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方法論記事

マウスにおけるガイドワイヤー誘発性大動脈弁狭窄モデルの最適化プロトコル

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DOI:

10.3791/72218

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2026年8月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、C57BL/6マウスにおける最適化されたガイドワイヤー誘発性大動脈弁狭窄モデルについて詳述します。カスタム3Dプリント製血管支持プラットフォームを用いることで、正確な止血管理が可能となり、24時間生存率は95%（19/20）、4週間後のモデル作製成功率は全体で90%（18/20）に達しました。

要約

大動脈弁狭窄症（AVS）は、高齢化に伴い有病率が増加している主要な心血管疾患ですが、疾患組織の入手困難さがメカニズムの研究や治療法の開発を著しく制限しています。本プロトコルでは、制御された出血管理を通じてHondaガイドワイヤー誘発性弁損傷法を改良し、再現性のあるAVSマウスモデルを確立および最適化します。雌雄のC57BL/6マウスにガイドワイヤーによる大動脈弁損傷を誘発させます。この手順は、カスタム3Dプリントされた血管支持プラットフォームによって改良されており、ガイドワイヤーの挿入および抜去時の正確な出血制御を実現します。評価項目には、24時間の生存率、4週目の心エコー評価、および組織病理学的検証が含まれます。最適化されたプロトコルでは、24時間生存率95%（20匹中19匹）を達成しました。生存個体のうち94.7%（19匹中18匹）が4週時点で事前に定義された血行動態的成功基準を満たし、心エコーおよび組織学的解析で確認された総合的なモデル成功率は90%（20匹中18匹）となりました。この標準化されたモデルは、弁変性のメカニズム解明および候補となる治療介入の評価のための、信頼性と再現性の高いプラットフォームを提供します。

概要

心臓弁膜症は、人口の高齢化に伴い有病率が上昇しており、先進国と途上国の双方において依然として大きなヘルスケア上の負担となっています1。経カテーテル大動脈弁留置術（TAVI）は重症大動脈弁狭窄症の治療を一変させましたが2,3、弁変性を引き起こす細胞および分子メカニズムはまだ十分に解明されておらず、疾患の進行を遅らせる、あるいは逆転させるための承認された薬物療法は存在しません4,5。弁疾患研究における中心的な障害は、研究に利用可能な疾患組織が限られていることです6,7。ヒトの大動脈弁検体を十分な量で入手することは困難であり、病理学的な弁の変化を確実に再現できる動物モデルも同様に不足しています8。この乖離により、大動脈弁狭窄症（AVS）の血行動態的および組織学的特徴を再現する動物モデルの開発に向けた持続的な取り組みが進められてきました。

ApoE⁻/⁻マウスにおける長期的な高脂肪食負荷などの従来の食事アプローチでは、20～24週間を要し、かつ成功率も低く、決定的な狭窄表現型を示す動物はごく少数にとどまります9,10,11,12。Hondaらによって報告されたガイドワイヤー誘発性弁損傷モデルは、頸動脈経由で弁尖を機械的に損傷させることで、これらの欠点の多くを解消しました13。元の手法では、頸動脈の剥離、大動脈弁へのガイドワイヤーの逆行的な挿入、弁尖への繰り返しのスクラッチ、およびワイヤーの回転が行われ、これにより数日以内に急速な血行動態の変化が生じ、4週間までには安定した狭窄表現型が形成されます13,14,15,16。その相対的な迅速さと直接性から、Honda法は近年の心臓弁研究で広く採用されています。しかし、いくつかの重要な課題が残っています。手技の完全な詳細は文献に十分に記録されておらず、研究室間での標準化もなされていません。また、本モデルにおける周術期罹患率の主要な決定要因である止血管理の役割についても、体系的に論じられたことはありません。これらの不一致は再現性を低下させ、臨床へのトランスレータビリティを制限しています。

