方法論記事

ミトコンドリア呼吸スーパーコンプレックスの機能的再構成

62 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/72243

⸱

2026年8月21日

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

機能的なミトコンドリア呼吸スーパーコンプレックスを、構造的および機能的な相関解析が可能な、明確に定義されたプロテオリポソームへと再構成するための簡便なプロトコルを提示します。

要約

ミトコンドリアは生物エネルギー代謝の中心的なハブであり、ATPの主要な供給源である。ミトコンドリア内膜には、電子伝達系複合体（CI、CII、CIII）を含む酸化リン酸化系が存在する。2、および CIV)およびATP合成酵素（CV）。哺乳類では、CI、CIII2, およびCIVは、SC I+IIIなどのスーパーコンプレックス（SC）と呼ばれる高次構造を形成します。2+IV, SC I+III2、およびSC III2IV. スーパーコンプレックス（SC）形成を促進する生理学的要因は依然として不明であるものの、SC形成は複合体間の電子伝達速度を高める、活性酸素種の生成を抑制する、あるいは密に充填されたミトコンドリア内膜内での非特異的なタンパク質凝集を防ぐ可能性があると提案されている。呼吸鎖SCの構造および機能に関する研究は、界面活性剤で抽出した複合体に大きく依存してきた。これらの研究によって電子伝達系への理解は深まったが、密閉された膜脂質二重層が存在しないため、スーパーコンプレックス形成による機能的な利点を調べる能力には限界があった。しかしながら、近年の進展により、膜タンパク質を再構成された天然に近い膜環境下で構造的に特性評価できることが示されており、これらの研究に、より生理学的なコンテキストを提供している。本稿では、呼吸鎖SCをリポソームに再構成するための、簡便で迅速かつ再現性の高いプロトコルを提示する。この手法により、脂質組成、タンパク質濃度、および膜電位の変化が呼吸鎖SCの機能に及ぼす影響を試験することが可能となり、今後のメカニズム研究にとって有用なツールとなる。

概要

ミトコンドリアは真核生物の呼吸において中心的な役割を担っています。ミトコンドリア内膜（IMM）には、電子伝達系複合体（CI–CIV）とATP合成酵素（CV）からなる酸化的にリン酸化システムが存在します1。CIおよびCIIは、還元された基質からユビキノン（CoQ）へ電子を伝達してユビキノール（CoQH2）を生成し、この電子はCIII2およびシトクロム cを経由してCIVへと伝わり、そこで酸素が還元されて水になります。CI、CIII2、およびCIVによるプロトンポンプ作用によってプロトン駆動力（PMF）が形成され、これがCVによって利用されることで、ADPと無機リン酸（P）からATPが合成されます1。

CI、CIII2、およびCIVは、それぞれ独立して機能するだけでなく、SC I+III2+IV（レスピラソームとしても知られる）、SC I+III2、およびSC III2+IVなどの、明確な化学量論を持つ高次スーパーコンプレックス（SC）構造を形成することができる2,3,4,5。これらの複合体による機能的な利点は、依然として不明である6。その機能に関する仮説は、複合体の形成や基質のチャネリングにおける役割から、ミトコンドリア内膜（IMM）における高いタンパク質密度の副産物であるという説まで多岐にわたる3,7,8,9,10,11,12,13,14,15。近年の研究では、疎水性不整合に起因する膜歪み、タンパク質間相互作用、およびタンパク質-脂質相互作用を含む膜特性が、SCの形成と安定性に寄与することが示唆されている16。

膜タンパク質の構造および機能研究は、伝統的に界面活性剤で可溶化した複合体に依存してきましたが、これは天然の膜環境を破壊するため、膜電位やイオン勾配に依存するプロセスの解析を制限していました。対照的に、近年の進展により、膜タンパク質を再構成膜17,18,19または天然膜20,21,22,23中で構造的に特性解析できることが示されており、膜電位やイオン勾配に依存する膜タンパク質の機能メカニズムを調べる能力が大幅に向上しています。

本プロトコールでは、ミトコンドリア呼吸スーパーコンプレックス（SC）を定義されたプロテオリポソームに再構成するための、簡便で再現性の高い方法について説明します。得られたシステムは、制御された天然に近い膜環境において、呼吸SCの形成、安定性、および機能に関する根本的な問題を調査するための強力なプラットフォームとなります。再構成時にCoQ10とシトクロムcを組み込むことで、プロテオリポソームに再構成されたSCがNADH駆動の酸素消費をサポートすることを実証し、これにより複合体が脂質二重層内で機能的な能力を維持していることが示されます。さらに、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を用いて、プロテオリポソーム中のSCを容易に可視化できることを示し、構造的組織化と生化学的活性の直接的な相関を可能にします。

この手法は堅牢で容易に再現可能ですが、再構成を成功させるには、スーパーコンプレックスの安定性と活性を維持するために、脂質組成、界面活性剤濃度、タンパク質対脂質比の慎重な最適化、および効率的な膜封鎖が必要です。

本手法の全体的な目的は、規定された膜条件下で呼吸スーパーコンプレックス（SC）の構造的および機能的な統合解析を可能にすることである。このアプローチは、SCを密閉された脂質二重層に復元することで、膜電位の形成や生理学的に重要なタンパク質-脂質相互作用を維持させ、界面活性剤ベースのシステムの主要な限界を解消する。さらに、本システムでは脂質組成、コファクター、およびタンパク質含有量を精密に制御できるため、膜特性がSCの安定性と活性にどのように影響するかを体系的に検証するのに適している。界面活性剤で可溶化した調製物やin situアプローチと比較して、本手法はNADH駆動の酸素消費量などの機能アッセイとクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）による構造解析を組み合わせることができるという明確な利点があり、これにより他のシステムでは困難な構造-機能相関の解明が可能となる。

プロトコル

市販の心臓からブタ心臓ミトコンドリア膜を単離した。 食用に屠殺された動物から採取された組織。本プロトコルのために特別に生きた動物が使用されたわけではない。本材料の使用は、組織が副産物として得られたものであるため、動物倫理委員会の承認を免除されると判断された。 食用として屠殺された動物。

