方法論記事

Langendorff灌流マウス心における心房および心室力学評価のための光学システム

DOI：

10.3791/72264

⸱

2026年8月14日

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコールでは、マウス心臓の摘出とカニュレーションの手順、およびランゲンドルフ後向き灌流システムの準備と構成について説明します。この実験装置は、心房および心室の自然な動態を維持しながら、その機械的反応を評価するために設計された高解像度光学システムと組み合わされています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウス心臓は、工学技術の進歩により、心血管研究において広く利用されているモデルです。しかし、マウス心臓はサイズが小さいため、心房および心室の収縮能の評価は依然として困難です。本研究では、摘出した無処置の心臓において、収縮能と心拍数を評価するための新しい手法を導入します。Langendorff灌流マウス心臓と高解像度光学システムを組み合わせることで、心房および心室の収縮能の評価が可能となります。この実験系は、高解像度信号を取得しつつ、心臓のサイズの小ささと収縮速度の速さに関連する課題を解決しています。420から660 beats per minute (bpm)の範囲における刺激周波数と心収縮周波数の同期は、auxotonic法による結果と一致していました。さらに、心室短縮および心房動態信号の測定により、心房心室収縮の判定が可能になります。本手法は、薬理学的または全身的な影響を受けずに、摘出した無処置の心臓における収縮能と心拍数を評価するのに適しています。これらの結果は、本光学システムが心室および心房の短縮反応の測定を可能にすることを実証しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心臓生理学にはまだ多くの解明すべき点があります。心臓のペースメーカー機能や興奮収縮連関などの主要なプロセスは、絶えず研究されている中心的な教義です1。生物学的ノイズが心筋収縮能2やペースメーカー活動に及ぼす影響はまだ十分に理解されていませんが1、新しい光学イメージング手法によって、新たなパラダイムが提示されています3,4。

Langendorff系を用いた2つの実験手法が、心機能の測定に極めて重要な貢献をしてきました。1つ目は、左心室に挿入した小型バルーンから信号を得る等容性収縮法であり5,6,7、2つ目は、糸の一端を心尖部に、もう一端を機械的記録装置に縫い付け、心軸方向のオーキストニック収縮を測定して信号を得るオーキストニック記録法です2,8。しかしながら、マウスの心臓は極めて小さいため、心房および心室の収縮能を評価することは困難です。さらに、心臓は損傷を受けやすいため、処置には一定の慎重さが求められます9,10,11,12,13。

マウス心臓の機械的ダイナミクスを評価するためのこの光学システムには、いくつかの斬新な特徴と利点があります。第一に、本手法は薬理学的または全身的な影響がない状態で、摘出したままの完全な心臓における収縮能および心拍数を評価するのに適しています。また、本プロトコルは、薬理学的治療、細胞再生治療、または酸素療法に基づいた治療法を検討する際の虚血再灌流傷害の評価実験においても効果的に活用できます。

本論文では、高解像度光学システムを用いてマウス心臓の収縮機能の生物物理学的パラメータを記録するためのプロトコルを提示します。この手法は、単離した無傷の心臓における収縮能および心拍数の評価に有用です。さらに、心房および心室の収縮能の評価も可能です。本研究のランゲンドルフ法によるマウス心臓標本では、筋肉の収縮を阻害することなく、灌流液の温度低下とモーションアーチファクトを最小限に抑えるためのわずかな修正を加えた改良を導入しています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、動物実験およびケアに関する連邦規制に従って実施され、CINVESTAV動物ケア委員会の承認を得ました（メキシコ、D.F.、CINVESTAV Zacatenco）。本研究では、体重 28–34 g、週齢 8–14 週のC57BL/6J雄マウスを使用します。プロトコルで使用したすべての材料および装置は、材料表に記載されています。補足ファイル 1–11には、本プロトコルの裏付けとなる図解、ソフトウェアガイド、解析プログラム、ペーシングデータ、およびアプリケーションファイルが提供されています。

1. ストック溶液の調製

  1. あらかじめ2種類のストック溶液を調製し、4 °Cの冷蔵庫で保存しておく。(1) ストックI、1 L（脱イオン水で調製；g/L：76.13 NaCl, 4.02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0.4 NaH2PO4）、および(2) ストックII、0.1 L（脱イオン水で調製；g/L：73.5 CaCl2(2H2O)）。
    注：これらの溶液は調製後最大30日間使用可能である。4 °Cで保存すること。

2. ランゲンドルフ装置の接続と洗浄

  1. 図1Aに示すように、リザーバー(1)、リザーバー恒温槽(2)、灌流ポンプ(3)、サーペンタイン(4)、サーペンタイン再循環装置(5)、モニタリングシステム(6)、および排水システム(8)を接続する。
    注：モニタリングシステムと排水システムの接続については、補足ファイル1に詳しく示されている。
  2. ランゲンドルフ装置に50 °Cの脱イオン水1 Lを満たし、灌流ポンプと排水ポンプを起動する(Supplementary File 1, 排水システム)。約20–30分後、システムから液体を取り除き、次のステップに進む。
    注：システムに漏れや圧力低下がないことを確認すること。これらが認められる場合は、実験を続行してはならない。
  3. システムに1%酢酸（脱イオン水に溶解）1 Lを満たし、灌流ポンプと排水ポンプを停止して60分間待機した後、ポンプを起動して液体を取り除く。
  4. ステップ2.2を2回繰り返す。
  5. 溶液成分の付着を防ぐため、システムに70%エタノール（脱イオン水に溶解）を満たす。
    注：ランゲンドルフ灌流システムは、10回の実験ごと、または1ヶ月ごとに洗浄する必要がある。実験前の洗浄プロトコルについてはセクション4に、実験後の洗浄プロトコルの詳細についてはセクション8に説明されている。