止血法の系統的な最適化によって、周術期の生存率とモデルの信頼性を有意に向上させることができるという仮説を立てました。本プロトコルでは、カスタム設計の3Dプリント血管支持プラットフォームを導入することで、Honda法をベースとした改良および標準化されたアプローチを提示します。このデバイスにより、頸動脈に対して縦方向の張力を調整可能となり、血管を圧迫することなく、ガイドワイヤーの挿入および抜去時の完全な一時的止血を実現できます。このアプローチを用いた最適化プロトコルでは、24時間生存率95%（20匹中19匹）を達成しました。また、生存個体のうち94.7%（19匹中18匹）が4週時点で定義済みの血行動態学的成功基準を満たし、モデル全体の成功率は90%（20匹中18匹）となりました。研究室間での再現性を高めるため、手順の詳細なステップバイステップのドキュメントを提供します。

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プロトコル

注記：本プロトコルに記載されているすべての動物実験は、「実験動物の飼育および使用に関するガイドライン」に従って実施され、西中国医院の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）の承認を得て行われました（プロトコル番号：20240311055）。全過程を通じて、雄のC57BL/6マウス（8～10週齢、約22～25 g）および雌のC57BL/6マウス（8～10週齢、約18～20 g）を使用しました。カスタム3Dプリント血管支持プラットフォームを含む、本プロトコルで使用したすべての材料、試薬、器具、ソフトウェア、およびカスタムデバイスは、材料表に記載されています。

1. 術前準備および外科的切開

  1. 100%酸素で気化させたイソフルラン（導入時は3%、維持時は1.5–2%）を用いてマウスを麻酔します。足指を挟んで足底逃避反射がないことを確認し、十分な麻酔深度にあることを検証してください。
    注意：イソフルランは揮発性麻酔薬です。有効な排気システムを備えた環境または換気の良い場所で使用し、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、施設の安全手順に従ってください。
  2. 両眼に眼軟膏を塗布します。37 °Cに維持された温度調節機能付きの手術台の上に、マウスを仰臥位で安置します。
  3. 除毛クリームを用いて頸部前方の脱毛を行い、手術部位を準備します。
  4. ポビドンヨード（またはクロルヘキシジン）と70%アルコール（または温めた滅菌生理食塩水）を3回交互に塗布して皮膚を消毒し、最後に消毒剤で仕上げます。
  5. 先制的な局所鎮痛のため、予定している切開線に沿って0.5%リドカインを皮下浸潤させます。
  6. 次に、マイクロシザースを用いて、気管正中線からわずかに右側に位置するように、頸部前方に縦方向の中央皮膚切開（約1.0–1.5 cm）を施します。
    注意：マイクロシザース、針、ガイドワイヤーなどの鋭利な器具は怪我の原因となります。慎重に取り扱い、使用済みの鋭利物は承認された廃棄容器に廃棄してください。

2. 血管の単離と縫合糸の配置

  1. 手術用実体顕微鏡下で、上層の筋膜および筋肉層を鈍的に剥離し、右総頸動脈（RCCA）を露出させる。迷走神経への機械的刺激を避けるよう注意しながら、RCCAを隣接する迷走神経および周囲の結合組織から慎重に分離する。
    注：乾燥を防ぐため、処置の間、唾液腺および露出した組織を温めた滅菌生理食塩水で湿らせておくこと。
  2. 6-0シルク縫合糸を用い、滑りにくい結び方でRCCAの遠位端を永久結紮する。
  3. RCCAの近位セグメントに6-0シルク縫合糸で緩いスリップノットを作成し、後のガイドワイヤー挿入時に使用できるよう締めずに置いておく。

3. プラットフォームの適用と動脈切開

注意：手術前に、3Dプリント製プラットフォームを酸化エチレン（EtO）ガスで滅菌し、十分にエアレーションを行ってください。また、すべての金属製手術器具はオートクレーブで滅菌してください。

注意：酸化エチレンは毒性、可燃性、および発がん性があります。EtO滅菌は承認された施設のみで使用し、十分なエアレーション時間を設け、機関の廃棄物処理手順に従ってください。

