本研究では、標準化された気管支肺胞洗浄液の採取および処理、7つのマーカーを用いたフローサイトメトリーパネル、13種類の分析物を対象としたマルチプレックスサイトカインアッセイ、および統合解析パイプラインを組み合わせた、統合的な可視化ワークフローを提示します。
この記事について
サマリー
要約
気管支肺胞洗浄液（BALF）は、下気道炎症を研究するための最も直接的に採取可能なサンプリングマトリックスですが、従来の分析は、単一マーカーのフローサイトメトリーと個別の分析物ごとの酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）の組み合わせに依存しており、このアプローチでは情報密度が制限され、細胞と因子の相関関係が不明確になります。本研究では、標準化された回収および前処理に、7マーカーの好中球および単球フローサイトメトリーパネル、13分析物のマルチプレックスサイトカインアッセイ、そしてuniform manifold approximation and projection（UMAP）、FlowSOMメタクラスタリング、階層的クラスタリング、Spearman相関ネットワーク、および主成分分析（PCA）に基づく統合解析パイプラインを組み合わせた、統合的な可視化ワークフローを提示します。
このワークフローを、気管支鏡検査を受けた成人112名の単一施設前向きコホート（微生物学的に肺感染症が確認された患者64名および非感染コントロール群48名で構成）に適用した。細胞学的およびフローサイトメトリーによる解析の結果、感染時に肺胞プロファイルがマクロファージ優位から好中球優位へと顕著にシフトすることが明らかになり、好中球の割合は中央値3.2%から68.4%へと上昇し、好中球の絶対濃度は約50倍に増加した。マルチプレックス解析により、ケモカイン、炎症性、および調節性モジュールのすべてがアップレギュレートされた、協調的な3つのモジュールによるサイトカイン応答が解消され、本研究コホート内ではCXCL8/IL-8、IL-1β、IL-6、CXCL1/GRO-α、およびG-CSFが単一マーカーとして最も強力な識別能を示した（曲線下面積 [AUC] 0.89〜0.94）。PCA、相関行列、およびネットワークグラフを用いた統合的な可視化により、被験者レベルで好中球-ケモカイン軸が密接に結合していることが明らかになり、BALF中の好中球数がネットワークの中心的なハブとして浮上した。
このワークフローは、臨床的に適応となるBALから日常的に得られる検体のみを使用し、追加のサンプル量を必要としません。また、呼吸器感染症における気道炎症を解明するための情報密度の高いフレームワークを提供しており、マルチパラメーターフローサイトメトリーおよびマルチプレックスビーズアレイプラットフォームを備えた三次診療機関の検査室での実施が可能であり、さらに縦断的な研究、シングルセル解析、治療評価研究へと展開できます。個々の分析物をバイオマーカーとして広く臨床導入するためには、独立した多施設共同コホートでの前向き検証が必要となります。
概要
ワクチンの戦略や治療法が進歩しているものの、下気道感染症による感染死は依然として世界的な死亡原因の大きな割合を占めており、特に小児および高齢者においてその傾向が顕著です1。好中球は、罹患した呼吸器系における自然免疫応答の初期段階で報告される主要な細胞であり、そのプロセスは侵入した病原体の排除に不可欠です。しかし、制御不能な好中球性炎症は、肺胞毛細血管障壁の崩壊や組織への酸化ストレスによる損傷を引き起こし、急性呼吸器不全症候群（ARDS）の発症につながります2,3。また、肺気道内の好中球は、他の組織とは異なる動員キネティクス、保持パターン、およびエフェクター挙動を示し、これらの違いが感染の終息または重症肺炎への進行に影響を与えます4。
気管支肺胞洗浄液（BALF）は、肺胞微小環境に関する重要な情報源であり、この部位における臨床的な免疫状態を最も正確に反映している5。ケモカインであるCXCL8は、CXCL1、CXCL2、CXCL5などの他のケモカインとともに、その受容体であるCXCR1およびCXCR2を介して好中球を肺に動員させる重要な役割を担っている6。サイトカインのIL-1β、IL-6、およびTNF-αはこのプロセスをさらに促進させるが、一方でIL-10は拮抗的に作用するサイトカインとして機能する。BALFにおけるこれらのレベルは、肺感染症の重症度や、細菌性、ウイルス性、および非定型肺炎による肺合併症の発現と相関することが示されており7、下気道感染症における早期診断および病原体の識別のために、マルチプレックスBALFバイオマーカープロファイルが採用されつつある8。
ルーチンのBALF検査では、通常、その検査の根底にある生物学的特性を完全に取り込むことができません。細胞数はサイトスピンサンプルの細胞を manually に分化させて推定し、一方で可溶性メディエーターは個別の酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて測定され、棒グラフとして提示されます。ケモカイン、サイトカイン、および各細胞型は個別に評価されるため、特定のケモカイン濃度勾配と、サンプル内でそれが影響を及ぼしている細胞集団との相関関係は確立されていません。多変量解析が行われない場合、サイトカインモジュール、ケモカインと好中球の用量反応関係、および固有の炎症シグネチャーを持つ患者サブグループの組み合わせが見落とされることがよくあります9。
計算能力の向上により、このような包括的なアプローチが次第に現実的なものとなっています。マルチパラメータフローサイトメトリーおよびスペクトラルフローサイトメトリーを、t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) や uniform manifold approximation and projection (UMAP) といった次元削減手法と組み合わせることで、高次元の免疫表現型を2次元空間にマッピングすることが可能になります。なお、サイトメトリーデータに適用した場合、UMAPの方が大域的なトポロジーの保持能力と再現性に優れていることが証明されています10。また、サイトカインのマルチアナライトパネルを用い、その後に階層的クラスタリングおよび相関ネットワーク解析を行うことで、単一サイトカインのアプローチでは識別できない、重症度と相関するシグネチャーの特定に寄与します11。この分野における進展にもかかわらず、呼吸器感染症において、同一のBALF検体から好中球の動員とサイトカインシグネチャーを研究するためにこれらの手法を統合したワークフローはまだ存在しません。本研究では、細胞診およびマルチパラメータフローサイトメトリーを用いて好中球の動員を調査し、続いてUMAPおよびマルチプレックス immunoassay によるサイトカインシグネチャー解析を行い、さらに階層的クラスタリング、相関行列、主成分分析を用いて解析する、統合的な可視化ワークフローについて記述します。このワークフローにより、下気道感染症における臨床的に適応のある気管支鏡検査で日常的に採取されるBALFサンプルを用いて、気道における細胞性および可溶性免疫リードアウトを単一のグラフにまとめた統合的な可視化が可能となります。
プロトコル
研究対象集団および倫理
本研究は、2026年1月から2026年4月にかけて、三次教育病院で実施された単一施設前向き観察研究である。プロトコルは承認番号2026HL-038の下で承認され、すべての研究手順に先立ち、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