3. 実験中のタイロード溶液の調製

  1. 以下の組成（mM）で溶液1 Lを調製する：130.25 NaCl, 5.4 KCl, 0.53 MgCl2(6H2O), 0.33 NaH2PO4, 1.8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPESとし、NaOHを用いてpH 7.35 ± 0.05に調整する。
    1. Stock I 100 mLを脱イオン水700 mLと混合して絶えず撹拌し、溶液の温度を37 °Cまで上げる。図1A (1)に示すように、O2タンクをエアストーンに接続し、溶液に酸素を供給し続ける。
    2. Stock II 3.6 mLと脱イオン水96.4 mLを加え、1.8 mM CaCl2(2H2O)となるようにし、その後 NaOHを加えてpHを7.35 ± 0.05に調整する。
    3. 脱イオン水で定容し、Tyrode溶液1 Lとする。
      注：溶液100 mLを冷蔵庫（4 °C）で保存することを推奨する。この分量は後のステップ6で使用する。

4. Langendorff系の準備

注意：実験当日にLangendorff装置にエタノールが満たされていない場合は、手順を進めることは推奨されません。代わりに、 セクション2を繰り返してください。

  1. 灌流ポンプとドレナージポンプの電源を入れます。灌流ポンプの流量を 3 mL/min に、ドレナージポンプを 10 mL/min に設定します。システム内をドレインします。
  2. 37 °C の脱イオン水 1 L をシステムに満たし、その後、水をドレインします。
  3. ステップ 3で調製したタイロード液をシステムに満たし、溶液を生理的温度に維持し、常に酸素供給を行います。
  4. リザーバー用恒温槽とサーペンタイン再循環装置の電源を入れます。溶液を生理的条件に維持するため、リザーバー温度（図 1A (2)）を 38 °C に設定します。サーペンタイン（図 1A (5)）の温度を 40 °C に設定します。これにより、ランゲンドルフ系溶液の温度低下を補正します。
    注意：システム出口でのタイロード液の温度が生理的温度（37 ± 0.5 °C）でない場合は、サーペンタイン再循環装置の温度を調整してください。温度が適切な値で安定するまで、ステップ 6 に進むことは推奨されません。
  5. 圧力モニター（補足ファイル 1、モニタリングシステム）の電源を入れ、0–200 mmHg の範囲で校正します。システムの校正には、モニタリングおよびペーシングアプリケーション（補足ファイル 3 および 補足ファイル 11）を利用可能です。
    注意：システム内に圧力損失や気泡がないことを確認することが不可欠です。システム内に気泡がある場合は、サーペンタインの下部出口を一時的に塞ぎ、上部バルブを開きます。これによりカラムが満たされ、気泡が外部に放出されます。この状態が確認されるまで、実験を進めることは推奨されません。

5. 光学系14

  1. CMOSカメラを組み立てます（図1A, 10）、調節可能なカメラレンズ（LC）、および照明システム。
    注：照明システムは2つのLEDで構成されています（図1A, 9）、2枚の平面凸照明レンズ（LI）、照明制御（図1A, 11）、データ収集カード（補足ファイル 1、モニタリングシステム）、および3D設計のサポートパーツ（補足ファイル 1).
  2. 体積が約1,000 mm³のリファレンスオブジェクトを配置します。3 カメラレンズから100～200 mmの距離（の中央 図1A).
    注：対象物はランゲンドルフ装置の心臓設置位置に配置する必要があります。この位置は、以下で確認できます。 図1B, 特に、光ビームが入射する画像の中央部分において。
  3. カメラキャプチャソフトを起動し、サブサンプリングを4倍（4ピクセル＝1サブピクセル）に設定します。次に、関心領域（ROI）を200 x 200サブピクセルに設定します（補足ファイル 2).
    注：この構成により、750フレーム/秒（fps）の時間分解能が可能になります。
  4. 照明システムをオンにします（補足ファイル1）、光ビームを調整してリファレンスオブジェクトに焦点を合わせ、均一な照明を実現します（図1B).
  5. 画像の白飛びを防ぐため、リファレンスオブジェクトの光強度を調整します。
    注：画像は次のように見える必要があります。 図2A (または 図1C, （コントローラーPC）。物体の表面（心臓）における反射は、輪郭の鮮明さを損なわない範囲で、可能な限り低減させる必要があります。これは、照明の制御出力を調整するか、カメラ設定で露光時間を短縮することで行えます。
  6. リファレンスオブジェクトの鮮明な画像を得るために、カメラレンズのピントを合わせます（図1C、コントローラーPC）。参照物体が視野の80%を占めるようにしてください（図2A) により、約の換算尺度を得る 61 µm サブピクセルあたり。
    注：カメラが取得モードに設定されると、光学系によって照明システムが自動的に起動します（図1A および 補足ファイル 2。オーバーヒートを避けるため、カメラはスタンバイモードに維持し、照明システムはオフのままにして、実験データの収集期間中のみ作動させることを推奨します。