  1. 3Dプリントされた血管支持プラットフォームを、単離したRCCAセグメントの下に慎重に挿入し、逆V字型の頂点が血管の直下に位置するように配置します。
  2. あらかじめ配置した縫合糸を段階的に高い位置にあるサイドノッチに掛け、プラットフォームをゆっくりと調整してRCCAに縦方向の張力を加えます。
    注：逆V字型の頂点は、血管壁を圧迫せずに血管の湾曲に適合するように120°の角度で設計されています。動脈の拍動が視覚的に感知できなくなった正確な時点で、張力を加えるのを停止してください。この重要な視覚的エンドポイントにより、血管への過剰な損傷を与えずに一時的な止血が確保されます。
  3. マイクロシザーを用いて、安定化したRCCAセグメントに小さな横方向の動脈切開（血管周囲の約半分）を行います。張力が正しく設定されていれば、出血は最小限であるか、あるいは全く起こらないはずです。

4. ガイドワイヤーの挿入と弁損傷

  1. 顕微鏡下で、ガイドワイヤー（直径0.014 inch / 0.36 mm）を、横方向の動脈切開部から大動脈根に向かって逆行性に動脈腔内へ挿入する。
    注：この口径は、既報のガイドワイヤー損傷モデルにおける標準であり、マウス右総頸動脈（RCCA）の腔内径（~0.4–0.5 mm）に近く、ガイドワイヤー対血管比は約0.7–0.9となる。
    注意：ガイドワイヤーは血管や周囲組織を穿刺する可能性がある。視認下でゆっくりと進め、使用済みのガイドワイヤーは鋭利物または汚染外科廃棄物として廃棄すること。
  2. あらかじめ配置した近位のスリップノットを血管とガイドワイヤーの両方を囲むように締め、挿入部位の完全な止血を行う。スリップノットが固定されたら、血管の下から3Dプリントされたプラットフォームを慎重に除去する。
    注：挿入中に予期せぬ出血が発生した場合、またはガイドワイヤーの直径により過度な摩擦が生じた場合は、一時的にプラットフォームの位置を調整して止血を補助するか、プラットフォームの張力をわずかに緩めて血管腔を拡張させてから、再度挿入を試みる。
  3. ガイドワイヤーをRCCAを通じて、大動脈弓を越え、大動脈弁に向かって逆行性に慎重に進める。リアルタイム心エコーガイド下で、ガイドワイヤーの先端が大動脈弁を通過し、左心室に入ったことを確認する。
  4. 止血を維持するために近位のスリップノットを完全に締めた状態で、大動脈弁を横切るように100回のプッシュプル（前後の往復）動作を行い、続いて弁尖に対してガイドワイヤーを100回回転させることで、機械的な弁損傷を行う。
    注：100回のプッシュプルおよび100回の回転動作は、手技時間と、血行動態的に有意な狭窄を確実に誘導することとのバランスが最も適切であるとして、社内での広範な最適化を通じて設定された回数である。

5. ガイドワイヤーの抜去と創閉鎖

  1. 弁損傷の完了後、ガイドワイヤーを血管からゆっくりと引き抜く。
  2. 近位側のスリップノットを直ちに永久的な固定結節に変換し、近位側RCCAを結紮して、術後の出血を防止する。
  3. 皮膚切開部を5-0ナイロン縫合糸による結節縫合または外科用ステープラーで閉鎖する。
  4. 術後の非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は投与しない。本処置は無菌条件下で実施されるため、周術期の抗菌薬も投与しない。
  5. 動物を清潔で保温された回復用ケージに移し、完全に歩行が回復するまで継続的に観察する。