日常的な臨床ケアの一環として、肺胞洗浄（BAL）を伴う診断的柔軟性気管支鏡検査を受けた18歳から75歳の成人を連続的にリクルートし、最終的な臨床的および微生物学的診断に基づき、感染群または非感染対照群に割り付けた。患者のリクルートから統合的な視覚的出力に至るまでの統合可視化ワークフローの概要を図 1に示す。
図 1: BALFを用いた好中球リクルートメントおよび炎症性サイトカイン応答のプロファイリングにおける統合的可視化ワークフローの概要。 左から順に、気管支鏡検査およびBALによる感染群と対照群の前向きリクルートメント、BALFの前処理（細胞ペレットと上清画分への分離）、細胞レベル（Wright–Giemsa細胞診およびマルチパラメーターフローサイトメトリー）と可溶性因子レベル（13-plexビーズベース免疫アッセイ）の並行測定、統合的可視化パイプライン（FlowSOMメタクラスタリングを用いたUMAP、階層的ヒートマップ、主成分分析、およびSpearman相関ネットワーク）、そして統合的な視覚的アウトプットの5つのステージにまとめられている。略語：BAL = 気管支肺胞洗浄、BALF = BAL液、UMAP = 一様多様体近似および投影。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
感染群の組み入れ基準は以下の通りとした：(1) 米国感染症学会（IDSA）および米国胸部疾患学会（ATS）のガイドラインに基づき、市中肺炎（CAP）、院内肺炎（HAP）、または人工呼吸器関連肺炎（VAP）のいずれかと診断された患者であること。(2) BALF培養で104 CFU/mL以上の病原体が1種類以上検出されたか、呼吸器マルチプレックスPCR、BALFのメタゲノム次世代シーケンシング、または呼吸器検体と血清検体のペアを用いた特異的抗原・抗体検査で病原体が検出されたこと。
対照群の基準は以下の通りとした：(1) 気管支鏡検査の理由が非感染性であること（不確定な肺結節の評価、感染を唆さない異常な放射線学的結果、または慢性咳嗽の検査を含む）。(2) 気管支鏡検査時に、微生物学的検査の結果が陰性であり、炎症または全身性感染の徴候が認められないことから、急性肺感染症がないこと。(3) 参加前の30日間に抗菌薬を使用していないこと。対照群は、健康なボランティアではなく、他の臨床的に適応のある肺疾患で気管支鏡検査を受ける患者からリクルートした。これは、当研究センターにおいて臨床的に適応のあるBALが日常的に行われる対象集団を反映している。
除外基準は以下の通りとした：(1) 過去6か月以内に悪性腫瘍および/または細胞毒性化学療法歴があること、(2) HIV血清陽性であること、(3) 固形臓器移植または造血幹細胞移植を受けていること、(4) プレドニゾン相当量での持続的な免疫抑制療法を受けていること。 > 0.3 mg/kgを3週間以上投与している、(5) 妊娠中または授乳中の女性、(6) 出血性素因の既往または経気管支柔軟性内視鏡検査の禁忌がある、(7) 重度の慢性呼吸器疾患の既往（慢性閉塞性肺疾患［COPD］のGOLD分類ステージIII/IV、特発性肺線維症、重症持続性喘息、または臨床的に有意な気管支拡張症）、(8) 活動性結核、(9) 過去30日以内に他の介入研究に参加している。BALは、1回目の気管支鏡検査時に、感染症による入院後72時間以内に、および機械換気管理中の感染症患者では挿管後48時間以内に実施した。
サンプルサイズ計算は、主要な細胞学的アウトカムである、群間のBALF中の好中球数に焦点を当てて行いました。感染気道と非感染気道の間で想定されるエフェクトサイズを0.6 SDとし、15%のドロップアウトを考慮した結果、両側検定において1群あたり最低45例のサンプルサイズが必要であると算出されました。 α p = 0.05、統計学的パワー80%とした。適格な候補者156名のうち、27名が適格要件を満たさなかった（18名は、主に規定期間内に疾患の原因となる病原体を特定できなかったこと、または処置自体への同意が得られなかったことにより選択基準を満たさなかった。9名は、主に活動性悪性腫瘍、化学療法の投与歴、慢性的な副腎皮質ステロイドの使用、重度の既存慢性肺疾患、または出血性素因により除外基準に抵触した）。残りの129名の参加者が気管支鏡検査を受けた。その後、17名の被験者が研究から脱落した（7名はBALFの回収量不足のため < 40%；入院中の同意撤回により4名；および最終的な微生物学的評価後の被験者の再分類により6名（培養結果に基づき潜在的感染症と診断された対照候補者が4名、培養分析後に感染の根拠が認められなかった感染候補者が2名）。最終的な研究対象者は、感染あり64名、感染なし48名の計112名であった。
BALFの回収および前処理
気管支鏡検査は、気管支肺胞洗浄に関する既報の技術的推奨事項に基づき、施設標準プロトコルに従って熟練した操作者により実施された。12リドカインを局所的に使用し、患者には中等度の静脈内鎮静を行い、酸素飽和度（SpO2）を維持するために補助酸素を投与した。₂) >92%。フレキシブル気管支鏡を挿入し、放射線学的異常が認められる気管支肺区域に配置した。放射線学的異常がびまん性であるか、または局在を特定できない場合は、右中葉または左舌区を選択した。各注入後、陰圧を用いて穏やかに手動吸引を < 100 mmHgで実施した。滅菌生理食塩水を計3～5回注入し、 37 °Cそれぞれ20～40 mL、合計で100～150 mLの容量を投与した。回収率は、投与量に対する回収量の割合として算出し、回収率が40%以上のサンプルのみを解析対象とした。
気管支の混入を減らし、肺胞成分を濃縮したサンプルを得るため、2回目以降の洗浄で回収したサンプルをプールした。ヒトBALFサンプルの長期保存および加温後に細胞組成や分画数に変化が生じるという最近の知見13を考慮し、気管支肺胞洗浄液（BALF）プールは氷上に保持し、回収から2時間以内に処理した。粘液を除去するため、孔径70 µmの滅菌ナイロンメッシュを用いてろ過を行った。予備試験において、ジチオスレイトールなどの粘液溶解剤や凝集防止剤を添加せず機械的に通過させるだけで、後続の表面エピトープの完全性を損なうことなく粘液塊を十分に除去できることが示されていたため、この方法を採用した。ろ過後、液を4 °Cで10分間、400 × gで遠心分離した。上清をデカンテーションしてサイトカイン分析用に低タンパク吸着クライオバイアルに分注し、細胞は0.5% 牛血清アルブミンおよび 2 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁させ、一部を細胞診およびフローサイトメトリー用に保存した。サイトカインサンプルは液体窒素で凍結し、–80 °Cで保存し、使用前の凍結融解サイクルを1回以内に留めた。
好中球の細胞診およびフローサイトメトリーによる定量
細胞病理学的な観点では、 100 µL BALF細胞懸濁液の一部を、サイトセントリフュージを用いてガラススライドに塗布した（参照 材料一覧）を300で × g 5分間自然乾燥させた後、ライト・ギムザ染色を施した。分画計算は、患者の病歴を知らされていない血液学検査技師が、1スライドあたり最低400個の細胞を計数し、マクロファージ、リンパ球、好中球、および好酸球の割合を算出することで行った。肺浸潤影を有する患者において、感染性肺疾患と非感染性肺疾患を区別する上での有用性が現在のエビデンスで示唆されていることから、BALF（気管支肺胞洗浄液）中の好中球割合を細胞病理学的な主要評価項目とした。14.
