マウスにおけるガイドワイヤー誘発性大動脈弁狭窄モデルの最適化プロトコル

サマリー

本プロトコルでは、C57BL/6マウスにおける最適化されたガイドワイヤー誘発性大動脈弁狭窄モデルについて詳述します。カスタム3Dプリント製血管支持プラットフォームを用いることで、正確な止血管理が可能となり、24時間生存率は95%（19/20）、4週間後のモデル作製成功率は全体で90%（18/20）に達しました。

要約

大動脈弁狭窄症（AVS）は、高齢化に伴い有病率が増加している主要な心血管疾患ですが、疾患組織の入手困難さがメカニズムの研究や治療法の開発を著しく制限しています。本プロトコルでは、制御された出血管理を通じてHondaガイドワイヤー誘発性弁損傷法を改良し、再現性のあるAVSマウスモデルを確立および最適化します。雌雄のC57BL/6マウスにガイドワイヤーによる大動脈弁損傷を誘発させます。この手順は、カスタム3Dプリントされた血管支持プラットフォームによって改良されており、ガイドワイヤーの挿入および抜去時の正確な出血制御を実現します。評価項目には、24時間の生存率、4週目の心エコー評価、および組織病理学的検証が含まれます。最適化されたプロトコルでは、24時間生存率95%（20匹中19匹）を達成しました。生存個体のうち94.7%（19匹中18匹）が4週時点で事前に定義された血行動態的成功基準を満たし、心エコーおよび組織学的解析で確認された総合的なモデル成功率は90%（20匹中18匹）となりました。この標準化されたモデルは、弁変性のメカニズム解明および候補となる治療介入の評価のための、信頼性と再現性の高いプラットフォームを提供します。

概要

心臓弁膜症は、人口の高齢化に伴い有病率が上昇しており、先進国と途上国の双方において依然として大きなヘルスケア上の負担となっています¹。経カテーテル大動脈弁留置術（TAVI）は重症大動脈弁狭窄症の治療を一変させましたが^2,3、弁変性を引き起こす細胞および分子メカニズムはまだ十分に解明されておらず、疾患の進行を遅らせる、あるいは逆転させるための承認された薬物療法は存在しません^4,5。弁疾患研究における中心的な障害は、研究に利用可能な疾患組織が限られていることです^6,7。ヒトの大動脈弁検体を十分な量で入手することは困難であり、病理学的な弁の変化を確実に再現できる動物モデルも同様に不足しています⁸。この乖離により、大動脈弁狭窄症（AVS）の血行動態的および組織学的特徴を再現する動物モデルの開発に向けた持続的な取り組みが進められてきました。

ApoE⁻/⁻マウスにおける長期的な高脂肪食負荷などの従来の食事アプローチでは、20～24週間を要し、かつ成功率も低く、決定的な狭窄表現型を示す動物はごく少数にとどまります^9,10,11,12。Hondaらによって報告されたガイドワイヤー誘発性弁損傷モデルは、頸動脈経由で弁尖を機械的に損傷させることで、これらの欠点の多くを解消しました¹³。元の手法では、頸動脈の剥離、大動脈弁へのガイドワイヤーの逆行的な挿入、弁尖への繰り返しのスクラッチ、およびワイヤーの回転が行われ、これにより数日以内に急速な血行動態の変化が生じ、4週間までには安定した狭窄表現型が形成されます^13,14,15,16。その相対的な迅速さと直接性から、Honda法は近年の心臓弁研究で広く採用されています。しかし、いくつかの重要な課題が残っています。手技の完全な詳細は文献に十分に記録されておらず、研究室間での標準化もなされていません。また、本モデルにおける周術期罹患率の主要な決定要因である止血管理の役割についても、体系的に論じられたことはありません。これらの不一致は再現性を低下させ、臨床へのトランスレータビリティを制限しています。

止血法の系統的な最適化によって、周術期の生存率とモデルの信頼性を有意に向上させることができるという仮説を立てました。本プロトコルでは、カスタム設計の3Dプリント血管支持プラットフォームを導入することで、Honda法をベースとした改良および標準化されたアプローチを提示します。このデバイスにより、頸動脈に対して縦方向の張力を調整可能となり、血管を圧迫することなく、ガイドワイヤーの挿入および抜去時の完全な一時的止血を実現できます。このアプローチを用いた最適化プロトコルでは、24時間生存率95%（20匹中19匹）を達成しました。また、生存個体のうち94.7%（19匹中18匹）が4週時点で定義済みの血行動態学的成功基準を満たし、モデル全体の成功率は90%（20匹中18匹）となりました。研究室間での再現性を高めるため、手順の詳細なステップバイステップのドキュメントを提供します。

