了時点でマウスを麻酔し、後眼窩静脈叢から採血を行う。
  2. 施設ガイドラインに従い、CO₂吸入により安楽死させる。
  3. 臓器を採取し、規定の下流工程に従って組織学的解析のための組織処理を行う。

10. 凝固、線溶、およびサイトカインアッセイ

注：これらの手順で使用される試薬、アッセイキット、および機器は、材料表に記載されています。

  1. aPTTの測定
    1. 材料表に記載の凝固計を用いて、すべての凝固時間を記録する。
    2. 25 µLのマウス血漿を25 µLのaPTT試薬と混合し、37 °Cで3分間インキュベートする。HBS（20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4）で調製した25 µLのCaCl₂ (25 mM) を添加して凝固を開始させ、凝固時間を記録する。
  2. FV、FII、およびFX活性の測定
    1. 5 µLのマウス血漿を、20 µLの対応する因子欠乏血漿および0.5%牛血清アルブミンを含む25 µLのHBSと混合する。
    2. 37 °Cで1分間インキュベートし、材料表に記載のInnovin試薬を添加して凝固を開始させる。
    3. 対応する校正/参照システムに対する因子活性を決定する。
  3. FVIIIの測定
    1. 製造元の指示に従い、発色法FVIIIアッセイを用いてFVIIIを測定する。
  4. フィブリノゲンの測定
    1. Clauss法を用いてフィブリノゲン濃度を測定する。10 µLのマウス血漿を、0.01%牛血清アルブミンを含む40 µLのHEPES緩衝生理食塩水に添加し、37 °Cで3分間インキュベートする。
    2. 25 µLのトロンビン (25 U/mL) を添加して凝固を開始させ、アッセイの校正を用いてフィブリノゲン濃度を決定する。
  5. 血漿バイオマーカーの測定
    1. 材料表に記載の市販のアッセイキットを用いて、血漿TAT複合体、PAP複合体、およびD-ダイマーを測定する。各アッセイは製造元の指示に従って実施する。
    2. 製造元が指定するアッセイ固有の標準品、キャリブレーター、およびコントロールを使用し、対応する標準曲線から分析物濃度を算出する。
  6. 血漿IL-6の測定
    1. 材料表に記載のマルチプレックスサイトカインアッセイを用いて、基線時、および肝裂傷後60分と6時間における血漿IL-6濃度を測定する。
    2. 製造元の指示に従ってアッセイを実施し、製造元のQ-Viewソフトウェアを用いてデータを解析する。

結果

LLモデルにより、マウスにおいて再現性があり標準化された傷害重度を実現できる。図1Aは、体重で正規化した（%BW）肝裂創重量の整合性を示しており、実験群全体での傷害中央値は体重の1.4%であった。この整合性は、外科的誘導が信頼できることを裏付けており、個体間および異なる実験条件下での再現性を可能にする。傷害重度を標準化できる能力は、組織損傷のばらつきに依存せず、その後の生理学的反応を評価するために極めて重要である。

本モデルにおける出血反応の検証および治療的な調整の効果は、図1Bに示されています。マウスに生理食塩水、止血前処置剤のrhFVIIa、または抗フィブリン溶解剤のTXAを前投与し、失血量を定量化して体重で標準化（µL/g）しました。生理食塩水を投与したマウスは、LL後に相当量の出血を示しましたが、rhFVIIaまたはTXAを投与したマウスでは失血量が減少しました。これらの結果は、本モデルが出血の薬理学的調整を検出し、制御不能な出血条件下で止血介入を評価できる能力を有していることを示しています。

このモデルは、外傷性凝固 {trauma-induced coagulopathy} の主要な特徴も再現しています。図1Cに示されているように、LLによりaPTTの延長が認められ、受傷後の凝固能の低下が示されました。rhFVIIaまたはTXAによる治療はこの延長を緩和し、凝固機能が回復したことが示唆されました。同様に、TAT複合体によって評価したトロンビン生成は、LL後に増加し、TXA治療で減少しましたが、rhFVIIaではTATレベルが低下しなかったため（図1D）、凝固活性化の調節が行われていることが示唆されました。