フローサイトメトリーによる定量プロトコルは、最近の4色気管支肺胞洗浄液（BALF）白血球分化プロトコルのバリデーション15に基づいており、好中球を特定するための追加マーカーを含めた。具体的には、BALFから単離した約 5 × 105 個の細胞を、ヒトFc受容体ブロッキング試薬（材料表を参照）を用いて 4 °C で 10 分間ブロッキングし、その後、CD45（クローン HI30）、CD66b（クローン G10F5）、CD15（クローン HI98）、CD16（クローン 3G8）、CD11b（クローン ICRF44）、CD14（クローン M5E2）、および HLA-DR（クローン L243）に対する抗体、ならびに固定可能な生存細胞染料（材料表を参照）を用いて 4 °C で 20 分間染色した。赤血球溶血には、市販の赤血球溶血液（材料表を参照）を用い、室温で 10 分間処理した。赤血球溶血後、細胞を 2% ウシ胎児血清を添加した PBS で2回洗浄し、フローバッファーに再懸濁させた後、マルチカラーフローサイトメーター（材料表を参照）で解析した。コンペンセーションは、単色染色のコンペンセーションビーズ（材料表を参照）を用いて行い、各パネルにFMO（fluorescence-minus-one）および未染色管を含めた。
各サンプルについて、少なくとも1 × 105 個のCD45⁺イベントを収集した。まずFSC-A/FSC-Hプロットでシングルレットをゲートし、次に生存（生存染料⁻）CD45⁺白血球をゲートし、その後、CD14⁺HLA-DR⁺単球・マクロファージを除外して、サイドスキャターの高いCD66b⁺顆粒球を選択した。次に、顆粒球集団の中からCD15⁺CD16⁺CD11b⁺イベントを好中球と定義した。この一次CD66b⁺顆粒球ゲートは、CD15⁺CD16⁺CD11b⁺の境界に限定せず、すべてのサイドスキャターが高いイベントを広く囲むように設定した。これにより、CD16-dim、CD11b-highの活性化好中球や、その他の未熟な顆粒球形態が、自動好中球総数に含まれるようにした。より厳格なCD15⁺CD16⁺CD11b⁺の定義は、後続のクラスター分析で個別に報告される成熟好中球サブセットを特徴付けるためのみに適用した。BALF中の好中球数（cells/µL）は、好中球の割合と、自動血球分析装置（Table of Materials参照）を用いて決定した総有核細胞数に基づいて算出した。補正マトリックス、ゲーティング戦略、および個々のサンプルの品質管理レポートをアーカイブし、解析者は収集および解析の全過程を通じて、参加者のグループ割り当てについて盲検化された状態を維持した。
マルチプレックス炎症性サイトカインプロファイリング
BALF上清を氷上で一度解凍し、短時間ボルテックスした後、10,000で遠心分離して清澄化した。 × g 5分間、以下で 4 °C アッセイの直前に調製する。3つの機能的カテゴリーに分類される13種類の分析物の測定は、カスタム磁性ビーズパネルを用いたマルチプレックスビーズベース免疫アッセイプラットフォームを用いて行った（参照 材料表）。前炎症性グループはIL-1で構成されたβ, IL-6, IL-17A, TNF-αα；ケモカイン群は、CXCL8/IL-8およびCXCL1/GRO-αで構成されました。α, CXCL10/IP-10、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、および調節性群はIL-10、IFN-（で構成されていた）γ、IL-1RAおよびG-CSF。分析対象物の選択は、肺炎または重症呼吸器感染症の研究におけるBALF（気管支肺胞洗浄液）または血清サイトカインのマルチプレックス解析で、有用であると最も一般的に報告されているものに基づいた。7,11希釈倍率（アッセイバッファーで1:2）は、感染サンプルと対照サンプルの双方から抽出した代表的なサブセットを用いて実施した予備実験に基づき決定し、これにより以下を確実にしました。 >測定値の90%が標準曲線内に収まった。
標準曲線は、メーカーの組換え標準物質を7点の連続希釈して作成し、バックグラウンドを差し引くためのブランクウェル1つを含む各プレートにつき2連（デュプリケート）で測定した。曲線フィッティングは、装置独自のデータ収集・解析ソフトウェアを用い、5パラメータロジスティック（5PL）回帰によって行った（参照 材料一覧表定量下限（LLOQ）は、バックフィット回収率が80%から120%の間であり、かつラン内変動係数（CV）が20%以下となる標準物質の最小量として算出した。LLOQを下回る値は、LLOQ/で代用した。√2. 長期的な性能を追跡するため、代表的な感染患者および非感染被験者から得られた2つのプール化気管支肺胞洗浄液（BALF）品質管理試料を分注し、各プレートに添加した。品質保証基準は、12年間にわたる多施設共同マルチプレックスビーズベースアッセイ習熟度判定プログラムから得られたベストプラクティス推奨事項に基づいた。16、これには、二重ウェルにおけるアッセイ内CV ≤ 10%、品質管理におけるプレート間CV ≤ 20%、および1ウェルあたりの解析物につき最小ビーズ数 ≥ 50という要件が含まれる。上記の基準を満たさなかったプレートは再試験した。解析は、単一のキットロットを用い、感染サンプルとコントロールサンプルをランダムに混在させて、4週間以内に単一バッチで実施した。
可視化解析パイプライン
フローサイトメトリー標準（FCS）ファイルは、まず市販のフローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて解析した（参照 材料一覧表）にて補正を行い、生存CD45陽性細胞をゲートする⁺ シングレットを抽出した後、R v4.4を用いてバイアスのない解析を行うためにエクスポートした。各サンプルについて、10,000個のCD45⁺ イベントをダウンサンプリングして結合し、信号強度は共因子150のarcsinh関数を用いて変換した。次元削減およびUMAP投影は、uwotパッケージを用いて、最近傍数を15、最小距離を0.1として行い、併せてRtsneパッケージを用いてパープレキシティ30でt-SNE埋め込みを行った。10100個の自己組織化マップノードを用いたFlowSOMにより表現型クラスターを特定し、さらに、高次元サイトメトリーデータで最近検証された最適化ベースの手法によるメタクラスタリングを用いて、12～15個のクラスターに分割した。17各クラスターは、リネージマーカーおよび活性化マーカーの中央値発現に基づいてアノテーションされ、手動ゲートと照らし合わせて確認された。
マルチプレックスサイトカインデータの解析では、まず生値を log₁₀ 変換し、さらなる解析の前に z-score による標準化を行い、アナライト間の値を揃えた。アナライトと患者の両方に対し、ユークリッド距離と Ward.D2 法を用いた階層的クラスタリングを行い、その結果を行および列でクラスタリングしたヒートマップとして表示した。この手法は、マルチプレックス炎症コホートにおける共発現サイトカインモジュールの検出および患者サブセットの分類に使用された9。すべての細胞性および可溶性バイオマーカーについて、ペアごとのスピアマン順位相関を用いて相関行列を作成した。相関行列のヒートマップを、ノードがバイオマーカーに対応し、エッジが Benjamini–Hochberg (BH) 法による多重検定補正後も有意であった相関を示すネットワークと共にプロットした。エッジの幅は相関係数の絶対値 |ρ| に応じてスケールさせ、補正後の |ρ| ≥ 0.30 かつ p < 0.05 の場合のみエッジを表示した。細胞とサイトカインを含む標準化行列に対し、unit variance scaling を用いた prcomp() 関数で主成分分析 (PCA) を実施した。参加者を第1および第2主成分に投影し、感染群とコントロール群を重ねて表示した。すべての解析において一貫したダウンサンプリングと標準化を行うことで、すべての可視化における細胞性バイオマーカーと可溶性バイオマーカーの読み取り値の比較可能性を確保した。
統計解析
連続変数は、Shapiro–Wilk検定により非正規分布である場合は中央値（四分位範囲、IQR）で、それ以外の場合は平均値（標準偏差、SD）で記述した。カテゴリ変数は、頻度と割合を用いて記述した。群間比較は、連続変数が非正規分布である場合はMann–Whitney U検定を、正規分布である場合はWelch t検定を、カテゴリ変数で適用可能な場合はカイ二乗検定またはFisherの正確確率検定を用いて行った。連続変数間の関連性は、Spearmanの順位相関係数を通じて評価した。マルチプレックスサイトカイン分析および相関分析における偽発見率（FDR）を考慮するため、p値はBenjamini–Hochberg法を用いて調整し、カットオフ値をq < 0.05とした。すべての主要解析において、両側 p < 0.05を統計的に有意とみなした。可能な限り、個別の変数に欠損データがある症例を保持し、該当する変数について完全ケース分析を用いて解析した一方、感度分析を行うために連鎖方程式による多重代入法（m = 20）を実施した。研究コホート全体を用いて、pROCパッケージにより個々のサイトカインの受信者動作特性（ROC）曲線および対応する曲線下面積（AUC）を作成した。なお、独立した外部バリデーションコホートは使用していない。事前規定の感度分析として、気管支鏡検査前72時間以内に抗菌薬を投与された参加者を除外した後、および感染群を機械換気の状態および肺炎のサブタイプ（市中肺炎、院内肺炎、または人工呼吸器関連肺炎）で層別化した後に、主要な群間比較を繰り返した。解析は、R v4.4のrstatix、FlowSOM、uwot、ComplexHeatmap、igraph、pROC、およびmiceパッケージを用いて行った。図は商用科学グラフ作成ソフトウェアを使用して作成した（材料表を参照）。