6. 外科的手順およびカニュレーション手順

  1. ヘパリン投与および麻酔
    1. チレタミン・ゾラゼパム（マウス体重1kgあたり40mg）およびキシラジン（マウス体重1kgあたり10mg）を含む麻酔混合液を調製し、その後、～まで希釈する。 200 µL 生理食塩水で。
    2. 27G針を用い、麻酔混合液を腹腔内投与する。マウスが深い麻酔状態になるまで待機する。
      注：四肢または尾への刺激に対する反射が消失していることを確認してください（通常は10分間で十分です）。
    3. 27Gの針を用い、非分画ヘパリン200 UIを腹腔内投与し、約5分間待機してから実験を続行する。
  2. 抽出およびカニュレーション
    1. マウスを仰臥位に固定し、外科用はさみを用いて胸部の被毛と皮膚を除去する。
    2. 横隔膜の整合性を維持することに注意しながら、横隔膜の下方で腹部切開を行う。
    3. 続いて横隔膜を横方向に切開し、速やかに肋骨を通して両側上行開胸術を行い、肋骨壁を除去します。
      注：心臓を損傷させないよう注意すること。処置中に心臓に不具合が生じたか、あるいは損傷した場合は、実験を続行しないことを推奨する。
    4. 細いピンセットを用いて、大動脈弓および隣接する血管を含む心臓の上部構造を穏やかに保持する。そのまま静かに持ち上げ、下から上に向かって切断し、心臓と肺をまとめて摘出する。
    5. 速やかに心臓を、Tyrode液50 mLが入ったペトリ皿に移します。 4 °C 初回洗浄用として。
      注：横隔膜を切開した瞬間から、動物に呼吸困難が生じ始めます。この時点からステップ6.2.3〜6.2.6を完了させるまでの制限時間は60秒です。この制限時間を超えると、虚血性損傷が誘発される可能性があります。
    6. 実体顕微鏡と微細剪刀を用いて、肺および過剰な脂肪組織を除去し、大動脈弓を露出させる。
      注： 組織を洗浄する際は、大動脈弓を損傷させないように注意してください。腕頭動脈より下方で大動脈を切断すると、カニュレーションが困難になり、圧漏れの原因となる可能性があります。
    7. 心臓を、Tyrode緩衝液50 mLを含む特製のカニューレ固定台に移します。 4 °C そして、20 G針からカスタムメイドしたカニューレに大動脈端を挿入し（補足ファイル 1).
      注意：大動脈弁を損傷しないよう十分に注意してください。弁が損傷すると心臓が膨張し、冠循環による洗浄が適切に行われなくなります。
    8. 4/0シルク縫合糸を用いて、カニューレーション結びを2箇所に行う。1つ目はカニューレ先端より遠位の陥凹部に、2つ目は腕頭動脈の手前に行う。補足ファイル1).
    9. 室温の緩衝液を満たした1 mLシリンジを用いて、タイロード液をゆっくりと注入します。冠状動脈組織が透明になることを確認し、カニュレーションが適切に行われたか検証してください。
    10. 心室および心房にアクセスできるよう、脂肪組織を除去する。
      注意：心臓の生存性を維持するため、カニュレーションは5分を超えないようにしてください。
    11. 心臓をランゲンドルフ装置に移し、30分間安定させる。
      注： 心臓をシステムの中心に配置します（図1A,B）、垂直に吊り下げます。心臓を吊り下げる際は、気泡が混入しないよう細心の注意を払ってください。気泡が生じると、圧力が140 mmHgを超えて上昇し、心臓が膨張し始め、生存不能となります。
      注：心臓が機械的に安定した反応を示し、自然振動数が約360回/分（BPM）となり、灌流圧が60～110 mmHgの範囲に収まった時点で、ランゲンドルフ装置のセットアップは完了となる。

