卵巣摘出ラットにおける左帰丸による骨芽細胞・破骨細胞カップリングの調節：3×3要因設計研究

サマリー

本研究では、3×3要因子設計を用い、卵巣摘出ラットにおける閉経後骨粗鬆症に対する左帰丸の効果を評価しました。その結果、陰および陽の成分が骨代謝および関連するEphB4/ephrinB2経路マーカーに対して相乗効果を持つことが示されましたが、メカニズムに関する根拠は因果関係ではなく相関関係にとどまっています。

要約

閉経後骨粗鬆症は、エストロゲン欠乏に伴う骨形成と骨吸収の脱共役によって引き起こされます。本研究では、卵巣摘出ラットモデルを用いて、左帰丸の陰を養う部分処方の独立した効果および相互作用を定量化し、EphB4/ephrinB2/RhoA/アルカリフォスファターゼ経路との関連を検討しました。ARRIVE 2.0に基づき、130匹の特定病原体フリーの雌性Sprague-Dawleyラットを、3×3の要因設計による9群を含む計13群（n=10/群）に無作為に割り付けました。評価項目には、P1NP、CTX-1、二重エネルギーX線吸収法（DXA）で測定した大腿骨密度（BMD）、海綿骨組織学、および逆転写定量PCRとウェスタンブロッティングで測定したメッセンジャーリボ核酸およびタンパク質発現を含めました。全処方（I2A2）は、モデル群と比較してP1NPが高く、CTX-1が低く、BMDが高いことに関連していました。要因分析により、P1NPとBMDの間に陰陽の相互作用が認められ、薬理学的シナジーが裏付けられました。分子レベルの変化は、EphB4/ephrinB2/ALP発現の増加およびRhoA発現の減少に関連していました。これらの知見は、左帰丸による治療、骨表現型の改善、および経路マーカーの調節との関連を支持するものであり、因果的な経路依存性については、阻害剤、ノックダウン、および共培養による検証が必要です。

概要

閉経後骨粗鬆症（PMOP）は多くの女性に影響を及ぼし、エストロゲン欠乏に伴う骨形成と骨吸収のバランスの崩壊を特徴とする^1,2。EphB4/ephrinB2受容体-リガンド系は骨芽細胞と破骨細胞間の相互作用を媒介しており、EphB4シグナル伝達は骨芽細胞の分化およびアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を促進する一方で、ephrinB2のリバースシグナル伝達はRhoA関連のメカニズムを通じて破骨細胞形成を抑制し得る^3,4。エストロゲン欠乏骨におけるカップリング能の低下は、骨リモデリングの両細胞系に影響を与える介入策を評価するためのメカニズム的な根拠となる。

骨吸収抑制剤や骨形成促進剤を含む現在の骨粗鬆症治療は、骨折のリスクを低減させますが、長期使用における服薬コンプライアンス、コスト、禁忌、リバウンド効果、または有害事象によって制限される場合があります⁵。したがって、過剰な骨吸収を抑えつつ骨形成を改善させる候補治療法の開発は、科学的に重要な課題であり続けています。

左帰丸（ZGP; Zuo Gui Wan）は、骨の脆弱性と関連する理論的パターンである腎精不足に対して用いられる、中医学の古典的な多成分処方である。陰を養う成分には、Rehmannia glutinosa（熟地黄、24 g）、Dioscorea opposita（山薬、12 g）、Cornus officinalis（山茱萸、12 g）、Lycium barbarum（枸杞子、12 g）、Chinemys reevesiiの腹甲ゼラチン（鼈甲膠、12 g）、およびCyathula officinalis（牛膝、9 g）が含まれる。陽を補う成分には、Cuscuta australis（菟絲子、12 g）およびCervus elaphusの鹿角ゼラチン（鹿角膠、12 g）が含まれる。古典的な理論において、「陰中求陽」の原則は、陽を補う生薬が単なる独立した添加物として作用するのではなく、陰を養う基盤を増強させる可能性を示唆している。臨床的根拠および前臨床研究では、BMD、骨形成、および薬物動態挙動への影響を含む、ZGPまたはZGP含有介入の抗骨粗鬆症活性が報告されている^6,7,8,9,10。

本研究の新規性は、卵巣摘出（OVX）ラットを用いて、補陰成分と補陽成分を3×3の要因設計で形式的に分離し、骨表現型およびEphB4/ephrinB2/RhoA/ALP経路のマーカーを同時に評価した点にある。この設計は、処方全体または単一の比較対照のみを用いた研究よりも、方剤の配伍理論をより直接的に検証するものである。同時に、経路マーカーの変化は、メカニズム的に阻害またはサイレンシングされない限り、相関関係にとどまるという点も認識している¹。