結果
研究集団およびサンプルの特性
最終解析コホートは112例であり、感染群に64例、非感染コントロール群に48例が含まれていた。 表 1に示されている通り、ベースラインの人口統計学的特性は両群間で同様であったが、感染に関連する臨床検査パラメータは感染群でより高かった。感染は主にグラム陰性菌によって引き起こされており、主な細菌病原体はKlebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、およびAcinetobacter baumanniiであった。その他の病原体は、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、非定型病原体、ウイルス、および混合感染であった。
BALF回収率は、保持されたすべてのサンプルにおいて、あらかじめ設定された閾値である40%以上を満たしており、対照群と比較して感染群でわずかに低い値であった（中央値 48.3% vs 53.3%）。 p = 0.03)であり、これは感染した気道における気道炎症および粘膜充血の増強と一致している。回収量についても群間で差が認められたため（58 mL対64 mL、 p = 0.04) であるため、報告されたすべてのサイトカイン濃度において、群間に希釈因子のわずかな差が生じている可能性があります。回収率50%以上のサンプル（感染群 n = 42、対照群 n = 34）に限定して事前に規定した感度分析を行った結果、すべての群間比較において方向性と大きさが再現されました（効果量における最大の変化は < 8%）であり、希釈バイアスが観察された差の原因である可能性は低いことを示している。採取から処理までの時間は、感染群で65分、対照群で62分であり、2時間の許容範囲内に収まっていた。サンプルレベルでの品質管理（QC）基準は、結果が高品質であることを示した。細胞学的分画数えは、全112例中112サンプル（100%）において、400個以上の細胞をカウントすることで得られた。フローサイトメトリーのデータ収集は、あらかじめ設定された基準である1個以上を充足していた。 × 105 CD45⁺ 全112/112サンプル（100%）でイベントが検出され、生存細胞生存率の中央値は89.4%（IQR 85.6–92.8%）であった。すべてのマルチプレックスサイトカインプレートは、1回の再測定後にQC基準を満たした。全13種類の分析物において、アッセイ内変動係数（CV）は4.7%（2.1–9.3%、すべて <10%）であり、プールしたQCサンプルのプレート間CVは11.2%（6.8–18.4%、すべて <20％）、またビーズ数の中央値は78 events/analyte/well（53–142、すべて50以上）であった。
| 変数 | 感染（n = 64） | 対照群 (n = 48) | p値 |
| 年齢（歳）、中央値 [四分位範囲] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| 男性, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, kg/m²2, 中央値 [四分位範囲] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| 喫煙歴、n (%) | 0.52 | ||
| 決して～ない | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| 以前の | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| 電流 | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| 高血圧、n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| 糖尿病, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| 冠動脈性心疾患、n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| 慢性腎臓病、n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| 気管支鏡検査の適応、n (%) | — | ||
| 市中肺炎 | 35 (54.7) | — | |
| 院内肺炎 | 19 (29.7) | — | |
| 人工呼吸器関連肺炎 | 10 (15.6) | — | |
| 不確定肺結節 | — | 23 (47.9) | |
| 持続的な放射線学的異常 | — | 15 (31.3) | |
| 慢性咳嗽の評価 | — | 10 (20.8) | |
| 原因病原体、n (%) | — | ||
| グラム陰性菌 | 28 (43.8) | ||
| グラム陽性菌 | 16 (25.0) | ||
| 非定型病原体 | 7 (10.9) | ||
| 呼吸器ウイルス | 8 (12.5) | ||
| 混合感染 | 5 (7.8) | ||
| BAL施行時の人工呼吸管理、n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| BAL前72時間以内の抗菌薬投与、n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| 注入量、mL、中央値［四分位範囲］ | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| 回収量, mL, 中央値 [四分位範囲] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| BALF回収率, %, 中央値 [四分位範囲] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| 処理時間、分、中央値 [四分位範囲] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| 血液白血球数 × 10⁹/L, 中央値 [四分位範囲] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| 血液好中球数 (%)、中央値 [四分位範囲] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| C反応性蛋白、mg/L、中央値［四分位範囲］ | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| プロカルシトニン, ng/mL, 中央値 [四分位範囲] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
表1：研究コホートの人口統計学的、臨床的およびBALF処理の特徴。 ベースラインの人口統計学的特性、併存疾患、気管支鏡検査の適応、原因病原体、処置パラメータ、および末梢血検査値を、感染群の64名と非感染対照群の48名の間で比較した。連続変数は中央値［四分位範囲］として報告し、Mann–Whitney U 検定を用いて比較した。カテゴリー変数はn (%)として報告し、カイ二乗検定または適宜フィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。略語：BAL = 気管支肺胞洗浄、BALF = 気管支肺胞洗浄液、BMI = ボディマス指数、IQR = 四分位範囲、WBC = 白血球数。
BALFにおける好中球動員の可視化
図2に示すように、感染個体において、マクロファージ主体の集団から好中球主体の集団への比率の明確な転換が観察されました。サイトセントリフュージによる標本をライト・ギムザ染色法で染色したところ、2群間で明確な差が認められました。対照群では肺胞マクロファージが多く、一部にリンパ球、少数の好中球が見られたのに対し、感染群では好中球が主体であり、細胞内細菌、核の変性、および毒性顆粒が頻繁に認められました。少なくとも400個の細胞を数えた分画数によって差異を検証したところ、好中球の比率は、対照群の中央値3.2% (IQR: 1.8–5.6%) から感染群では68.4% (IQR: 49.2–82.5%) に増加し (p < 0.001)、一方で肺胞マクロファージの比率は88.2% (IQR: 82.4–92.5%) から22.6% (IQR: 12.3–38.5%) に減少しました (p < 0.001)。リンパ球の割合は、群間で同程度でした (7.4% [4.8–11.3%] 対 6.5% [3.4–11.2%], p = 0.42)。