7. ペーシングプロトコルおよびビデオ録画

  1. 心臓の生存能の確認
    1. 3 mL/minの灌流ポンプを用いて、冠動脈圧が60–110 mmHgの範囲にあることを確認する。冠灌流圧が60 mmHgを下回った場合は、灌流ポンプの流量をわずかに上げる（圧力が低いと、心臓が蒼白になり弛緩する）。逆に、圧力が110 mmHgを超えた場合は、ポンプの流量をわずかに下げる（過剰な圧力は組織浮腫を誘発し、心停止に至るまで圧力が進行的に上昇する）。}
      注：前述の最適範囲外で灌流圧を長時間維持すると、心臓の生存能に不可逆的な影響を及ぼす。
    2. カメラで正面全体が映るように、心臓を正面の位置に配置する。両心房がカメラに見えるように位置を調整する（図 2A）。
    3. 白金電極を右心房上部のペースメーカー結節にそっと浅く配置する。カメラのフィードをガイドにして、電極を視野内に導入する。電極が右心房を遮らないように配置する。カメラのライブビューを監視しながら、電極が心房組織に接触するまでゆっくりと進める。この際、過剰な圧迫を加えないように注意する（圧迫しすぎると、画像上で右心房が押しつぶされる）。
      注：正しく行われれば、カメラの視野は図 2Aのようになる.
    4. モニタリングおよびペーシングアプリケーション（補足ファイル 11）を起動し、データ収集カード（図 1A (6))をオンにする。刺激パラメータ値を、振幅 2 V、周波数 420、540、720 pulses per minute (PPM)、デューティサイクル 7 msの矩形パルスに設定する（図 2Aの挿入図）。
    5. 最も低い周波数から順に生存能確認刺激を行う。刺激時間は20 sとし、各刺激の間に20 sの回復期間（静止時間）を設ける。
      注：カメラモニタリングにより心臓の生存能を評価する。器官が生理学的に機能していれば、印加された刺激と心臓の反応との同期が観察され、心腔間で適切な協調が見られる。逆に、生存能がない場合は、心腔間の協調の喪失、または孤立した心房収縮のみの出現として現れる。
    6. 実験は室内の光や温度変動の影響を受けやすいため、チャンバーのドアを閉める（図 1C）。
      注：実験中はチャンバーのドアを閉めたままにする。カメラと灌流圧で心臓の生存能を監視する。
  2. データ記録
    1. 30 s間の矩形パルス列の印加と、それに続く30 s間の無刺激からなるペーシングプロトコルを適用する。各ペーシング列の刺激パラメータ値を、振幅 2 V、デューティサイクル 7 ms、周波数 360から720 PPMの範囲に設定する。
      注：ペーシングプロトコルは360 PPMから開始し、各タイムポイントで60 PPMずつ増加させる（図 2Aの挿入図）。
    2. カメラ収集ソフトウェア（補足ファイル 2）を用いて、心臓正面のダイナミクスのビデオを.avi形式で継続的に記録する。各ペーシング列について20 sのビデオ録画を行う。ペーシング開始から5 s後に始まる20 sのセグメントを記録する。代表的な生データ記録を補足動画 1に示す。
      注：コンピュータにより、モニタリングおよびペーシングアプリケーションとカメラ収集ソフトウェアからそれぞれ生成される、各記録ビデオ（.avi）に対応する印加ペーシング列（.xls, 補足ファイル 9）が同時に記録される（補足ファイル 2および補足ファイル 3）。
    3. 刺激プロトコル開始前に記録した最初のビデオと、プロトコル適用後に記録した2番目のビデオを比較して、心臓の生存能を確認する（図 2B）。

8. Langendorff灌流システムの実験後洗浄

  1. 刺激装置とECG白金電極を取り外します。心臓をシステムから取り出し、残っているTyrode液をすべて排液します。
  2. 光学システムをオフにし、O2バルブを閉じます。
  3. 37 °Cの脱イオン水1 Lでシステムを洗浄し、排液します。
  4. ステップ2.4と2.5を繰り返します。
  5. すべてのシステムと装置の電源を切ります。

