ラット脳卒中後痙縮モデルにおけるモーションスタイル頭皮鍼治療が外嚢微細構造および脊髄反射の興奮性に与える影響

サマリー

本プロトコルは、脳卒中後の痙縮ラットモデルにおけるモーションスタイルの頭皮鍼治療を説明し、行動学的、磁気共鳴画像法、組織学的評価、電気生理学的評価を用いて外部カプセルの微組織および脊髄反射の興奮性の変化を調査します。

要約

脳卒中後の痙縮(PSS)は、脳卒中後の運動機能と生活の質を著しく損なう。皮質-網様脊髄経路の障害および脊髄上下降抑制の障害は重要な病理学的メカニズムと考えられています。しかし、モーションスタイル頭皮鍼治療(MSSA)の治療効果の根底にある神経および微小構造的メカニズムは、まだ完全には解明されていません。本研究は、神経画像、電気生理学、組織学を統合したマルチモーダル評価を用いて、中大脳動脈閉塞のラットモデルにおいてMSSAがPSSに与える影響を調査することを目的としました。T2加重磁気共鳴画像法を用いて脳梗塞容積を定量化し、拡散テンソルイメージングを用いて外嚢白質の微細構造的完全性を評価しました。ルクソール・ファストブルー(LFB)染色は外部カプセル内のミエリンの完全性を評価し、H反射記録は脊髄反射の興奮性を評価しました。梗塞量、白質微細構造、脊髄反射の興奮性、痙縮の重症度との関係を調べる相関解析が行われました。MSSAは脳梗塞量を減少させ、外嚢の微小構造的損傷を緩和し、脱髄を軽減しました。さらに、MSSAは異常なH反射パラメータ、脊髄反射の興奮性の正規化、痙縮の減少を図りました。相関解析では、大きな梗塞は外嚢損傷の増加と関連し、より良好に保存された白質の完全性は脊髄反射調節の改善と軽度の痙縮と関連していることが示されました。これらの発見は、MSSAが虚血性脳損傷の減少、外嚢の微小構造の完全性の維持、皮質-網様脊髄経路に関連する下降抑制機能の改善を通じてPSSを緩和する可能性を示唆しており、その治療応用を支持する前臨床的証拠を提供しています。

概要

脳卒中後痙縮(PSS)は、虚血性脳卒中の蔓延し障害を伴う後遺症であり、臨床的には筋緊張の速度および長さに依存する増加によって定義されます。この疾患はしばしば異常な肢の姿勢や機能不全の運動パターンを引き起こし、患者の運動自立性や生活の質を著しく損なう一方で、世界中で経済的および介護者に大きな負担をもたらします^1,2。上位運動ニューロン症候群の典型的な症状として、PSSの病因は主に脊椎伸縮反射の過度興奮性の亢進に起因します。神経解剖学的および神経生理学的研究が蓄積され、錐体外系から脊髄反射回路への下降抑制調節の喪失がPSSの開始と進行の主要な病理的メカニズムであることが示されており、皮質-網様脊髄経路がこの下降^{調節制御を}媒介する主要な神経回路として機能していることが示^{されています。}

ニードリング技術は鍼治療の効果を決定する重要な要素であり、臨床鍼治療の実践において重要な位置を占めています。モーションスタイル頭皮鍼治療(MSSA)は、頭皮鍼治療と同時進行の能動的または受動的な肢のエクササイズを組み合わせた、PSS介入のために特別に開発された独特のニードリング技術^です。多くの臨床試験で、MSSAは脳卒中生存者において、痙性の重症度の軽減、運動機能の回復、日常生活活動の改善において頭皮鍼治療単独や運動リハビリテーション単独と比較して優れたアウトカムをもたらすことが示されています。6,7,8,9。以前の動物実験では、MSSAが従来の頭皮鍼治療よりも顕著な抗痙性効果をラットモデルで示しました。機構的には、これらの治療効果は虚血半節における脳灌流の改善、脊髄伸縮反射の興奮性の低下、脊髄前角運動ニューロンにおける塩化カリウム共輸送体2(KCC2)の発現増加と関連しています。この分子調節は脊髄γアミノ丁酸(GABA)の作動性阻害伝達をさらに促進し、痙縮の緩和に寄与する可能性があります^10,11。

MSSAの既存の機構的調査は限られており、錐体外下行経路内の上流脳内白質がPSSにどのように寄与するかを具体的に検証した先行研究はありません。外被膜は皮質-網状脊髄経路の重要な白質セグメントを形成します。この細胞は皮質被蓋線維を含み、脳幹網様状形成に皮質信号を伝達し、脊髄反射回路の脊髄上抑制制御に寄与します(^12,13)。この解剖学的役割と整合して、複数のボクセルベースの病変-症状マッピング研究により、外被膜損傷は脳卒中後の上肢および下肢の痙縮と関連していることが示^{されています。}これらの解剖学的および臨床的観察は、外部カプセルを主要な関心領域(ROI)として選択することを支持しています。これまでのところ、MSSAが外部カプセルの微細構造の完全性を維持できるか、またはそのような変化が脊髄反射の興奮性の変化と関連しているかを示す生体内での証拠はありません。行動評価、従来の磁気共鳴画像法(MRI)、電気生理学的検査に基づく臨床評価は相関分析のみを許可し、患者の異質性、疾患期間、その他の臨床交絡因子の影響を受けることがあります。これに対し、PSSの標準化されたラットモデルは、実験変数の厳密な制御と均一な介入プロトコルを可能にし、メカニズム的調査のための補完的なプラットフォームを提供します。