ゲーティングおよび次元削減解析により、顕微鏡観察で認められた細胞表現型が確認および拡張されました。デブリ、ダブレット、および死細胞を除外した後、CD45⁺CD66b⁺顆粒球は、対照群の4.1% (IQR: 2.3–6.8%) に対し、感染群のCD45⁺白血球の正中値で65.8% (IQR: 46.2–79.4%) を占めていました (p < 0.001)。顆粒球集団内では、CD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟好中球が、対照群の88.6% (IQR: 82.3–93.5%) に対し、感染群の全顆粒球の92.4% (IQR: 87.5–95.8%) を占めており、動員された好中球プールが初期前駆細胞ではなく、主に成熟し完全に分化した細胞で構成されていたことを示しています。arcsinh変換した表面タンパク質マトリックスに基づくUMAPおよびt-SNE投影では、ほぼ同一のトポロジーが示されました。そこでは、感染例がCD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟好中球の顕著なアイランドを占有していたのに対し、対照サンプルではその領域の細胞密度は低くなっていました。一方で、HLA-DR⁺CD14⁺肺胞マクロファージのアイランドは逆のパターンを示し、対照群で高密度であり、感染群では低密度でした。FlowSOMによるメタクラスタリングでは13のサブポピュレーションが同定され、そのうち成熟好中球サブポピュレーション (38.4% [22.6–56.2%] vs 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.001) と活性化CD16-dim CD11b-high好中球クラスター (22.6% [11.4–32.5%] vs 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.001) が、群間で最大の拡大を示しました。
好中球の絶対数に関して、感染群では対照群と比較してBALF中の好中球数が約50倍に増加しました。BALF 1 µLあたりの有核細胞総数は、対照群の156 cells/µL（IQR 88–232）から感染群では384 cells/µL（IQR 180–712）に上昇し（p < 0.001）、好中球数は対照群の5 cells/µL（IQR 2–13）から感染群では262 cells/µL（IQR 89–578）に上昇しました（p < 0.001）。Benjamini–Hochberg（BH）補正後においても、群間における好中球の割合および絶対数のペア比較による差は、高度に有意なままでした（q < 0.001）。
図 2: BALFにおける好中球動員の可視化。 コントロール群の被験者と感染群の被験者から得られたWright–Giemsa染色サイトスピン視野の代表例は、BALFの細胞プロファイルがマクロファージ主体から好中球主体へと移行することを示している。4段階のフローサイトメトリーゲーティング戦略（FSC singlets → 生存CD45⁺白血球 → CD14⁺HLA-DR⁺除外後のCD66b⁺顆粒球 → CD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟好中球）、生物学的アノテーションで色分けしFlowSOM 13-metaclusterをオーバーレイしたarcsinh変換済みフローサイトメトリーデータのUMAP埋め込み、およびBALF中の好中球比率と好中球絶対数（cells/µL、対数スケール）の箱ひげ図を並べて表示し、感染群とコントロール群で同定された細胞表現型の直接比較を可能にしている。略称：BALF = 肺胞洗浄液；FSC = 前方散乱光；UMAP = 一様多様体近似および投影。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
BALF炎症性サイトカインプロファイルの可視化
複数のサイトカイン軸にわたる協調的な応答パターンにより、感染群と対照群が区別され、サイトカインは図3に示すように、3つの整合性のある機能モジュールにグループ化されました。log₁₀変換および正規化されたサイトカイン濃度のWard.D2法を用いたクラスター分析により、検体の明確な2群のデンドログラムが作成され、感染検体と対照群はデンドログラムの両端に位置し、誤分類された参加者はわずか7名（対照群のうち6名は感染検体とクラスター化され、そのほとんどが軽度の好中球性気道炎症を伴う慢性咳嗽例であり、感染検体のうち1名は対照群とクラスター化され、非定型肺炎の早期症例であった）でした。分析物のデンドログラムにより、3つのサイトカインクラスターが定義されました。CXCL8、CXCL1、CXCL10、CCL2、およびCCL3からなるケモカインクラスターは、感染群と対照群の間で最大の fold change を示し、モジュール内相関が最も高い結果となりました。IL-1β、IL-6、IL-17A、およびTNF-αを含む炎症性クラスターも同様の方向性の増加を示しましたが、その程度はやや緩やかでした。IL-10、IL-1RA、IFN-γ、およびG-CSFを含む制御性クラスターも感染検体で上昇しており、この応答が単なる炎症性ではなく、対抗制御および抗ウイルス機構が並行して関与していたことを示唆しています。
すべての測定分析物の中央値（IQR）は、対照群と比較して感染群で高く、BH法に基づく偽発見率（BH-FDR）補正後の調整p値は、13種類すべての分析物において0.001未満であった。分析物の中で、CXCL8/IL-8が最も高い濃度と最大の倍率変化を示した（対照群の68 [32–142] pg/mLから感染群の2,485 [842–6,520] pg/mLへと、約36倍に増加）。CXCL1/GRO-αでも同様の傾向が見られ、約21倍の増加であった（78 [36–148] vs 1,672 [524–3,890] pg/mL）。IL-1βは約13倍の増加を示した（5.8 [2.6–11.4] vs 78 [29–184] pg/mL）。IL-6、IL-1RA、およびG-CSFは13〜16倍の増加を示した（それぞれ、16.4 [7.8–30.5] vs 248 [82–612] pg/mL、112 [48–258] vs 1,748 [658–3,964] pg/mL、24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL）。その他の緩やかな増加には、TNF-α（約8倍）、CXCL10/IP-10（約9倍）、CCL2/MCP-1（約8倍）、CCL3/MIP-1α（約10倍）、IL-10（約10倍）、IFN-γ（約6倍）、およびIL-17A（約4倍）が含まれていた。
コホート内での受信者動作特性（ROC）解析により、感染群と対照群の間で単一マーカーとして最も強力な識別能を示した分析物として、IL-8 (AUC 0.94)、IL-1β (AUC 0.92)、IL-6 (AUC 0.91)、CXCL1 (AUC 0.91)、および G-CSF (AUC 0.89) が同定されました。これらのAUC値は、独立した外部検証セットがない状態での解析コホート内における識別能を要約したものです。連鎖方程式による多重代入法（m = 20）を用いた感度分析の結果、すべての分析物において推定値は完全ケースの中央値から5%以内であり、エフェクトサイズの順位に変動は見られませんでした。
事前の抗生物質曝露および肺炎のサブタイプが、観察されたサイトカインの差に及ぼす影響を評価するため、あらかじめ規定した感度分析を行った。BALの72時間前に抗生物質投与を受けた感染群の参加者41名（64.1%）を除外して主要な群間比較を繰り返したところ、BH-FDR補正後、13項目すべての分析物が、残りの23例の感染例において対照群よりも有意に高値を示した（上位5つの識別因子の調整後 p < 0.001）。点推定値は、コホート全体の中央値よりもわずかに高い値となり（例：CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL、IL-1β 92 [34–210] pg/mL）、これはBAL前の抗生物質曝露によって気道サイトカインが部分的に抑制されたことと一致している。感染群を肺炎のサブタイプ別に層別化したところ、市中肺炎（n = 35）、院内肺炎（n = 19）、および人工呼吸器関連肺炎（n = 10）のすべてにおいて、ケモカインおよび前炎症性サイトカインの順位は同一であった。なお、人工呼吸器関連肺炎のサブグループでCXCL8、CXCL1、IL-6、およびG-CSFの最高中央値が示され、機械的換気の有無によって群間比較の方向性が変わることはなかった。
図 3: BALF炎症性サイトカインプロファイルの可視化。 全112名の被験者における、測定した13種類の分析物のlog₁₀変換およびzスコア化された濃度の階層的クラスター解析ヒートマップ。ヒートマップ上部の色付きアノテーションバーは、グループ割り当て（コントロール、感染）、肺炎サブタイプ（CAP、HAP、またはVAP肺炎）、および原因病原体カテゴリー（グラム陰性、グラム陽性、非定型、ウイルス、または混合感染）を示す。主要な発現変動サイトカイン（CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF, およびTNF-α; log₁₀スケール, pg/mL）のボックスプロットにより、感染群とコントロール群を比較している。*** p < 0.001（BH偽発見率補正後）。略語：BALF = 気管支肺胞洗浄液; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = 市中肺炎; HAP = 院内肺炎; VAP = 人工呼吸器関連肺炎。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
