本研究では、3×3要因子設計を用い、卵巣摘出ラットにおける閉経後骨粗鬆症に対する左帰丸の効果を評価しました。その結果、陰および陽の成分が骨代謝および関連するEphB4/ephrinB2経路マーカーに対して相乗効果を持つことが示されましたが、メカニズムに関する根拠は因果関係ではなく相関関係にとどまっています。
研究記事
卵巣摘出ラットにおける左帰丸による骨芽細胞・破骨細胞カップリングの調節：3×3要因設計研究
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2026年9月11日
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この記事について
サマリー
要約
閉経後骨粗鬆症は、エストロゲン欠乏に伴う骨形成と骨吸収の脱共役によって引き起こされます。本研究では、卵巣摘出ラットモデルを用いて、左帰丸の陰を養う部分処方の独立した効果および相互作用を定量化し、EphB4/ephrinB2/RhoA/アルカリフォスファターゼ経路との関連を検討しました。ARRIVE 2.0に基づき、130匹の特定病原体フリーの雌性Sprague-Dawleyラットを、3×3の要因設計による9群を含む計13群（n=10/群）に無作為に割り付けました。評価項目には、P1NP、CTX-1、二重エネルギーX線吸収法（DXA）で測定した大腿骨密度（BMD）、海綿骨組織学、および逆転写定量PCRとウェスタンブロッティングで測定したメッセンジャーリボ核酸およびタンパク質発現を含めました。全処方（I2A2）は、モデル群と比較してP1NPが高く、CTX-1が低く、BMDが高いことに関連していました。要因分析により、P1NPとBMDの間に陰陽の相互作用が認められ、薬理学的シナジーが裏付けられました。分子レベルの変化は、EphB4/ephrinB2/ALP発現の増加およびRhoA発現の減少に関連していました。これらの知見は、左帰丸による治療、骨表現型の改善、および経路マーカーの調節との関連を支持するものであり、因果的な経路依存性については、阻害剤、ノックダウン、および共培養による検証が必要です。
概要
閉経後骨粗鬆症（PMOP）は多くの女性に影響を及ぼし、エストロゲン欠乏に伴う骨形成と骨吸収のバランスの崩壊を特徴とする1,2。EphB4/ephrinB2受容体-リガンド系は骨芽細胞と破骨細胞間の相互作用を媒介しており、EphB4シグナル伝達は骨芽細胞の分化およびアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を促進する一方で、ephrinB2のリバースシグナル伝達はRhoA関連のメカニズムを通じて破骨細胞形成を抑制し得る3,4。エストロゲン欠乏骨におけるカップリング能の低下は、骨リモデリングの両細胞系に影響を与える介入策を評価するためのメカニズム的な根拠となる。
骨吸収抑制剤や骨形成促進剤を含む現在の骨粗鬆症治療は、骨折のリスクを低減させますが、長期使用における服薬コンプライアンス、コスト、禁忌、リバウンド効果、または有害事象によって制限される場合があります5。したがって、過剰な骨吸収を抑えつつ骨形成を改善させる候補治療法の開発は、科学的に重要な課題であり続けています。
左帰丸（ZGP; Zuo Gui Wan）は、骨の脆弱性と関連する理論的パターンである腎精不足に対して用いられる、中医学の古典的な多成分処方である。陰を養う成分には、Rehmannia glutinosa（熟地黄、24 g）、Dioscorea opposita（山薬、12 g）、Cornus officinalis（山茱萸、12 g）、Lycium barbarum（枸杞子、12 g）、Chinemys reevesiiの腹甲ゼラチン（鼈甲膠、12 g）、およびCyathula officinalis（牛膝、9 g）が含まれる。陽を補う成分には、Cuscuta australis（菟絲子、12 g）およびCervus elaphusの鹿角ゼラチン（鹿角膠、12 g）が含まれる。古典的な理論において、「陰中求陽」の原則は、陽を補う生薬が単なる独立した添加物として作用するのではなく、陰を養う基盤を増強させる可能性を示唆している。臨床的根拠および前臨床研究では、BMD、骨形成、および薬物動態挙動への影響を含む、ZGPまたはZGP含有介入の抗骨粗鬆症活性が報告されている6,7,8,9,10。
本研究の新規性は、卵巣摘出（OVX）ラットを用いて、補陰成分と補陽成分を3×3の要因設計で形式的に分離し、骨表現型およびEphB4/ephrinB2/RhoA/ALP経路のマーカーを同時に評価した点にある。この設計は、処方全体または単一の比較対照のみを用いた研究よりも、方剤の配伍理論をより直接的に検証するものである。同時に、経路マーカーの変化は、メカニズム的に阻害またはサイレンシングされない限り、相関関係にとどまるという点も認識している1。
プロトコル
本研究におけるすべての手順は、内モンゴル医科大学の動物実験委員会（承認番号：YKD202404105）によって承認され、ARRIVE 2.012のガイドラインに準拠して実施されました。
研究デザイン
本研究は、内蒙古医科大学の動物実験プラットフォームで実施されました。2つの因子：滋陰基剤（I；3つの投与量レベル：0, 27, 54 g 生薬相当量）および壮陽処方（A；3つの投与量レベル：0, 8, 16 g 生薬相当量）を用いた3×3の完全要因計画法を適用し、9つの要因セルに4つの参照群を加えた設計としました。要因計画をTable 1に示します。I2A2は、臨床等価量における完全なZGP処方を表します。投与量の換算には体表面積法（ラット：ヒト係数 = 6.25）を用いました13。