プロトコル

注記：本プロトコルに記載されているすべての動物実験は、「実験動物の飼育および使用に関するガイドライン」に従って実施され、西中国医院の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）の承認を得て行われました（プロトコル番号：20240311055）。全過程を通じて、雄のC57BL/6マウス（8～10週齢、約22～25 g）および雌のC57BL/6マウス（8～10週齢、約18～20 g）を使用しました。カスタム3Dプリント血管支持プラットフォームを含む、本プロトコルで使用したすべての材料、試薬、器具、ソフトウェア、およびカスタムデバイスは、材料表に記載されています。

1. 術前準備および外科的切開

1. 100%酸素で気化させたイソフルラン（導入時は3%、維持時は1.5–2%）を用いてマウスを麻酔します。足指を挟んで足底逃避反射がないことを確認し、十分な麻酔深度にあることを検証してください。
   注意：イソフルランは揮発性麻酔薬です。有効な排気システムを備えた環境または換気の良い場所で使用し、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、施設の安全手順に従ってください。
2. 両眼に眼軟膏を塗布します。37 °Cに維持された温度調節機能付きの手術台の上に、マウスを仰臥位で安置します。
3. 除毛クリームを用いて頸部前方の脱毛を行い、手術部位を準備します。
4. ポビドンヨード（またはクロルヘキシジン）と70%アルコール（または温めた滅菌生理食塩水）を3回交互に塗布して皮膚を消毒し、最後に消毒剤で仕上げます。
5. 先制的な局所鎮痛のため、予定している切開線に沿って0.5%リドカインを皮下浸潤させます。
6. 次に、マイクロシザースを用いて、気管正中線からわずかに右側に位置するように、頸部前方に縦方向の中央皮膚切開（約1.0–1.5 cm）を施します。
   注意：マイクロシザース、針、ガイドワイヤーなどの鋭利な器具は怪我の原因となります。慎重に取り扱い、使用済みの鋭利物は承認された廃棄容器に廃棄してください。

2. 血管の単離と縫合糸の配置

1. 手術用実体顕微鏡下で、上層の筋膜および筋肉層を鈍的に剥離し、右総頸動脈（RCCA）を露出させる。迷走神経への機械的刺激を避けるよう注意しながら、RCCAを隣接する迷走神経および周囲の結合組織から慎重に分離する。
   注：乾燥を防ぐため、処置の間、唾液腺および露出した組織を温めた滅菌生理食塩水で湿らせておくこと。
2. 6-0シルク縫合糸を用い、滑りにくい結び方でRCCAの遠位端を永久結紮する。
3. RCCAの近位セグメントに6-0シルク縫合糸で緩いスリップノットを作成し、後のガイドワイヤー挿入時に使用できるよう締めずに置いておく。

3. プラットフォームの適用と動脈切開

注意：手術前に、3Dプリント製プラットフォームを酸化エチレン（EtO）ガスで滅菌し、十分にエアレーションを行ってください。また、すべての金属製手術器具はオートクレーブで滅菌してください。

注意：酸化エチレンは毒性、可燃性、および発がん性があります。EtO滅菌は承認された施設のみで使用し、十分なエアレーション時間を設け、機関の廃棄物処理手順に従ってください。

1. 3Dプリントされた血管支持プラットフォームを、単離したRCCAセグメントの下に慎重に挿入し、逆V字型の頂点が血管の直下に位置するように配置します。
2. あらかじめ配置した縫合糸を段階的に高い位置にあるサイドノッチに掛け、プラットフォームをゆっくりと調整してRCCAに縦方向の張力を加えます。
   注：逆V字型の頂点は、血管壁を圧迫せずに血管の湾曲に適合するように120°の角度で設計されています。動脈の拍動が視覚的に感知できなくなった正確な時点で、張力を加えるのを停止してください。この重要な視覚的エンドポイントにより、血管への過剰な損傷を与えずに一時的な止血が確保されます。
3. マイクロシザーを用いて、安定化したRCCAセグメントに小さな横方向の動脈切開（血管周囲の約半分）を行います。張力が正しく設定されていれば、出血は最小限であるか、あるいは全く起こらないはずです。