凝固障害のさらなる詳細な特性解析を図2に示す。LLにより、TIC（トラウマ誘発性凝固障害）と一致して、凝固因子VおよびVIIIの選択的な枯渇が認められ、これらの変化はrhFVIIaまたはTXAによる治療で回復した（図2A,B）。対照的に、因子IIおよびXは有意に変化せず（図2C,D）、これらの変化が因子IIおよびXが維持された状態で起こっていることを示しており、播種性血管内凝固（DIC）様表現型よりもTIC主体の表現型であることを支持している。

LL後のフィブリノリシスの展開を図3に示す。受傷後にフィブリノゲンレベルが低下したことは消費を示しており、rhFVIIaまたはTXAによっても完全には回復しなかった(図3A)。対照的に、プラスミン-アンチプラスミン（PAP）複合体やDダイマーを含むフィブリノリシスマーカーは、LL後に上昇した。rhFVIIaはPAP複合体レベルを低下させたが、Dダイマーレベルを有意に変化させなかった。TXAは、LL後のPAP複合体およびDダイマーレベルの両方を低下させた(図3B,C)。

最後に、図4にて、全身性炎症反応と生存率を評価する。すべての治療群において、LL後60分および6時間における血漿中インターロイキン-6（IL-6）レベルを測定した。すべての群で、早期の時間経過においてIL-6レベルの上昇が認められた（図4A）。7日間の生存率はカプラン・マイヤー分析を用いて評価した。7日生存率は、生理食塩水群で75%、rhFVIIa群で55%、TXA投与群で80%であった。生理食塩水群とTXA群との間に有意差は認められなかったが、rhFVIIa群の生存率は生理食塩水群およびTXA群と比較して有意に低下していた（図4B）。

肝重量、失血量、aPTT、TAT複合体データ。生理食塩水、rFVIIa、TXA投与群を比較した棒グラフ。
Figure 1: 肝裂傷（LL）モデルの検証：損傷重症度の再現性、定量的な失血量、および凝固障害の誘導。 正中切開による開腹後、標準化されたLLを行うことで重度の内出血を誘導する。出血および凝固障害の薬理学的調節を評価するため、損傷前に生理食塩水（~100 µL）、リコンビナントヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）、またはトラネキサム酸（TXA; 10 mg/kg）をマウスに前処置する。（A）損傷重症度は、体重で正規化した裂傷肝重量（%BW）として定量化されており、個体間で標準化された損傷が再現性よく誘導されていることを示している。（B）失血量は重量法を用いて定量し、体重で正規化（µL/g）して示されており、測定可能な出血がTXA治療によって減少することが示されている。（C）活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）および（D）トロンビン-アンチトロンビン（TAT）複合体は、LL後の凝固障害の再現性のある誘導を示しており、rhFVIIaまたはTXA治療による調節が観察された。データは個々の値として、中央値および四分位範囲とともに提示されている。比較には非パラメトリックのMann-Whitney U検定を用いた（n = 5–21）。****P ≤ 0.0001。Josephら16より許可を得て改変。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

血液凝固因子のレベル比較。FV、F-VIII、F-IX、F-Xのグラフ、治療群における統計解析。
図 2: 肝裂傷（LL）後の外傷性凝固異常（TIC）の検証：凝固因子の選択的減少。正中腹腔切開および標準化されたLLにより重度の内出血を誘導する。凝固異常の薬理学的調節を評価するため、損傷前に生理食塩水（~100 µL）、リコンビナントヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）、またはトラネキサム酸（TXA; 10 mg/kg）をマウスに前処置する。LL後60分に凝固パラメータを評価する。（A）第V因子および（B）第VIII因子のレベルは、TICと一致して、LL後に再現性のある減少を示している。（C）第II因子および（D）第X因子は比較的維持されており、全般的な消費ではなく選択的な凝固因子の減少であることを示している。データは個々の値とともに、中央値および四分位範囲（n = 7–10）で提示している。統計的比較は非パラメトリックのMann-Whitney U検定を用いて行った。***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。Josephら16より許可を得て改変。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