1. ブタ心臓ミトコンドリアの洗浄膜からのミトコンドリアスーパーコンプレックス SC I+III2/SC I+III2+IVの精製

  1. 洗浄済みミトコンドリア膜 40 mg (4 mL) を 10 mg/mL の分注量で解凍する（洗浄済み膜は既報24,25に従って調製する）。
  2. 膜を 4 mL の Buffer MX (30 mM HEPES, pH 7.7, 150 mM potassium acetate, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0.002% (w/v) phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1% (w/v) CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 1 mM potassium ferricyanide) で希釈する。Buffer MX で調製した 2% (w/v) digitonin (8 mL 中に digitonin 160 mg) を 8 mL 加える（最終比率 4:1, (mg digitonin: mg total membrane protein)）。最終容量は 16 mL となる。
  3. Dounceホモジナイザーを用いて、気泡が入らないように注意しながら手動でホモジナイズ（50ストローク）する。4 °C で 1 時間インキュベート（タンブリング）する。
  4. ホモジネートを 16,000 × g, 4 °C で 30 分間遠心分離する。上清を回収する。
  5. 100 kDa 分画限界の遠心フィルター濃縮器を用い、3000 × g, 4 °C で上清を 1 mL まで濃縮する。目的の容量に達するまで、遠心サイクルの間に十分に混合しながら 10 分サイクルで濃縮する（遠心サイクルの間に再懸濁させないと、フィルター付近で界面活性剤の局所濃度が上昇し、サンプルが凝集する傾向がある）。
  6. 濃縮したサンプルを 250 µL ずつ4つの分注量に分ける。 
  7. サイズ排除クロマトグラフィーカラム（カラム容量：24 mL）を、サイズ排除クロマトグラフィーバッファー（SEC buffer; 30 mM HEPES pH 7.8, 150 mM potassium acetate, 1 mM EDTA, 0.005% glycocide detergent）を用いて 48 mL (2カラム容量) 分平衡化する。
  8. 溶出容量 6 mL から開始し、溶出容量 24 mL まで 1 mL ずつ分画を回収するようにクロマトグラフィープログラムを設定する。250 µL の分注量（ステップ 1.6 より）を 24 mL のサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に注入する。サイズ排除クロマトグラフィーバッファーで予備平衡化したカラム（ステップ 1.7 より）を使用する。次のランを開始する前に、分画回収装置から分画を回収する。
  9. ステップ 1.6 で調製した残りの濃縮分注量について、ステップ 1.7 および 1.8 を繰り返す。
  10. SEC ランの各分画 10 µL を blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) ローディングダイ 5 µL と混合し、3%–12% アクリルアミドグラジエントゲルで電気泳動を行い、NADH/Nitro tetrazolium blue chloride CI インゲル活性測定26 によって、分画中の CI 活性を確認する。 
    注：呼吸鎖スーパーコンプレックス（SCs）は、24 mL の架橋アガロースゲルろ過媒体において、約 11.5 mL の溶出容量で溶出される。
  11. CI インゲル活性測定において最大の高分子量 CI 活性を示した分画をプールする。上記 1.5 の方法でサンプルを濃縮する。
    注：糖鎖界面活性剤 glyco-diosgenin GDN 中の濃縮 SCs は、最終濃度約 10 mg/mL で 30% (v/v) glycerol を加えて液体窒素 (Liquid N2) 中で保存できる。BCA アッセイに基づくと、40 mg の洗浄済みミトコンドリア複合体から 3.4 mg の全タンパク質が得られた。

2. 脂質ミックスの調製

注：既報のプロトコル27,28を改変したものである。クロロホルムは毒性があり、揮発性で、発がん性が疑われている。適切なPPEを着用し、認定済みの化学薬品用ドラフトチャンバー内でのみ取り扱うこと。ペンタンは引火性が非常に高い。火気から遠ざけること。適切なPPEを着用し、認定済みの化学薬品用ドラフトチャンバー内でのみ取り扱うこと。有機溶媒廃棄物は、施設の環境健康安全（EH&S）ポリシーに従い、承認されたハロゲン系/非ハロゲン系溶媒廃棄物容器に廃棄すること。

  1. ドラフトチャンバー内で、POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、およびCL (cardiolipin: 1,3-bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycerol; ウシ心臓組織由来) の 25 mg/mL ストック溶液を、それぞれクロロホルムで調製する。 
  2. 10 mM CoQ10 をクロロホルムで調製する。総脂質混合物 25 mg に対して、13 mL ガラス試験管にストック溶液から POPC 0.4 mL (10 mg)、POPE 0.4 mL (10 mg)、CL 0.2 mL (5 mg)、および 10 mM CoQ10 50 µL (最終濃度 500 nmol CoQ10 (20 nmol CoQ10/mg 脂質)) を加える。POPC:POPE:CL の最終重量比は 2:2:1 となる。
  3. 不活性ガス流（アルゴンまたは窒素）下で混合物を乾燥させてクロロホルムを除去し、その際、試験管をゆっくりと回転させて試験管壁に脂質混合物の薄層を形成させる。不活性ガスを絶えず流しながら 10 min 間乾燥させる。
  4. 乾燥した脂質層を 1 mL のペンタンで再溶解し、手順 2.3 を繰り返して、残留クロロホルムの除去を促進する。
  5. 乾燥させた脂質の入った試験管を真空デシケーターに入れ、室温で一晩インキュベートして溶媒を完全に除去する。 
  6. 脂質混合物を再水和させるため、プロテオリポソーム緩衝液 (PLB; 10 mM MOPS pH 7.4, 150 mM KCl) 5 mL を加え、漏れを防ぐために試験管をしっかりと密閉し、脂質が完全に溶解するまで（試験管壁に乾燥脂質が見えなくなるまで）緩やかにボルテックスにかける。
  7. 密閉を解き、試験管内に不活性ガス（アルゴンまたは窒素）を満たして再密閉し、室温で 1 h インキュベートする。1 h のインキュベーション後、脂質混合物を 300 µL ずつ分注し、−20 °C で保存する。 
    注：POPC:POPE:cardiolipin (2:2:1) の混合物は、経験的な最適化に基づき、また PE と cardiolipin がミトコンドリア内膜の主要構成成分であることから選択したが、本プロトコルは他の脂質組成の試験に合わせて容易に適応させることができる。

3. ミトコンドリアSCのリポソームへの再構成

  1. 液体 N 2 （ステップ 1.12）で保存したSC分注液を氷上で融解させる。サンプルをSECバッファーで再懸濁し、バッファー交換を行ってサンプルからグリセロールを除去する。100 kDaカットオフの遠心フィルターを用い、4 °C、3000 × gでサンプルを濃縮する。濃縮遠心の間（約5分ごと）に、サンプルをSECバッファーで再懸濁してバッファー交換を継続する。
  2. BCAアッセイ（ビスシンコニン酸タンパク質アッセイキット）を用いて、SCの最終濃度を確認する。
  3. ステップ 2.7で調製した脂質ミックスの300 µL分注液を融解させ、100 nmポリカーボネート膜を装着したエクストルーダーを用いて、室温で6サイクル押し出し（エクストリュージョン）を行う（1サイクルは、脂質混合物を左側のシリンジから右側へ、そして再び左側へ通過させる操作で構成される）。押し出しサイクル完了後、開始側とは反対側のシリンジから得られた100 nmリポソームを回収する。あるいは、超音波処理によってリポソームを生成することも可能である。 
  4. 別のチューブに入れ、押し出し後の脂質ミックス 250 µLに対し、20% (w/v)界面活性剤 9 µL（最終濃度 0.6% w/v）を加える。
    注：異なる界面活性剤を試すことができる。本実験では、アニオン性胆汁酸塩界面活性剤であるコール酸ナトリウムが最適であった。
  5. 転倒混和し、4 °Cで30分間インキュベートする。 
  6. 混合物にミトコンドリアSC 120 µg（またはそれ以上）と10 mM シトクロム c 3 µL（最終濃度 100 µM）を加える。PLBで全量を300 µLに調整する。最終的な脂質：タンパク質比は約 10:1 (w:w)となる。追加のコントロールとして、ミトコンドリアSCおよびシトクロム cの代わりにSECバッファー（30 mM HEPES, pH 7.8, 150 mM 酢酸カリウム, 1 mM EDTA, 0.005% グリコシド界面活性剤）を脂質-界面活性剤混合物に添加し、空のリポソームを並行して作製する。 
  7. 転倒混和し、4 °Cで30分間インキュベートする。 
  8. G-25樹脂を含むプリパック済み脱塩スピンカラムを、PLBバッファーで重力流により4回洗浄する。その後、カラムを 1,000 × gで2分間遠心洗浄する。
  9. 洗浄済みのプリパックG-25樹脂脱塩スピンカラムにプロテオリポソームサンプルを加え、4 °C、1,000 × gで2分間遠心して界面活性剤を除去する。溶出液を回収する。
    注：押し出し法で調製したリポソームは、超音波処理で生成したものよりも均一なサイズ分布を示した。サンプルの界面活性剤汚染を避けるため、プリパック脱塩スピンカラムの遠心時間はメーカーの推奨時間を超えないようにすること。プロテオリポソームは 4 °Cで保存し、活性の低下を最小限に抑え、スーパーコンプレックスの完全性を維持するため、通常36時間以内に使用した。

