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研究記事

ラット脳卒中後痙縮モデルにおけるモーションスタイル頭皮鍼治療が外嚢微細構造および脊髄反射の興奮性に与える影響

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DOI:

10.3791/72225

2026年8月7日

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、脳卒中後の痙縮ラットモデルにおけるモーションスタイルの頭皮鍼治療を説明し、行動学的、磁気共鳴画像法、組織学的評価、電気生理学的評価を用いて外部カプセルの微組織および脊髄反射の興奮性の変化を調査します。

要約

脳卒中後の痙縮(PSS)は、脳卒中後の運動機能と生活の質を著しく損なう。皮質-網様脊髄経路の障害および脊髄上下降抑制の障害は重要な病理学的メカニズムと考えられています。しかし、モーションスタイル頭皮鍼治療(MSSA)の治療効果の根底にある神経および微小構造的メカニズムは、まだ完全には解明されていません。本研究は、神経画像、電気生理学、組織学を統合したマルチモーダル評価を用いて、中大脳動脈閉塞のラットモデルにおいてMSSAがPSSに与える影響を調査することを目的としました。T2加重磁気共鳴画像法を用いて脳梗塞容積を定量化し、拡散テンソルイメージングを用いて外嚢白質の微細構造的完全性を評価しました。ルクソール・ファストブルー(LFB)染色は外部カプセル内のミエリンの完全性を評価し、H反射記録は脊髄反射の興奮性を評価しました。梗塞量、白質微細構造、脊髄反射の興奮性、痙縮の重症度との関係を調べる相関解析が行われました。MSSAは脳梗塞量を減少させ、外嚢の微小構造的損傷を緩和し、脱髄を軽減しました。さらに、MSSAは異常なH反射パラメータ、脊髄反射の興奮性の正規化、痙縮の減少を図りました。相関解析では、大きな梗塞は外嚢損傷の増加と関連し、より良好に保存された白質の完全性は脊髄反射調節の改善と軽度の痙縮と関連していることが示されました。これらの発見は、MSSAが虚血性脳損傷の減少、外嚢の微小構造の完全性の維持、皮質-網様脊髄経路に関連する下降抑制機能の改善を通じてPSSを緩和する可能性を示唆しており、その治療応用を支持する前臨床的証拠を提供しています。

概要

脳卒中後痙縮(PSS)は、虚血性脳卒中の蔓延し障害を伴う後遺症であり、臨床的には筋緊張の速度および長さに依存する増加によって定義されます。この疾患はしばしば異常な肢の姿勢や機能不全の運動パターンを引き起こし、患者の運動自立性や生活の質を著しく損なう一方で、世界中で経済的および介護者に大きな負担をもたらします1,2。上位運動ニューロン症候群の典型的な症状として、PSSの病因は主に脊椎伸縮反射の過度興奮性の亢進に起因します。神経解剖学的および神経生理学的研究が蓄積され、錐体外系から脊髄反射回路への下降抑制調節の喪失がPSSの開始と進行の主要な病理的メカニズムであることが示されており、皮質-網様脊髄経路がこの下降調節制御を媒介する主要な神経回路として機能していることが示されています。

ニードリング技術は鍼治療の効果を決定する重要な要素であり、臨床鍼治療の実践において重要な位置を占めています。モーションスタイル頭皮鍼治療(MSSA)は、頭皮鍼治療と同時進行の能動的または受動的な肢のエクササイズを組み合わせた、PSS介入のために特別に開発された独特のニードリング技術です。多くの臨床試験で、MSSAは脳卒中生存者において、痙性の重症度の軽減、運動機能の回復、日常生活活動の改善において頭皮鍼治療単独や運動リハビリテーション単独と比較して優れたアウトカムをもたらすことが示されています。6,7,8,9。以前の動物実験では、MSSAが従来の頭皮鍼治療よりも顕著な抗痙性効果をラットモデルで示しました。機構的には、これらの治療効果は虚血半節における脳灌流の改善、脊髄伸縮反射の興奮性の低下、脊髄前角運動ニューロンにおける塩化カリウム共輸送体2(KCC2)の発現増加と関連しています。この分子調節は脊髄γアミノ丁酸(GABA)の作動性阻害伝達をさらに促進し、痙縮の緩和に寄与する可能性があります10,11