動物、ランダム化、および盲検化
コンピューターで生成した乱数表を用いて、特定病原体のないSprague-Dawley系雌ラット130匹（6ヶ月齢、20–250 g）を割り付けた。割り付けコードは、アウトカム評価に関与しない研究者が順次封印された封筒に封入した。ラットは、2 ± 2 oC、湿度50–60%の条件下で、12時間の明暗サイクルにて、換気付きケージ1つにつき3～4匹で飼育した。水およびカルシウムとリンの含有量が記録された標準的な齧歯類用飼料を自由摂取させ、ケージ内での活動および環境エンリッチメントを提供した。分子アッセイ、組織学的スコアリング、画像定量化、およびデンシトメトリーは、割り付けについて盲検化された研究者が実施した。サンプルサイズは事前の検出力分析によって決定し、1群あたりn = 10とした。
OVXモデルおよび薬剤投与
精密気化器を用いて投与した吸入イソフルラン下で、両側卵巣摘出術（OVX）を実施した。酸素中で3–4%にて麻酔を導入し、ノーズコーンを通じて1.5–2.5%で維持した。足底逃避反射および眼瞼反射の消失と、安定した呼吸により、十分な麻酔深度を確認した。OVXの成功は、術後5日目における腟性発情周期の消失、および12週後のBMD低下によって評価した。モデルの妥当性を確認した後、8週間にわたり経口ゾンデ投与（1 mL/10 g/day）を行った。煎剤は、沸騰状態（100 °C、還流）での連続水抽出により作製した。まず10倍量で2時間、続いて8倍量で1.5時間抽出し、4層の医療用ガーゼでろ過後、減圧濃縮して粗薬濃度0.968 g/mLとした。濃縮抽出液は4 °Cで保存し、調製後7日以内に使用した。陽性対照として、駆心康顆粒（1.8 g/kg/day）およびジエチルスチルベストロール（0.04 mg/kg/day）を用いた。実験終了時、ラットを5%イソフルランで足底反射および角膜反射が消失するまで深く麻酔し、その後、放血および頸椎脱臼を行った。心拍および呼吸の停止により死亡を確認した。死骸および組織は生物学的廃棄物として、化学残留物は有害廃棄物として廃棄し、針やブレードは承認済みの鋭利物専用容器に廃棄した。
アウトカム評価項目
血清P1NPおよびCTX-1をサンドイッチELISA法（Jiyinmei社）により測定した。14大腿骨の骨密度（BMD）はDXAで定量化した。海綿骨の組織学的評価は、ヘマトキシリン・エオジン染色を用い、20倍の倍率で実施した。遺伝子発現は、2--ΔΔCt値（サイクルしきい値） 法を用い、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）で標準化した。タンパク質発現は、ウェスタンブロットおよびImageJを用いた定量により評価した（参照 材料表）。観察された分子量および抗体のカタログ情報は、以下に記載されています。 付随表1プライマー配列は以下の通りである。EphB4 正方向/逆方向：5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'、ephrinB2：5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'、RhoA：5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'、ALP：5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'、GAPDH：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。
統計解析
パラメトリック解析の前に、Shapiro-Wilk検定を用いて正規性を、Levene検定を用いて分散の均一性を評価した。データは平均値 ± SDで表記し、すべての定量的な図のエラーバーはSDを示す。9つの要因セルに対して二元配置分散分析（Two-way factorial ANOVA）を適用し、主効果およびIとAの相互作用を推定し、効果量として部分イータ二乗（ηp2）を用いた。全13群間のペア比較は、Bonferroni補正を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）により行った。統計解析にはGraphPad Prismを使用した。有意性の記号は以下のように一貫して定義した：*, **, ***, ****はモデルに対する p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.001を示し、#, ##, ###, ####はフルフォーミュラZGPに対する同様の閾値を示す。
結果
腟細胞診によるモデルの検証
手術後5日以内に発情周期の消失が認められたことから、すべての卵巣摘出動物においてOVXが成功したことが確認された（Figure 1A）。一方、シャム手術群の動物は4日周期を維持していた（Figure 1B）。12週時点でDXA測定を行ったところ、OVXモデル群の大腿骨BMDはシャム対照群よりも低くなっており（0.214 ± 0.020 vs. 0.281 ± 0.019 mg/cm3; Bonferroni補正後 p < 0.01）、治療前のOVX誘発骨量減少モデルの確立が裏付けられた。
骨密度
ZGPの完全処方（I2A2）は、要因設計に基づく部分処方の中で最も高いBMD回復率を示し、2つの陽性対照群のいずれとも統計的に同等であった（表2、図2）。すべての部分処方において、モデル群と比較してBMDが増加した。高用量の滋陰薬単独（I3A1: 0.253 mg/cm3）および高用量の温陽薬単独（I1A3: 0.243 mg/cm3）は、完全処方のZGP（I2A2: 0.307 mg/cm3）よりも低い値にとどまっており、単純な用量効果ではなく相互作用があることが示唆された。