さまざまな治療におけるフィブリノゲン、PAP複合体、およびDダイマーのレベルを示す3部構成のチャート。
図3肝裂傷（LL）後のフィブリン溶解活性化の検証。 正中線開腹術に続き、標準化された肝葉切除（LL）を行うことで、重度の内出血を誘発させる。マウスに生理食塩水を前処置し（～100 µL）、または組み換えヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）、あるいはトラネキサム酸（TXA; 10 mg/kg）を受傷前に投与し、線溶の薬理学的調節を評価した。線溶パラメータは、LLの60分後に評価した。（Aフィブリノゲン濃度は、損傷後の消費を示しており、これはフィブリン溶解の活性化および凝固因子の枯渇と一致している。B) プラスミン–アンチプラスミン（PAP）複合体および（C) LL後にはDダイマー値が上昇しており、これはフィブリン分解の活性化および全身性フィブリノライシス活性化を示している。データは個々の値として、中央値および四分位範囲とともに提示されている（n = 8–13）。統計的比較には、非パラメトリックのMann-Whitney U検定を用いた。**P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。Josephらの論文より許可を得て改変。16. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

IL-6レベルと生存率の比較。A：IL-6濃度グラフ、B：生存率プロット。
図4: 肝裂傷（LL）後の全身性炎症反応の検証および生存率評価。正中線開腹術に続き、標準化されたLLを行うことで重度の内出血を誘発する。マウスには、損傷前に生理食塩水（100 µL）、リコンビナントヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）、またはトラネキサム酸（TXA; 10 mg/kg）を前投与する。損傷後、腹部切開創を創傷クリップと組織用接着剤で閉鎖し、動物をホームケージに戻す。支持療法として、損傷後最初の3日間、生理食塩水（400 µL）を毎日皮下投与する。全身性炎症活性化を評価するため、LL後60分および6時間に血漿サンプルを回収する。（A）Interleukin-6 (IL-6) レベルは、損傷後に持続的な全身性炎症反応が起こることを示している。データは、中央値および四分位範囲を伴う個々の値として提示されている。統計的比較は、ノンパラメトリックなMann–Whitney U検定を用いて行った（n = 9–13）。（B）7日間の生存率をKaplan-Meier解析を用いて評価し、本モデルが縦断的なアウトカムベースのエンドポイントをサポートできる能力を有することを示している（n = 20）。****P ≤ 0.0001。Josephら16より許可を得て改変。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1：肝裂創モデルおよび実験タイムラインの概略図 この図は、制御不能な出血の標準化マウス肝裂傷（LL）モデルにおける実験ワークフローをまとめたものである。マウスに正中線腹開術を施した後、左肝葉の約75%に再現性のあるLLを誘導する。損傷前に、マウスに生理食塩水（〜100 µL（ビヒクル対照群）、またはリコンビナントヒト活性化第VII因子（rhFVIIa; 3 mg/kg）、またはトラネキサム酸（TXA; 10 mg/kg）を、LLの5分前に後眼窩静脈注射にて投与する。失血量の定量は、受傷時に腹腔内に留置したあらかじめ重量を測定した腹部スポンジを用いて行い、LLの60分後に回収して重量を測定することで総出血量を決定する。その後、組織接着剤と創傷用クリップを用いて腹部を閉鎖する。血液サンプルは、エンドポイント群では60分後、生存群では6時間後および7日後に後眼窩的に採取する。プラズマを分析し、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）、凝固因子の活性、トロンビン-アンチトロンビン（TAT）複合体、プラスミン-α2-アンチプラスミン（PAP）複合体、および60分後のDダイマーを含む凝固パラメータを測定する。サイトカインプロファイリングは60分後および6時間後に行う。生存率は7日間にわたってモニタリングする。Josephらの方法を許可を得て改変。16. こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、定量的な失血量評価、外傷性凝固障害（TIC）および炎症の特性評価、そして生存率解析を単一の実験に統合した、標準化された肝裂傷（LL）による重度の出血の再現可能なマウスモデルを提示します。本モデルは、体重で正規化した肝裂傷重量が同等であることから示されるように、一貫した損傷重度をもたらすと同時に、実験群間での出血および全身性の止血反応の再現可能な評価を可能にします。標準化された損傷と定量的なアウトカム測定を備えた小型齧歯類モデルを用いることで、技術的に複雑な手順を必要とせず、単一の実験枠組みの中で複数の実験エンドポイントを効率的に評価でき、TICの再現性と拡張性のある研究を支援します。