好中球動員とサイトカインプロファイルの連動した可視化
細胞成分と可溶性成分のコンパートメントを結合させたことにより、図4に示すように、好中球の動員とケモカイン系の間に強い生物学的関連があることが明らかになりました。標準化した細胞およびサイトカイン行列の主成分分析（PCA）から二次元的な描写を導き出したところ、PC1が全分散の51.1%を、PC2がさらに12.7%を占め、累積で63.8%となりました。PC1は感染群と対照群を分離しており、BALF好中球、CXCL8、CXCL1、IL-6、IL-1β、およびG-CSFで高い正の負荷量を示し、マクロファージで高い負の負荷量を示すことが特徴でした。PC2は、ケモカインが豊富な軌道（CXCL8およびCXCL1で高い正の負荷量）と、調節因子が豊富な軌道（IL-10、IL-1RA、およびIFN-γで正の負荷量）を分離しました。その結果、感染群内において、参加者は重症度に応じて分離する傾向があり、人工呼吸器管理下の呼吸器関連肺炎（VAP）症例は、高ケモカイン象限に分類されました。
17種類の細胞および可溶性形質間のペアワイズ・スピアマン順位相関分析により、BALF中好中球数とケモカイン軸全体との間に強い正の相関があることが明らかになりました（CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; すべて補正後 p < 0.001）。次いで有意な相関が検出されたのは、好中球数と炎症性促進軸の間であり（G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51）、その後、調節軸との間に中程度の正の相関が認められました（IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48）。マクロファージの割合は、ケモカイン軸および炎症性促進軸の両方と、同程度の強さの鏡像的な負の相関を示しました。軸内相関は軸間相関よりも大幅に強く（軸内 |ρ| 中央値 = 0.68 vs. 軸間 |ρ| 中央値 = 0.33）、ケモカイン軸、炎症性促進軸、および調節軸を制御する共通の上流調節経路という概念を支持する結果となりました。
相関ネットワークにより、このカップリングをグラフ上にマッピングしたところ、BALF好中球が最も中心的なハブノードとなり、サイトカインへの13本のエッジすべてが多重検定に対するBH補正後も維持されました。17の特徴量間で可能な136通りのペア接続のうち、|ρ| ≥ 0.30 かつ BH補正後 p < 0.05 という共同基準を満たした99件が保持されました。相関ネットワークグラフには、階層的クラスター分析から得られたクラスターを再現する、明確な3ブロックのモジュール構造が表示されました。すなわち、最も密度が高く強力な接続はケモカインモジュールとBALF好中球数および割合の間に見られ、中程度の強さの接続が前炎症性モジュールを好中球とケモカインモジュールの両方に結びつけ、調節性モジュールからの細い接続がケモカインブロックと前炎症性ブロックを橋渡ししていました。マクロファージ割合のノードは好中球-ケモカインブロックの反対側に位置し、負の重みを持つエッジの扇状の広がりを介して結合していました。総括すると、PCA、相関行列、およびネットワークグラフにより、BALF好中球浸潤とケモカイン反応が個々の参加者レベルで強く関連しており、前炎症性および調節性経路が、この好中球-ケモカイン軸を中心とした、明確に定義されつつも相互に関連するモジュールとして機能しているという一貫したパターンが明らかになりました。
図 4好中球の動員と炎症性サイトカインプロファイルの共視覚化 標準化した細胞およびサイトカイン行列の主成分分析バイプロット（参加者をグループ別に色分け）、スピアマン相関ヒートマップ、および全17種の細胞・可溶性因子のネットワークグラフ（ノードの大きさは次数、エッジの太さは|に基づきスケーリング）ρ| およびBH法で補正してフィルタリングした p < 0.05 および |ρ| ≥ 0.30)、好中球-ケモカインハブを強調している。略語：BH = Benjamini-Hochberg、PC = 主成分。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
データの可用性：
本研究で使用した匿名化済みの参加者レベルのデータセットおよびR解析コードは、以下として提供されています。 付録表 S1 および 補足ファイル 1本研究の結果を裏付けるその他のデータは、合理的な要求があれば責任著者から提供可能です。
補足表 S1: BALFデータセット。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
補完ファイル 1：解析コードを含むZIPファイル。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
本プロトコルの堅牢性は、解析前および解析中に下されるいくつかの決定に依存しています。回収率の下限を40%に設定し、2回目以降の分注分を統合したのは意図的な決定です。これは、1回目の分注分に気管支気道物質が高濃度に濃縮されており、また回収率が年齢、性別、喫煙歴、および標的となる気管支によって系統的に変動するためです18。Fc受容体のブロッキングを行い、成熟CD15⁺CD16⁺CD11b⁺好中球とCD14⁺HLA-DR⁺肺胞マクロファージ（BALF検体の中で非特異的染色と自家蛍光バックグラウンドが最も高い主要細胞）の間の正確なゲーティング境界を確保するために個々のクローンに対する抗体をタイトレーションすることは、2つの群間で一貫性を維持するために不可欠です19,20。凍結融解の制限およびマルチプレックス解析の2時間の時間枠も、恣意的なものではありません。ヒトBALFのデータでは、4 °Cで保存した場合でも、マクロファージおよびリンパ球の割合は一定であったのに対し、好中球の割合は6時間から24時間にかけて有意に減少することが示されています13。t-SNEおよびUMAPアルゴリズムのパラメータ、ならびにFlowSOMの100ノードグリッドおよび12～15のメタクラスターのパラメータは、サイトメトリーパイプラインの再現性を損なう要因の一つとされる事後調整を防ぐため、群の解析前に決定しました16。将来の大規模解析においてバッチ補正法を適用できるよう、オペレーターおよびプレート/ランの識別情報は、セルイベントごとに保持することが可能です21。
プロトコルの変更を必要としない一般的な失敗モードがいくつかあります。回収率の低下（<40%）は、通常、ウェッジの配置不備または吸引のしすぎが原因です。この問題は、気管支鏡の位置を調整し、別の分注量を吸引する前に吸引圧を<100 mmHgに下げることで解決できます。肺細胞のフローサイトメトリー解析における主要な交絡因子である肺胞マクロファージからの過剰な自家蛍光は、すべてのバッチに未染色の肺細胞コントロールを含め、生存率染料のみに頼るのではなく、ハイサイドスキャッターのマクロファージゲートを明確に定義することで軽減できます19。マルチプレックスパネルでは、ビーズ数の不足や外れ値としての高値が発生しやすくなります。1:2希釈に固定する前に、感染サンプルおよびコントロールサンプルのサブセットを用いて予備的な希釈曲線を走らせることで、BALFサンプルにおいて以前に報告されたマトリックス効果22に起因する、肺炎サンプルの標準曲線の最高値付近に位置するCXCL8、CXCL1、およびG-CSFのシグナル飽和を回避できます。プロトコルは、コホートの特性に応じてさらに調整可能です。サンプルが主に単一の病原体種である場合、コアパネルをケモカインと炎症性メディエーターのみに絞ることで、十分な統計的検出力を維持できます。細菌、ウイルス、および非定型病原体を含む混合集団の場合、肺胞好中球およびマクロファージにおける病原体特異的なシグネチャーの存在が最近証明されており23、また、炎症性および調節性BALFサイトカインの組み合わせが市中肺炎の疾患重症度を反映することが示されているため24、調節性メディエーターも併せて測定することが有益です。
本ワークフローの貢献は、呼吸器感染症における好中球の流入やケモカインおよび炎症性サイトカインの上昇という個々の観察（これらはすでに十分に立証されている）ではなく、7種類のマーカーを用いた好中球・単球フローサイトメトリーパネルと13種類の解析物を対象としたマルチプレックス免疫測定法を、同一のBALF検体に適用した共通の可視化パイプラインに統合した点にある。好中球と単球を標的とした7マーカーパネルと13解析物のマルチプレックス免疫測定法を実装することで、表現型とサイトカインの複雑性を捉えることが可能となる。これがなければ、通常の気管支鏡検査で得られる量よりもはるかに多くのBALFを用い、複数の独立した検査を行う必要があった。前者は、BALF検体の細胞型同定において多色フローサイトメトリーが手動顕微鏡観察と同等に信頼できることを示した先行研究15と整合しており、後者の判定基準は、認められた多施設共同マルチプレックスビーズベースアッセイ習熟度プログラム16のベストプラクティスを反映している。特に、同一の標準化入力を用いて構築されたヒートマップ、ネットワークプロット、およびPCAを組み合わせることで、これまで独立した棒グラフを合算することでしか推論できなかった細胞型とそれに関連する因子の関係を明らかにできる。BALF由来のケモカインであるCXCL8、CCL2、およびCCL3は、共通の循環系から好中球および単球をリクルートするために協調して機能しており、それらの共同構造は独立した単一解析物の読み取りからは得られない情報を有しているため、このアプローチは重要である9,10。BALFはすでに臨床目的で日常的に採取されており、追加の採取量を必要としないため、本ワークフローは単独の診断手順としてではなく、既存の気管支鏡サービスへのトランスレーショナルな付加機能として位置づけることができる。