4. ガイドワイヤーの挿入と弁損傷

1. 顕微鏡下で、ガイドワイヤー（直径0.014 inch / 0.36 mm）を、横方向の動脈切開部から大動脈根に向かって逆行性に動脈腔内へ挿入する。
   注：この口径は、既報のガイドワイヤー損傷モデルにおける標準であり、マウス右総頸動脈（RCCA）の腔内径（~0.4–0.5 mm）に近く、ガイドワイヤー対血管比は約0.7–0.9となる。
   注意：ガイドワイヤーは血管や周囲組織を穿刺する可能性がある。視認下でゆっくりと進め、使用済みのガイドワイヤーは鋭利物または汚染外科廃棄物として廃棄すること。
2. あらかじめ配置した近位のスリップノットを血管とガイドワイヤーの両方を囲むように締め、挿入部位の完全な止血を行う。スリップノットが固定されたら、血管の下から3Dプリントされたプラットフォームを慎重に除去する。
   注：挿入中に予期せぬ出血が発生した場合、またはガイドワイヤーの直径により過度な摩擦が生じた場合は、一時的にプラットフォームの位置を調整して止血を補助するか、プラットフォームの張力をわずかに緩めて血管腔を拡張させてから、再度挿入を試みる。
3. ガイドワイヤーをRCCAを通じて、大動脈弓を越え、大動脈弁に向かって逆行性に慎重に進める。リアルタイム心エコーガイド下で、ガイドワイヤーの先端が大動脈弁を通過し、左心室に入ったことを確認する。
4. 止血を維持するために近位のスリップノットを完全に締めた状態で、大動脈弁を横切るように100回のプッシュプル（前後の往復）動作を行い、続いて弁尖に対してガイドワイヤーを100回回転させることで、機械的な弁損傷を行う。
   注：100回のプッシュプルおよび100回の回転動作は、手技時間と、血行動態的に有意な狭窄を確実に誘導することとのバランスが最も適切であるとして、社内での広範な最適化を通じて設定された回数である。

5. ガイドワイヤーの抜去と創閉鎖

1. 弁損傷の完了後、ガイドワイヤーを血管からゆっくりと引き抜く。
2. 近位側のスリップノットを直ちに永久的な固定結節に変換し、近位側RCCAを結紮して、術後の出血を防止する。
3. 皮膚切開部を5-0ナイロン縫合糸による結節縫合または外科用ステープラーで閉鎖する。
4. 術後の非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は投与しない。本処置は無菌条件下で実施されるため、周術期の抗菌薬も投与しない。
5. 動物を清潔で保温された回復用ケージに移し、完全に歩行が回復するまで継続的に観察する。

6. 超音波心エコーによる経弁血行動態の評価

1. 手術後4週目に、生存しているすべてのマウスに対して心エコー検査を行い、大動脈弁狭窄症の重症度を評価する。
2. 100%酸素に3%のイソフルランを混合した導入チャンバーに動物を入れ、麻酔を導入する。足底反射の消失を確認し、麻酔深度を確認する。化学脱毛クリームを用いて前胸壁の除毛を行う。角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼軟膏を塗布する。
3. 麻酔をかけたマウスを温度調節機能付きのイメージングプラットフォームに仰臥位で移す。
4. 心拍数を継続的にモニタリングするため、肢を表面心電図（ECG）電極に固定する。生理的な心拍数を450–550 beats per minの安定した範囲に維持するように、イソフルラン濃度（通常1.0–1.5%）を調整する。
5. 前胸壁を清浄し、あらかじめ加温した音響カップリングジェルを十分に塗布する。
6. Bモード画像の取得
   1. MX550Dトランスデューサー（40 MHz）を装着したVevo 3100超音波診断装置を使用し、B-Modeコントロールを押してリアルタイム2次元イメージングを開始する。
   2. トランスデューサーを左側胸骨傍の位置に配置し、左心室、大動脈弁、および上行大動脈の胸骨傍長軸像を取得する。深度、幅、および2Dゲインを最適化する。
7. Mモードの取得および左心室の測定
   1. 胸骨傍長軸像から、M-Modeコントロールを押す。サンプリングラインを乳頭筋レベルの左心室に配置する。
   2. Startを押して取得を開始する。少なくとも3心周期にわたる安定したトレースが得られたら、Saveを押す。
   3. Vevo LABにおいて、LV Traceツールを使用して拡張末期および収縮末期の心内膜をトレースし、左心室内部径、前壁および後壁厚（LVAWd, LVPWd）、および左心室重量を記録する。
8. トランスデューサーの位置と角度を調整し、大動脈弓の専用ビューを取得する。
   ​注：大動脈弁を通過する血流方向と超音波ビームを最適に一致させるため、この特定の大動脈弓ビューを取得することが正確な弁通過血流速度の測定に不可欠である。
9. カラードプラ評価
   1. 大動脈弓ビューから、Colorコントロールを押す。カラーボックスを大動脈弁および上行大動脈近位部に配置する。
   2. エイリアシングを起こさずに収縮期ジェットが明確に表示されるよう、カラースケールとゲインを調整する。Startを押し、続いてSaveを押す。
10. パルス波ドプラ速度測定
    1. PW Dopplerコントロールを押す。サンプルボリュームゲートをジェットの最も狭い点（ヴェナ・コントラクタ）に配置し、角度補正（<60°）を行う。
    2. Startを押してスペクトラムトレースを開始し、少なくとも3心周期が記録されたらSaveを押す。Vevo LABで、Peak Velocityツールを用いて弁通過最高速度を測定し、少なくとも3心周期の平均値を算出する。