9. ビデオ処理

  1. まず、各ビデオを解析ソフトにインポートし、ビデオ正規化関数を適用します。15.
  2. 心臓領域を含む関心領域（ROI）を選択します。画像セグメンテーションを行い、背景ノイズ、電極、およびカニューレを除去します（補足ファイル 4).
    注記削除する画像領域を正しく選択するには、以下を参照してください。 補足ファイル 10
  3. グローバル力学特性解析（補足ファイル 5）。変動性と信号の例を以下に示す。 付随図 S1, 付随図 S2、および 補足図 S3.
    1. 各ビデオフレームに形態学的演算を適用して心臓の外周を検出し、次に塗りつぶしフレームアルゴリズムを適用してマスクを生成します。15.
    2. 各フレームのセグメンテーション領域内のピクセル数をカウントし、次にこのカウントを画像内の総ピクセル数で正規化して、ダイナミックシグナルを算出します（挿入図 図2B および 補足図 S3).
    3. 得られた信号に対し、高周波ノイズおよび灌流滴下アーチファクトを抑制するため、3〜100 Hzの5次双方向バターワースフィルターを適用する。15.
    4. 記録された最大値および最小値を用いて、すべてのビデオ間で信号を正規化します。
    5. 各ダイナミカル信号および刺激信号について、最大振幅値間の間隔（IAA (s)）を算出することで、心拍数を決定する。
    6. 以下の式を用いて、BPM単位の周波数を算出します。
      figure-protocol-1
    7. IAAデータからポアンカレ写像を作成し、短期的および長期的な変動を可視化する16,17,18 (補足図 S1 および 付随図 S2).
      注：詳細については、以下をご参照ください。 補足ファイル10
  4. 心室の機械的力学のセグメント解析を行う（補足ファイル6).
    1. 画像の二値化を適用する。形態学的演算を用いて心室領域を限定し、ROIを損なうことなく楕円形状に調整する。15.
    2. 各フレームの心室領域に最小楕円を適合させます。フレーム内の遠位点セットの座標を抽出します。Y軸に沿った各端点において、10〜20点のポイントセットを使用します（図3A）。代表的な楕円推定の結果を以下に示す。 補足動画 2.
    3. 各ビデオにおけるY軸方向の最遠点間の平均距離として、心室短縮率を算出する。19.
    4. 得られた信号に対し、高周波ノイズおよび灌流ドリップによるアーチファクトを抑制するため、3～100 Hzの5次双方向バターワースフィルタを適用する。15.
    5. 各ペーシングで得られたすべてのビデオに対して心室短縮信号を正規化し、ステップ9.3.5～9.3.6と同様に心拍数と遅延を算出する。
      注：心室サイクル期間（DVE）、弛緩期間（DVW）、心室間間隔（IVV）、および心室振幅（VA）などのパラメータは、以下のように取得される（図3A).
      注：詳細については、以下をご参照ください。 補足ファイル10
  5. 心房の機械的ダイナミクスのセグメント解析を行う（補足ファイル 7).
    1. 2つのROIを用いて心房を画定します（図3C).
    2. それぞれの心房を個別に解析してください。
      1. ROIを損なうことなく調整を行いながら、形態学的演算子を用いて心房を画定する15コントラスト強調アルゴリズムを用いて、各心房の輪郭を抽出する。20,21.
      2. 画像の二値化を行い、1フレームあたり0以外のピクセル数を定量化することで、心房ダイナミック信号を取得する。
      3. 得られた信号に対し、高周波ノイズおよび灌流滴下アーチファクトを抑制するため、3～100 Hzの5次双方向バターワースフィルタを適用する。15.
      4. 2つの心房信号の平均を算出します（図3D).
    3. 各ペーシングで得られたすべてのビデオに基づき、心房短縮信号を正規化し、ステップ9.3.5–9.3.6と同様に心拍数および遅延を算出する。
      注：心房周期時間（DAE）、心房間間隔（IAT）、心房振幅（AA）などのパラメータは、以下のように取得されます（図 3D）。詳細については、補足ファイル10をご参照ください。
  6. 電気機械解析を実施する13,22 (補足ファイル 8).
    1. ペーシングデータを心房および心室信号と比較してください（図3D).
    2. 心伝導系における伝播時間を算出し、心房イベントと心室イベントの間の遅延時間を求めます（AVD）、印加した刺激を基準とする。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心機能の機械的評価実験は、図に示されるLangendorff装置を用いて行います。 図1A (上)モニタリングシステムおよび光学システムにより、照明制御がトリガーされた際にビデオ録画が可能になります。これは、以下に示される通りです。 図1A （下）. 図1C 周囲の温度変動や光から心臓を隔離して維持するように設計された、恒温制御キャビネットの外観を示しています。～に描かれているように 図1B分離心は、ランゲンドルフ装置、光学系、および刺激系で構成される実験セットアップにおいて、参照物体として配置される。

〜に示すように 図2A、単離心は逆行性灌流下で心房および心室の前面が明確に見えるように配置した。ドレナージベースの使用により（補足ファイル 1（排水システム）は、滴下する灌流液によって生じるモーションアーチファクトを低減し、取得信号を安定させるために不可欠であった。刺激プロトコルは、360～720 bpmの範囲の周波数で、それぞれ30秒間持続するパルス列（2 V, 7 ms）で構成された。

光学系を用いて心臓領域（HA）の変化を記録します。このダイナミック信号により、ピーク間の時間間隔（IAA）を取得することが可能です（図 2B の挿入図）。n = 6 個の心臓のコホートにおいて、刺激プロトコルの前（Start）と後（End）の平均心拍数を比較することで、モデルの生存性を評価しました。平均心拍数に有意な差は認められず（Start: 385 ± 38 BPM vs. End: 372 ± 18 BPM, Student’s t-test P > 0.05）、実験手順が心機能を損なわなかったことが示されました（図 2B）。

図2Cは、7つの異なる刺激周波数に対する心臓の周波数応答を示しており、明確な線形関係が認められます2 (R2 = 0.98 ± 0.01, 1:1モード)。最小ペーシング値は、マウスの生理学的特性によって制限されます (360 bpm)22,23。Langendorff灌流心臓は頻拍プロファイルを示します。代表的なペーシング刺激とそれに対応する応答を図2Cの挿入図に示します。

続いて、心腔のダイナミクスを評価するために、特定のセグメンテーション手法を導入します。心室短縮のパラメータは光学記録から得られました（図 3A）。図 3A の挿入図は、標準化された心室短縮を示しています。このダイナミック信号から、心室短縮振幅（VA）、心室収縮間の時間間隔（IVV）、心室収縮持続時間（DVE）、および心室弛緩持続時間（DVW）の4つのパラメータを取得します。