4. 脂質フロテーションアッセイ29

  1. PLBを用いて27%および7% (w/v) のスクロース溶液を作成する。3.5 mL遠心チューブに27%スクロースを1.5 mL、7%スクロースを0.9 mLの順で重ね、ステップグラジエントを作成する。
  2. SCを含むプロテオリポソーム溶液（ステップ3.9で作成）300 µLを、スクロースグラジエントの上に静かに重ねる。固定角ローターを用いて、4 °Cで2時間、100,000 × gで遠心分離を行う。
  3. 上層から下層に向かって、300 µLずつ9分画（または270 µLずつ10分画）を、混ざらないように注意して慎重に回収する。ペレットが存在する場合は、最後の分画に再懸濁して分画9または10として回収する。再構成されなかったSCは、分画9または10に蓄積するはずである。
    注：フロテーションアッセイは、再構成されたプロテオリポソームを、空のリポソームや再構成されていないタンパク質複合体から分離するのに有用である。これは再構成条件の最適化に使用される。

5. CI分光光度法によるフェリシアン化物活性測定およびCIインゲル活性測定

  1. 必要量のフェリシアン化反応バッファー（FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1% w/v 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1 mM フェリシアン化カリウム）を調製する。
  2. 1 mL キュベットに反応バッファー 990 µL を分注する。そこに（各グラジエント画分からの）サンプル 5 µL を加え、さらに 20 mM NADH（最終濃度 100 µM）5 µL を反応系に加える。キュベットを透明フィルムで密閉し、転倒混和する。
  3. 分光光度計を用いて、25 °C で 340 nm における吸光度減少速度をモニターする。340 nm における吸光度の減少は NADH の酸化を示す。すべての画分について3連で繰り返す。サンプルの代わりに PLB 5 µL を用いてブランクを測定する。
  4. ブランクを差し引いて NADH 酸化速度を算出し、各画分の全活性をプロットする。
    注：あるいは、本実験は 96ウェルプレートで実施することも可能である。
  5. 最大全活性を示す画分を回収する（チューブ底部の活性を含む画分は、未再構成のタンパク質に相当するため避ける）。回収した画分に PLB を加え、ショ糖を希釈して全量を 20 mL とする。
  6. 固定角ローターを用い、150,000 × g, 4 °C で 1 時間、サンプルを遠心分離する。上清を捨て、ペレットを 200 µL の PLB で再懸濁する。
  7. 前ステップで得られた再懸濁ペレット 25 µL を、2% w/v ジギトニン含有 PLB 25 µL と混合し、4 °C で 1 時間インキュベート（タンブラー混和）する。
  8. 未抽出のタンパク質を 16,000 × g で 20 分間遠心し、上清を回収する。
  9. 上清 30 µL に BN-PAGE ローディングダイ 10 µL を加え、3%–12% グラジエント BN-PAGE にロードする。CI および CIV のインゲル活性測定26を行うため、2枚のゲルを流す。
  10. ダーク BN-PAGE バッファー（25 mM Tris, 0.192 g Glycine, 200 mg Coomassie blue）を用い、150 V で 30 分間電泳を行う。その後、バッファーをライトブルーバッファー（25 mM Tris, pH 8.3, 0.192 g Glycine, 20 mg Coomassie blue）に交換し、200 V でさらに 2 時間電泳する。
  11. 電泳後、ゲルを適切な容器に移し、CI および CIV のインゲル活性測定26を行う。
    注：リポソームに再構成された複合体の構造的および機能的研究を行う場合は、ステップ 5.6 で得られた残りの再懸濁プロテオリポソームを使用する。再構成条件が完全に最適化されていれば、ステップ 4 および 5 を省略し、ステップ 3 から直接再構成プロテオリポソームを使用することができる。

6. 再構成したプロテオリポソームの膜完全性を測定するためのACMA蛍光消光アッセイ29

  1. 必要な量のACMA（9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine）反応バッファー（10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0.5 mg/mL 牛血清アルブミン (BSA), 2 mM 2-メルカプトエタノール）を調製する。 
  2. 1 mLキュベットに反応バッファーを930 µL分注する。再構成したプロテオリポソームを50 µL加え、キュベットを密封して転倒混和する。遮光下で8分間インキュベートする。
  3. 分光光度計のパラメータを、励起波長 410 nm、蛍光波長 490 nmに設定する。 
  4. インキュベーション後、キュベットを再度転倒混和し、室温で8分間分光光度計を用いて蛍光を測定する。
  5. 20 µM valiのみシン（最終濃度 80 nM）を4 µLキュベットに加え、転倒混和して8分間測定する。
  6. 1 mM CCCP（carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone）（最終濃度 6 µM）を6 µLキュベットに加え、転倒混和して8分間測定する。
  7. 空のベシクルコントロールを作成するため、ステップ6.2〜6.6を繰り返す。ただし、再構成したプロテオリポソームを「空のリポソーム」に置き換える。空のリポソームは、再構成したプロテオリポソームと同様の手順で作成するが、再構成時（ステップ3.6）にSCsの添加をSECバッファーに置き換えて作製する。
  8. 再構成したプロテオリポソームと空のリポソームの両方について、測定を3回繰り返し、相対蛍光強度の経時変化をプロットする。
    注：再構成したプロテオリポソームまたは空のリポソームのデータは、(Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin)によってスケーリングされる。ここで、Fmaxはそのサンプルの開始時のベースライン蛍光値であり、FminはCCCP添加後のそのサンプルの最低ベースライン値である。
    警告：CCCPは毒性のあるミトコンドリア脱共役剤であるため、ドラフトチャンバー内で手袋を着用して取り扱うこと。

7. 再構成したSCsの機能を評価するための酸素消費量のレスピロメトリー測定30.