重要な点として、本モデルは、一般凝固パラメータ（aPTT）の延長、TAT複合体によって反映されるトロンビン生成の増加、凝固因子VおよびVIIIの選択的な枯渇、そしてPAP複合体の上昇とD-ダイマー形成によって証明されるフィブリン溶解の活性化を含む、TICの主要な特徴を再現しています。これらの変化は、因子IIおよびXが維持されている状態で起こっており、播種性血管内凝固ではなくTICが優位な表現型であることを支持しています。これらのパラメータを同時に定量できる能力は、外傷後の止血調節不全を評価するための、トランスレーショナルに有用な枠組みを提供します。

このモデルの大きな強みは、外傷性出血の設定において生存率をアウトカムエンドポイントとして組み込んでいる点にあります。臨床的に意義のある救済戦略を検証するため、ヒトの外傷蘇生で使用される、あるいは研究されている2つの薬剤であるrhFVIIaとTXAの両方を評価しました。TXAは、出血量の減少、凝固障害およびフィブリン溶解活性の正常化において一貫した効果を示し、それが生存率の向上につながりました。対照的に、rhFVIIaは止血パラメータの過剰補正および不完全なフィブリン溶解制御に関連して、顕著な死亡率をもたらしました16。

これらの知見は、本モデルの重要な側面を浮き彫りにしています。つまり、生存は個々の止血経路の単独の改善ではなく、出血の重症度、凝固異常、および全身反応の複雑な相互作用によって左右されるということです。この出血モデルは、生化学的な止血パラメータと生存率の統合に対して感度が高く、後者は臨床現場における極めて重要な転帰決定因子となります。本システムでモデル化している主な損傷は重度の外傷性出血ですが、二次的な臓器損傷も転帰に寄与している可能性があります。本モデルを用いた先行研究では、rhFVIIa投与マウスにおいて肺微小血栓およびフィブリン沈着が観察され、死亡率の上昇と関連していたことから、血栓炎症性の臓器損傷が転帰に寄与している可能性が示唆されました16。

本研究では同時期のシャム手術群は含まれていないが、我々は以前、LLを伴わない開腹術ではTICが誘導されないことを示しており、TICに認められる特徴的な凝固異常を誘発するには、さらなる急速な失血（ショック）が必要であることが実証されている14.

本モデルの再現性には、いくつかの技術的な検討事項が重要である。肝損傷（LL）の範囲と部位は標準化されるべきである。なぜなら、切除される肝臓の量の変動は、出血の程度およびそれに伴う凝固障害反応に大きな影響を及ぼす可能性があるからである。本プロトコルでは、左肝葉の約75%を切除し、損傷した肝臓の重量を体重で標準化することで、損傷の一貫性を客観的に測定している。また、観察期間中に外部への出血を防ぎ、腹腔内出血環境を維持するためには、迅速かつ確実な腹壁閉鎖が極めて重要である。正確な失血量を測定するためには、あらかじめ重量を測定したスポンジを、実験群間で同一の回収手順およびタイミングで一貫して回収する必要がある。これらの手順により、術者による変動を最小限に抑えることができる。初期失血量の差は、その後の凝固障害や生存率に影響を与える可能性があるため、これらのステップは特に重要である。閉腹前に過剰な出血が発生した場合や、外部に血液が漏出した場合は、その個体を解析から除外すべきである。