図3B は、7つのペーシング値における心室短縮振幅を示している。青色のバーは本研究の結果を表し、オレンジ色のバーはauxotonic記録法2を用いて得られたデータに対応している。統計解析には、二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびそれに続くSidak検定を用いた。より高いペーシング値である600 PPMおよび660 PPMにおいて、心室短縮振幅（VA）はそれぞれ有意に増加した（P < 0.05*, P < 0.005**）。VA（ref. 15 vs. 360 P > 0.05, ref. 15 vs. 420 P > 0.05, ref. 15 vs. 480 P > 0.05, ref. 15 vs. 540 P > 0.05, ref. 15 vs. 600 P < 0.005, ref. 15 vs. 660 P < 0.05, ref. 15 vs. 720 P > 0.05）。

心房領域を算出するために、特定のセグメンテーション手法を適用します（図 3C）。各心房にROIを設定します。図 3Dは、心房の平均信号と心室の短縮を示しています。このダイナミック信号から、心房振幅（AA）と心房収縮間の時間間隔（IAT）の2つのパラメータを算出します。心室信号と心房信号を比較することにより、心房イベントと心室イベントの間の遅延時間（AVD）を算出します。

figure-results-1
図1. キャビネットに設置されたLangendorff孤立心灌流系および光学系の実験セットアップ。(A) 光学系と結合した定流量逆行性Langendorff灌流システムの概略図。Langendorffシステム（上段）は以下で構成される：(1) 連続的に酸素供給されたTyrode溶液を含むリザーバー。灌流液の温度は、(2) 温浴リザーバーと (5) サーペンタイン再循環器によって 37 °C に維持される。(3) ペリスタルティック灌流ポンプにより 3 mL/min の一定流量が確保される。(8) 排水システムによって溶液が除去される。(4) 冷却コイルは熱交換器および気泡トラップの両方の役割を果たす。圧力モニタリングおよび電気刺激アプリケーションは、(6) モニタリングシステムによって制御される。光学系（下段）は、(11) 照明制御、(10) テレセントリックレンズを備えた高速カメラ、および2つの光源（LED）間の同期を含む。カメラレンズにより 100–200 mm の範囲で手動フォーカスが可能である。(9) 2つのLEDが平面凸レンズ（LI）と組み合わされ、心臓を均一に照射する。ペーシングデータは、モニタリングおよび刺激アプリケーション（Supplementary File 11）を用いて記録される。(7) コントローラーPCは、カメラおよびモニタリング・刺激アプリケーションに接続され、データ（ビデオおよび電気ペーシング）を同時に記録する。(B) キャビネット内部の様子。リファレンスオブジェクトによって心臓の垂直方向の位置が示されている。Langendorff装置のその他の構成要素も示されている。(C) キャビネット外部の様子。キャビネットは断熱されており、内部および外部の黒い壁面により反射と外光を最小限に抑えている。モニタリングおよびビデオキャプチャアプリケーションを実行しているコンピュータが示されている。略語：LC = テレセントリックレンズ、LEDs = 発光ダイオード、LI = 照明レンズ、PC = パーソナルコンピュータ。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-2
図2マウス心臓の設置および光学系のバリデーション。 (A) 心房、心室、ペーシング、およびECG電極を示す心臓の正面像。この画像は、420 bpmでペーシングした際のフレームに対応している（付随動画1）。挿入図は、ペーシングを適用した様子である。ビデオは刺激プロトコルの5秒から25秒の間で取得された。（B）心生存能試験。振動周波数を取得するために、ペーシングプロトコルの適用前と適用後の2本のビデオを記録する。その後、反応周波数を算出する。Student's t-検定を適用した（P > 0.05）。群間に有意な差は認められなかった。データは平均値で示した。 ± 標準偏差（n = 6）。挿入図は、プロトコルステップ9.3で得られた心臓面積（HA）および適用したペーシングを示す。C) 適用されたペーシングに対する心拍数応答。青色のバーは、7つのペーシング値に対する心臓の応答を示す（R2 = 0.98 ± 0.01)。オレンジ色のバーはPeña-Romoによって報告されたデータに対応している。2挿入図は代表的な応答波形を示している。統計解析には二元配置分散分析（two-way ANOVA）を用い、続いてSidak検定を行った。群間の差は有意ではない（P > 0.05)。データは平均値として提示されている。 ± 標準偏差（n = 6）。略語：ANOVA = 分散分析、BPM = 1分間あたりの拍動数、ECG = 心電図、HA = 心領域、PPM = 1分間あたりの脈拍数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3心房および心室の力学的応答の解析。 (A）心室短縮。この画像は、420 bpmのペーシング時のフレームに相当する（補足動画1）。赤い楕円を用いて、心室短縮率（VS）の推定が可能です（付随動画 2）。VSは、長軸（NV；オレンジ色の線）に沿った10〜20本の線の最大値と最小値の平均値として算出します。正規化された心室短縮は挿入図に示されています。これにより、短縮持続時間（DVE）、弛緩持続時間（DVW）、心室収縮間の時間間隔（IVV）、および心室短縮振幅（VA）の一連のパラメータを得ることができます。（B) ペーシングの関数としての心臓応答振幅（VA）を示す。青色のバーは本研究の結果を表し、オレンジ色のバーは補助等張（auxotonic）記録法を用いて得られたデータに対応する。2統計解析には、二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびそれに続くSidak検定を用いた。より高いペーシング値である600 PPMおよび660 PPMにおける心室短縮振幅（VA）は、有意に増加した（P < 0.05*, P < 0.005**)、それぞれであった。VA（参照 15 vs. 360 P > 0.05（文献15）、420 Pとの比較 > 0.05（参考文献15）、480 Pに対して > 0.05（文献15）、540 Pとの比較 > 0.05、参考文献15 vs. 600 P < 0.005（参考文献15）、対 660 P < 0.05、参考文献15 vs. 720 P > 0.05)。データは平均値として提示されている。 ± 標準偏差 (n = 6)。(C) 心房セグメンテーション。この画像は420 bpmでのペーシング時のフレームに対応している（補足動画1）。画像は、右心房（黄色の円）および左心房（青色の円）に設定された関心領域（ROI）を示している。心房の力学的信号は、両方のROIを平均化することで得られる。（D）心房および心室のダイナミクス。平均心房面積（黒線）、心室短縮（青線）の正規化応答、および420 bpmでのペースメーカー刺激（赤線）を示す。一連のパラメータを取得することが可能である：心房収縮間の時間間隔（IAT）、平均心房振幅（AA）、および心房心室遅延（AVD）。略語：AA = 心房振幅、ANOVA = 分散分析、AVD = 心房心室遅延、DVE = 心室短縮持続時間、DVW = 心室弛緩持続時間、IAT = 心房間間隔、IVV = 心室間間隔、NV = 心室ライン数、PPM = 1分間あたりのパルス数、ROI = 関心領域、VA = 心室短縮振幅、VS = 心室短縮。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