大脳白質の微細構造と神経生理学的機能に焦点を当て、本研究ではT2加重イメージング(T2WI)、拡散テンソルイメージング(DTI)、H反射電気生理学的記録、外部カプセルのターゲットLuxol Fast Blue(LFB)染色、行動評価などのマルチモーダル手法を統合しました。本研究は、構造・機能・行動の統合的相関枠組みを確立し、MSSA治療後の脳梗塞、外カプセル微細構造、脊髄反射の興奮性、痙縮の関係をラットモデルで調査することを目的とした。本研究結果は、MSSA後の外部カプセルの完全性の維持と脊髄反射の過興奮性低下との関連を支持する前臨床的証拠を提供するとともに、PSSリハビリテーションにおけるMSSAの翻訳応用の理論的基盤を提供することを目的としています。

プロトコル

成虫オスの特定病原体フリー(SPF)Sprague–Dawley(SD)ラット40頭(体重240〜280g)が北京バイタルリバー動物技術実験技術から購入されました[ライセンス番号:SCXK (Jing) 2021-0011]。すべてのラットは北京中医薬大学の実験動物センターに収容され、室温は23°C±1°C、相対湿度は50%±5%、12時間の光と12時間の暗いサイクルで、食物と水は自由に利用されました。ラットは5日間の順応期間中、同時にトレッドミル運動による順応トレーニングを実施しました。動物たちは、取り扱いストレスを減らすために電気刺激なしで、1日1回、1分間10m/分の速度で15分間トレッドミルの順応を受けました。

前回の研究に基づくと、中大脳動脈閉塞法(MCAO)によるPSS誘導の成功率は約60%です¹⁵。乱数表を用いて、事前に9匹のラットを偽操作グループとして無作為に選びました。残りの31頭のラットはモデル設置に使われました。モデリングに成功した後、これらのラットはモデルグループとMSSAグループにランダムに分けられました。最終的に、各グループに9匹のラットが含まれました。この実験は実験動物福祉の3R原則に従って実施され、北京中医薬大学動物倫理委員会(BUCM 20250915-008)により承認されました。

モデル設立

MCAOモデルは、ラットを対象に改良された内潤フィラメント技術を用いて確立されました。ラットは誘導時に3%イソフルランで麻酔され、手術中は1.5%イソフルランを酸素で1L/分の一定流量で投与して麻酔を維持しました。頸椎の正中切開を行い、その後鈍的解離を施して右総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、内頸動脈(ICA)を露出させました。ナイロンモノフィラメント縫合糸(直径0.36 ± 0.02 mm)がECAを通じてICAに挿入され、動脈閉塞を達成するために中大脳動脈(MCA)の起点まで約18〜20 mm前進しました。血管は結紮され、切開部は閉じられました。その後、ラットは麻酔回復まで温熱パッドの上に置かれました。偽手術群のラットは、内管フィラメント挿入なしでCCA、ICA、ECAの同一の外科的曝露を受けました。

手術後、すべてのMCAOラットは標準化された術後ケアを受けました。動物は低体温症を防ぐため、最初の12時間は37°Cの温熱パッドで維持されました。手術切除部は3日間連続で毎日洗浄され、感染予防のために腹腔内注射でアンピシリン(100 mg/kg)が投与され、十分な栄養維持のために軟らかい食事が提供されました。術後1日目から10日目まで、一般的な活動量、食事摂取、創傷の状態、四肢運動機能が毎日モニタリングされました。

神経学的欠損は、グループ割り当てを盲検にした研究者がZea Longa神経学的欠損スコアを用いて評価し、筋緊張は修正アシュワース尺度(MAS)を用いて評価しました。評価は手術1日前(−1日目)、MCAO前手術当日(0日目)、および術後1日目、3日目、5日目、7日目、10日目に実施されました。術後3日目にZea LongaおよびMASスコア≥1のラットは、PSSモデルを成功裏に確立したと考えられました。

MSSA治療

介入は術後3日目から開始されました。頭皮鍼刺激部位は同側頭前側頭斜線(MS 6ライン)でした。頭 皮鍼治療の標準 化操作全国標準(GB/T 21709.2-2021)に従い、MS 6ラインはGV 21(千頂)からGB 6(玄利)まで伸びています。

使い捨て滅菌鍼(0.25×13mm)がGV 21の頭蓋膜上網下に、頭皮表面に対して約15°の斜めに挿入され、前頭頂側頭側頭斜線に沿ってGB-6に向かって約10mmの深さまで進みました。急速な回転操作(200回転/分)が1分間連続で適用されました。針保持15分後、同じ回転操作を1回繰り返し、合計30分の針保持時間となりました。針保持期間中、ラットは同時にトレッドミル運動を10 m/minの一定速度で行いました。

偽手術およびモデルグループのラットは鍼治療もトレッドミル運動も受けませんでした。非特異的な取り扱いや拘束ストレスをコントロールするため、MSSA群の1日の介入期間と一致し、非圧縮ストッキングホルダー内で1日30分間優しく扱い・拘束しました。

行動評価

神経学的欠損に関するゼア・ロンガスコア:

ラットの神経学的欠損はZea Longaスコアリングシステム¹⁶を用いて評価されました。適用された基準は以下の通りです:スコア0は神経障害なし、正常で制限のない運動を示し、スコア1の場合は、前肢または後肢が影響を受けた側の反対側に不完全伸展していることを示し、スコア2は移動中に反対側に向かって旋回していることを示しました。スコア3は歩行中に反対側に倒れたことを示し、スコア4は意識喪失で自発的な歩行がないことを示しました。

筋肉緊張のためのMAS:

筋緊張はMAS¹⁷を用いて評価されました。基準は以下の通りです:グレード0、筋緊張の増加なし;グレード1は筋肉の緊張がわずかに増加し、受動的な屈曲と伸展の終わりに一時的な引っかかりや最小限の抵抗が見られる;グレード1+、筋肉緊張の著しい増加、可動域の中間に一時的な引っかかり、後半に持続的な抵抗が続く;グレード2では筋緊張が顕著に増加し、ほとんどの動作範囲で抵抗が見られたが、四肢は容易に動かせる状態を保っていた。グレード3では、受動的な屈曲や伸展が困難になる筋緊張が大幅に増加しました。グレード4は関節の剛性による受動的動きの制限です。グレード1+には2点のスコアが割り当てられ、^{本研究では}最大5点のMASスコアが与えられました。

脳梗塞容積の定量化のためのT2WI神経画像診断

すべてのT2WIスキャンは、ParaVision 360ソフトウェア(バージョン3.5)で操作されるPharmaScan MRIスキャナーで取得されました。T2加重ターボ急速取得とリラクゼーション強化(T2_TurboRARE、RARE/高速スピンエコー[FSE]とも呼ばれる)パルスシーケンスをMCAOラットに適用し、脳梗塞容積の定量化にしました。イメージングパラメータは次のように構成されました:繰り返し時間(TR)= 3000.0 ms、エコー時間(TE)= 33.0 ms、視野角(FOV)= 35.00 × 35.00 mm²、マトリックスサイズ = 250 × 250、スライス厚さ = 0.80 mm、スライス数 = 35、励起数(NEX)= 3.0、反転角(FA)= 180.0°。脳梗塞領域は、ITK-SNAPソフトウェア(バージョン4.4.0)で、信号強度の変化や虚血性梗塞と一致する形態的特徴を用いてグループ割り当てを盲目にした単一の研究者によって、スライスごとに手動で区画されました。その後、ソフトウェアによって脳梗塞容積が自動的に計算されました。

白質の微細構造的完全性評価のためのDTI神経画像診断

MRIデータは7.0 T PharmaScan磁気共鳴スキャナーを用いて取得されました。麻酔は3%イソフルランを圧縮空気中に投与(0.4–0.6 L/min)で誘導し、DTI取得中は1%イソフルランで維持されました。体温は画像診断中ずっとサーモスタティック制御の水浴で維持されました。

MRIスキャン中、まず三平面局在シーケンスを適用してラット脳を磁石内で位置特定しました。DTIは、軸方向単発スピンエコーエコー平面イメージングシーケンスを用いて実施され、以下のパラメータを含みました:TR/TE = 3000/27 ms、マトリックス = 90 × 75、FOV = 20 × 15 mm²、スライス厚さ = 0.7 mm、拡散勾配方向30、 b値 0および1000 s/mm²。DTI解析のために、ブレグマから1.3mm後方の脳スライスに関心領域を外部カプセルに描画しました。ParaVision 360ソフトウェアを用いて、分数異方性(FA)、平均拡散率(MD)、軸方向拡散率(AD)、放射拡散率(RD)のパラメトリックマップを再構築しました。データは、影響を受けた半球と反対側の健康な半球の比率として表されます。

ミエリン損傷および再髄化の評価のためのLFB染色

LFB染色は、外嚢の髄鞘化軸索の構造損傷を評価するために実施されました。ミエリン損傷は、ミエリンの稀薄化と真空化を特徴とし、ImageJソフトウェア(バージョン6.0;グレースケール閾値35–225)を用いて外部カプセル内のROI内のLFB染色ミエリン化線維の積分光学密度(IOD)を測定することで定量化されました。ラット脳立体走位アトラス¹⁸に基づき、各動物に対して外嚢の前後、中後部に相当するブレグマ+1.0 mm、−1.3 mm、−1.6 mmの3つの冠状切片を解析しました。3つの区画の平均IODは各動物を表すために計算されました(グループあたりn=4頭)。同側IOD値は対側に正規化され、パーセンテージ¹⁹で表されました。

脊髄反射の興奮性評価のための電気生理学的記録

脊髄単シナプスH反射は生物学的機能実験システムを用いて記録されました。ラットには、電気生理記録中の脊髄反射の興奮性を維持するため、α-クロラロース(50 mg/kg、腹腔内投与)で軽く麻酔されました。左坐骨神経は鈍的解離で露出され、電気刺激のために双極フック電極に置かれました。露出した神経には、組織の水分補給と神経の生存性を維持するために、油性ビタミン液が断続的に塗布されました。ステンレス製の記録電極が左後足の骨間筋に挿入され、尾には接地電極が置かれました。H反射は、パルス持続時間100μsの単極双極パルス刺激器を用いて誘発されました。H反射閾値および運動閾値(MT)は、漸進的な電気刺激を用いて測定され、電流は0.05 mA段階で最大強度3.0 mAに増加させ、不可逆的な末梢神経損傷を回避しました。

最大H反射(H最大)を引き起こすのと同じ刺激強度を_用い、0.3Hz、5Hz、10Hzの異なる周波数のパルス刺激を投与し、異なる刺激周波数でのH反射振幅を得ました。0.3 Hzでの繰り返しパルス刺激を適用し、M波振幅が初期値の95%以内に留まっていることを検証しました。それ以外の場合は、データセットは破棄されました。H反射周波数依存減圧(FDD)は、5 Hzおよび10 HzにおけるH波/M波振幅比(H/M比)が0.3 Hz時の振幅比(H/M比)に対して割合を比べて計算され、0.3 HzのH/M比が基準基準¹⁰となりました。