注：酸素消費速度はクラーク型酸素電極システムを用いて測定します。再構成したSCの機能解析は、脱塩カラムからの溶出液（ステップ 3.9）を用いて直接行います。

  1. メーカーの指示に従って酸素電極システム装置をセットアップし、装置制御ソフトウェアを開く。測定チャンバーに超純水を 2 mL 加える。
  2. 撹拌速度を上げていっても酸素濃度のグラフが変化しなくなるまで、撹拌速度を設定する（10から開始し、10ずつ増加させる）。超純水を抜き、酸素飽和水（ボトルに入れた超純水を激しく振盪させたもの）を加える。
  3. Calibrate > Liquid-phase calibration > Air-saturated water をクリックし、校正が安定する（速度が 0 nmol per min になる）まで待機する。小型のスパチュラを用い、反応容器にジチオン酸ナトリウムの結晶を数粒（4–6粒）加え、チャンバー内の酸素をゼロにする。
  4. 信号がプラトーに達するまで待機してから次へ進む。校正値を保存し、反応チャンバーを 70% エタノール 1 mL × 5回、0.1 mM EDTA 1 mL × 5回、超純水 1 mL × 5回、およびオキシグラフ反応バッファー（ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0.02 mM EGTA, 0.5 mg/mL BSA）1 mL × 5回で洗浄する。
  5. ORB を 2 mL 加え、ソフトウェアの「start read」ボタンをクリックして、グラフが安定するまで待機する。プロテオリポソーム（サンプル）を反応チャンバーに加える際、ソフトウェア上のグラフにサンプルの添加を示すラベルを付ける。
    注：プロテオリポソームサンプルのタンパク質濃度は、リポソームに添加した全タンパク質量から推定する。タンパク質：脂質比 1:12、酸素電極システムチャンバー（2 mL）内での最終タンパク質濃度 50 µg/mL が最適であった。正確なプロテオリポソーム回収量は測定していない。
  6. 酸素電極システムの読み取り値が安定した後、反応チャンバーに NADH を加え、同時にソフトウェアのグラフに NADH 添加を示すラベルを付ける。そのまま 5分間測定を続ける。
  7. CCCP を加え、ソフトウェアに添加ラベルを付け、さらに 5分間測定を続ける。
  8. 阻害剤（例：CI 阻害剤 (Piericidin A)、CIII2 阻害剤 (Myxothiazol)、または CIV 阻害剤 (NaN3)）を加え、ソフトウェアのグラフにラベルを付けて 2分間測定し、その後測定を停止する。 
  9. グラフを保存し、次の測定を行う前に、反応チャンバーを 70% エタノール 1 mL × 5回、0.1 mM EDTA 1 mL × 5回、超純水 1 mL × 7回、および ORB 1 mL × 5回で洗浄する。
  10. バックグラウンド速度でデータを補正するため、NADH 添加前の読み取り値の傾きであるバックグラウンド速度を算出し、この速度を測定の時間経過に沿って線形外挿して、各時点における予想バックグラウンド [O2] を算出する。次に、各時点の測定 [O2] 値から、外挿したバックグラウンド [O2] を差し引く。
  11. 各試薬添加後のバックグラウンド補正済み [O2] 濃度測定値の傾きとして、酸素消費速度（OCR）を算出する。
  12. NADH 添加後の OCR に対する相対速度を算出するため、個々のトレースについて、測定した各 OCR（例：それぞれ NADH、CCCP、および阻害剤添加後の OCR）を NADH 添加後に測定した OCR で除す。     
    注：注意：ジチオン酸ナトリウムは強力な還元剤であり、酸化剤や水分と激しく反応する可能性がある。手袋を着用して取り扱うこと。阻害剤を含む廃棄物は、施設ガイドラインに従い有害化学廃棄物として処理すること。

8. 動的光散乱法を用いた再構成リポソームのサイズ推定

  1. 動的光散乱（DLS）装置の電源を入れ、レーザーが安定するまで約30分間待機します。
  2. 装置のデータ収集ソフトウェアを起動し、以前のファイルをすべて閉じてください。
  3. プロテオリポソームをろ過する（0.2 μm) 粒子状物質を除去します。
  4. 70を移送する µプロテオリポソームのLを、指紋や汚れが付着しないように注意しながら、清潔なキュベットに移します。
  5. キュベットを装置にセットし、蓋をしっかりと閉じてください。
  6. 新しいファイルを作成し、「Manual Measurement」を選択します。 > サイズ
  7. 温度を25に設定してください。 °Cに設定し、減衰指数をオートにしてください。
  8. 分散剤の特性（粘度および屈折率。例：水／緩衝液のRI = 1.330）を定義する。
  9. 取得パラメータ（自動時間、約3回の測定、汎用処理）を設定します。
  10. 測定を開始し、サイズ、多分散指数（PDI）、およびカウントレート（目標値：約100～500 kcps）をモニタリングします。
  11. 結果の解析：粒度分布（強度/体積）およびPDI（多分散指数）を確認する。<（0.3まで許容）、および自己相関の質（緩やかな減衰、安定したベースライン）を確認し、データを保存する。

9. クライオ電子顕微鏡用グリッドの作製とスクリーニング

  1. ステップ5.11（ステップ4および5を省略した場合はステップ3.9）で調製したプロテオリポソーム試料を用いて、EMグリッドをセットアップする。必要に応じて、ステップ5.6を繰り返し、より少量のPLBで再懸濁することでプロテオリポソームを濃縮する。
  2. グロー放電クリーニングシステムを用い、空気中で20 mA、90秒間、穴あきカーボンコート300メッシュ銅グリッドにグロー放電処理を行う。
  3. 自動プランジ凍結装置を、湿度95％、温度15 °Cに設定し、以下のパラメータでプランジ凍結の準備を行う：ブロット時間10 s、ブロット強度 −8、待機時間10 s、ドレイン時間0。
  4. グロー放電処理済みのグリッドを保持したピンセットをプランジ凍結装置に取り付ける。
  5. 自動プランジャー上のグロー放電処理済みグリッドに、プロテオリポソーム試料を4.0 µL添加する。
  6. グリッドを10秒間インキュベートした後、10秒間ブロッティングし、液体エタン中でプランジ凍結させる。グリッドを慎重に液体N2チャンバー内のグリッドボックスへ移し、その後、液体N2保存デュワーに移す。
  7. 凍結させたグリッドをロードし、クライオ試料ローダーを備えた透過電子顕微鏡でスクリーニングを行う。本手順では、直接電子検出器を備えた透過電子顕微鏡を使用した。
  8. 製造元の指示に従って顕微鏡をセットアップし、再構成されたプロテオリポソームのスクリーニングを行う。画像を保存する。
    注：注意：液体エタンは極めて可燃性が高く、極低温であるため、火災や低温火傷を避けるため、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、火気のない場所で取り扱うこと。液体窒素は極低温であり、深刻な低温火傷や酸素欠乏を引き起こす可能性がある。適切な極低温用PPEを着用し、換気の良い場所でのみ使用すること。