プロトコル

本研究におけるすべての手順は、内モンゴル医科大学の動物実験委員会（承認番号：YKD202404105）によって承認され、ARRIVE 2.0¹²のガイドラインに準拠して実施されました。

研究デザイン

本研究は、内蒙古医科大学の動物実験プラットフォームで実施されました。2つの因子：滋陰基剤（I；3つの投与量レベル：0, 27, 54 g 生薬相当量）および壮陽処方（A；3つの投与量レベル：0, 8, 16 g 生薬相当量）を用いた3×3の完全要因計画法を適用し、9つの要因セルに4つの参照群を加えた設計としました。要因計画をTable 1に示します。I2A2は、臨床等価量における完全なZGP処方を表します。投与量の換算には体表面積法（ラット：ヒト係数 = 6.25）を用いました¹³。

動物、ランダム化、および盲検化

コンピューターで生成した乱数表を用いて、特定病原体のないSprague-Dawley系雌ラット130匹（6ヶ月齢、20–250 g）を割り付けた。割り付けコードは、アウトカム評価に関与しない研究者が順次封印された封筒に封入した。ラットは、2 ± 2 ^oC、湿度50–60%の条件下で、12時間の明暗サイクルにて、換気付きケージ1つにつき3～4匹で飼育した。水およびカルシウムとリンの含有量が記録された標準的な齧歯類用飼料を自由摂取させ、ケージ内での活動および環境エンリッチメントを提供した。分子アッセイ、組織学的スコアリング、画像定量化、およびデンシトメトリーは、割り付けについて盲検化された研究者が実施した。サンプルサイズは事前の検出力分析によって決定し、1群あたりn = 10とした。

OVXモデルおよび薬剤投与

精密気化器を用いて投与した吸入イソフルラン下で、両側卵巣摘出術（OVX）を実施した。酸素中で3–4%にて麻酔を導入し、ノーズコーンを通じて1.5–2.5%で維持した。足底逃避反射および眼瞼反射の消失と、安定した呼吸により、十分な麻酔深度を確認した。OVXの成功は、術後5日目における腟性発情周期の消失、および12週後のBMD低下によって評価した。モデルの妥当性を確認した後、8週間にわたり経口ゾンデ投与（1 mL/10 g/day）を行った。煎剤は、沸騰状態（100 °C、還流）での連続水抽出により作製した。まず10倍量で2時間、続いて8倍量で1.5時間抽出し、4層の医療用ガーゼでろ過後、減圧濃縮して粗薬濃度0.968 g/mLとした。濃縮抽出液は4 °Cで保存し、調製後7日以内に使用した。陽性対照として、駆心康顆粒（1.8 g/kg/day）およびジエチルスチルベストロール（0.04 mg/kg/day）を用いた。実験終了時、ラットを5%イソフルランで足底反射および角膜反射が消失するまで深く麻酔し、その後、放血および頸椎脱臼を行った。心拍および呼吸の停止により死亡を確認した。死骸および組織は生物学的廃棄物として、化学残留物は有害廃棄物として廃棄し、針やブレードは承認済みの鋭利物専用容器に廃棄した。

アウトカム評価項目

血清P1NPおよびCTX-1をサンドイッチELISA法（Jiyinmei社）により測定した。¹⁴大腿骨の骨密度（BMD）はDXAで定量化した。海綿骨の組織学的評価は、ヘマトキシリン・エオジン染色を用い、20倍の倍率で実施した。遺伝子発現は、2-^{-ΔΔCt値（サイクルしきい値）} 法を用い、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）で標準化した。タンパク質発現は、ウェスタンブロットおよびImageJを用いた定量により評価した（参照 材料表）。観察された分子量および抗体のカタログ情報は、以下に記載されています。 付随表1プライマー配列は以下の通りである。EphB4 正方向/逆方向：5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'、ephrinB2：5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'、RhoA：5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'、ALP：5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'、GAPDH：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

統計解析

パラメトリック解析の前に、Shapiro-Wilk検定を用いて正規性を、Levene検定を用いて分散の均一性を評価した。データは平均値 ± SDで表記し、すべての定量的な図のエラーバーはSDを示す。9つの要因セルに対して二元配置分散分析（Two-way factorial ANOVA）を適用し、主効果およびIとAの相互作用を推定し、効果量として部分イータ二乗（ηp²）を用いた。全13群間のペア比較は、Bonferroni補正を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）により行った。統計解析にはGraphPad Prismを使用した。有意性の記号は以下のように一貫して定義した：*, **, ***, ****はモデルに対する p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.001を示し、#, ##, ###, ####はフルフォーミュラZGPに対する同様の閾値を示す。