7. 組織学的処理および大動脈根の染色

1. 心エコー検査後、足底逃避反射の完全な消失を確認して、深い麻酔状態であることを確認する。AVMAの動物安楽死ガイドライン（2020年版）および施設で承認されたプロトコルに従い、二次的な安楽死方法として頚脱骨を行う。
   注意：動物の死骸、摘出した組織、および血液で汚染された材料は生物学的／動物廃棄物である。施設のバイオセーフティおよび動物施設規定に従って廃棄すること。
2. 外科用マイクロ鋏を用いて開胸を行い、心臓を露出させる。
3. 灌流針を左心室の心尖部に挿入し、冷たい滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で全身循環をフラッシュする。肝臓と肺が白濁すれば、灌流が成功したことを示す。
4. 心臓をそのまま摘出し、完全な固定を行うため、室温で4%パラホルムアルデヒド（PFA）に最低24時間浸漬させる。
   注意：パラホルムアルデヒドは毒性および刺激性がある。4% PFAは適切なPPEを着用し、化学薬品用ドラフト内で取り扱い、PFA廃棄物は有害化学廃棄物として廃棄すること。
5. 固定した組織を自動組織処理機に移し、段階的なエタノール系列による脱水、次いでキシレンによる透徹、および65 °Cでのパラフィンワックス浸透を順次行う。
   注意：キシレンは可燃性および毒性があり、高温のパラフィンは火傷の原因となる。キシレンはドラフト内または承認された処理機内で取り扱い、キシレンを含む廃棄物は有害化学廃棄物として廃棄すること。
6. 処理した心臓をパラフィンブロックに包埋する。
   注：包埋時の心臓の向きを正しく設定することが重要である。3つの弁尖のレベルにある大動脈根を横断的に切断できるよう、心臓を配置する。
7. 回転式ミクロトームを使用し、3つの弁尖すべてが含まれるように、大動脈弁平面で4–5 µmの厚さの連続横断切片を作成する。切片をガラススライドに貼付し、室温で保存する。
8. 選択したスライドに対してヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行い、組織形態、構造的リモデリング、および弁尖の厚さを評価する。
9. 隣接する連続切片に対してVon Kossa染色を行い、弁尖内の暗褐色から黒色の鉱物沈着として識別される異栄養性石灰化を検出し、定量化する。

8. 偽手術手順

注：このセクションでは、シャム対照群の手順について説明します。シャム群のマウスには、大動脈ワイヤー損傷（AWI）群と同様に、麻酔、皮膚の処置、血管の露出、動脈切開、およびガイドワイヤーの逆行性挿入を行います。ガイドワイヤーは弁上レベルまで進めますが、大動脈弁を通過させず、機械的な弁損傷は行いません。

1. ステップ1.1から1.5に従い、マウスを麻酔し、手術野を準備する。
2. 実体顕微鏡下で、ステップ2.1に従い、鈍的剥離によって右総頸動脈（RCCA）を露出させる。
3. 6-0シルク縫合糸を用いてRCCAの遠位端を永久結紮し、近位端に緩いスリップノットを配置する（ステップ2.2～2.3と同様）。
4. ステップ3.1～4.2に従い、横方向の動脈切開を行い、ガイドワイヤーを挿入する。
5. 超音波心臓検査のガイド下で、ガイドワイヤーを逆行方向に上行大動脈の弁上レベルまで進め、ガイドワイヤーの先端が大動脈弁を通過していないことを確認する。
   注意：ステップ4.4に記載されているプッシュ・プル動作や回転による弁損傷動作は行わないこと。ガイドワイヤーを抜去し、直ちにステップ5.1～5.2に従い近位RCCAを結紮する。
6. 断続的な5-0ナイロン縫合糸または皮膚ステープラーを用いて皮膚切開部を閉鎖する。
   注意：AWI群と同様に、術中鎮痛はリドカインの局所浸潤（ステップ1.5）により行う。動物を加温した回復ケージに移し、完全に歩行可能になるまで観察する。
7. Shamマウスに対しても、AWI群と同様の術後モニタリング、4週時点での超音波心臓検査による評価、および組織学的処理を行う。

9. 統計解析および研究デザイン

1. 本研究では、マウス20匹（オス10匹、メス10匹）にAWI処置を、C57BL/6マウス6匹（オス3匹、メス3匹）にSham処置を施した。
2. 生存したすべての個体（AWI群19匹、Sham群6匹）において、最大経弁膜速度（モデル作成成功の判定基準）を測定する。
3. あらかじめ規定した、性別比を等しくしたAWIマウス6匹（オス3匹、メス3匹）のサブグループにおいて、詳細な心エコー指標および組織学的指標を解析する。
4. すべての心エコーおよび組織学的測定は、群割り付けを知らされていない研究者が行うようにする。
5. パラメトリック検定を行う前に、Shapiro-Wilk検定を用いてデータの正規性を評価する。2つの独立した群（AWI群 vs. Sham群）の比較には、非対応の二方向Student's t-testを用いる。
6. Kaplan-Meier法を用いて生存データを解析し、表示する。
7. すべての解析はGraphPad Prismで実施する。データは平均値 ± SEMで示し、p < 0.05を統計的に有意とみなす。