結果

本プロトコルを用いて、ブタ心臓ミトコンドリアから単離したミトコンドリアスーパーコンプレックス（SC）の最適な再構成条件を同定した（Figure 1A,B）。スクロースステップ勾配プロトコルは、再構成されたプロテオリポソームを、空の小胞や組み込まれなかったタンパク質から効果的に分離させることができ、迅速な試験と条件の最適化を可能にする。Figure 2に示す代表的な結果は、遠心分離前後における試料添加後の勾配を示している。さらに、呼吸鎖SCをリポソームに再構成するために使用する界面活性剤を最適化した。アニオン性胆汁酸界面活性剤、CHAPS、ジギトニン、配糖体界面活性剤の4種類の異なる界面活性剤を、SCの再構成に個別に用いた。各界面活性剤について、分画中の全CI活性をNADH-フェリシアン化物酸化還元アッセイにより測定した（Figure 3A–D）。再構成が成功した場合、2つのスクロース濃度（27% w/v sucroseおよび7% w/v sucrose）の界面にある分画でCIの最大活性が観察された。特筆すべき点として、アニオン性胆汁酸界面活性剤とCHAPSでは分画#10で最小限の活性しか検出されなかったが、ジギトニンと配糖体界面活性剤の両方では分画#10で相当な活性が認められ、ジギトニンおよび配糖体界面活性剤ではスーパーコンプレックスがリポソームに効果的に再構成されないことが示された。以降のすべての再構成には、アニオン性胆汁酸界面活性剤を使用した。

ジギトニンで抽出したPOPC:POPE:CL (2:2:1) プロテオリポソームのブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）ゲルを用いてCIおよびCIVのインゲル活性測定を行ったところ、再構成後のSCおよび個々のETC複合体の相対量が得られた（Figure 4）。結果は、ジギトニンによる再抽出およびBN-PAGE後も、プロテオリポソーム内においてCIとCIII2の相互作用が大部分維持されていることを示している。スーパー複合体のバンドに一部のCIV活性が認められるものの、CIV単体に一致する低分子量領域でも強いシグナルが観察され、解離していることが示唆された。再構成リポソームの膜透過性はACMA蛍光消光法を用いて測定され、プロテオリポソームのプロトンに対する透過性は有意ではないことが示された（Figure 5A,B）。再構成リポソームのサイズをDLSを用いて推定したところ、再構成前のエクストルージョンにより、最終的なプロテオリポソームのサイズ分布は、空のベシクルで直径 82.9 ± 0.8 nm、再構成されたスーパー複合体プロテオリポソーム（RSPs）で 110.6 ± 0.4 nmとなった（Figure 6）。プロテオリポソームによる酸素消費量を用いてSC機能を評価したところ、明確な阻害剤感受性のNADH駆動型酸素消費が認められた（Figure 7A）。NADH添加後のOCRに対する相対的なOCRをプロットすることで、RSPs内での共役度を直接的に評価でき、すなわち、NADH単独添加時と比較してCCCP添加後にOCRが約1.5倍に増加した（Figure 7B）。スクリーニングしたCryo-EMグリッドにより、プロテオリポソーム膜中のSCの可視化が可能となり、再構成が成功したことが確認された（Figure 8A–I）。

figure-results-1
図 1: ブタ心臓ミトコンドリアからの界面活性剤可溶化スーパーコンプレックスの単離および特性解析。 (A) ジギトニンで抽出したブタミトコンドリア膜複合体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）精製の代表的なクロマトグラム。 (B)  Aの分画をCIインゲル活性染色で可視化したBlue-native PAGE（BN-PAGE）。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-2
図 2: プロテオリポソームを用いたショ糖ステップ勾配。超遠心機を用いて 100,000 × g で 2 時間遠心分離する前（左）と後（右）。勾配にロードされたプロテオリポソーム試料は、空の小胞、プロテオリポソーム、および底部に凝集したタンパク質に分離される。その後、この勾配は記載の通り、さらなる特性解析のために分画される。各分画のおおよその範囲が示され、ラベル付けされている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3: 異なる界面活性剤における再構成効率を評価するための浮遊アッセイ。(A) アニオン性胆汁酸塩界面活性剤、(B) 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) (0.6% (w/v))、(C) ジギトニン (0.6% w/v)、(D) グリコシド界面活性剤 (GDN) (0.6% (w/v)) で再構成した後、ショ糖ステップ勾配からの各分画における CI NADH-フェリシアン化物活性。分画 #10 は、最終分画のペレットを再懸濁させることで得られる。分画 #10 における活性は、タンパク質が再構成されなかったことを示す。n = 3、エラーバーは SD = 標準偏差を示す。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-4
図4: 3%–12% BN-PAGEを用いて解析したジギトニン抽出プロテオリポソームのインゲル活性測定。CI（左）およびCIV（右）のインゲル活性測定。R = レスピラソーム (SC I+III2+IV)、SC1,3 (SC I+III2)、IGA CI = (CI インゲル活性測定)、IGA CIV = (CIV インゲル活性測定)。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-5
図 5: 再構成プロテオリポソームにおけるプロトン漏出を検出するためのACMA蛍光消光アッセイ。pH感受性色素（ACMA）を用い、ValinomycinおよびCCCPを順次添加した後の、再構成プロテオリポソーム（シアン）と空リポソーム（オレンジ）の内部pHを比較した。比較のため、異なるプロテオリポソーム調製物から得られた代表的なACMA蛍光トレースを示す。(A) 膜が損傷した再構成リポソーム（漏出あり）。(B) 膜が完全な再構成リポソーム。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-6
図 6: 空リポソームおよび再構成SCプロテオリポソームの動的光散乱測定。エクストルージョン後の空リポソーム（オレンジ）およびSC再構成プロテオリポソーム（シアン）の平均体積重み付け粒度分布を示す。測定は3回のテクニカルリピートで実施した。空リポソームの平均流体力学的直径は 82.9 ± 0.8 nm であり、RSPの平均流体力学的直径は 110.6 ± 0.4 nm であった。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-7
図7: リポソームに再構成したSCの共役を評価するための酸素消費アッセイ。エクストルージョン法で調製したリポソームへの再構成後、呼吸活性およびETC複合体の共役を評価するために酸素消費量を測定した。(A) 背景補正後の代表的な酸素電極のトレース。NADHの添加によるCI駆動呼吸の開始、CCCPによるプロトン勾配の消失および最大脱共役酸素消費速度（OCR）の測定、ピエリシジンAによるCIの阻害、アンチマイシンAによるCIII2の阻害、またはNaN3（アジ化ナトリウム）によるCIVの阻害に伴う酸素濃度の変化を示している。 (B) 指示された条件下でのOCRの定量値であり、ステップ7.10に従って補正したものである。NADH添加後のOCRに対する相対的なデータポイントを、各トレースについて平均値 ± SD（エラーバー）とともに示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-8
図 8: プロテオリポソーム膜に再構成された SC のクライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）可視化。(A–C) プロテオリポソーム膜に関連した再構成 SC を示す、スクリーニング済みグリッドの代表的な電子顕微鏡写真。再構成された SC は黄色の矢印で示されている。スケールバー = 50 nm。(D–I) プロテオリポソーム膜上の SC 粒子を高倍率で観察した代表例。スケールバー = 10 nm。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