付随ムービー 1. 420 PPM 刺激下のビデオ。空間解像度 200 x 200 サブピクセル、時間解像度 750 fps で撮影した摘出マウス心臓の記録。略語：fps = frames per second、PPM = pulses per minute。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

付随動画 2. 心室短縮における楕円推定の代表的なビデオ。付随動画 1 の記録を 75 fps でリサンプリングして用いた、セグメンテーションアルゴリズムのデモンストレーション。略語：fps = frames per second。ここをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 S1. 心面積間隔の変動解析。 (A) 刺激なしの基底状態、(B) 360 PPM、(C) 420 PPM、および (D) 480 PPM。赤色の楕円で示されるように、短期変動および長期変動をデータ平均に対する分散として算出した。略語：IAA = 心面積間隔；PPM = pulses per minute；SD1 = 短期変動；SD2 = 長期変動。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 S2. 心拍面積間隔の変動解析。(A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM, および (D) 720 PPM。短期および長期の変動は、赤色の楕円で示されるデータ平均に対する分散として算出した。略語：IAA = 心拍面積間隔; PPM = 1分間拍動数; SD1 = 短期変動; SD2 = 長期変動。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 S3. 収縮ダイナミクスから得られた正規化信号の経時的グラフ。適用した刺激は 420 PPM（赤）であり、応答には心臓全体の面積（黒）、心室の短縮（青）、および心房面積のダイナミクス（黄）が含まれる。略語：PPM = pulses per minute（1分間あたりの拍動数）。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 1–11. アルゴリズムおよび技術文書。以下を含む圧縮フォルダ：1) 3Dプリントパーツの画像および仕様。2) カメラ取得ソフトウェアの詳細ガイド。3) モニタリングおよびペーシングアプリケーションの詳細ガイド。4) ビデオの正規化およびセグメンテーション用の計算プログラム（ステップ 9.1–9.2）。5) 心臓のグローバルメカニクスを計算するための計算プログラム（ステップ 9.3）。6) 心室メカニクスのセグメント別計算用の計算プログラム（ステップ 9.4）。7) 心房メカニクスのセグメンテーション用の計算プログラム（ステップ 9.5）。8) 心房室遅延を計算するための計算プログラム（ステップ 9.6）。9) 補足動画 1 に適用された電気ペーシング。10) 計算プログラム（ファイル 4–7）の操作に関する詳細ガイド。11) モニタリングおよびペーシングアプリケーション。さらに、計算プログラムの動作に必要な5つの外部関数（AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare）が含まれています。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの心臓は温度変化に対して非常に敏感です2,9,10,11,22。本実験では、灌流心臓を垂直に配置しました。また、Langendorff灌流法において灌流液の温度低下とモーションアーティファクトを最小限に抑えるため、わずかな修正を加えました。灌流液の温度を37 ± 0.5 °Cに維持し、温度低下を最小限にするためにサーペンチンに再循環ポンプを追加し、モーションアーティファクトを最小限にするためにドレナージベースを追加しました。さらに、Figure 1に示すように、光学系と、心臓組織を均一に照射するために両側に配置された2つの強度調整可能なLED光源を備えた断熱キャビネットを使用しました。

実験的な固定法の実現可能性を調査するため、異なるペーシング条件下での心領域の変化を追跡する一連の実験が行われました。ペーシングと心臓の周波数応答との間の同期範囲が得られ、これはauxotonic記録法8を用いたPeña-Romo2によって報告された同期領域と一致していました。これにより、この光学的な実験セットアップは、心室短縮に関するさらなる実験的研究をサポートするのに十分であると結論付けることができます（図 2）。