結果

止血のための3Dプリントプラットフォームの開発

従来のガイドワイヤー誘発性AVSモデルにおける罹患率および死亡率の主因である術中出血に対処するため、3Dプリントによる血管支持プラットフォームが設計された（図1プラットフォームは、生体適合性のある（USP Class VI / ISO 10993準拠）光硬化性樹脂を用い、光造形法（SLA）によって作製されており、構造的な厚さは1.07 mmである。プリント後、未硬化の樹脂を除去するために部品をイソプロピルアルコールで洗浄し、紫外線下で後硬化させた。標準的なSLAシステムでプラットフォームを再現できるよう、完全な設計ファイル（.stp）を提供している。プラットフォームは、頂角が以下の逆V字型の頂面を備えている。 120° (図1A–B）、これは、過度な壁面圧迫を引き起こすことなく、単離した右総頸動脈の曲率に適合する。複数の段階的なサイドノッチ (図1C–D) 術者が事前に配置した縫合糸を締め、血管に調整可能な縦方向の張力を加えられるようにします。動脈の拍動が見えなくなるまで段階的に張力を高めます。この視覚的なエンドポイントは、十分な一時的止血が得られたことを示します。この手法により、血管壁への過剰な圧迫損傷を避けつつ、動脈切開およびガイドワイヤー挿入のための安定した術野を確保できます。

ガイドワイヤー留置位置の手術中確認

ガイドワイヤの適切な配置は、手技中の2つの段階で確認した。まず、実体顕微鏡下での直接視認により、ガイドワイヤが横方向の動脈切開部から逆行性にRCCA腔内へ挿入されることを観察した（Figure 2A）。次に、リアルタイム超音波心エコー図検査により、ガイドワイヤの先端が大動脈弁を通過して左心室に進入したことを確認した。Bモード画像では、大動脈弁平面を横切る高輝度の線状アーチファクトとしてガイドワイヤを特定した (Figure 2B)。カラードプラ法では、大動脈弁レベルで局所的な乱流が認められ、これによりガイドワイヤが弁尖を越えて配置されていることがさらに確認された（Figure 2C; Supplementary Video 1）。

周術期生存率およびモデル作製成功率

術中ワークフローへのテンション調整可能なプラットフォームの導入により、高い早期生存率が得られた。カプラン・マイヤー解析の結果、術後24時間における生存率は95%であった（マウス20匹中19匹；Figure 3A）。唯一の非生存個体の死後検査では、重大な出血、構造的損傷、または心筋虚血の証拠は認められず、死因は外科的外傷ではなく麻酔に関連する合併症によるものであることが示唆された。4週時点でのモデルの成功は、あらかじめ定義された基準（最高経弁流速が2,000 mm/sを超え、かつ組織学的所見による裏付けがあること）を用いて評価した。生存した19匹の動物のうち、18匹（94.7%）がこの閾値を満たし、全コホートにおける総合的なモデル成功率は90%であった（マウス20匹中18匹；Figure 3B）。結果は雌雄間で同等であり、24時間生存率は雄で10匹中9匹、雌で10匹中10匹であり、4週時点のモデル成功率は雌雄ともに10匹中9匹（90%）であった。術周期の唯一の死亡例は雄（麻酔関連）であり、唯一のモデル失敗例は生存した雌であった。

心エコーによる大動脈弁狭窄症の確定診断

術後4週目の経胸壁心エコー検査により、AWI群において重症大動脈弁狭窄症と一致する血行動態の変化が確認された。定量的な心エコー値は平均値 ± 標準誤差（SEM）で示している。左室機能およびリモデリングパラメータは、Shamマウス6匹およびAWIマウス6匹で解析し、最高経弁速度は生存したすべてのAWIマウスおよびSham対照群（n = 19 AWI, n = 6 Sham）で測定した。4週目における左室駆出率は、Sham対照群と比較してAWI群でわずかに低かったが（56.21 ± 1.15% vs. 61.57 ± 2.12%; p = 0.0503; Figure 3C）、統計的な有意差には至らなかった。パルスドプラ法による記録では、AWI群の経弁ジェット速度が著しく増加し、Sham対照群の 988.00 ± 126.24 mm/s に対して 2740.89 ± 104.10 mm/s に達した（Figure 3D）。定量解析の結果、Sham対照群と比較してAWI群で最高経弁ジェット速度が極めて有意に上昇していることが確認された（p < 0.0001; Figure 3E）。圧力負荷適応の早期相と一致して、AWI群では左室の同心性リモデリングが認められた。拡張期前壁厚は有意に増加したが（LVAWd 1.14 ± 0.02 vs. 0.96 ± 0.03 mm; p = 0.0016; Figure 3F）、拡張期後壁厚および左室重量は高値を示したものの、統計的な有意差には至らなかった（LVPWd 1.01 ± 0.12 vs. 0.76 ± 0.02 mm, p = 0.0650, Figure 3G; LV mass 124.51 ± 10.63 vs. 104.47 ± 2.45 mg, p = 0.0961, Figure 3H）。