6. 超音波心エコーによる経弁血行動態の評価

  1. 手術後4週目に、生存しているすべてのマウスに対して心エコー検査を行い、大動脈弁狭窄症の重症度を評価する。
  2. 100%酸素に3%のイソフルランを混合した導入チャンバーに動物を入れ、麻酔を導入する。足底反射の消失を確認し、麻酔深度を確認する。化学脱毛クリームを用いて前胸壁の除毛を行う。角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼軟膏を塗布する。
  3. 麻酔をかけたマウスを温度調節機能付きのイメージングプラットフォームに仰臥位で移す。
  4. 心拍数を継続的にモニタリングするため、肢を表面心電図（ECG）電極に固定する。生理的な心拍数を450–550 beats per minの安定した範囲に維持するように、イソフルラン濃度（通常1.0–1.5%）を調整する。
  5. 前胸壁を清浄し、あらかじめ加温した音響カップリングジェルを十分に塗布する。
  6. Bモード画像の取得
    1. MX550Dトランスデューサー（40 MHz）を装着したVevo 3100超音波診断装置を使用し、B-Modeコントロールを押してリアルタイム2次元イメージングを開始する。
    2. トランスデューサーを左側胸骨傍の位置に配置し、左心室、大動脈弁、および上行大動脈の胸骨傍長軸像を取得する。深度、幅、および2Dゲインを最適化する。
  7. Mモードの取得および左心室の測定
    1. 胸骨傍長軸像から、M-Modeコントロールを押す。サンプリングラインを乳頭筋レベルの左心室に配置する。
    2. Startを押して取得を開始する。少なくとも3心周期にわたる安定したトレースが得られたら、Saveを押す。
    3. Vevo LABにおいて、LV Traceツールを使用して拡張末期および収縮末期の心内膜をトレースし、左心室内部径、前壁および後壁厚（LVAWd, LVPWd）、および左心室重量を記録する。
  8. トランスデューサーの位置と角度を調整し、大動脈弓の専用ビューを取得する。
    ​注：大動脈弁を通過する血流方向と超音波ビームを最適に一致させるため、この特定の大動脈弓ビューを取得することが正確な弁通過血流速度の測定に不可欠である。
  9. カラードプラ評価
    1. 大動脈弓ビューから、Colorコントロールを押す。カラーボックスを大動脈弁および上行大動脈近位部に配置する。
    2. エイリアシングを起こさずに収縮期ジェットが明確に表示されるよう、カラースケールとゲインを調整する。Startを押し、続いてSaveを押す。
  10. パルス波ドプラ速度測定
    1. PW Dopplerコントロールを押す。サンプルボリュームゲートをジェットの最も狭い点（ヴェナ・コントラクタ）に配置し、角度補正（<60°）を行う。
    2. Startを押してスペクトラムトレースを開始し、少なくとも3心周期が記録されたらSaveを押す。Vevo LABで、Peak Velocityツールを用いて弁通過最高速度を測定し、少なくとも3心周期の平均値を算出する。

7. 組織学的処理および大動脈根の染色

  1. 心エコー検査後、足底逃避反射の完全な消失を確認して、深い麻酔状態であることを確認する。AVMAの動物安楽死ガイドライン（2020年版）および施設で承認されたプロトコルに従い、二次的な安楽死方法として頚脱骨を行う。
    注意：動物の死骸、摘出した組織、および血液で汚染された材料は生物学的／動物廃棄物である。施設のバイオセーフティおよび動物施設規定に従って廃棄すること。
  2. 外科用マイクロ鋏を用いて開胸を行い、心臓を露出させる。
  3. 灌流針を左心室の心尖部に挿入し、冷たい滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全身循環をフラッシュする。肝臓と肺が白濁すれば、灌流が成功したことを示す。
  4. 心臓をそのまま摘出し、完全な固定を行うため、室温で4%パラホルムアルデヒド（PFA）に最低24時間浸漬させる。
    注意：パラホルムアルデヒドは毒性および刺激性がある。4% PFAは適切なPPEを着用し、化学薬品用ドラフト内で取り扱い、PFA廃棄物は有害化学廃棄物として廃棄すること。
  5. 固定した組織を自動組織処理機に移し、段階的なエタノール系列による脱水、次いでキシレンによる透徹、および65 °Cでのパラフィンワックス浸透を順次行う。
    注意：キシレンは可燃性および毒性があり、高温のパラフィンは火傷の原因となる。キシレンはドラフト内または承認された処理機内で取り扱い、キシレンを含む廃棄物は有害化学廃棄物として廃棄すること。
  6. 処理した心臓をパラフィンブロックに包埋する。
    注：包埋時の心臓の向きを正しく設定することが重要である。3つの弁尖のレベルにある大動脈根を横断的に切断できるよう、心臓を配置する。
  7. 回転式ミクロトームを使用し、3つの弁尖すべてが含まれるように、大動脈弁平面で4–5 µmの厚さの連続横断切片を作成する。切片をガラススライドに貼付し、室温で保存する。
  8. 選択したスライドに対してヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行い、組織形態、構造的リモデリング、および弁尖の厚さを評価する。
  9. 隣接する連続切片に対してVon Kossa染色を行い、弁尖内の暗褐色から黒色の鉱物沈着として識別される異栄養性石灰化を検出し、定量化する。