ミトコンドリア呼吸スーパーコンプレックス（SC）を規定のプロテオリポソームに再構成するための、簡便で再現性の高い方法を提示します。これにより、その構造と機能の制御された解析が可能になります。本プロトコルにおいて、再構成を成功させるためにはいくつかのステップが極めて重要です。我々の経験では、エクストルージョン法で調製したリポソームは、ソニケーション法で調製したものよりもサイズ分布が均一（動的光散乱法により評価）でした。膜の封鎖および脂質二重層へのSCの適切な組み込みを促進するためには、あらかじめ充填された脱塩スピンカラムを用いて界面活性剤を効率的に除去することが不可欠です。除去が不十分な場合、プロテオリポソームに漏出が生じたり、不安定になったりすることがあります。また、脂質組成、タンパク質対脂質比、および界面活性剤の選択の最適化も同様に重要であり、これらのパラメータは再構成効率とSCの安定性に強く影響します。初期の最適化にはスクロース密度勾配浮上法が有用ですが、条件が確定した後は、サンプル損失や勾配分画中の破壊を避けるため、脱塩スピンカラム処理後のプロテオリポソームをそのまま後続の構造・機能解析に使用することが好ましいです。活性を観察するために必要な分画の量は、調製ごとに異なります。調製物に応じて、反応混合液に添加する量を調整してください。プロテオリポソーム膜内における呼吸SCの配向は、呼吸能の測定値に大きな影響を与える可能性があります。本再構成手順は、単一のトポロジーを強制するように最適化されていません。したがって、配向は混在していると予想されますが、CIフェリシアン化物アクセスアッセイの結果、CIの末梢アームが外向きになる強い傾向があることが示されています。

再構成されたスーパーコンプレックスの配向性を実験的に評価し、界面活性剤の存在下および非存在下でCIフェリシアン化物活性を測定した。完全なRSPでは、外部から添加したNADHは、末梢アームが外部媒体に露出しているCI分子にのみアクセスできるが、界面活性剤による透過処理を行うと、すべてのコンプレックスにNADHがアクセスできるようになる。したがって、このアッセイはプロテオリポソームのトポロジーを完全に構造的に決定するものではなく、外部媒体に面しており機能的にアクセス可能なCI末梢アームの割合を推定するものである。これらの条件下で測定された活性を比較した結果、レスピラソーム（SC）の83.1% ± 0.04%がCI末梢アームを外側に向けて配向しており、再構成過程において顕著な配向バイアスがあることが明らかになった。

再現性と安定性を向上させるために、いくつかの変更およびトラブルシューティング戦略が有効です。ショ糖密度勾配から回収したデジトニン抽出プール分画を用いてCIおよびCIVのインゲル活性測定を行うと、SCのバンドが認められ、再構成中にSCが完全に解離しないことが示されます。しかし、SCのバンドはCIV活性ゲルよりもCI活性ゲルで強く、再構成後にCIVがCIおよびCIII2から部分的に解離している可能性が示唆されます（図4）。脂質組成を調整することで、SCの安定性を高められる可能性があります。CIVの部分的な解離は、界面活性剤の選択や再構成時の急速な界面活性剤除去に起因する場合もあり、これによりスーパーコンプレックス内の弱いタンパク質間相互作用が不安定化すると考えられます。界面活性剤交換条件をさらに最適化することで、CIVの保持率を向上させることができます。加えて、機械的ストレスを最小限に抑え、不必要な精製ステップを避け、サンプルを慎重に取り扱うことで、プロテオリポソームの完全性を維持できます。機能解析においては、膜の漏出が膜貫通プロトン勾配への共役を妨げるため、プロテオリポソームが完全に封止されていることを確認することが不可欠です。クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のグリッド作成では、連続カーボンコートグリッドの使用が重要であり、これによりグリッドホール内の粒子分布が改善することが示されています19。

多くの利点があるものの、このアプローチには限界もあります。プロテオリポソームは、天然のミトコンドリア内膜の組成および動的な複雑さを完全に再現しているわけではなく、特にCIVなどのSC構成成分の部分的な解離が課題として残っています。また、機能的な読み取り値は、不完全な共役や再構成効率の不均一性の影響を受ける可能性があります。それにもかかわらず、界面活性剤で可溶化した系と比較して、本手法は脂質とタンパク質の相互作用を維持し、天然に近い膜環境をサポートすると同時に、in situアプローチよりも優れた実験的制御を可能にします。したがって、本手法は、脂質組成や膜特性がSCの安定性と活性をどのように調節しているかを系統的に調査するための有用なプラットフォームを提供します。

呼吸鎖スーパーコンプレックスの組織化の崩壊が、広範なミトコンドリア疾患および代謝疾患に関与しているため、これらの関係性を理解することは特に重要である31,32,33,34,35,36,37,38,39,40。Leigh症候群41,42,43,44,45,46,47、Barth症候群48,49,50,51,52,53,54、Sengers症候群48などの疾患で見られるETCコンプレックスの構築、カルジオリピン合成、または脂質リモデリングの欠陥は、スーパーコンプレックスを不安定化させ、電子伝達を損ない、ATP産生を減少させ、活性酸素種の生成を増加させる可能性がある。これらの生物エネルギー的な欠陥は、心臓、骨格筋、脳などのエネルギー需要の高い組織に不釣り合いなほど大きな影響を及ぼし、心筋症、運動不耐症、神経変性などの表現型を引き起こす36,37,38。逆に、スーパーコンプレックスの形成は、ETCコンプレックスを安定化させ、病理的なROS産生を制限することで、ストレス下で代償的および保護的な役割を果たす可能性が新たな証拠により示唆されている55,56。本稿で述べる再構成プロテオリポソームプラットフォームは、疾患に関連する脂質リモデリング、変異、または薬理学的介入がスーパーコンプレックスの構築と機能にどのように影響するかを直接検証するための制御された系を提供し、それによってミトコンドリア機能不全の機序研究を可能にし、将来的な治療戦略への知見を与えるものである。