血清骨代謝マーカー
モデル群と比較して、フルフォーミュラZGPはP1NPの増加（+51%; 95% CI: 210.3–327.5 pg/mL; p <0.01）およびCTX-1の減少（-16%; p <0.01）と関連しており、これは形成と吸収のバランスが改善したことと一致していた（図 3A,B）。高用量の単剤療法群では、いくつかの比較においてP1NPの絶対値がより高くなったが、要因設計のパターンは、単一群の最大用量反応よりも、最適化された複合的な活性を支持していた。グループレベルの完全なデータは表 3に記載されている。
要因配置分散分析（Factorial ANOVA）と相乗的相互作用
9つの要因セルを用いた二元配置分散分析（Two-way factorial ANOVA）により、主要エンドポイントにおいて、補陰因子および補陽因子の有意な主効果、ならびに補陰因子と補陽因子の有意な相互作用項が認められた（表4）。P1NPに関する相互作用効果（ηp2 = 0.74）は、本実験条件下において、補陽成分が補陰成分の活性を増強させたことを示唆している。
骨密度（モデル検証）
図4に示すように、モデル（OVX）群の大腿骨密度は、Blank群およびSham手術群よりも低く、処置前にOVX骨量減少表現型が正常に誘導されたことが確認された。
EphB4/ephrinB2/RhoA/ALPの発現
RT-qPCR解析では、各群の生物学的サンプルを用い、技術的トリプリケート（n=3）で反応を行い、ウェスタンブロットのデンシトメトリーは独立した生物学的ライセートを用いて実施した（Figure 5およびFigure 6）。モデル群と比較して、全処方ZGP投与群では、EphB4 (0.498 ± 0.09 vs. 0.048 ± 0.02; p < 0.001)、ephrinB2 (0.41 ± 0.036 vs. 0.048 ± 0.03; p < 0.01)、およびALP (0.842 ± 0.019 vs. 0.090 ± 0.03; p < 0.001) の発現が高く、RhoA (1.658 ± 0.028 vs. 7.32 ± 0.430; p < 0.01) の発現は低かった。これらの分子生物学的な所見は、因果的な媒介の証明ではなく、パスウェイマーカー間の関連性として解釈される。
データの可用性
本研究の結果を導出するために使用した元のデータファイルは、本記事に付随する補完コーディングファイルとして提供されています
図1. 卵巣摘出後の発情周期を確認するために用いられた代表的な腟細胞診像（ヘマトキシリン・エオジン染色、20倍）。(A) 非サイクル性の細胞像が持続していることを示す、卵巣摘出ラットの代表的な腟塗抹標本。 (B) 正常な発情周期を示す、偽手術を行ったラットの代表的な膣 smears（膣塗抹標本）。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2全群における大腿骨BMD。 エラーバーは標準偏差（SD）を示す。統計記号は、「統計解析」セクションで定義したモデルまたは全定式化ZGPに対するボンフェローニ補正後の比較を示す。 この図の拡大表示をご覧になるには、こちらをクリックしてください。
図3血清骨代謝マーカー. (A) 骨形成マーカーであるP1NP。 (B) 骨吸収マーカーであるCTX-1。エラーバーは標準偏差（SD）を示す。統計記号は、モデル群または全成分配合ZGPに対するボンフェローニ補正後の比較を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4治療前に、OVX誘発性の骨量減少を確認するための大腿骨密度。 大腿骨密度（mg/cm³）を比較した棒グラフ3前処置前のモデル検証時点における、Blank群（卵巣摘出なし、未処理）、Sham手術群、およびモデル（OVX）群間の比較。棒グラフは平均値を表す ± SD（n = 10/群）。*** = p < 0.01 vs. ブランクおよび vs. シャム（ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析）。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5相対的なmRNA遺伝子発現量。 （の）発現レベルA) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) 2^-法を用いたALPの算出ΔΔGAPDHで標準化したCt法。qPCRでは、各生物学的サンプルについてテクニカル・トリプリケート（技術的反復）で反応を行った。エラーバーは標準偏差（SD）を示す。統計記号はボンフェローニ補正後の比較結果を示す。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6ウェスタンブロットによるタンパク質発現解析 各パネルは、独立した生物学的サンプルから選択したEphB4、ephrinB2、RhoA、ALP、およびローディングコントロールとしてのGAPDHの代表的な免疫ブロットを示す。デンシトメトリーはImageJを用いてGAPDHで標準化した。観察された分子量は、EphB4が10 kDa、ephrinB2が36 kDa、RhoAが2 kDa、ALPが39 kDa、GAPDHが37 kDaであった（参照 付随表1). こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 補陰因子（I） | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| 陽気増強因子（A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ （モデル） | I₂A₁ （陰） | I₃A₁ (ハイイン) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP)†) | I₃A₂ (高陰陽) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (ハイヤン) | I₂A₃ (陰＋陽ハイ) | I₃A₃ (フルハイ) | |