8. 偽手術手順

注：このセクションでは、シャム対照群の手順について説明します。シャム群のマウスには、大動脈ワイヤー損傷（AWI）群と同様に、麻酔、皮膚の処置、血管の露出、動脈切開、およびガイドワイヤーの逆行性挿入を行います。ガイドワイヤーは弁上レベルまで進めますが、大動脈弁を通過させず、機械的な弁損傷は行いません。

  1. ステップ1.1から1.5に従い、マウスを麻酔し、手術野を準備する。
  2. 実体顕微鏡下で、ステップ2.1に従い、鈍的剥離によって右総頸動脈（RCCA）を露出させる。
  3. 6-0シルク縫合糸を用いてRCCAの遠位端を永久結紮し、近位端に緩いスリップノットを配置する（ステップ2.2～2.3と同様）。
  4. ステップ3.1～4.2に従い、横方向の動脈切開を行い、ガイドワイヤーを挿入する。
  5. 超音波心臓検査のガイド下で、ガイドワイヤーを逆行方向に上行大動脈の弁上レベルまで進め、ガイドワイヤーの先端が大動脈弁を通過していないことを確認する。
    注意：ステップ4.4に記載されているプッシュ・プル動作や回転による弁損傷動作は行わないこと。ガイドワイヤーを抜去し、直ちにステップ5.1～5.2に従い近位RCCAを結紮する。
  6. 断続的な5-0ナイロン縫合糸または皮膚ステープラーを用いて皮膚切開部を閉鎖する。
    注意：AWI群と同様に、術中鎮痛はリドカインの局所浸潤（ステップ1.5）により行う。動物を加温した回復ケージに移し、完全に歩行可能になるまで観察する。
  7. Shamマウスに対しても、AWI群と同様の術後モニタリング、4週時点での超音波心臓検査による評価、および組織学的処理を行う。

9. 統計解析および研究デザイン

  1. 本研究では、マウス20匹（オス10匹、メス10匹）にAWI処置を、C57BL/6マウス6匹（オス3匹、メス3匹）にSham処置を施した。
  2. 生存したすべての個体（AWI群19匹、Sham群6匹）において、最大経弁膜速度（モデル作成成功の判定基準）を測定する。
  3. あらかじめ規定した、性別比を等しくしたAWIマウス6匹（オス3匹、メス3匹）のサブグループにおいて、詳細な心エコー指標および組織学的指標を解析する。
  4. すべての心エコーおよび組織学的測定は、群割り付けを知らされていない研究者が行うようにする。
  5. パラメトリック検定を行う前に、Shapiro-Wilk検定を用いてデータの正規性を評価する。2つの独立した群（AWI群 vs. Sham群）の比較には、非対応の二方向Student's t-testを用いる。
  6. Kaplan-Meier法を用いて生存データを解析し、表示する。
  7. すべての解析はGraphPad Prismで実施する。データは平均値 ± SEMで示し、p < 0.05を統計的に有意とみなす。

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結果

止血制御のための3Dプリントプラットフォームの開発

従来のガイドワイヤ誘発性AVSモデルにおける罹患および死亡の主因である術中出血に対処するため、3Dプリントによる血管支持プラットフォームが設計された（図1プラットフォームは、生体適合性（USPクラスVI/ISO 10993準拠）のある光硬化性樹脂を用い、光造形（SLA）方式の3Dプリントによって作製され、構造的な厚さは1.07 mmでした。プリント後、未硬化の樹脂を除去するためにパーツをイソプロピルアルコールで洗浄し、紫外線照射による後硬化を行いました。標準的なSLAシステムでプラットフォームを再現できるよう、完全な設計ファイル（.stp）を提供しています。このプラットフォームの頂点面は逆V字型になっており、頂角は 120° (図1A–B）、これは単離した右総頸動脈の湾曲に適合し、過度な壁圧迫を引き起こさない。複数の段階的なサイドノッチ