さらに、心室短縮と心房面積のダイナミクス信号を用いて、心臓の電気機械的共役の解析が可能かどうかを調査しました。心室および心房の信号により、房室収縮遅延（AVD）の時間を決定できます。ペースメーカーによる刺激周波数 420 PPM において、53 ± 14 ms（平均 ± 標準偏差）という値が得られました。この結果は、心電図（ECG）で測定した PR 間隔を 44 ± 6 ms と報告している VanderBrink24 の結果と一致しています。

本手法にはいくつかの限界もあります。図3Bに示されているように、ECG法と比較した際の房室遅延の不正確さや、auxotonic記録法で得られた結果と比較した際の心室振幅の不正確さは、外部のモーションアーティファクトに起因している可能性があります。

この手法は、薬理学的または全身的な影響を受けない無傷の摘出心において、心収縮性と心拍数を評価することに寄与します。これらの結果は、本光学システムによって心室および心房の短縮反応の測定が可能であることを示しており、房室協調性を損なう不整脈の研究や、薬理学的効果の評価に有用であることが強調されています。

この方法にはいくつかの制限もあります。第一に、2D近似であるため、オーキソトニック法のような収縮力の測定は不可能です。一方で、この方法は溶液滴によるモーションアーティファクトの低減や、溶液温度の制御に有用です。第二に、マウスモデルにおける性差は、生物医学研究の妥当性、再現性、および安全性に大きな影響を与えます。歴史的に、研究者は雌マウスの発情周期によるデータの変動を避けるために雄マウスを強く優先してきましたが、この前提はその後、大部分が不正確であることが示されています25,26。研究の種類に応じて、このプロトコルは雄または雌のマウスを用いた研究に適用することができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者に申告すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、科学・人文・技術・イノベーション事務局（SECIHTI）の助成金（助成番号：LN-2025-C-23）による支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL シリンジBD Plastipak302485外科的手順
20 G 針NIPROAH-2032大動脈カニューレ
25 mm 調節可能レンズ（倍率 8x-100x）GenericN/A光学システムカメラレンズ（調節可能カメラレンズとして言及）
27 G 針BD PrecisionGlide302358外科的手順
3D設計サポートパーツCINVESTAVN/Aカスタム3D設計サポートパーツ
4-0 シルク縫合糸AMERICAN SUTURETGSN0901大動脈カニューレ
40-A 電源STERENPRL-25LED電源
エアストーンN/AN/Aタイロード液の酸素供給
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306タイロード液
D-グルコースJ.T. Baker1916-01タイロード液
ドレナージポンプCINVESTAVN/Aカスタムドレナージポンプ（ドレナージポンプとして言及）
F = 25.4 mm 平凸レンズTHORLABSLA1951-A光学システム照明レンズ（平凸照明レンズとして言及）
氷酢酸Sigma-Aldrich695092ランゲンドルフシステムの洗浄
ヘパリンPiSA060M91抗凝固剤
HEPESSigma-AldrichH3375タイロード液
高出力LEDLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED光源
照明システムCINVESTAVN/Aカスタム照明システム（照明システムとして言及）
KClCTR SCIENTIFICCTR02196タイロード液
LabVIEW ソフトウェア version 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aモニタリングおよびペーシングアプリケーションの実行に使用するソフトウェア（モニタリングおよびペーシングアプリケーションとして言及）
MATLAB ソフトウェアThe MathWorksN/Aビデオの正規化、セグメンテーション、および解析プログラム用の計算ソフトウェア（計算ソフトウェアとして言及）
医療用酸素GRUPO INFRAN/Aタイロード液の酸素供給
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104タイロード液
可変流量ミニポンプCONTROL COMPANY3385灌流ポンプ
マウス外科手術キットKent ScientificINSMOUSEKIT外科的手順
NaClSigma-AldrichS5886タイロード液
NaH2PO4DEQDEQF290400250タイロード液
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH調整
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01データ収集カード
白金電極、径 0.25 mmSigma-Aldrich349402電気刺激電極
電源 (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Aリサーキュレーター用電源
圧力モニターCINVESTAVN/Aカスタム圧力モニター（圧力モニターとして言及）
圧力トランスデューサLA BOUVETB17295ランゲンドルフシステム圧力モニター
純エタノールSigma-Aldrich493511システム洗浄用エタノール
循環式恒温槽 (LXC)PolyScienceL113A0412リザーバーリサーキュレーター
生理食塩水PiSA1118480.9% 塩化ナトリウム (NaCl) 液
蛇行管式恒温槽CINVESTAVN/Aカスタム蛇行管リサーキュレーター/恒温槽
実体顕微鏡N/AN/A外科的手順
実体顕微鏡照明N/AN/A外科的手順
uEye Cockpit ソフトウェアIDS Imaging Development System GmBHN/Aカメラ画像収集ソフトウェア（カメラ画像収集ソフトウェアとして言及）
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624高速CMOSカメラ（CMOSカメラとして言及）
キシラジンPiSA4001211麻酔剤
ゾレチル 100Virbac83048907チレタミン-ゾレパゼム麻酔剤（麻酔剤混合液として言及）

参考文献

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