表 1： 3×3 要因設計および実験群。 本表は、陰を補う（I）および陽を強める（A）の用量レベルによる 3×3 要因設計で配置された 13 の実験群と、4 つのリファレンス群を示している。†I₂A₂ = 臨床相当用量の左帰丸全処方。体表面積法（ラット：ヒト = 6.25）を用いた用量換算。
| 群 | 要因設計セル | BMD (mg/cm³, x̄ ± SD) | モデル群との比較 |
| ブランク対照群 | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| 偽手術群 | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| モデル群 (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| 補陽群 | I₁A₂ | 0.258 ± 0.01 | ** |
| 高用量補陽群 | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| 滋陰群 | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| 高用量滋陰群 | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| 滋陰＋高用量補陽群 | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| 高用量滋陰＋補陽群 | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| 全成分高用量群 | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| ZGP完全処方群 | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| 中薬陽性対照群 | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| 西洋薬対照群 | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
表 2： 全群における大腿骨BMD（各群 n=10、平均値 ± SD）。 * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.01, **** = p<0.01 vs. モデル群（ボンフェローニ補正）。
| 群 | 細胞 | P1NP (pg/mL, x̄ ± 標準偏差 (SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± 標準偏差（SD） |
| ブランクコントロール | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| 偽手術群 | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| モデル（OVX） | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| 陽気を高める | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| 高陽気補完的な | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| 滋陰 | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| 高い滋陰作用 | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| 陰と陽 | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Hi-Yin + Yang | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| フルハイ | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| ZGPの完全式 | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| TCM陽性対照 | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| 西洋医学対照群 | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
表 3： 全群における血清 P1NP および CTX-1（n=10/群、平均値 ± 標準偏差）。 ** = p <0.01, **** = p <0.01 vs. モデル群; # = p <0.05, ## = p <0.01, ### = p <0.01, #### = p <0.01 vs. ZGP群（Bonferroni法）。モデル群に対するZGP P1NPの95% CI: 210.3–327.5 pg/mL。