データ分析

統計解析はSPSSソフトウェア(バージョン20.0)を用いて実施されました。連続データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価されました。一方移動分散解析(ANOVA)を用いて、従来の画像診断アウトカムおよびその他の定量的変数をグループ間で比較しました。分散の均質性が認められると、ボンフェローニの事後検定が行われました。それ以外の場合は、ダネットのT3検定が適用されました。行動データは、実験群と術後時刻を固定因子とした二元ANOVAを用いて分析した。スピアマン相関解析を用いて、研究変数間の関連性を評価しました。 p < 0.05の値は統計的に有意とされました。

結果

MSSAは神経機能障害の改善

二元反復測定ANOVAでは、Zea Longa神経スコアにおいて時間(F[2.613, 62.71] = 315.3, p < 0.001)およびグループ(F[2, 24] = 142.9, p < 0.001)に有意な主効果が示され、Zea Longa神経スコアには時間×グループ相互作用(F[12, 144] = 99.94, p < 0.001)が示されました。手術の前日、偽手術群、モデル群、MSSA群の全ラットのZea Longaスコアは0であり、神経学的欠損なしに基線神経機能が完全なものであることを示しました。術後1日目から、Zea Longaスコアはモデル群とMSSA群の両方で徐々に上昇しました。術後1日目から5日目にかけてこれらの群間で有意な差は認められませんでした(p > 0.05)。介入を継続した結果、MSSA群のZea Longaスコアは術後7日目および10日目にモデル群よりも有意に低く(p < 0.001)、神経機能の改善を示しました(図1A)。

図1。モーションスタイルの頭皮鍼治療は、脳卒中後の痙性を持つラットの神経障害を改善し、筋緊張を低下させます。 (A) Zea Longa神経欠損スコアは、中大脳動脈閉塞前(MCAO;−1日目)、MCAO直前(0日目)、術後1日目、3日目、5日目、7日目、10日目に測定されます。(B) 対応する時点で測定された修正アシュワース尺度スコア。縦線はMCAOの0日目を示しています。データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。誤差バーはSDを表します。***p < 0.001 は括弧で示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

MSSAは脳梗塞量を減少させる

偽手術ラットは正常なT2WI所見を示し、脳全体で一様な実質信号強度を示しました。病理的な高信号、脳梗塞、形態異常、心室拡張は認められませんでした(図2A)。対照的に、モデル群は同側の大脳半球、すなわち虚血性梗塞領域に顕著なT2高信号を示し、さらに明らかな心室拡大も見られました(図2A)。定量的な形態計測解析により、MSSA群の脳梗塞容積はモデル群と比較して有意に減少していることが示されました(p < 0.001; 図2B)。MSSA介入は 図2Cに示されています。

図2。モーションスタイルの頭皮鍼治療は、脳卒中後の痙性ラットの脳梗塞量を減少させます。 (A) 偽手術、モデル、モーションスタイルの頭皮鍼(MSSA)グループからの代表的なT2加重イメージング(T2WI)画像(ブレグマに対して1.00、0.20、−0.92、−1.88mm)。(B)T2WIによる脳梗塞容積の定量化。個々のシンボルは個々の動物を表しています。(C) トレッドミル運動と同時に行われたMSSA介入の写真。データは平均±標準差として示されます。誤差バーは標準差を表しています。***p < 0.001 とモデルグループを比較しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

MSSAは脳卒中後の筋肉痙縮を軽減します

MASスコアでは、二方向反復測定ANOVAにより、時間(F[2.158, 51.79] = 183.7, p < 0.001)およびグループ(F[2, 24] = 57.68, p < 0.001)に有意な時間×グループ相互作用(F[10, 120] = 58.70, p < 0.001)の有意な主要効果が示されました。すべてのラットは手術前1日目および術後1日目にMASスコアが0を示し、痙攣のない正常なベースライン筋緊張を反映しました。術後3日目以降、モデル群とMSSA群でMASスコアが徐々に上昇し、脳卒中後の四肢痙縮の発症を示し、この時点で両群間で有意な差は認められませんでした。術後5日目から10日目にかけて、MSSA群のMASスコアはモデル群よりも有意に低く(p < 0.01から p < 0.001)、これはMSSAがPSSを緩和したことを示しています(図1B)。

MSSAは外部カプセルの白質の微細構造的完全性を保持します

代表的なDTIパラメータマップは図3Aに示されています。術後10日目には、偽手術群と比較してモデル群が外部カプセル内の分数異方性(rFA)比率(p < 0.001)に著しく減少しました。平均拡散係数(rMD)および放射拡散率(rRD)の比率が有意に増加した(p<0.001;図3C、D)。モデル群と比較して、MSSAはrFAを有意に増加させました(p < 0.001;図3B)およびrMDおよびrRDが有意に低下(いずれもp < 0.01;図3C、D)。両群間で軸方向拡散率(rAD)の比率に有意な差は認められませんでした(p > 0.05;図3E)。DTI取得時のラットの位置と外部カプセルROIの解剖学的位置は図3F,Gに示されています。

図3。モーションスタイルの頭皮鍼治療は、脳卒中後の痙縮を持つラットの拡散テンソルイメージングパラメータを変化させます。 (A) 偽操作、モデル、モーションスタイルの頭皮鍼(MSSA)グループからの代表的な分数異方性(FA)、平均拡散率(MD)、軸方向拡散率(AD)、放射拡散率(RD)マップ(bregmaに対して−1.30 mm)。(B–E)同側性FAと対側性FA(rFA)、MD(rMD)、RD(rRD)、AD(rAD)の比率の定量化。個々のシンボルは個々の動物を表しています。(F) 拡散テンソルイメージング(DTI)のために位置を取ったラットの写真。(G) 関心のある対側および同側の外部カプセル領域を示す回路図および対応する磁気共鳴画像。データは平均±SDとして示されています。誤差バーはSDを表しています。#p < 0.05および###p < 0.001と、偽操作群の比較;**p < 0.01 と ***p < 0.001 とモデルグループを比較します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