このモデルの限界は、臓器損傷に焦点を当てている点であり、長管骨骨折や軟部組織の圧挫傷、その他の複雑なショック状態を含む多発外傷の不均一性を反映していないことです。しかし、この限定的な損傷は本モデルの意図的な特徴でもあり、複数の損傷形態によって導入される手順の複雑さや変動性を排除し、重度の出血およびTICの影響を研究することを可能にしています。結論として、このマウスLLモデルは、外傷関連の出血、TIC、および死亡率を研究するための、費用対効果が高く（大型動物研究と比較して）、堅牢で、拡張可能なアプローチを提供します。単純な小型齧歯類実験プラットフォームを、標準化された損傷、定量的な失血量測定、包括的な止血プロファイリング、および生存評価と組み合わせることで、本モデルは、より広範な器具を装着した外傷モデルに代わる実用的な選択肢となります。これにより、臨床的に関連のある文脈において、血液量減少、凝固（aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT）、線溶（Fibrinogen, PAP, D-dimer）、および生存エンドポイントの統合的な評価が可能となり、抗線溶剤や標的止血介入の評価に適しています。

開示事項

A.v.D.は、BioMarin、Regeneron、Pfizer、Bioverativ/Sanofi、CSL Behring、Novo Nordisk、Spark Therapeutics、Genentech、およびuniQureから、科学顧問委員会への参加、コンサルティング、および講演活動に対する謝礼を受け取っています。A.v.D.は、出血性合併症に対するsuperFVa治療法を開発しているバイオテクノロジー企業であるHematherix LLCの共同創設者です。B.C.J.、M.L.C.、およびR.M.には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

技術的な助言をいただいたLaurent Mosnier博士に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25G針BD Diagnostics305124
30G針BD Diagnostics305106
麻酔システムPatterson Scientific78915712
aPTT試薬 - STA-C.K. Prest. 5Stago597
オートクリップFine Science Tools12022-19
オートクリップアプリケーターFine Science Tools12020-09
オートクリップリムーバーFine Science Tools12023-00
ウシ血清アルブミンSigma Aldrich10735078001
塩化カルシウムFisher ScientificC79-500
キャピラリーチューブ – プレーンFisher Scientific22-260943
綿棒メディケ19-090-701
脱脂綿Fisher Scientific22-456-103
D-ダイマーELISAキットInvitrogenEEL094
デルタフェーズ等温パッドBraintree Scientific50-195-4663
エタノールFisher ScientificBP28184
EthiqaフィデリスSKU 072117
第II因子欠乏血漿Affinity BiologicalsFII-DP
第V因子欠乏血漿Affinity BiologicalsFV-DP
第VIII因子欠損血漿Affinity BiologicalsFVIII-DP
第X因子欠乏血漿Affinity BiologicalsFX-DP
ろ紙、極厚、7 cm × 8.4 cmFisher ScientificPI88605
グレーフェ鉗子Fine Science Tools11049-10
誘導チャンバーパターソン・サイエンティフィック78933385
注射用生理食塩水Hospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
イソフルランMed Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIIIDiapharma K822585
Liqui Vet ラピッド組織接着剤World Precision Instrument50-253-9340
マイクロビーズ滅菌器Fisher scientific14-955-342
マイクロチューブ – 1.5 mLFisher ScientificAM12400
マウスサイトカインマルチプレックスキットQuansys Biosciences 111049MS-13P
PAP複合体アッセイキットBio-TechneNBP3-06903
ポビドンヨードMed Vet International50-283-2277
組換えヒト活性化第VII因子Novo Nordisk0169-7001
クエン酸ナトリウムFisher ScientificS279-500
手術用ドレープStoelting10-000-695
外科用プラットフォーム equaflow マウス用5系統麻酔マニホールドPatterson Scientific78919268
手術用鋏Fine Science Tools91405-11
テープFisher Scientific15-901-5R
TAT複合体アッセイキットSiemens Healthineers23-044-704
トロンビンInvitrogenPIRP43100
トラネキサム酸Auromedics55150-0188-10
トリマーStoelting10-000-792
WAG活性炭ろ過システムパターソン・サイエンティフィック78909457
量り皿Fisher Scientific01-549-752

参考文献

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