MSSAの既存の機構的調査は限られており、錐体外下行経路内の上流脳内白質がPSSにどのように寄与するかを具体的に検証した先行研究はありません。外被膜は皮質-網状脊髄経路の重要な白質セグメントを形成します。この細胞は皮質被蓋線維を含み、脳幹網様状形成に皮質信号を伝達し、脊髄反射回路の脊髄上抑制制御に寄与します(12,13)。この解剖学的役割と整合して、複数のボクセルベースの病変-症状マッピング研究により、外被膜損傷は脳卒中後の上肢および下肢の痙縮と関連していることが示されています。これらの解剖学的および臨床的観察は、外部カプセルを主要な関心領域(ROI)として選択することを支持しています。これまでのところ、MSSAが外部カプセルの微細構造の完全性を維持できるか、またはそのような変化が脊髄反射の興奮性の変化と関連しているかを示す生体内での証拠はありません。行動評価、従来の磁気共鳴画像法(MRI)、電気生理学的検査に基づく臨床評価は相関分析のみを許可し、患者の異質性、疾患期間、その他の臨床交絡因子の影響を受けることがあります。これに対し、PSSの標準化されたラットモデルは、実験変数の厳密な制御と均一な介入プロトコルを可能にし、メカニズム的調査のための補完的なプラットフォームを提供します。

大脳白質の微細構造と神経生理学的機能に焦点を当て、本研究ではT2加重イメージング(T2WI)、拡散テンソルイメージング(DTI)、H反射電気生理学的記録、外部カプセルのターゲットLuxol Fast Blue(LFB)染色、行動評価などのマルチモーダル手法を統合しました。本研究は、構造・機能・行動の統合的相関枠組みを確立し、MSSA治療後の脳梗塞、外カプセル微細構造、脊髄反射の興奮性、痙縮の関係をラットモデルで調査することを目的とした。本研究結果は、MSSA後の外部カプセルの完全性の維持と脊髄反射の過興奮性低下との関連を支持する前臨床的証拠を提供するとともに、PSSリハビリテーションにおけるMSSAの翻訳応用の理論的基盤を提供することを目的としています。

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プロトコル

成虫オスの特定病原体フリー(SPF)Sprague–Dawley(SD)ラット40頭(体重240〜280g)が北京バイタルリバー動物技術実験技術から購入されました[ライセンス番号:SCXK (Jing) 2021-0011]。すべてのラットは北京中医薬大学の実験動物センターに収容され、室温は23°C±1°C、相対湿度は50%±5%、12時間の光と12時間の暗いサイクルで、食物と水は自由に利用されました。ラットは5日間の順応期間中、同時にトレッドミル運動による順応トレーニングを実施しました。動物たちは、取り扱いストレスを減らすために電気刺激なしで、1日1回、1分間10m/分の速度で15分間トレッドミルの順応を受けました。

前回の研究に基づくと、中大脳動脈閉塞法(MCAO)によるPSS誘導の成功率は約60%です15。乱数表を用いて、事前に9匹のラットを偽操作グループとして無作為に選びました。残りの31頭のラットはモデル設置に使われました。モデリングに成功した後、これらのラットはモデルグループとMSSAグループにランダムに分けられました。最終的に、各グループに9匹のラットが含まれました。この実験は実験動物福祉の3R原則に従って実施され、北京中医薬大学動物倫理委員会(BUCM 20250915-008)により承認されました。

モデル設立

MCAOモデルは、ラットを対象に改良された内潤フィラメント技術を用いて確立されました。ラットは誘導時に3%イソフルランで麻酔され、手術中は1.5%イソフルランを酸素で1L/分の一定流量で投与して麻酔を維持しました。頸椎の正中切開を行い、その後鈍的解離を施して右総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、内頸動脈(ICA)を露出させました。ナイロンモノフィラメント縫合糸(直径0.36 ± 0.02 mm)がECAを通じてICAに挿入され、動脈閉塞を達成するために中大脳動脈(MCA)の起点まで約18〜20 mm前進しました。血管は結紮され、切開部は閉じられました。その後、ラットは麻酔回復まで温熱パッドの上に置かれました。偽手術群のラットは、内管フィラメント挿入なしでCCA、ICA、ECAの同一の外科的曝露を受けました。