MSSAは外部カプセルのミエリンの完全性を向上させます

LFB染色は外部カプセルのミエリン完全性を評価するために実施されました。組織学的には、偽手術群ではミエリン化線維は形態と規則的な配置を保持したのに対し、MCAOモデルラットの外包では明らかなミエリン喪失と構造的乱れが観察されました(図4A)。定量解析の結果、モデル群のLFB染色の相対IODは偽手術群よりも有意に低かったことが示されました(p < 0.001; 図4B)。モデル群と比較して、MSSA群は相対的なIOD値(p < 0.001、 図4B)は、MSSA処理後の外包におけるミエリンの完全性の改善を示しています。

図4。モーションスタイルの頭皮鍼治療は、脳卒中後の痙性を持つラットの外カプセルミエリン損傷を軽減します。 (A) 偽手術、モデル、モーションスタイル鍼(MSSA)グループからの代表的なパノラマLuxol Fast Blue(LFB)染色脳切片および対側および同側外被膜領域(ROI)の拡大図。パノラマ画像の青い枠と赤いボックスは、それぞれ対側と同側のROIを示しています。拡大画像のスケールバー=50μm。(B) 対側に正規化された同側外部カプセルにおけるLFB染色の相対集積光学密度(IOD)の定量化。個々のシンボルは個々の動物を表し、 n = グループごとに4個です。データは平均±標準差として示されます。誤差バーは標準差 ###p < 0.001 と偽操作群を表しています。p < 0.001 対モデル群;△p <括弧で示された比較では0.05です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

MSSAは脊髄H反射の過興奮性を抑制します

代表的なM波およびH波の記録は図5Aに示されており、電気生理学的記録装置は図5Bに示されています。術後10日目の電気生理学的評価により、偽手術群と比較してモデル群が運動閾値(MT)を有意に増加させたことが示されました。p < 0.001)および最大H波/最大M波振幅比(p < 0.001)、M波遅延のわずかな増加(p < 0.05)、それに伴うH反射遅延の低下(p < 0.05;図5C–H)。モデル群と比較して、MSSA群はMTが有意に低く(p < 0.001)、H最大_対M最大比(p < 0.001)を示し、さらにH反射閾値が有意に高く(p < 0.001;図5C–H)。モデル群とMSSA群間で、MTの倍数で表されるH_maxを誘発するために必要な刺激強度に有意な差は観察されませんでした(図5H)。さらに、0.3 HzのH/M比に正規化すると、3グループすべてのグループでH反射FDDは刺激頻度の増加に伴い徐々に減少しました(図5I)。5 Hzおよび10 Hzの両方で、MSSA群のH/M比はモデル群よりも有意に低く(いずれもp < 0.001)、これはH反射FDDが生理的パターンに部分的に回復していることを示しています(図5J;表1)。

図5。モーションスタイルの頭皮鍼治療は、脳卒中後の痙縮を持つラットの脊髄反射過剰興奮を軽減します。 (A) 偽手術、モデル、モーションスタイルの頭皮鍼治療(MSSA)グループからの代表的な重ね合わせM波およびH波の痕跡。(B) 坐骨神経刺激部位、記録電極、接地電極を示す電気生理記録装置の写真。(C–H)運動閾値(MT)、最大H波/最大M波振幅比(H_max/M_max)、H波遅延、H反射閾値、M波遅延、そしてそれぞれMTの倍数_{で表される} 刺激強度の定量化。個々のシンボルは個々の動物を表しています。(I) 各グループで0.3 Hz、5 Hz、10 Hzの刺激周波数で得られた代表的なH反射トレース。(J) H反射の周波数依存低下(5 Hzおよび10 HzのH/M比を0.3 HzのH/M比に正規化)で表します。陰の領域は平均値の標準差を表します。データは平均標準差±表示されています。誤差バーはSD表<#p 0.05、###p <0.001と偽操作群の比較を示します。p < 0.001 対モデル群。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

グループ	MT(mA)	Mmax(mV)	Hmax(mV)	Mレイテンシ(ms)	Hレイテンシ(ms)	H反射閾値(MT)×MT)	Hmax(×MT)	H/M比(0.3 Hz)	H/M比(5 Hz)	H/M比(10 Hz)
シャム (n = 9)	0.808 ± 0.218	11.119 ± 7.802	2.804 ± 2.896	4.567 ± 0.731	11.311 ± 0.849	1.296 ± 0.251	1.554 ± 0.264	0.452 ± 0.264	0.304 ± 0.155	0.176 ± 0.137
モデル (n = 9)	1.855 ± 0.203###	3.282 ± 2.040##	2.307 ± 1.296	5.333 ± 0.893	10.456 ± 1.056	0.729 ± 0.299	1.517 ± 0.303	0.826 ± 0.120##	0.741 ± 0.129###	0.684 ± 0.131###
MSSAプログラム (n = 9)	0.663 ± 0.236	5.908 ± 2.751	1.497 ± 0.688	4.744 ± 0.590	10.978 ± 0.602	1.939 ± 0.819	1.832 ± 1.557	0.556 ± 0.238*	0.390 ± 0.193**	0.142 ± 0.134