| 結果 | 因子 | df | F | p値 | 部分的 η² |
| P1NP (pg/mL) | 陰 (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm²）³) | 陰（I） | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | 陰 (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
表4： ボンフェローニ補正後解析（ポストホック比較）を伴う3x3要因配置分散分析（ANOVA）の主効果および交互作用項。 効果量として部分イータ二乗を報告する。dfは自由度を示す。
補足表1. ウェスタンブロット抗体情報。 本表には、本研究で使用した一次抗体および二次抗体の標的タンパク質、観察された分子量、サプライヤー、カタログ番号、宿主種、および使用希釈率を記載しています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足コーディングファイル1. 本研究を裏付ける未加工の実験データ。 本アーカイブには、個々のBMD測定値、ELISA生データ、増幅および融解曲線出力を含むRT-qPCRのCt値、元のウェスタンブロット画像およびデンシトメトリー解析ファイル、代表的な組織学的顕微鏡画像、ならびにこれらの実験に関連する機器出力ファイルなど、原稿に提示された結果を生成するために使用された元のデータファイルが含まれています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
要因交互作用項は、ZGPの補陰成分と補陽成分の間の非相加的な関係を裏付けています。この結果は、「陰中求陽」という伝統的な原則と一致しており、そこでは補陽成分が補陰の基盤を活性化または増強させることが期待されています15。この知見は、処方レベルでの薬理学的シナジーとして解釈されるべきです。本結果は、この効果を担う個々の活性成分を特定するものではありません。
EphB4およびephrinB2は、生物学的に妥当な骨芽細胞と破骨細胞のカップリングの媒介因子であると考えられている3,4が、現在の証拠は相関関係を示すにとどまっている。RhoAの減少に伴うEphB4、ephrinB2、およびALPの増加が観察されたことは、カップリングの改善と整合しているが、この経路がZGPの作用に必要であるか、あるいは十分であるかを立証するものではない。因果関係を検証するには、経路阻害剤、抗EphB4またはephrinB2遮断アプローチ、RhoA/ROCK調節16、遺伝子ノックダウン、および骨芽細胞と破骨細胞の共培養実験が必要である。
臨床への応用には慎重な検討が必要です。ラットからヒトへの等価用量換算は初期のスケールアップの根拠となりますが、ヒトへの投与には薬物動態学、薬力学、および長期的な安全性試験も必要です。標準化されたZGP製品には、HPLCまたはLC-MSによる化学的プロファイリング、指標成分の限界値の設定、バッチ間の同等性、汚染物質試験、ならびに生薬の調達、抽出、濃縮、および製造工程の文書化が必要となります17。規制上の適用にあたっては、構成成分間の相互作用、既存の抗骨粗鬆症薬との適合性、およびBMD単独ではなく骨折減少率などの比較臨床アウトカムについても考慮しなければなりません。
本研究にはいくつかの限界がある。OVXラットモデルは急激なエストロゲン欠乏を誘導するため、ヒトの閉経、老化、免疫調節、寿命、併存疾患、または長期的な骨リモデリングのダイナミクスを完全に再現することはできない18,19。全身的な内分泌効果が観察された結果に寄与している可能性があるため、骨細胞への直接的なシグナル伝達を想定すべきではない。経路の阻害や遺伝子ノックダウンを行っていないため、因果関係に基づいたメカニズムの主張はできない。HPLCまたはLC-MSによるプロファイリングを行っていないため、再現性が制限され、特定の成分に効果を帰属させることができない。海綿骨微細構造の定量的な評価は実施しなかった。今後の研究では、骨構造の変化をより包括的に評価するために、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Spを含むmicro-CTまたは定量組織形態計測分析を取り入れるべきである20。生薬のバッチ間変動、抽出手順、および品質管理の要件は、依然として重要なトランスレーショナルな障壁となっている。
OVX誘発PMOPラットにおいて、全処方の左帰丸は、BMDの改善、良好な血清骨代謝マーカー、およびEphB4/ephrinB2/RhoA/ALP経路マーカーの協調的な変化に関連していた。3×3の要因分析により、補陰成分と補陽成分の間の相乗的な相互作用が示され、これは伝統的な方剤の配伍理論と一致している。これらのデータは、PMOPに対するマルチターゲット候補としてのZGPのさらなる研究を支持するものであるが、メカニズムやトランスレーショナルな主張を確定させるには、阻害剤研究、遺伝子サイレンシング実験、骨芽細胞・破骨細胞共培養、化学プロファイリング、定量的な骨微細構造解析、薬物動態、長期安全性試験、および臨床試験が必要である。
開示事項
著者に開示すべき利益相反はありません。
謝辞
本研究は、内モンゴル自治区自然科学基金（助成番号 2025LHMS08047）、内モンゴル医科大学一般プロジェクト（助成番号 YKD2025MS015）、および内モンゴル医科大学博士課程スタートアップ基金（助成番号 YKD2023BSQD07）の支援を受けて行われました。助成団体は、研究デザイン、データ収集、解析、出版の決定、または原稿の作成において一切の役割を担っていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1%アンモニア水 | 入力テキストがありません。翻訳するソーステキストを提供してください。 | 翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。 | ヘマトキシリン分化後の青染液。 |