サンプルの輸送、染色、フローサイトメトリーによるデータ取得、マルチプレックスアッセイのインキュベーションおよび読み取り、そして下流の計算パイプラインを含む全ワークフローの実質的なターンアラウンドタイムは、研究室条件下で24 h程度です。したがって、本ワークフローは、メカニズムの特性評価や治療反応のモニタリングのためのディープフェノタイピングツールとして位置付けられており、人工呼吸器関連肺炎と無菌性急性呼吸器困難症を即座に区別するといった、時間的制約のある意思決定のための急性期のベッドサイドトリアージアッセイとして想定されていません。後者については、より迅速な微生物学的検査や単一マーカーのバイオマーカーアッセイが引き続き標準治療となっています。
言及しておくべきいくつかの限界点がある。BALFは気腔から回収されるため、気腔における直接的な表面相互作用を反映しているが、多くの活性化マクロファージや組織常在性リンパ球が存在する肺胞壁や肺胞中隔内の細胞は含まれていない。したがって、気腔と実質における免疫状態の間には一対一の相関関係がなく、これは既報のデータ25と一致している。マルチプレックスビーズ法による検出は、抗体の交差反応性やマトリックス効果の影響を受けるが、これらは血清と比較して、ムチンやサーファクタントを含むBALFの環境において特に顕著である。さらに、生理食塩水による上皮ライニング液の希釈プロセスは、尿素などの内因性マーカーを用いても克服できず、これは最近発表された批評26と一致している。回収された洗浄液量は、感染群で対照群よりも平均して6 mL少なかったため、ここで報告する絶対濃度は、群間での希釈因子のわずかな差の影響を受けており、内因性希釈マーカーは適用していない。感染群の参加者64名のうち41名（64.1%）に抗菌剤の投与歴があることは、気道サイトカイン濃度や病原体の回収率を低下させた可能性がある。重要な点として、本プロトコールは臨床的に適応となった気管支鏡検査時の単一時点でのスナップショットを示しているに過ぎず、個々の患者における好中球動員、最大ケモカイン分泌、およびそれらの消退のキネティクスを解析することはできない。単一分析物のAUC値は、独立した検証コホートがない状態で、バイオマーカー同定に使用した同一コホートから導出されており、外部的に検証された診断能ではなく、コホート内での識別能の指標として解釈されるべきである。臨床実務において単一マーカーのカットオフ値を採用するには、独立した多施設共同コホートでの前向き検証が必要となる。回収率が高い検本、抗菌剤未投与の参加者に限定した解析、および人工呼吸器管理の状態や肺炎のサブタイプ（市中肺炎、院内肺炎、または人工呼吸器関連肺炎）で層別化した事前規定の感度分析においても、群間比較の方向性に変化は見られなかった。
将来的には、タンパク質および細胞の定量に用いたものと同じBALFペレットに、シングルセルRNAシーケンシングまたはCITE-seqを追加することで、これらの制限に対処することが可能です。これらの手法は、細菌性肺炎および小児Mycoplasma pneumoniae肺炎の大規模コホートにおいて適用成功しており、従来のフローサイトメトリーでは区別できなかった肺胞好中球およびマクロファージのサブセットを明らかにすることができます27,28。気道解析によって得られた情報を、対応する生検組織や検死資料のイメージング質量サイトメトリーまたは空間トランスクリプトーム解析から得られた情報に加えることで、これらの情報を文脈化することが可能になります29。また、縦断的なBALFサンプリングを、重症肺炎および急性呼吸窮迫症候群（ARDS）において生存率の向上や臓器サポートの有益性が示されているCXCR1/CXCR2アンタゴニストおよびIL-6受容体遮断薬の評価に結びつけることで、本ワークフローで重点を置いた好中球-ケモカイン軸を治療上の意思決定支援として検証することが可能になります30,31。
結論として、本研究では、標準化されたBALFの採取および調製手順、好中球と単球の組成を定量化する7マーカーのフローサイトメトリーパネル、13種類のサイトカインを測定するマルチプレックスサイトカインアッセイ、およびUMAP、階層的クラスタリング、相関ネットワーク、PCA解析からなる共通の可視化プラットフォームで構成される、統合的な可視化ワークフローについて記述した。臨床的に必要とされて気管支鏡検査を受けた成人112名の前向きコホートにこのワークフローを適用した結果、感染症患者において肺胞免疫細胞の組成がマクロファージから好中球へと著しく移行していることが特定され、3つのモジュールからなるサイトカイン応答パターンが検出され、さらに、単一マーカーの測定では観察不可能な、強力に結合した好中球–ケモカイン軸が明らかになった。本手順は、臨床診断中に採取された検体のみに依存し、追加のサンプル量を必要とせず、マルチパラメーターフローサイトメトリーおよびマルチプレックスビーズアレイ解析を備えた三次医療機関の検査室において実施可能であると考えられる。より広範な導入や、個々の分析物を診断バイオマーカーとして使用するには、独立した多施設共同コホートによる前向きな検証が必要となる。したがって、本研究は呼吸器感染症における気道炎症を特徴付けるための、再現性が高くデータ豊富な手法を提示するものであり、縦断的研究、シングルセルおよび空間解析、ならびに好中球–ケモカイン軸を標的とした免疫調節の治療評価へのさらなる展開のための基礎を提供するものである。
開示事項
著者に開示すべき利益相反はありません。
謝辞
本研究にご協力いただいたすべての患者様およびボランティアの方々の貴重なご協力に、心より感謝申し上げます。また、研究プロセス全体における倫理的承認（承認番号：2026HL-038）および規範的な指導をいただいた倫理委員会に深く感謝いたします。
臨床検体の採取、気管支肺胞洗浄液の処理、および微生物学的検出におけるご支援をいただいた呼吸器科、気管支鏡センター、および臨床検査部の医療スタッフに感謝いたします。また、高次元フローサイトメトリーおよびマルチプレックスサイトカインプロファイリング実験において、技術プラットフォームのサポートを提供してくださった病院中央検査部に感謝いたします。
本研究は、公的、商業的、または非営利部門の助成機関から特定の助成金を受けていません。
患者のスクリーニング、サンプルの管理、実験操作、およびデータの整理にご尽力いただいた、本プロジェクトに関与したすべての研究者、技術者、および看護スタッフに感謝いたします。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD11b antibody, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | 好中球活性化マーカー；バイオレットレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 antibody, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | 単球・マクロファージ除外マーカー；レッドレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 antibody, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | 好中球系譜マーカー；ブルーレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 antibody, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | 好中球成熟およびNK細胞マーカー；バイオレットレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45 antibody, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | 全白血球マーカー；ブルーレーザーチャンネル URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anti-human CD66b antibody, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | 顆粒球マーカー；ブルーレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human HLA-DR antibody, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | 抗原提示細胞マーカー；ブルーレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| 自動血球分析装置 (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | 装置 (モデル XN-1000) | 絶対好中球数の算出に必要な全有核細胞数を決定するために使用 URL: https://www.sysmex.com |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | フローサイトメトリー用染色緩衝液に使用 (2 mM EDTA含有PBS中 0.5% w/v) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap パッケージ (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.20 (オープンソース) | マルチプレックスサイトカインデータの階層的クラスタリングヒートマップに使用 URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| サイトスピン遠心機 (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | BALF細胞懸濁液から細胞診スライドを作成するために使用 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| 赤血球溶解液 (BD FACS Lysing Solution, 10X 濃縮液) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | 表面染色後の赤血球溶解に使用 URL: https://www.bdbiosciences.com |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 0.5 M pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | フローサイトメトリー用染色緩衝液に 2 mM で使用 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| 固定可能生存率染料 (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | ゲーティング前の死細胞除外用；レッドレーザーチャンネル URL: https://www.biolegend.com |
| 柔軟ビデオ気管支鏡 | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | 装置 (モデル BF-1TQ290) | 中等度鎮静下でのBALに使用 URL: https://www.olympus-global.com |
| マルチカラーフローサイトメーター (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | 装置 (モデル CytoFLEX LX, 6レーザー構成) | 7つのマーカーを用いた好中球/単球フローパネルのデータ収集に使用 URL: https://www.beckman.com |
| フローサイトメトリー解析ソフトウェア (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | FCSファイルのコンペンセーションおよび手動ゲーティングに使用 URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM パッケージ (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (オープンソース) | フローサイトメトリーデータの自己組織化マップ（SOM）クラスタリングおよびメタクラスタリングに使用 URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (統計グラフ作成ソフトウェア) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | 最終図表の作成に使用 URL: https://www.graphpad.com |
| ヒトFc受容体ブロッキング試薬 (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | 抗体染色の前のFc受容体ブロックに使用 URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph パッケージ (R) | CRAN | v2.0 (オープンソース) | 相関ネットワークグラフの構築および可視化に使用 URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| 低タンパク吸着凍結保存チューブ, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | サイトカイン分析用のBALF上清分注に使用 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex マルチプレックスビーズベース免疫測定プラットフォーム (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | 装置 (モデル MAGPIX) | マルチプレックスサイトカインアッセイのデータ収集に使用 URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa 染色液 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | サイトスピンによる分画細胞数カウントに使用 URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice パッケージ (R) | CRAN | v3.16 (オープンソース) | 感度分析における連鎖方程式による多重代入法に使用 URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| マルチプレックス磁気ビーズサイトカイン/ケモカインパネル (13-plex, カスタム; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | セクション 2.4 に記載の13の分析物を測定するカスタムパネル URL: https://www.merckmillipore.com |
| ナイロンメッシュセルストレーナー, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | 粘液塊を除去するためのBALFの機械的ろ過に使用 URL: https://www.corning.com |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | 細胞再懸濁および染色のための基本緩衝液 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC パッケージ (R) | CRAN | v1.18 (オープンソース) | ROC曲線およびAUC値の生成に使用 URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (統計計算環境) | R Core Team | v4.4 (オープンソース) | 統計解析および可視化のためのプラットフォーム URL: https://www.r-project.org |
| rstatix パッケージ (R) | CRAN | v0.7 (オープンソース) | 群間比較および相関統計に使用 URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne パッケージ (R) | CRAN | v0.17 (オープンソース) | t-SNE埋め込みに使用 URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| 単色染色コンペンセーションビーズ (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | 単色コンペンセーションコントロールに使用 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| 塩化ナトリウム注射液, 0.9% (滅菌生理食塩水) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | BALinstillationに使用 (100–150 mL, 37 °Cにて 20–40 mL 分注) URL: https://www.baxter.com |
| uwot パッケージ (R) | CRAN | v0.2 (オープンソース) | UMAP次元削減に使用 URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (マルチプレックスアッセイ収集および曲線フィッティングソフトウェア) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 5PL標準曲線のフィッティング用装置専用ソフトウェア URL: https://www.luminexcorp.com |
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