表1:脳卒中後痙生ラットにおけるH反射の電気生理的パラメータ。 偽手術、モデル、モーションスタイルの頭皮鍼(MSSA)群から得られた電気生理学的測定値(運動閾値(MT)、最大M波振幅(M_max)、最大H波振幅(H_max)、M波レイテンシ、H波レイテンシ、MT(×MT)の倍数で表されるH反射閾値、H_max を引き起こす刺激強度などが含まれます刺激周波数0.3、5、10 Hzで測定されたMT(×MT)およびH/M比の倍数で表されます。データは平均±標準差(SD)として提示されます。##p < 0.01、###p < 0.001 に対し、偽操作群と比較されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 とモデルグループを比較しました。

T2WI梗塞体積、外嚢のDTI指標、電気生理指標、MASスコアの相関

まず、T2WIで測定された脳梗塞容積と外嚢のDTI指標との相関を調べました。プール解析では、梗塞容積はrFAと強い負の相関を示し(ρ = −0.902, p < 0.001)、rMDおよびrRDとも正の相関を示しました(ρ = 0.511, p = 0.03; ρ = 0.661, p = 0.003;図6A–D)。サブグループ解析では、梗塞容積とDTIパラメータの間に有意な相関は認められませんでした。次に、外嚢のDTI指標、脊髄反射興奮性の電気生理指標、MASが評価した筋緊張度の関係を評価しました。統合解析では、低いrFAはH_{最大比/M最大}比が高いこと(ρ = −0.895、p < 0.001)と関連し、rRDが高いほどH反射閾値が低くなること(ρ = −0.504、p = 0.03;図6E,F)。さらに、H_max/M_最大比が高いほど、H反射閾値が低いほどMASスコアも高くなっていました(ρ = 0.760、p < 0.001;ρ = −0.479、p = 0.01;図6G,H)。サブグループ解析では、モデル群でのみH反射閾値とMASスコアの間に有意な負の相関が認められました(ρ = −0.736、p = 0.03)一方、偽手術群やMSSA群では有意な相関は認められませんでした。

図6。脳梗塞容積、拡散テンソルイメージングパラメータ、H反射指数、筋緊張の関連性を、脳卒中後痙縮ラットのラットに示すこと。 (A–D)T2加重画像診断(T2WI)由来の脳梗塞容積と、それぞれ分数異方性(rFA)、平均拡散率(rMD)、放射拡散率(rRD)、軸方向拡散率(rAD)の同側対側比との関連。(E) rFAと最大H波/最大M波振幅比(H_max/M_max)との関連。(F) rRDとH反射閾値の関連。(G) H_max/M_max と修正アッシュワース尺度(MAS)スコアとの関連。(H)H反射閾値とMASスコアの関連。円、四角、三角形は、それぞれ偽手術、モデル、モーションスタイルの頭皮鍼(MSSA)グループを表しています。破線は測定データから生成される線形回帰フィッティング曲線に対応します。全体およびグループごとのスピアマン相関係数(ρ)と対応する p 値が各パネルに表示されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

データの利用可能性:

本研究で生成または分析されたすべてのデータは、本論文および補足資料に含まれています。本研究の調査結果を裏付ける生データセットは 補足表1に示されています。

補足表1。本研究で提示された定量的分析を支持する生データセット。 このワークブックには、行動評価、T2加重イメージング(T2WI)梗塞体積解析、拡散テンソルイメージング(DTI)指標、Luxol Fast Blue(LFB)染色定量、H反射電気生理学的測定に用いられた生の実験データが含まれています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

伝統中国医学の観点から見ると、PSSは筋腱障害のカテゴリーに属し、脳損傷が根本原因であり、四肢の痙縮が表面的な症状であると説明されています^。したがって、治療戦略は一次脳病変と二次末梢症状の両方に対処すべき^です。MSSAの根拠は、虚血性脳から痙攣性の四肢にかけての全体的な調整を重視し、血液循環促進、経絡の閉塞解除、腱の緩和、痙縮の緩和を治療目標としています。鍼治療の効果にとってはニードリング技術が中心であり、疾患のパターンに合わせた適切な治療法を選択することが、臨床的な良好な結果を得るために非常に重要です。MSSAは、PSSの特徴的な頭皮鍼治療法であり、頭皮鍼治療と針保持中の能動または受動的な手足の動きを組み合わせ^{ています。}最近のシステマティックレビューおよびメタアナリシスでは、MSSAが従来の頭皮鍼治療や運動リハビリ単独と比較して、PSS患者において筋肉痙縮の軽減、運動機能の改善、日常生活活動の改善において優れた効果をもたらすことが示されました。⁹。特に、MSSAで実施されている頭皮鍼治療と運動リハビリテーションの同時投与は、非同期介入よりも良好な転帰を生み出し、中程度の質の臨床エビデンスによって支持されています。MS 6はGB/T 21709.2-2021で定義される前頭頂側頭斜頭鍼治療ラインであり、その解剖学的関連性と確立された^{臨床的有用}性から選ばれました。これは一次運動皮質および二次運動皮質の上に重なり、これらは脳幹網様体出力を形成し脊髄反射の興奮性を調節する下行皮質野投射の主な源です。臨床的には、前述のメタアナリシスによって確認されたように、MS 6はPSSにおける最も一般的に用いられる頭皮鍼治療ラインであり、本研究における運動経路の調節に最適な標的となっています。これらの発見は、PSS管理におけるMSSAの独特な手技的特徴と潜在的な臨床的利点を強調しています。前臨床研究では、MSSAが虚血半影における脳灌流を改善し、脊髄前角運動ニューロンの興奮性を調節することが示されており、^{治療応用の}予備的なメカニズム的サポート^{を提供しています。}