| 1%塩酸アルコール溶液 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストをご提示ください。 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 | ヘマトキシリン染色の分化液。 |
| 2x qPCRミックス | 該当なし | 入力データがありません。翻訳するテキストをご提示ください。 | 定量PCRマスターミックス。元の反応液量：1反応あたり12.5 $\mu$L。 |
| 4%パラホルムアルデヒド溶液 | 該当なし | 翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳が必要な原文をご提示ください。 | 組織学的解析に向けた左大腿骨および脛骨サンプルの固定。 |
| 5倍濃縮ローディングバッファー | 該当なし | 該当なし | 電気泳動前の試料変性。 |
| ALP一次抗体 | Affinity Biosciences | 該当なし | ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。 |
| ALPプライマーペア | 該当なし | 該当なし | ALP mRNAはqRT-PCRによって測定されていますが、親プライマー表にALPプライマーの配列が記載されていません。著者の確認が必要です。 |
| ビオチン化抗体試薬 | ELISAキットに付属、Jiyinmei | キット構成品 | ELISAにおいてサンプルウェルに添加される。 |
| アカシカ角ゼラチン（鹿角膠） | 北京同仁堂 | 該当なし | 陽気補完成分。原方における処方量：12 g、比率 4。ゼラチンを煎剤に溶かした。 |
| クサガメ腹甲ゼラチン（Gui Ban Jiao） | 北京同仁堂 | 該当なし | 滋陰成分。出典における処方全体の用量：12 g、比率4。ゼラチンを煎剤に溶かした。 |
| クロロホルム | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストをご提示ください。 | 該当なし | RNA抽出における相分離。 |
| 冷却ステージ | Leica | 1150 | 切片作成ワークフローのためのクライオまたは冷却サポート。 |
| サンシュユ（Cornus officinalis） | 北京同仁堂 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。 | 補陰成分。出典における処方量：12 g、比率 4。 |
| トウサイカズラ（Tu Si Zi） | 北京同仁堂 | 該当なし | 陽気補完成分。原材での処方全量：12 g、比率 4。 |
| Cyathula officinalis, 川牛膝 | 北京同仁堂 | 該当なし | 滋陰成分。出典における処方全量投与量：9 g、比率 3。 |
| DEPC処理PBS | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する原文を入力してください。 | 該当なし | 液体窒素凍結前の第4・第5腰椎の洗浄。 |
| ジエチルスチルベストロール | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | 該当なし | ウェスタン医学陽性対照。投与量：0.04 mg/kg/日、1 mL/10 g/日。ジエチルスチルベストロール。 |
| Dioscorea opposita、淮山薬 | 北京同仁堂 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | 滋陰成分。出典における処方量：12 g、比率 4。 |
| dNTP混合液 | 入力がありません。翻訳するソーステキストを提供してください。 | 該当なし | 逆転写反応に含める。 |
| ECL化学発光試薬 | 該当なし | 入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。 | ウェスタンブロット検出試薬 |
| ELISA発色試薬A | ELISAキットに付属、Jiyinmei製 | キット構成品 | ELISA用発色試薬 |
| ELISA発色試薬B | ELISAキットに付属、Jiyinmei | キット構成品 | ELISA用発色試薬 |
| ELISA停止液 | ELISAキットに付属、Jiyinmei | キット構成品 | ELISAの呈色反応を停止させるために使用する。 |
| 酵素標識ELISA試薬 | ELISAキットに付属、Jiyinmei | キット構成品 | ELISAのブランク以外のウェルに添加した。 |
| EphB4一次抗体 | Proteintech | 該当なし | ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。 |
| EphB4プライマーペア | 該当なし | PCR産物 232 bp | フォワード CTAGACTCTTTCCTGCGGCT、リバース GGGAACTTGTGTAGGTGGGA。親テーブルの誤植 Rat RphB4 は Rat EphB4 の誤りです。 |