酸素消費速度が低い場合は、スーパーコンプレックスへの組み込み不全、CIVの部分的な解離、界面活性剤の残留、CoQ10またはシトクロム cの不足、NADHの分解、あるいはオキシグラフチャンバー内のタンパク質濃度が低いことが原因と考えられます。フローテーションアッセイまたはBN-PAGEで再構成を確認し、ACMAクエンチングで膜の完全性を検証し、NADHを新しく調製し、タンパク質対脂質比、コファクター濃度、界面活性剤の除去、およびサンプル濃度を最適化してください。プロテオリポソームの漏出は、不完全な界面活性剤の除去、過剰な界面活性剤濃度、過酷な取り扱い、繰り返しの凍結融解サイクル、または脂質の損傷によって起こる可能性があります。ACMAアッセイでプロトン漏出が観察された場合は、新しく平衡化した脱塩カラムを用いて界面活性剤の除去をやり直し、カラムの過剰な遠心分離を避け、リポソームを新しく調製し、機械的ストレスを最小限に抑え、再構成後すぐにプロテオリポームを使用してください。濃縮ステップ中の凝集は、濃縮膜における局所的なタンパク質濃度または界面活性剤濃度が高いために発生することがあります。サンプルは短時間（10 min）の遠心分離サイクルで濃縮し、遠心分離の間はサンプルを穏やかに再懸濁させ、過剰な濃縮を避け、サンプルを 4 °C に維持し、後続の工程で使用する前に低速の清澄化によって目に見える凝集物を取り除いてください。不均一なフローテーション挙動は、リポソームサイズのばらつき、不完全な界面活性剤の除去、凝集、不適切なスクロース層の形成、あるいはサンプルロード時やフラクション回収時の勾配の乱れを反映している可能性があります。スクロース溶液を新しく調製し、界面を混ぜないようにゆっくりと勾配を形成し、均一に押し出したリポソームを使用し、遠心分離条件を一定に保ち、フラクションを上から下へ穏やかに回収してください。cryo-EMにおける粒子の分布不良は、プロテオリポソーム濃度が低いこと、凝集、カーボンへの優先的な吸着、グリッドの濡れ不良、氷が厚いこと、または過剰なブロッティングに起因することがあります。プロテオリポソーム濃度を最適化し、グリッド作製の前に凝集物を取り除き、グロー放電条件を調整し、ブロット時間とブロット力をテストし、異なるグリッドタイプやカーボン支持体を検討し、可能な限り新しく調製したサンプルを使用してください。

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

グリッドのスクリーニングは、UC Davis BioEM Core施設にて実施されました。スクリーニングにご協力いただいたFei Guo博士に感謝いたします。本研究は、NIHのNIGMSによる助成金 R35GM137929 (JAL) の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)Avanti Research860320
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (POPE)Avanti Research850757
1,3-ビス(sn-3’-ホスファチジル)-sn-グリセロール (カルジオリピン、ウシ心臓組織由来)Avanti Research840012
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸 --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸 (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-ジアミノベンジジン ---- DABBSigma-AldrichD4293
カルボニルシアニド m-クロロフェニルヒドラゾン ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
クロロフォームSigma-Aldrich650948
コエンザイム Q10Sigma-AldrichC9538
シトクロム c (ウマ心臓由来)Sigma-AldrichC2506
ジギトニンSigma-Aldrich300410
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-テトラ酢酸 --- EGTASigma-AldrichE3889
エチレンジアミン四酢酸 -- EDTASigma-AldrichE6758
グリセロールSigma-AldrichG7893
グリコジオスゲニンAnatraceGDN101界面活性剤
ラウリルマルトースネオペンチルグリコール ---- LMNGSigma-AldrichNG310
塩化マグネシウムSigma-AldrichM8266
ミキソチアゾールSigma-AldrichT5580
NADH 二ナトリウム塩Sigma-Aldrich481913
ニトロテトラゾリウムブルー塩化物Sigma-AldrichN6876
ピエリシジン ASigma-Aldrich96861
酢酸カリウムSigma-AldrichP5708
塩化カリウムSigma-AldrichP3911
フェリシアン化カリウムSigma-Aldrich702587
リン酸一カリウム ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002
コール酸ナトリウム水和物Sigma-AldrichC1254
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9888
ジチオン酸ナトリウムSigma-Aldrich71699
スクロースSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-アミノ-6クロロ-2-メトキシアクリジン)Sigma-AldrichSML4162
装置およびキット
Amicon® ウルトラ遠心フィルター, 100 kDa MWCO 0.5 mLMilliporeUFC5100
Amicon® ウルトラ遠心フィルター, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Beckman Optima TLX 超遠心機Beckman Coulter
BN-PAGE ゲルブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル
Beckman Optima XE 超遠心機Beckman Coulter
グロー放電クリーニングシステムグロー放電クリーニングシステム
Glacios 2 Cryo-TEM (Gatan K3検出器搭載)Thermo Fisher Scientific透過型電子顕微鏡
KIMBLE Dounce 組織ホモジナイザーセットSigma-AldrichD9188
Leica Automatic GP2 プランジャーLeica
Microfuge 16Beckman CoulterA46474
NGC Discover 10 クロマトグラフィーシステムBio-Rad7880009
Oxygraph+酸素電極システム
PD-10 脱塩カラムCytiva28918007サイズ排除スピンカラム
Pierce BCA タンパク質定量キットThermo Fisher Scientific23225ビシンコニン酸タンパク質定量キット
Q-125 超音波発生装置Q-sonicaQ125-110
Sephadex G-25 M カラム充填済み G-25 レジン脱塩スピンカラム
SpectraMax M2 マイクロプレートリーダーMolecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596架橋アガロースゲルろ過担体
TLA-100.3 固定角ローターパッケージBeckman Coulter349490
Type 50.2 Ti 固定角ローターBeckman Coulter337901
Milli-Q (MQ) 水超純水
Malvern Zetasizer ZS 動的光散乱 (DLS) 装置Malvern Paranytical
Hansatech Oxygraph+ システムHansatech Instruments
PELCO easiGlow グロー放電クリーニングシステムTED PELLA, INC
Vitrobot Mark IV システムThermo Fisher Scientificプランジ凍結機
Quantifoil R 1.2/1.3 300 mesh 銅グリッド (2 nm カーボン)TED PELLA, INC668-300-Cu-100穴あきカーボンコーティング
Avanti ミニエクストルーダーAvanti Lipids610000