手術後、すべてのMCAOラットは標準化された術後ケアを受けました。動物は低体温症を防ぐため、最初の12時間は37°Cの温熱パッドで維持されました。手術切除部は3日間連続で毎日洗浄され、感染予防のために腹腔内注射でアンピシリン(100 mg/kg)が投与され、十分な栄養維持のために軟らかい食事が提供されました。術後1日目から10日目まで、一般的な活動量、食事摂取、創傷の状態、四肢運動機能が毎日モニタリングされました。

神経学的欠損は、グループ割り当てを盲検にした研究者がZea Longa神経学的欠損スコアを用いて評価し、筋緊張は修正アシュワース尺度(MAS)を用いて評価しました。評価は手術1日前(−1日目)、MCAO前手術当日(0日目)、および術後1日目、3日目、5日目、7日目、10日目に実施されました。術後3日目にZea LongaおよびMASスコア≥1のラットは、PSSモデルを成功裏に確立したと考えられました。

MSSA治療

介入は術後3日目から開始されました。頭皮鍼刺激部位は同側頭前側頭斜線(MS 6ライン)でした。頭 皮鍼治療の標準 化操作全国標準(GB/T 21709.2-2021)に従い、MS 6ラインはGV 21(千頂)からGB 6(玄利)まで伸びています。

使い捨て滅菌鍼(0.25×13mm)がGV 21の頭蓋膜上網下に、頭皮表面に対して約15°の斜めに挿入され、前頭頂側頭側頭斜線に沿ってGB-6に向かって約10mmの深さまで進みました。急速な回転操作(200回転/分)が1分間連続で適用されました。針保持15分後、同じ回転操作を1回繰り返し、合計30分の針保持時間となりました。針保持期間中、ラットは同時にトレッドミル運動を10 m/minの一定速度で行いました。

偽手術およびモデルグループのラットは鍼治療もトレッドミル運動も受けませんでした。非特異的な取り扱いや拘束ストレスをコントロールするため、MSSA群の1日の介入期間と一致し、非圧縮ストッキングホルダー内で1日30分間優しく扱い・拘束しました。

行動評価

神経学的欠損に関するゼア・ロンガスコア:

ラットの神経学的欠損はZea Longaスコアリングシステム16を用いて評価されました。適用された基準は以下の通りです:スコア0は神経障害なし、正常で制限のない運動を示し、スコア1の場合は、前肢または後肢が影響を受けた側の反対側に不完全伸展していることを示し、スコア2は移動中に反対側に向かって旋回していることを示しました。スコア3は歩行中に反対側に倒れたことを示し、スコア4は意識喪失で自発的な歩行がないことを示しました。

筋肉緊張のためのMAS:

筋緊張はMAS17を用いて評価されました。基準は以下の通りです:グレード0、筋緊張の増加なし;グレード1は筋肉の緊張がわずかに増加し、受動的な屈曲と伸展の終わりに一時的な引っかかりや最小限の抵抗が見られる;グレード1+、筋肉緊張の著しい増加、可動域の中間に一時的な引っかかり、後半に持続的な抵抗が続く;グレード2では筋緊張が顕著に増加し、ほとんどの動作範囲で抵抗が見られたが、四肢は容易に動かせる状態を保っていた。グレード3では、受動的な屈曲や伸展が困難になる筋緊張が大幅に増加しました。グレード4は関節の剛性による受動的動きの制限です。グレード1+には2点のスコアが割り当てられ、本研究では最大5点のMASスコアが与えられました。

脳梗塞容積の定量化のためのT2WI神経画像診断

すべてのT2WIスキャンは、ParaVision 360ソフトウェア(バージョン3.5)で操作されるPharmaScan MRIスキャナーで取得されました。T2加重ターボ急速取得とリラクゼーション強化(T2_TurboRARE、RARE/高速スピンエコー[FSE]とも呼ばれる)パルスシーケンスをMCAOラットに適用し、脳梗塞容積の定量化にしました。イメージングパラメータは次のように構成されました:繰り返し時間(TR)= 3000.0 ms、エコー時間(TE)= 33.0 ms、視野角(FOV)= 35.00 × 35.00 mm2、マトリックスサイズ = 250 × 250、スライス厚さ = 0.80 mm、スライス数 = 35、励起数(NEX)= 3.0、反転角(FA)= 180.0°。脳梗塞領域は、ITK-SNAPソフトウェア(バージョン4.4.0)で、信号強度の変化や虚血性梗塞と一致する形態的特徴を用いてグループ割り当てを盲目にした単一の研究者によって、スライスごとに手動で区画されました。その後、ソフトウェアによって脳梗塞容積が自動的に計算されました。