結果

腟細胞診によるモデルの検証

手術後5日以内に発情周期の消失が認められたことから、すべての卵巣摘出動物においてOVXが成功したことが確認された（Figure 1A）。一方、シャム手術群の動物は4日周期を維持していた（Figure 1B）。12週時点でDXA測定を行ったところ、OVXモデル群の大腿骨BMDはシャム対照群よりも低くなっており（0.214 ± 0.020 vs. 0.281 ± 0.019 mg/cm³; Bonferroni補正後 p < 0.01）、治療前のOVX誘発骨量減少モデルの確立が裏付けられた。

骨密度

ZGPの完全処方（I2A2）は、要因設計に基づく部分処方の中で最も高いBMD回復率を示し、2つの陽性対照群のいずれとも...

ディスカッション

要因交互作用項は、ZGPの補陰成分と補陽成分の間の非相加的な関係を裏付けています。この結果は、「陰中求陽」という伝統的な原則と一致しており、そこでは補陽成分が補陰の基盤を活性化または増強させることが期待されています¹⁵。この知見は、処方レベルでの薬理学的シナジーとして解釈されるべきです。本結果は、この効果を担う個々の活性成分を特定するものではありません。

EphB4およびephrinB2は、生物学的に妥当な骨芽細胞と破骨細胞のカップリングの媒介因子であると考えられている^3,4が、現在の証拠は相関関係を示すにとどまっている。RhoAの減少に伴うEphB4、ephrinB2、およびALPの増加が観察されたことは、カップリングの改善と整合しているが、この経路がZGPの作用に必要であるか、あるいは十分であるかを立証するものではない。因果関係を検証するには、経路阻害剤、抗EphB4またはephrinB2遮断アプローチ、RhoA/...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1%アンモニア水	入力テキストがありません。翻訳するソーステキストを提供してください。	翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。	ヘマトキシリン分化後の青染液。
1%塩酸アルコール溶液	提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストをご提示ください。	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。	ヘマトキシリン染色の分化液。
2x qPCRミックス	該当なし	入力データがありません。翻訳するテキストをご提示ください。	定量PCRマスターミックス。元の反応液量：1反応あたり12.5 $\mu$L。
4%パラホルムアルデヒド溶液	該当なし	翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳が必要な原文をご提示ください。	組織学的解析に向けた左大腿骨および脛骨サンプルの固定。
5倍濃縮ローディングバッファー	該当なし	該当なし	電気泳動前の試料変性。
ALP一次抗体	Affinity Biosciences	該当なし	ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。
ALPプライマーペア	該当なし	該当なし	ALP mRNAはqRT-PCRによって測定されていますが、親プライマー表にALPプライマーの配列が記載されていません。著者の確認が必要です。
ビオチン化抗体試薬	ELISAキットに付属、Jiyinmei	キット構成品	ELISAにおいてサンプルウェルに添加される。
アカシカ角ゼラチン（鹿角膠）	北京同仁堂	該当なし	陽気補完成分。原方における処方量：12 g、比率 4。ゼラチンを煎剤に溶かした。
クサガメ腹甲ゼラチン（Gui Ban Jiao）	北京同仁堂	該当なし	滋陰成分。出典における処方全体の用量：12 g、比率4。ゼラチンを煎剤に溶かした。
クロロホルム	提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストをご提示ください。	該当なし	RNA抽出における相分離。
冷却ステージ	Leica	1150	切片作成ワークフローのためのクライオまたは冷却サポート。
サンシュユ（Cornus officinalis）	北京同仁堂	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。	補陰成分。出典における処方量：12 g、比率 4。
トウサイカズラ（Tu Si Zi）	北京同仁堂	該当なし	陽気補完成分。原材での処方全量：12 g、比率 4。
Cyathula officinalis, 川牛膝	北京同仁堂	該当なし	滋陰成分。出典における処方全量投与量：9 g、比率 3。
DEPC処理PBS	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する原文を入力してください。	該当なし	液体窒素凍結前の第4・第5腰椎の洗浄。
ジエチルスチルベストロール	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	該当なし	ウェスタン医学陽性対照。投与量：0.04 mg/kg/日、1 mL/10 g/日。ジエチルスチルベストロール。
Dioscorea opposita、淮山薬	北京同仁堂	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	滋陰成分。出典における処方量：12 g、比率 4。
dNTP混合液	入力がありません。翻訳するソーステキストを提供してください。	該当なし	逆転写反応に含める。