参考文献

  1. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961;191:144-8.
  2. Dudkina NV, Kudryashev M, Stahlberg H, Boekema EJ. Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15196-200.
  3. Althoff T, Mills DJ, Popot JL, Kühlbrandt W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 2011;30:4652-64.
  4. Schäfer E, Dencher NA, Vonck J, Parcej DN. Three-dimensional structure of the respiratory chain supercomplex I1III2IV1 from bovine heart mitochondria. Biochemistry. 2007;46:12579-85.
  5. Schägger H, Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 2000;19:1777-83.
  6. Milenkovic D, Blaza JN, Larsson NG, Hirst J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metab. 2017;25:765-76.
  7. Berndtsson J, et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Rep. 2020;21. doi:10.15252/embr.202051015.
  8. Moe A, Di Trani J, Rubinstein JL, Brzezinski P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118. doi:10.1073/pnas.2021157118.
  9. Blaza JN, et al. Kinetic evidence against partitioning of the ubiquinone pool and the catalytic relevance of respiratory-chain supercomplexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15735-40.
  10. Diaz F, Enríquez JA, Moraes CT. Cells lacking Rieske iron-sulfur protein have a reactive oxygen species-associated decrease in respiratory complexes I and IV. Mol Cell Biol. 2012;32:415-29.
  11. Maranzana E, et al. Mitochondrial respiratory supercomplex association limits production of reactive oxygen species from complex I. Antioxid Redox Signal. 2013;19:1469-80.
  12. Schägger H, et al. Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J Biol Chem. 2004;279:36349-53.
  13. Acín-Pérez R, et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell. 2004;13:805-15.
  14. Letts JA, Sazanov LA. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nat Struct Mol Biol. 2017;24:800-8.
  15. Protasoni M, et al. Respiratory supercomplexes act as a platform for complex III-mediated maturation of human mitochondrial complexes I and IV. EMBO J. 2020;39. doi:10.15252/embj.2019102817.
  16. Pöverlein MC, Jussupow A, Kim H, Kaila VRI. Protein-induced membrane strain drives supercomplex formation. eLife. 2024;13. doi:10.7554/eLife.102104.1.
  17. Mandala VS, MacKinnon R. Voltage-sensor movements in the Eag Kv channel under an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119. doi:10.1073/pnas.2214151119.
  18. Falzone ME, MacKinnon R. Gβγ activates PIP2 hydrolysis by recruiting and orienting PLCβ on the membrane surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2301121120.
  19. Grba DN, et al. Molecular mechanism of the ischemia-induced regulatory switch in mammalian complex I. Science. 2024;384:1247-53.
  20. Tao X, Zhao C, MacKinnon R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2302325120.
  21. Zheng W, Chai P, Zhu J, Zhang K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 2024;631:232-9.
  22. Nakano A, et al. Structures of respiratory supercomplexes and ATP synthase oligomers in mammalian mitochondrial inner membrane. Nat Commun. 2026;17:4075. doi:10.1038/s41467-026-70578-x.
  23. Coupland CE, et al. High-resolution electron cryomicroscopy of V-ATPase in native synaptic vesicles. Science. 2024;385:168-74.
  24. Letts JA, Fiedorczuk K, Sazanov LA. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 2016;537:644-8.
  25. Letts JA, et al. Structures of respiratory supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Mol Cell. 2019;75:1131-46.e6.
  26. Jha P, Wang X, Auwerx J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Curr Protoc Mouse Biol. 2016;6:1-14.
  27. Biner O, Fedor JG, Yin Z, Hirst J. Bottom-up construction of a minimal system for cellular respiration and energy regeneration. ACS Synth Biol. 2020;9:1450-9.
  28. Wright JJ, et al. Reverse electron transfer by respiratory complex I catalyzed in a modular proteoliposome system. J Am Chem Soc. 2022;144:6791-801.
  29. Lee SY, Letts JA, MacKinnon R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 2009;387:1055-60.
  30. Caldeira D de AF, Oliveira DF de, Cavalcanti-de-Albuquerque JP, Nascimento JHM, Zin WA, et al. Isolation of mitochondria from fresh mice lung tissue. Front Physiol. 2021;12:748261. doi:10.3389/fphys.2021.748261.
  31. Shi H, et al. Global burden of ischaemic heart disease from 2022 to 2050: projections of incidence, prevalence, deaths, and disability-adjusted life years. Eur Heart J Qual Care Clin Outcomes. 2025;11:355-66.
  32. Rahman S. Mitochondrial disease in children. J Intern Med. 2020;287:609-33.
  33. Pérez-Albert P, et al. Mitochondrial disease in children: the nephrologist’s perspective. JIMD Rep. 2018;42:61-70.
  34. Gorman GS, et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Ann Neurol. 2015;77:753-9.
  35. Pitceathly RDS, Rahman S. Mitochondrial DNA-related diseases associated with single large-scale deletions and point mutations. In: Gasparre G, Porcelli AM, editors. The Human Mitochondrial Genome: From Basic Biology to Disease. London: Academic Press; 2020. p. 353-74.
  36. Morán M, et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction: implications in neurodegeneration. Free Radic Biol Med. 2012;53:595-609.
  37. Chinnery PF. Primary mitochondrial disorders overview. In: Adam MP, Feldman J, Mirzaa GM, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, et al., editors. GeneReviews®. Seattle: University of Washington, Seattle; 1993–2026. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1224/
  38. Ellis CE, et al. Mitochondrial lipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking α-synuclein. Mol Cell Biol. 2005;25:10190-201.
  39. Hekimi S, Wang Y, Noë A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells: the discerning killers. Front Genet. 2016;7:161. doi:10.3389/fgene.2016.00161.
  40. Chouchani ET, et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 2014;515:431-5.
  41. Van de Wal MAE, et al. Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome: pathophysiology and intervention. Brain. 2022;145:45-63.
  42. Hoefs SJG, et al. NDUFA10 mutations cause complex I deficiency in a patient with Leigh disease. Eur J Hum Genet. 2011;19:270-4.
  43. Ostergaard E, et al. Respiratory chain complex I deficiency due to NDUFA12 mutations as a new cause of Leigh syndrome. J Med Genet. 2011;48:737-40.
  44. Marin SE, et al. Leigh syndrome associated with mitochondrial complex I deficiency due to novel mutations in NDUFV1 and NDUFS2. Gene. 2013;516:162-7.
  45. Adjobo-Hermans MJW, et al. NDUFS4 deletion triggers loss of NDUFA12 in Ndufs4−/− mice and Leigh syndrome patients: a stabilizing role for NDUFAF2. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2020;1861:148213. doi:10.1016/j.bbabio.2020.148213.
  46. Leshinsky-Silver E, et al. NDUFS4 mutations cause Leigh syndrome with predominant brainstem involvement. Mol Genet Metab. 2009;97:185-9.
  47. Piekutowska-Abramczuk D, et al. NDUFB8 mutations cause mitochondrial complex I deficiency in individuals with Leigh-like encephalomyopathy. Am J Hum Genet. 2018;102:460-7.
  48. Bertero E, Kutschka I, Maack C, Dudek J. Cardiolipin remodeling in Barth syndrome and other hereditary cardiomyopathies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020;1866:165803. doi:10.1016/j.bbadis.2020.165803.
  49. Xu Y, et al. Loss of protein association causes cardiolipin degradation in Barth syndrome. Nat Chem Biol. 2016;12:641-7.
  50. McKenzie M, Lazarou M, Thorburn DR, Ryan MT. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth syndrome patients. J Mol Biol. 2006;361:462-9.
  51. Acehan D, Xu Y, Stokes DL, Schlame M. Comparison of lymphoblast mitochondria from normal subjects and patients with Barth syndrome using electron microscopic tomography. Lab Invest. 2007;87:40-8.
  52. Dudek J, et al. Cardiolipin deficiency affects respiratory chain function and organization in an induced pluripotent stem cell model of Barth syndrome. Stem Cell Res. 2013;11:806-19.
  53. Hagen TM, et al. Acetyl-L-carnitine fed to old rats partially restores mitochondrial function and ambulatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9562-6.
  54. Schlame M, et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. J Am Coll Cardiol. 2003;42:1994-9.
  55. Ayala-Hernandez MG, et al. Respiratory complex III2 assembles complex I via toxic intermediate in mitochondrial disease. bioRxiv. 2025:doi:10.1101/2025.06.17.660237.
  56. Liang C, et al. Formation of I2+III2 supercomplex rescues respiratory chain defects. Cell Metab. 2025;37:441-59.e11.

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

BiochemistryMitochondriaSupercomplexesReconstitutionProteoliposomesRespirationMetabolism
動画は近日公開

関連記事