白質の微細構造的完全性評価のためのDTI神経画像診断

MRIデータは7.0 T PharmaScan磁気共鳴スキャナーを用いて取得されました。麻酔は3%イソフルランを圧縮空気中に投与(0.4–0.6 L/min)で誘導し、DTI取得中は1%イソフルランで維持されました。体温は画像診断中ずっとサーモスタティック制御の水浴で維持されました。

MRIスキャン中、まず三平面局在シーケンスを適用してラット脳を磁石内で位置特定しました。DTIは、軸方向単発スピンエコーエコー平面イメージングシーケンスを用いて実施され、以下のパラメータを含みました:TR/TE = 3000/27 ms、マトリックス = 90 × 75、FOV = 20 × 15 mm2、スライス厚さ = 0.7 mm、拡散勾配方向30、 b値 0および1000 s/mm2。DTI解析のために、ブレグマから1.3mm後方の脳スライスに関心領域を外部カプセルに描画しました。ParaVision 360ソフトウェアを用いて、分数異方性(FA)、平均拡散率(MD)、軸方向拡散率(AD)、放射拡散率(RD)のパラメトリックマップを再構築しました。データは、影響を受けた半球と反対側の健康な半球の比率として表されます。

ミエリン損傷および再髄化の評価のためのLFB染色

LFB染色は、外嚢の髄鞘化軸索の構造損傷を評価するために実施されました。ミエリン損傷は、ミエリンの稀薄化と真空化を特徴とし、ImageJソフトウェア(バージョン6.0;グレースケール閾値35–225)を用いて外部カプセル内のROI内のLFB染色ミエリン化線維の積分光学密度(IOD)を測定することで定量化されました。ラット脳立体走位アトラス18に基づき、各動物に対して外嚢の前後、中後部に相当するブレグマ+1.0 mm、−1.3 mm、−1.6 mmの3つの冠状切片を解析しました。3つの区画の平均IODは各動物を表すために計算されました(グループあたりn=4頭)。同側IOD値は対側に正規化され、パーセンテージ19で表されました。

脊髄反射の興奮性評価のための電気生理学的記録

脊髄単シナプスH反射は生物学的機能実験システムを用いて記録されました。ラットには、電気生理記録中の脊髄反射の興奮性を維持するため、α-クロラロース(50 mg/kg、腹腔内投与)で軽く麻酔されました。左坐骨神経は鈍的解離で露出され、電気刺激のために双極フック電極に置かれました。露出した神経には、組織の水分補給と神経の生存性を維持するために、油性ビタミン液が断続的に塗布されました。ステンレス製の記録電極が左後足の骨間筋に挿入され、尾には接地電極が置かれました。H反射は、パルス持続時間100μsの単極双極パルス刺激器を用いて誘発されました。H反射閾値および運動閾値(MT)は、漸進的な電気刺激を用いて測定され、電流は0.05 mA段階で最大強度3.0 mAに増加させ、不可逆的な末梢神経損傷を回避しました。

最大H反射(H最大)を引き起こすのと同じ刺激強度を用い、0.3Hz、5Hz、10Hzの異なる周波数のパルス刺激を投与し、異なる刺激周波数でのH反射振幅を得ました。0.3 Hzでの繰り返しパルス刺激を適用し、M波振幅が初期値の95%以内に留まっていることを検証しました。それ以外の場合は、データセットは破棄されました。H反射周波数依存減圧(FDD)は、5 Hzおよび10 HzにおけるH波/M波振幅比(H/M比)が0.3 Hz時の振幅比(H/M比)に対して割合を比べて計算され、0.3 HzのH/M比が基準基準10となりました。

データ分析

統計解析はSPSSソフトウェア(バージョン20.0)を用いて実施されました。連続データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価されました。一方移動分散解析(ANOVA)を用いて、従来の画像診断アウトカムおよびその他の定量的変数をグループ間で比較しました。分散の均質性が認められると、ボンフェローニの事後検定が行われました。それ以外の場合は、ダネットのT3検定が適用されました。行動データは、実験群と術後時刻を固定因子とした二元ANOVAを用いて分析した。スピアマン相関解析を用いて、研究変数間の関連性を評価しました。 p < 0.05の値は統計的に有意とされました。