ECL化学発光試薬	該当なし	入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。	ウェスタンブロット検出試薬
ELISA発色試薬A	ELISAキットに付属、Jiyinmei製	キット構成品	ELISA用発色試薬
ELISA発色試薬B	ELISAキットに付属、Jiyinmei	キット構成品	ELISA用発色試薬
ELISA停止液	ELISAキットに付属、Jiyinmei	キット構成品	ELISAの呈色反応を停止させるために使用する。
酵素標識ELISA試薬	ELISAキットに付属、Jiyinmei	キット構成品	ELISAのブランク以外のウェルに添加した。
EphB4一次抗体	Proteintech	該当なし	ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。
EphB4プライマーペア	該当なし	PCR産物 232 bp	フォワード CTAGACTCTTTCCTGCGGCT、リバース GGGAACTTGTGTAGGTGGGA。親テーブルの誤植 Rat RphB4 は Rat EphB4 の誤りです。
ephrinB2一次抗体	Affinity Biosciences	提供されたソーステキストがありません。翻訳対象となるテキストをご提示ください。	ウェスタンブロット抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEへの提出にはRRIDおよびロット番号が必須です。
ephrinB2プライマーペア	該当なし	PCR産物 172 bp	フォワード CGGACAAGGCCTGGTACTAT; リバース ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
エタノール（無水および95%、85%、75%の段階希釈）	提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストを入力してください。	該当なし	ヘマトキシリン・エオジン染色における段階的な脱水および親水処理。
雌性Sprague-Dawleyラット	北京維塔河実験動物技術有限公司	ソース記事に動物実験証明書およびライセンス番号の記載はありません。	特定病原体未感染（SPF）の、生後6カ月で健康な非妊娠雌。中国側の資料では230～270g、以前の英文草案では220～250gと記載されている。提出前に最終的な範囲を確認すること。
GAPDH一次抗体	Servicebio	翻訳するテキストが提供されていません。翻訳対象のソーステキストをご提示ください。	ローディングコントロール抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。
GAPDHプライマーペア	該当なし	PCR産物 253 bp	フォワード ACAGCAACAGGGTGGTGGAC、リバース TTTGAGGGTGCAGCGAACTT
GraphPad Prismソフトウェア	GraphPadソフトウェア	バージョン9.4.1; RRID:SCR_02798	統計解析およびグラフ作成。正規性、分散の均一性、ANOVA、ボンフェローニ補正、および効果量は、出力ファイルに保持させる必要がある。
呉竹兼顆粒	遼寧沃華康辰製薬有限公司	該当なし	漢方薬陽性対照。投与量：1.8 g/kg/日または0.5 mL/100 g/日。
ヘマトキシリン染色液	珠海北索生物科技有限公司	該当なし	組織学的染色。元の手順では、5分間のヘマトキシリン染色を用いた。
高速マイクロ遠心機	該当なし	TG16W	血清および核酸抽出の手順における遠心分離。
Hologic デュアルエナジーX線吸収測定装置	Hologic	該当なし	骨密度分析。ソースレポートには大腿骨のin vivoおよびex vivoスキャニングについて記載されている。
ImageJ ソフトウェア	アメリカ国立衛生研究所	RRID:SCR_03070	ウェスタンブロットバンドのデンシトメトリー定量。ソース論文にバージョン記載なし。
IHクッキングヒーター	Midea	該当なし	中国語の親機器テーブルに記載されています。
イソフルラン	該当なし	翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。	両側卵巣摘出術のための麻酔およびDXAポジショニング。改訂プロトコルでは、導入、維持、投与経路、および麻酔深度の判定基準を明記する必要がある。
イソプロパノール	該当なし	該当なし	抽出過程におけるRNA沈殿。
液体窒素	入力されたテキストがありません。翻訳するソーステキストを提供してください。	該当なし	腰椎サンプルの急速凍結。
クコ（Gou Qi Zi）	北京同仁堂	該当なし	滋陰成分。原典における処方量：12 g、比率 4。
マイクロプレートリーダー	翻訳するソーステキストをご提示ください。	AMR-10	450 nmにおけるELISA吸光度測定。
マイクロプレートウォッシャー	翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストを入力してください。	APW-20	ELISAプレートの洗浄工程。
MMLV逆転写酵素	該当なし	該当なし	逆転写酵素
中性封入剤	国药集团	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	ヘマトキシリン・エオジン染色スライド用封入剤。
生理食塩水	該当なし	該当なし	ブランクコントロール群、偽手術群、およびモデル群に対する溶媒の経口投与。
Oligo(dT)18プライマー	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。	逆転写に使用されます。