現代の神経学理論では、PSSの病因は主に三つの相互に関連する病理過程に起因するとされています。すなわち、脊髄上下降抑制の障害、脊椎内信号処理の異常、そして内因性筋肉の特性の変化です。その中で、脊髄上下降経路が脊髄反射の興奮性を調節するメカニズムは、まだ完全には解明されていません².網様脊髄路(RST)は、伸縮反射弧のバランスを維持する上で重要な役割を果たします。外側RSTは対側前運動皮質および補助運動領域から皮質網様体経路を通じて興奮性入力を受け、脊髄の背外側小索内を下降し、脊髄伸縮反射活動に対して抑制的な制御を行使します。対照的に、内側RSTは対側皮質によって調節されず、腹内側小索内側を下り、伸縮反射活動を促進します。皮質脳卒中は皮質網様体経路を乱し、髄質網様形成への興奮性入力を減少させ、内側RST活動の優勢をもたらします。この不均衡は、脊椎の伸ば反射、過剰興奮性、そして四肢痙縮の臨床症状に寄与しています³.臨床神経画像研究では、PSSが前運動皮質、フタメン、内包の後肢、外包に関わる病変と関連付けられています^12,14,22.その中でも、外部カプセルは皮質-網状脊髄経路における重要な白質導管を担い、皮質入力や脳幹網様体核のシナプスを統合し、脊髄に投射してα運動ニューロンおよび介在ニューロンに対する下降抑制制御を行わせる主要な錐体外路です²³.この解剖学的枠組みは神経トレーシングやDTI研究によって支持されており、外部カプセルが大脳皮質、基底核、脳幹の主要な接続点であることが一貫して特定されています^23,24.特に、痙縮は単一の経路の機能障害ではなく、皮質脊髄および錐体外系の両方を含む複数の下行運動系間のバランスの乱れによって生じるネットワークレベルの障害として認識されつつあります。この文脈では、外部カプセルはPSSへの錐体外寄与を探る代表的な構造として機能します。なぜなら、その関与は一貫して脊柱反射の活動の誇張と関連している一方で、孤立した皮質脊髄病変は筋力低下を生じさせることが多いからです。したがって、痙縮の重症度に関連する白質の微細構造変化を調査する主要なROIとして外部カプセルを選定しました。この枠組みに沿って、偽手術群ではT2WIで明らかな脳梗塞は認められなかったが、モデル群では顕著な梗塞病変が観察された。MSSA治療はZea Longa尺度で神経機能を大幅に改善し、虚血性脳損傷に対する神経保護効果を示唆しました。MSSAの梗塞抑制効果には複数の相乗メカニズムが関与している可能性があります。まず、MSSAは虚血性半影における局所的な脳灌流を促進することが示されています¹⁰これにより、神経細胞の生存に有利な微小環境が生まれます。さらに、MSSAの直接的な証拠は現在限られていますが、頭皮鍼治療の機構的研究により、MATN2/WNT3a/β-カテニンシグナル伝達経路の活性化による血管新生促進など、他の経路も寄与している可能性が示唆されています²⁵ そしてRORγt媒介によるTh17分化の抑制とTh17/Tregバランスの回復による虚血後神経炎症の減衰²⁶.これらの発見は、MSSAが血行動態効果を超えた同様の神経保護機構を関与させる可能性を示唆しています。しかし、各経路の相対的な貢献度はまだ明らかにされておらず、さらなる調査が必要です。

DTIは白質微組織の感度の高い定量的評価を可能にし、FAは繊維の完全性を反映し、RDは脱髄のマーカーとして機能し、ADは軸索完全性を反映^します。本研究では、外部カプセルをROIとして選択し、PSSにおける皮質-網様脊髄経路に関連する微細構造的変化を評価する。偽手術群と比較して、モデルラットは相対的なFAの有意な減少と、MDおよびRDの相対的な増加を示し、これは白質の完全性の障害、脳浮腫、外部嚢内の脱髄を示唆しました。LFB染色はさらに、白質束のミエリン減少と組織の乱れを示し、DTIの所見を組織学的に支持しました。神経画像および組織学的所見を総合すると、虚血性損傷はMSSA治療後に軽減された外部カプセルの顕著な微細構造的障害と関連していることを示している。H反射は、脊髄α運動ニューロンプールの興奮性および脊髄上下降調節を評価するための確立された電気生理学的指標^です。H_max/_{M 最大} 比は脊髄運動ニューロンの全体的な興奮性を反映し、H反射閾値は脊髄介在ニューロンと統合された脊髄下行入力によって媒介されるシナプス前抑制を反映しています²⁷。脳卒中による皮質網様脊髄経路の障害は下降抑制調節を弱め、脊髄運動ニューロンの過剰興奮性を引き起こし、H_max/_M最大 比の増加とH反射閾値の低下を特徴^とする。予備実験ではMSSAの抗痙性効果の分子メカニズムを探り、この治療法が脊髄KCC2発現を上方調節しGABA作動性阻害機能を回復する可能性を示しました^。これらの脊椎分子的発見を基に、本研究は皮質-網様脊髄経路内の外嚢の微細構造的損傷が脊髄の興奮性の著しい増加と関連していることを示すことで、脊髄反射の過剰を引き起こす上流の機構をさらに明らかにします。これらの発見を総合すると、MSSAはPSSラットにおける脊髄上下降抑制経路の再建や脊髄反射過剰興奮性の逆行を促進する可能性があることを示唆しています。