弁のリモデリングおよび石灰化の組織病理学的検証

大動脈基部の組織学的検査により、心エコー図検査の結果が裏付けられた。定量的な組織学的値は平均 ± SEM として提示し、Sham群 6匹およびAWI群 6匹のマウスで分析した。AWI群の H&E 染色は、Sham対照群では見られなかった顕著な弁葉の肥厚と構造的乱れを明らかにした (Figure 3I)。定量的な形態測定により、Sham群と比較してAWI群で平均弁葉厚が有意に増加していることが確認された (p < 0.0001; Figure 3J)。Von Kossa 染色は、AWI群の肥厚した弁葉内に、濃褐色から黒色の鉱物沈着として認められる広範な異形成石灰化を示した。Sham対照群では鉱物沈着はほとんど認められなかった (Figure 3K)。定量的な画像解析により、Sham対照群と比較してAWI群で総石灰化面積 (µm²) が有意に増加していることが明らかになった (p < 0.0001; Figure 3L)。

図1: 4つの視点から見た3Dプリント血管支持プラットフォームの設計。 (A) 前左斜視図。 (B) 後右斜視図。 (C) プラットフォーム全体の長手方向の形状を示す側面図。 (D) 逆V字型の頂点領域を強調した斜視図。コンポーネントラベル：110、プラットフォーム本体；120、側腕；121、段階的なサイドノッチ；130、操作端；140、逆V字型挿入頂点；150、血管接触支持面；160、隣接するノッチ間の遷移勾配；190、右総頸動脈（RCCA）。このプラットフォームは生体適合性光硬化樹脂で製作されている（構造厚：1.07 mm）。3D構造図は、無料のオープンソースCAD可視化およびモデリングソフトウェアであるFreeCADを用い、血管支持プラットフォームの元のCAD設計ファイル（.stp）から著者によって作成された。第三者の出版物や著作権で保護された図面は適応させていない。元のCAD設計ファイルは補足ファイルとして利用可能である。こちらのリンクから、この図の拡大版を表示してください。

図 2: ガイドワイヤ留置の術中および心エコーによる確認。 (A) 実体顕微鏡下の直接視認下で、横方向の動脈切開部から右総頚動脈 (RCCA) ルーメンへとガイドワイヤ（矢印）を逆行性に挿入している術中写真。(B) ガイドワイヤ（高エコーの線状アーチファクトとして識別；矢印）が大動脈弁を通過して左心室に入っていることを示すBモード心エコー画像。(C) 大動脈弁レベルでの局所的な乱流を示し、弁葉を横切るガイドワイヤの留置を確認したカラードプラ心エコー画像。ガイドワイヤ留置中の経弁流のリアルタイム・カラードプラ可視化は、補足ビデオ 1に示されている。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 3: 最適化した大動脈ワイヤー傷害（AWI）モデルにおける生存率、血行動態、心室リモデリング、および組織病理学的転帰。(A) AWIマウス（n = 20）の24時間カプラン・マイヤー生存曲線。(B) 4週時点でのAWI群におけるモデル作成の成功（赤）と失敗（黒）（n = 20）。成功の定義は、最高経弁血流速度 > 2,000 mm/sとした。(C) 駆出率（EF; p = 0.0503）。(D) Shamマウス（左）およびAWIマウス（右）の代表的なパルス波（PW）ドップラー心エコー図。(E) 最高経弁血流速度（n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001）。(F) 左室前壁拡張末期厚（LVAWd; p = 0.0016）。(G) 左室後壁拡張末期厚（LVPWd; p = 0.0650）。(H) 左室心筋重量（p = 0.0961）。(I) 代表的なHE染色大動脈基部切片（Sham：左、AWI：右）。(J) 大動脈弁尖厚（p < 0.0001）。(K) 代表的なVon Kossa染色大動脈基部切片（Sham：左、AWI：右）。(L) 総カルシウム沈着面積（µm²; p < 0.0001）。スケールバー = 500 µm。すべての定量棒グラフにおいて、棒は平均値を、エラーバーは平均標準誤差（SEM）を表す。パネルC、E–H、J、およびLにおけるSham群とAWI群の定量比較は、非対応の2標本t検定を用いて行った。定量データはSham群およびAWI群（各群 n = 6）から得たものであるが、パネルEの最高経弁血流速度のみ、生存したすべてのAWIマウスおよびSham対照群（n = 19 AWI, n = 6 Sham）で測定した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足ビデオ 1：ガイドワイヤー留置中の経弁血流のカラードップラー心エコー可視化。 このビデオでは、AWIの手技中における大動脈弁レベルでのリアルタイム・カラードップラー画像を示しており、弁葉を横切るガイドワイヤーの留置によって誘発される局所的な乱流が示されています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本プロトコルでは、安定し安全な大動脈弁狭窄症の動物モデルについて詳細に解説します。この手法の特徴は、総頸動脈へのガイドワイヤー挿入を容易にする補助プラットフォームにある点です。このプラットフォームは、生体適合性光硬化性樹脂を用いたステレオリソグラフィー（SLA）方式の3Dプリントにより作製されており（構造上の厚さは1.07 mm）、頂角120°の逆V字型の頂部を備えています。設計ファイル一式は、補足資料の.stpファイルとして無料で公開されています。このデバイスを用いることで、ガイドワイヤーの円滑な挿入が可能となり、術中の出血量を客観的に制御できるため、モデルマウスの短期および長期的な生存率を確保することができます。最初の報告以降、ガイドワイヤー誘発モデルはさらに改良および特性評価が進んでおり、損傷強度を調整して軽度から重度までの狭窄を再現する段階的な重症度バリアントの作成¹⁷や、術後合併症に関する最近の報告¹⁸などが行われています。本プロトコルは、これらの研究成果に基づき、術中出血への系統的な対処法を提示するものです。