ペニシリン	該当なし	該当なし	術後感染予防。投与量：20,00 U/kgを3日間、筋肉内投与。
圧力鍋	シンフェイ	該当なし	中国語の親機器テーブルに記載。
プロテアーゼ阻害剤	該当なし	該当なし	タンパク質抽出時に添加する。
タンパク質溶解バッファー	該当なし	該当なし	ウェスタンブロッティングのための骨組織タンパク質抽出。
PVDF膜	該当事項なし	該当なし	メタノールで活性化したウェスタンブロット転写膜。
qRT-PCR装置	該当なし	該当事項なし	EphB4、ephrinB2、RhoA、ALP、およびGAPDHの定量的逆転写PCR。
ラットCTX-1 ELISAキット	字音名	JYM026Ra	血清中のI型コラーゲンC末端テロペプチドのサンドイッチELISA。450 nmで検出。
ラットP1NP ELISAキット	ジインメイ	JYM030Ra	血清プロコラーゲンI型N末端プロペプチドのサンドイッチELISA。450 nmでの検出。
地黄（Rehmannia glutinosa）、熟地黄	北京同仁堂	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	滋陰成分。出典における処方1回量：24 g、比率 8。
RhoA一次抗体	Proteintech	該当なし	ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:200。JoVEへの提出にはRRIDおよびロット番号が必要です。
RhoAプライマーペア	該当なし	PCR産物 17 bp	フォワード GTTTATGTGCCCACGGTGTT、リバース ACTATCAGGGCTGTCGATGG。用語をRHoAからRhoAに統一。
RNase阻害剤	該当なし	翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳するソーステキストをご提示ください。	逆転写反応に含む。
RNaseフリー水	提供されたテキストがございません。翻訳するソーステキストをご提示ください。	該当なし	乾燥後のRNA溶解。
回転式ミクロトーム	Leica	2245	組織切片作製
ウェスタンブロッティング用二次抗体	該当なし	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。	原液希釈倍率：1:150。JoVEでは宿主反応性とRRIDが必要です。
脱脂粉乳 5%	該当なし	該当なし	ウェスタンブロッティング用ブロッキング剤を用い、室温で2時間処理する。
スライド塗抹・乾燥機	金華市義迪	該当なし	組織学のためのスライド標本作成
3% ペントバルビタールナトリウム	翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳をご希望の原文をご入力ください。	翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。	中国親文書における腹大動脈採血前の終末麻酔。最終的な安楽死処置および確認方法を検証すること。
標準試料希釈液	ELISAキットに付属、Jiyinmei	キット構成品	ELISAの手順における標準液の段階希釈に使用します。
TBST緩衝液	該当なし	該当なし	ウェスタンブロッティング用洗浄バッファー。
恒温振盪インキュベーター	上海易恒科学仪器有限公司	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストをご提示ください。	研究室でのインキュベーションおよび振盪。
TRIzol試薬	提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストを入力してください。	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。	10 mgの骨組織からのRNA抽出。
正立顕微鏡	Leica	DM100	20倍でのヘマトキシリン・エオジン染色組織学的イメージング。
ウォータージャケット式恒温培養器	該当なし	GNP-9080	アッセイ手順におけるインキュベーション。
水溶性エオシン染色液	珠海北锁生物科技有限公司	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	組織学的対比染色。元の手順では、エオジン染色を3分間行った。
ウェスタンブロット電気泳動システム	該当なし	該当なし	タンパク質分離。電気泳動条件：最初は80 V、その後120 V。
ウェスタンブロットイメージングシステム	該当なし	該当なし	化学発光メンブランイメージング。提出にはトリミングされていないメンブランが必要。
ウェスタンブロット転写システム	翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。	該当なし	PVDF膜へのタンパク質転写。転写条件：40 mA、90分、氷浴。
キシレン	提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。	該当なし	組織学における脱ロウおよび組織透明化。
左归丸の構成生薬	北京同仁堂	該当なし	8種の生薬組成：地黄（Rehmannia glutinosa）、山薬（Dioscorea opposita）、山茱萸（Cornus officinalis）、枸杞子（Lycium barbarum）、亀甲膠（Chinemys reevesii plastron gelatin）、杜 충（Cyathula officinalis）、菟思う（Cuscuta australis）、鹿茸膠（Cervus elaphus antler gelatin）。