本データの横断的性質を踏まえ、すべての相関分析は因果関係の証拠としてではなく、探索的かつ仮説形成的なものとして解釈されるべきです。梗塞負荷、外部カプセルの微細構造の完全性、脊髄反射の興奮性、痙縮の重症度との関係を調査するために相関解析が行われました。すべての動物において、梗塞体積が大きいほど、外部被膜内のDTI由来の微細構造的破壊がより重度であることが示唆されており、原発性虚血性損傷と皮質-網様脊髄経路に沿った二次白質変化との関連を示唆しています。特筆すべきは、これらの全体的な相関は主にグループ間の差異によって駆動され、個々のグループ内で有意な相関は観察されなかったことです。相対FA(rFA)が高いほどH最大_{比/M最大比は}低く、高い相対反発(rRD)はH反射閾値が低く、外部カプセルの完全性が保たれるほど効果的な下降抑制調節と関連しているという考えと一致しています。さらに、H_max/M最大比が高いとH反射閾値が低いほどMASスコアが高く、電気生理学的変化と痙縮の重症度との関連を支持しました。さらに、サブグループ分析では、全体的な相関パターンが主にグループ間の違いに起因していることが明らかになりました。特に、H反射閾値とMASスコアの間に有意な負の相関がモデル群でのみ観察されており、未治療の病理的状態下ではシナプス前抑制の障害が痙縮の増加と関連している可能性を示唆しています。

いくつかの制限点を認めておくべきです。第一に、鍼治療のみおよび運動のみの対照群が存在しないため、それらの独立的かつ相乗効果のある貢献を解明することが困難である。これらの比較群を取り入れた今後の研究は、統合介入のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。第二に、観察期間は急性期(術後0日から10日)に限定され、永久MCAOモデルの痙縮ピークウィンドウに基づいて選ばれました。MSSAが急性期を超えて持続的な治療効果をもたらすかどうかは不明であり、慢性PSSモデルでの検証はその長期的な翻訳可能性の判断に重要です。第三に、MASは筋緊張の評価に広く使われていますが、本質的に主観的かつ半量的です。この制限を補完するために、H反射は同時に脊髄反射の興奮性の客観的な電気生理学的測定値として評価されました。第四に、マルチモーダル評価に伴う技術的要求のためサンプル数が控えめであり、より多くの動物を含む研究は統計的検出力と結果の堅牢性を向上させるためです。最後に、すべてのエンドポイントは術後10日目のみ評価されました。複数の時点で縦断的評価を取り入れた今後の研究は、MSSA誘発性神経可塑性変化の時間的経路をより包括的に理解することができるでしょう。

今後の研究では、MSSA介入後の神経新生および再髄鞘化のメカニズムが調査される可能性があります。DTIは神経細胞再生を直接可視化できないため、神経トレーシングや免疫組織化学などの補完的なアプローチが神経細胞の可塑性や再髄化をさらに特徴付ける可能性があります。翻訳的観点からは、特にFAおよびRDなどの外部カプセルのDTI指標は、脳卒中の患者を皮質-網状脊髄損傷の重症度に基づいて階層化し、MSSAの恩恵を受けやすい患者を特定するのに役立つ可能性があります。このようなバイオマーカー駆動型アプローチは、将来の臨床試験で患者選択や治療層分けを促進する可能性がありますが、その臨床的有用性は前向き脳卒中コホートでの検証にはまだの課題です。結論として、本研究はT2WIに基づく梗塞評価、白質微細構造のDTI評価、H反射電気生理学、LFB組織学解析を含む統合フレームワークを用いて、PSSに対するMSSA治療に関連する神経機構を調査しました。研究結果は、MSSAが脳梗塞容積の減少、外部被膜の微小構造の保全、皮質-網様脊髄経路の下降抑制調節の改善と関連していることを示唆しています。これらの変化には脊髄反射の興奮性の正常化と痙縮の減少が伴いました。これらの発見は総合的に、PSS管理におけるMSSAの翻訳応用の可能性を支持する機構的洞察と前臨床的証拠を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
α-Chloralose	GoldBio	C-118-250	H反射記録のための麻酔薬
Absolute Ethanol	北京通光精細化工有限公司	VS104021-500 mL	組織学的試薬
鍼（0.25 × 13 mm）	北京中研泰和針具有限公司	NA	頭皮鍼用の使い捨て滅菌針
アンピシリン	北京瑞大恒輝科技開発有限公司	HD-3018-500g	術後感染予防のための抗生物質
生理機能実験システム（BL420N）	成都泰盟科技有限公司	NA	電気生理学的記録システム
拡散テンソル画像分析ソフトウェア（ParaVision 360）	Bruker	NA	MRI撮影とDTI再構成
エコフレンドリーな脱蝋・清浄液	Servicebio	G1128-500ML	組織学的試薬
全自動ロータリーマイクロトーム	Leica Microsystems	RM2255	組織切片
温熱パッド	蘇州財楊電気加熱技術有限公司	TT180×150-1XD	術後の温度維持
ImageJ 6.0	米国国立衛生研究所	NA	定量的画像解析
イソフルラン	北京索莱宝科技有限公司	I8000-25g	吸入麻酔薬
ITK-SNAP 4.4.0	ペンシルベニア大学	NA	脳梗塞の分割
Luxol Fast Blue溶液	Servicebio	G1030-100ML	ミエリン染色
モノフィラメントナイロン縫合糸（0.36 ± 0.02 mm）	北京信濃科技有限公司	NA	MCAO誘導
パラホルムアルデヒド（PBS中の4%）	Servicebio	TBAB0102	組織固定
PharmaScan 7.0 T磁気共鳴スキャナー	Bruker	NA	MRI撮影
SPSS Statistics 20.0	IBM	NA	統計分析
Sprague＆ndash;Dawleyラット（SPF、雄）	北京バイタルリバー実験動物技術有限公司	NA	実験動物
恒温制御水浴システム	上海志信実験機器技術有限公司	ZX-5A	MRI中の温度維持
げっ歯類用トレッドミル	Clever	TreadScan	順応およびMSSA中の運動トレーニング