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ディスカッション

本プロトコルでは、安定し安全な大動脈弁狭窄症の動物モデルについて詳細に解説します。この手法の特徴は、総頸動脈へのガイドワイヤー挿入を容易にする補助プラットフォームにある点です。このプラットフォームは、生体適合性光硬化性樹脂を用いたステレオリソグラフィー（SLA）方式の3Dプリントにより作製されており（構造上の厚さは1.07 mm）、頂角120°の逆V字型の頂部を備えています。設計ファイル一式は、補足資料の.stpファイルとして無料で公開されています。このデバイスを用いることで、ガイドワイヤーの円滑な挿入が可能となり、術中の出血量を客観的に制御できるため、モデルマウスの短期および長期的な生存率を確保することができます。最初の報告以降、ガイドワイヤー誘発モデルはさらに改良および特性評価が進んでおり、損傷強度を調整して軽度から重度までの狭窄を再現する段階的な重症度バリアントの作成17や、術後合併症に関する最近の報告18などが行われています。本プロトコルは、これらの研究成果に基づき、術中出血への系統的な対処法を提示するものです。

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益または利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、非感染性慢性疾患・国家科学技術重大プロジェクト（2026ZD0554300）、中国国家自然科学基金（U23A20395, 82170375, 82500455）、四川省自然科学基金（2026NSFSC0552）、中央大学基礎研究基金、中国西蔵自治区科学技術プロジェクト（XZ202501ZY0120）、および四川大学華西病院「1.3·5」プロジェクト（ZYGD23021, 23HXFH009）の支援を受けて行われました。また、小動物超音波検査にご協力いただいたQipu Feng氏（四川大学華西病院動物実験センター）に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3Dプリント血管支持プラットフォーム特注品N/A特注3Dプリント血管支持プラットフォーム。補足のCADファイルを.stp形式で提供。
4% パラホルムアルデヒドServicebioG1101-3ML組織固定
5-0 ナイロン縫合糸Jinhuan MedicalF503結節縫合による皮膚閉鎖
6-0 シルク縫合糸Jinhuan MedicalRC411遠位RCCAの永久結紮および近位のスリップノット
超音波伝達ジェル（予熱済み）KepplerKL-250心エコー検査
生体適合性光硬化樹脂FormlabsRS-F2-BMCL-01特注3Dプリント血管支持プラットフォームの作製に使用したSLAプリント材料。
C57BL/6 マウス (8–10 週齢; オス 22–25 g, メス 18–20 g)GemPharmatechC57BL/6全工程で両性を使用し、標準条件下で飼育
酸化エチレンガス施設内滅菌設備N/A特注3Dプリント血管支持プラットフォームの滅菌。
FreeCADFreeCAD Project Association1.1.1.stpファイルからのCAD可視化および3D構造図の作成。
GraphPad PrismGraphPad Software9.0統計解析およびグラフ作成
ガイドワイヤー (直径 0.014-inch)Boston ScientificH749393071900機械的大動脈弁損傷
ヘマトキシリン・エオジン (H&E) 染色キットBeyotimeC0105S弁葉の形態および厚さの評価
イソフルランRWD Life ScienceR510-22-2導入 3%; 維持 1.5–2% (100% O2 中)
リドカインShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045切開部位への事前の局所浸潤麻酔 (0.5%, ステップ 1.5)
マイクロサージェリー用鋏RWD Life ScienceF11022-11皮膚切開、動脈切開、開胸
MX550D トランスデューサ (40 MHz)FUJIFILM VisualSonicsMX550D心エコー検査
Nair 除毛クリームNair255 g頸前部および胸壁の除毛用
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)ServicebioG4202-100ML灌流
回転式ミクロトームLeica BiosystemsRM2125 RTS4–5 µm での連続切片作成
実体顕微鏡（手術用）OlympusSZX7血管の分離およびマイクロサージェリー
Vevo 3100 高解像度超音波診断システムFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100心エコー検査
Von Kossa 染色キットServicebioG1043-20ML異栄養性石灰化の検出
キシレンNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209パラフィン処理中の組織透明化。

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