本プロトコルのいくつかのステップは、モデル誘導を成功させるために極めて重要であり、特に注意が必要です。第一に、3Dプリントプラットフォームを介して加えられる縦方向の張力の程度を正確に調整する必要があります。張力は、動脈の拍動が視覚的に感知できなくなるまでのみ増加させてください。張力が不十分な場合は、動脈切開中に出血が続き、過剰な張力は内皮損傷や血管破裂のリスクとなります。第二に、プラットフォームを取り除く前に、血管とガイドワイヤーの両方を囲む近位のスリップノットをしっかりと締め付けなければなりません。スリップノットの固定が不十分なまま早期にプラットフォームを外すことは、手技中の出血の最も一般的な原因となります。第三に、心エコーガイド下でガイドワイヤーが左心室に進入したことを確認することが不可欠です。この確認ステップがなければ、術者はガイドワイヤーが大動脈弁に正しく配置されているかを確信できず、不完全な損傷によってモデル作成に失敗することになります。

いくつかの一般的な合併症が予想され、その管理が可能です。ガイドワイヤー挿入中に出血が発生した場合は、処置を続行する前にプラットフォームを血管の下に再配置し、一時的な止血を再確立させる必要があります。頸動脈径が小さい動物では、プラットフォームの張力をわずかに緩めることで血管腔を広げ、ガイドワイヤーを挿入しやすくすることができます。本モデルには、結果を解釈する際に考慮すべきいくつかの限界があります。機械的なワイヤーによる損傷は急性の機械的および炎症性弁損傷を引き起こしますが、これはヒトの石灰化大動脈弁狭窄症を特徴づける慢性的な脂質駆動性の変性プロセスとは異なります^17,19,20,21。その結果、組織学的特徴は、弁葉の肥厚や異栄養性石灰化を再現しているものの、ヒトの疾患におけるすべての分子事象を完全に再現していない可能性があります。本プロトコールは、8～10週齢の雌雄C57BL/6マウスで開発および検証されましたが、他の系統や高齢動物への適用には独立した検証が必要です。頸動脈径や心臓解剖における性差が、手術の難易度や血行動態の結果に影響を与える可能性があるため、研究者はその後の解析において生物学的変数として性を報告することが推奨されます²²。さらに、右総頸動脈の永久結紮はこの処置に不可欠ですが、マウスではウィリス動脈輪が側副的な脳血流を供給するため、明らかな神経学的欠損は観察されませんでした。ただし、微細な認知能または脳血管への影響は排除できません。ベースライン（処置前）心エコー検査は実施されていません。同時に設定したシャム群を正常な弁機能の対照として用いましたが、個体内の比較を可能にし、C57BL/6マウスで報告されている稀な自然発症の大動脈弁異常（未改変系統で約0.3%）をスクリーニングするため、可能な場合はベースラインスキャンの実施が推奨されます。本研究では大動脈弁閉鎖不全症の系統的な評価は行っていません。損傷誘発性の大動脈弁閉鎖不全症の頻度および狭窄の重症度との関係については、専用の評価が必要であり、今後の課題として取り組む予定です。