| ephrinB2一次抗体 | Affinity Biosciences | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象となるテキストをご提示ください。 | ウェスタンブロット抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEへの提出にはRRIDおよびロット番号が必須です。 |
| ephrinB2プライマーペア | 該当なし | PCR産物 172 bp | フォワード CGGACAAGGCCTGGTACTAT; リバース ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| エタノール（無水および95%、85%、75%の段階希釈） | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストを入力してください。 | 該当なし | ヘマトキシリン・エオジン染色における段階的な脱水および親水処理。 |
| 雌性Sprague-Dawleyラット | 北京維塔河実験動物技術有限公司 | ソース記事に動物実験証明書およびライセンス番号の記載はありません。 | 特定病原体未感染（SPF）の、生後6カ月で健康な非妊娠雌。中国側の資料では230～270g、以前の英文草案では220～250gと記載されている。提出前に最終的な範囲を確認すること。 |
| GAPDH一次抗体 | Servicebio | 翻訳するテキストが提供されていません。翻訳対象のソーステキストをご提示ください。 | ローディングコントロール抗体。原液希釈倍率：1:20。JoVEにはRRIDおよびロット番号が必要。 |
| GAPDHプライマーペア | 該当なし | PCR産物 253 bp | フォワード ACAGCAACAGGGTGGTGGAC、リバース TTTGAGGGTGCAGCGAACTT |
| GraphPad Prismソフトウェア | GraphPadソフトウェア | バージョン9.4.1; RRID:SCR_02798 | 統計解析およびグラフ作成。正規性、分散の均一性、ANOVA、ボンフェローニ補正、および効果量は、出力ファイルに保持させる必要がある。 |
| 呉竹兼顆粒 | 遼寧沃華康辰製薬有限公司 | 該当なし | 漢方薬陽性対照。投与量：1.8 g/kg/日または0.5 mL/100 g/日。 |
| ヘマトキシリン染色液 | 珠海北索生物科技有限公司 | 該当なし | 組織学的染色。元の手順では、5分間のヘマトキシリン染色を用いた。 |
| 高速マイクロ遠心機 | 該当なし | TG16W | 血清および核酸抽出の手順における遠心分離。 |
| Hologic デュアルエナジーX線吸収測定装置 | Hologic | 該当なし | 骨密度分析。ソースレポートには大腿骨のin vivoおよびex vivoスキャニングについて記載されている。 |
| ImageJ ソフトウェア | アメリカ国立衛生研究所 | RRID:SCR_03070 | ウェスタンブロットバンドのデンシトメトリー定量。ソース論文にバージョン記載なし。 |
| IHクッキングヒーター | Midea | 該当なし | 中国語の親機器テーブルに記載されています。 |
| イソフルラン | 該当なし | 翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。 | 両側卵巣摘出術のための麻酔およびDXAポジショニング。改訂プロトコルでは、導入、維持、投与経路、および麻酔深度の判定基準を明記する必要がある。 |
| イソプロパノール | 該当なし | 該当なし | 抽出過程におけるRNA沈殿。 |
| 液体窒素 | 入力されたテキストがありません。翻訳するソーステキストを提供してください。 | 該当なし | 腰椎サンプルの急速凍結。 |
| クコ（Gou Qi Zi） | 北京同仁堂 | 該当なし | 滋陰成分。原典における処方量：12 g、比率 4。 |
| マイクロプレートリーダー | 翻訳するソーステキストをご提示ください。 | AMR-10 | 450 nmにおけるELISA吸光度測定。 |
| マイクロプレートウォッシャー | 翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストを入力してください。 | APW-20 | ELISAプレートの洗浄工程。 |
| MMLV逆転写酵素 | 該当なし | 該当なし | 逆転写酵素 |
| 中性封入剤 | 国药集团 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | ヘマトキシリン・エオジン染色スライド用封入剤。 |
| 生理食塩水 | 該当なし | 該当なし | ブランクコントロール群、偽手術群、およびモデル群に対する溶媒の経口投与。 |
| Oligo(dT)18プライマー | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。 | 逆転写に使用されます。 |
| ペニシリン | 該当なし | 該当なし | 術後感染予防。投与量：20,00 U/kgを3日間、筋肉内投与。 |
| 圧力鍋 | シンフェイ | 該当なし | 中国語の親機器テーブルに記載。 |
| プロテアーゼ阻害剤 | 該当なし | 該当なし | タンパク質抽出時に添加する。 |
| タンパク質溶解バッファー | 該当なし | 該当なし | ウェスタンブロッティングのための骨組織タンパク質抽出。 |
| PVDF膜 | 該当事項なし | 該当なし | メタノールで活性化したウェスタンブロット転写膜。 |
| qRT-PCR装置 | 該当なし | 該当事項なし | EphB4、ephrinB2、RhoA、ALP、およびGAPDHの定量的逆転写PCR。 |