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結果

MSSAは神経機能障害の改善

二元反復測定ANOVAでは、Zea Longa神経スコアにおいて時間(F[2.613, 62.71] = 315.3, p < 0.001)およびグループ(F[2, 24] = 142.9, p < 0.001)に有意な主効果が示され、Zea Longa神経スコアには時間×グループ相互作用(F[12, 144] = 99.94, p < 0.001)が示されました。手術の前日、偽手術群、モデル群、MSSA群の全ラットのZea Longaスコアは0であり、神経学的欠損なしに基線神経機能が完全なものであることを示しました。術後1日目から、Zea Longaスコアはモデル群とMSSA群の両方で徐々に上昇しました。術後1日目から5日目にかけてこれらの群間で有意な差は認められませんでした(p > 0.05)。介入を継続した結果、MSSA群のZea Longaスコアは術後7日目および10日目に...

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ディスカッション

伝統中国医学の観点から見ると、PSSは筋腱障害のカテゴリーに属し、脳損傷が根本原因であり、四肢の痙縮が表面的な症状であると説明されていますしたがって、治療戦略は一次脳病変と二次末梢症状の両方に対処すべきです。MSSAの根拠は、虚血性脳から痙攣性の四肢にかけての全体的な調整を重視し、血液循環促進、経絡の閉塞解除、腱の緩和、痙縮の緩和を治療目標としています。鍼治療の効果にとってはニードリング技術が中心であり、疾患のパターンに合わせた適切な治療法を選択することが、臨床的な良好な結果を得るために非常に重要です。MSSAは、PSSの特徴的な頭皮鍼治療法であり、頭皮鍼治療と針保持中の能動または受動的な手足の動きを組み合わせています。最近のシステマティックレビューおよびメタアナリシスでは、MSSAが従来の頭皮鍼治療や運動リハビリ単独と比較して、PSS患者において筋肉痙縮の軽減、運動機能の改善、日常生活活動の改善において優れた効果をもたらすこ...

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開示事項

利益相反:

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(助成金番号82405579)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
α-ChloraloseGoldBioC-118-250H反射記録のための麻酔薬
Absolute Ethanol北京通光精細化工有限公司VS104021-500 mL組織学的試薬
鍼(0.25 × 13 mm)北京中研泰和針具有限公司NA頭皮鍼用の使い捨て滅菌針
アンピシリン北京瑞大恒輝科技開発有限公司HD-3018-500g術後感染予防のための抗生物質
生理機能実験システム(BL420N)成都泰盟科技有限公司NA電気生理学的記録システム
拡散テンソル画像分析ソフトウェア(ParaVision 360)BrukerNAMRI撮影とDTI再構成
エコフレンドリーな脱蝋・清浄液ServicebioG1128-500ML組織学的試薬
全自動ロータリーマイクロトームLeica MicrosystemsRM2255組織切片
温熱パッド蘇州財楊電気加熱技術有限公司TT180×150-1XD術後の温度維持
ImageJ 6.0米国国立衛生研究所NA定量的画像解析
イソフルラン北京索莱宝科技有限公司I8000-25g吸入麻酔薬
ITK-SNAP 4.4.0ペンシルベニア大学NA脳梗塞の分割
Luxol Fast Blue溶液ServicebioG1030-100MLミエリン染色
モノフィラメントナイロン縫合糸(0.36 ± 0.02 mm)北京信濃科技有限公司NAMCAO誘導
パラホルムアルデヒド(PBS中の4%)ServicebioTBAB0102組織固定
PharmaScan 7.0 T磁気共鳴スキャナーBrukerNAMRI撮影
SPSS Statistics 20.0IBMNA統計分析
Sprague&ndash;Dawleyラット(SPF、雄)北京バイタルリバー実験動物技術有限公司NA実験動物
恒温制御水浴システム上海志信実験機器技術有限公司ZX-5AMRI中の温度維持
げっ歯類用トレッドミルCleverTreadScan順応およびMSSA中の運動トレーニング

参考文献

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