本プラットフォームの潜在的なデメリットについても検討する必要があります。本デバイスは、頸動脈に沿って走行する迷走神経を含む隣接組織を機械的に刺激する可能性があります。このリスクは、プラットフォームの丸みを帯びた鈍いエッジ、血管に適合する120°の頂点、および短時間の適用時間によって最小限に抑えられており、本研究において本デバイスに起因する呼吸異常やその他の明らかな合併症は観察されませんでした。確立された代替アプローチと比較して、この最適化されたプロトコルにはいくつかの実用的な利点があります。ApoE⁻/⁻マウスを用いた食事モデルでは、20〜24週間の高脂肪食投与が必要であり、狭窄表現型にばらつきがあるため、多くの個体で血行動態的に有意な疾患が発現しません。本プロトコルでは、4週間以内に一貫した狭窄表現型を誘導でき、全体の成功率は90%（20匹中18匹）でした。従来のHondaガイドワイヤー法と比較して、本プロトコルの主な進歩は、3Dプリントされたプラットフォームによる術中出血の体系的な制御にあります。

ガイドワイヤー挿入中の出血は、従来の手技における合併症として認識されてきましたが、十分な対策が講じられてきませんでした。同研究室における従来の（プラットフォーム導入前の）処置の回顧的経験（400例以上）では、術中大出血が推定約40%の症例で発生し、出血後の死亡率は約60%、24時間生存率は約75%であり、主に頸動脈アクセス部位での出血が周術期死亡のほぼすべてを占めていました。これは、本モデルにおける周術期死亡の主因として頸動脈穿刺部位の出血を特定したQianらによる報告と一致しています。3Dプリントプラットフォームを用いて失血を制御することで、24時間生存率は95%まで向上し、本コホートでは出血に起因する死亡は観察されませんでした。出血がもはや制限要因ではなくなったため、機械的損傷の強度を変化させることで、段階的な狭窄重症度を作り出すことが可能になりました。この調整可能性は、直接的なトランスレーショナルな意義を持ちます。効果量が小さい治療薬候補の場合、より軽度なモデルでは治療に関連する差が不明瞭になる可能性があるため、その差を明らかにするには、より重度のベースライン損傷が必要となる場合があります。

このモデルは、いくつかの下流の調査カテゴリーに適しています。狭窄表現型が定義された再現可能な時間枠内で発現するため、弁の石灰化や線維化の抑制を目的とした候補薬物の前臨床評価プラットフォームとして活用できます²³。また、本モデルは遺伝学的アプローチとも互換性があり、C57BL/6背景のトランスジェニックマウスやノックアウトマウスにこのプロトコルを適用することで、弁疾患の進行における特定のシグナリング経路の寄与を解析することが可能です。さらに、4週間のエンドポイントは、疾患の進展や治療反応を連続的に心エコーでモニタリングするための実用的な期間を提供します。3Dプリントプラットフォームの設計ファイルは補足の.stpファイルとして自由に共有でき、このデバイスを研究室間で標準化することで、施設間の再現性がさらに向上することが期待されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dプリント血管支持プラットフォーム	特注品	N/A	特注3Dプリント血管支持プラットフォーム。補足のCADファイルを.stp形式で提供。
4% パラホルムアルデヒド	Servicebio	G1101-3ML	組織固定
5-0 ナイロン縫合糸	Jinhuan Medical	F503	結節縫合による皮膚閉鎖
6-0 シルク縫合糸	Jinhuan Medical	RC411	遠位RCCAの永久結紮および近位のスリップノット
超音波伝達ジェル（予熱済み）	Keppler	KL-250	心エコー検査
生体適合性光硬化樹脂	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	特注3Dプリント血管支持プラットフォームの作製に使用したSLAプリント材料。
C57BL/6 マウス (8–10 週齢; オス 22–25 g, メス 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	全工程で両性を使用し、標準条件下で飼育
酸化エチレンガス	施設内滅菌設備	N/A	特注3Dプリント血管支持プラットフォームの滅菌。
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	.stpファイルからのCAD可視化および3D構造図の作成。
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	統計解析およびグラフ作成
ガイドワイヤー (直径 0.014-inch)	Boston Scientific	H749393071900	機械的大動脈弁損傷
ヘマトキシリン・エオジン (H&E) 染色キット	Beyotime	C0105S	弁葉の形態および厚さの評価
イソフルラン	RWD Life Science	R510-22-2	導入 3%; 維持 1.5–2% (100% O2 中)
リドカイン	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	切開部位への事前の局所浸潤麻酔 (0.5%, ステップ 1.5)
マイクロサージェリー用鋏	RWD Life Science	F11022-11	皮膚切開、動脈切開、開胸
MX550D トランスデューサ (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	心エコー検査
Nair 除毛クリーム	Nair	255 g	頸前部および胸壁の除毛用
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	灌流
回転式ミクロトーム	Leica Biosystems	RM2125 RTS	4–5 µm での連続切片作成
実体顕微鏡（手術用）	Olympus	SZX7	血管の分離およびマイクロサージェリー
Vevo 3100 高解像度超音波診断システム	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	心エコー検査
Von Kossa 染色キット	Servicebio	G1043-20ML	異栄養性石灰化の検出
キシレン	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	パラフィン処理中の組織透明化。