| ラットCTX-1 ELISAキット | 字音名 | JYM026Ra | 血清中のI型コラーゲンC末端テロペプチドのサンドイッチELISA。450 nmで検出。 |
| ラットP1NP ELISAキット | ジインメイ | JYM030Ra | 血清プロコラーゲンI型N末端プロペプチドのサンドイッチELISA。450 nmでの検出。 |
| 地黄（Rehmannia glutinosa）、熟地黄 | 北京同仁堂 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | 滋陰成分。出典における処方1回量：24 g、比率 8。 |
| RhoA一次抗体 | Proteintech | 該当なし | ウェスタンブロット用抗体。原液希釈倍率：1:200。JoVEへの提出にはRRIDおよびロット番号が必要です。 |
| RhoAプライマーペア | 該当なし | PCR産物 17 bp | フォワード GTTTATGTGCCCACGGTGTT、リバース ACTATCAGGGCTGTCGATGG。用語をRHoAからRhoAに統一。 |
| RNase阻害剤 | 該当なし | 翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳するソーステキストをご提示ください。 | 逆転写反応に含む。 |
| RNaseフリー水 | 提供されたテキストがございません。翻訳するソーステキストをご提示ください。 | 該当なし | 乾燥後のRNA溶解。 |
| 回転式ミクロトーム | Leica | 2245 | 組織切片作製 |
| ウェスタンブロッティング用二次抗体 | 該当なし | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 | 原液希釈倍率：1:150。JoVEでは宿主反応性とRRIDが必要です。 |
| 脱脂粉乳 5% | 該当なし | 該当なし | ウェスタンブロッティング用ブロッキング剤を用い、室温で2時間処理する。 |
| スライド塗抹・乾燥機 | 金華市義迪 | 該当なし | 組織学のためのスライド標本作成 |
| 3% ペントバルビタールナトリウム | 翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳をご希望の原文をご入力ください。 | 翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。 | 中国親文書における腹大動脈採血前の終末麻酔。最終的な安楽死処置および確認方法を検証すること。 |
| 標準試料希釈液 | ELISAキットに付属、Jiyinmei | キット構成品 | ELISAの手順における標準液の段階希釈に使用します。 |
| TBST緩衝液 | 該当なし | 該当なし | ウェスタンブロッティング用洗浄バッファー。 |
| 恒温振盪インキュベーター | 上海易恒科学仪器有限公司 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストをご提示ください。 | 研究室でのインキュベーションおよび振盪。 |
| TRIzol試薬 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストを入力してください。 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 | 10 mgの骨組織からのRNA抽出。 |
| 正立顕微鏡 | Leica | DM100 | 20倍でのヘマトキシリン・エオジン染色組織学的イメージング。 |
| ウォータージャケット式恒温培養器 | 該当なし | GNP-9080 | アッセイ手順におけるインキュベーション。 |
| 水溶性エオシン染色液 | 珠海北锁生物科技有限公司 | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | 組織学的対比染色。元の手順では、エオジン染色を3分間行った。 |
| ウェスタンブロット電気泳動システム | 該当なし | 該当なし | タンパク質分離。電気泳動条件：最初は80 V、その後120 V。 |
| ウェスタンブロットイメージングシステム | 該当なし | 該当なし | 化学発光メンブランイメージング。提出にはトリミングされていないメンブランが必要。 |
| ウェスタンブロット転写システム | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 | 該当なし | PVDF膜へのタンパク質転写。転写条件：40 mA、90分、氷浴。 |
| キシレン | 提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。 | 該当なし | 組織学における脱ロウおよび組織透明化。 |
| 左归丸の構成生薬 | 北京同仁堂 | 該当なし | 8種の生薬組成：地黄（Rehmannia glutinosa）、山薬（Dioscorea opposita）、山茱萸（Cornus officinalis）、枸杞子（Lycium barbarum）、亀甲膠（Chinemys reevesii plastron gelatin）、杜 충（Cyathula officinalis）、菟思う（Cuscuta australis）、鹿茸膠（Cervus elaphus antler gelatin）。 |
参考文献
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