研究記事

バイオインフォマティクス的アプローチに基づくミトコンドリア機能障害および心不全におけるSUM酸化に関連する候補バイオマーカーの同定

DOI：

10.3791/72265

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2026年6月26日

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1Department of Cardiology, Hebei Medical University Third Hospital, 2Department of Clinical Pharmacy, Hebei Medical University Third Hospital

この記事について

サマリー

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バイオインフォマティクス、機械学習、qPCR検証を用いて、本研究は心不全におけるSUMoylationおよびミトコンドリア機能障害に関連する5つの候補バイオマーカーを特定しました。これらの発見は心不全のメカニズムの理解を深め、将来の診断研究の方向性を示唆しています。

要約

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心不全(HF)は慢性的な臨床的課題です。SUM酸化とミトコンドリア機能は心筋細胞の健康に不可欠ですが、それらがHFに与える影響は依然として不明です。HF関連のデータセット2件がGEOからダウンロードされました。重複遺伝子は、トレーニングセット内のすべての遺伝子、SUMO関連遺伝子、ミトコンドリア関連遺伝子から得られました。診断用主要遺伝子を特定するために3つの機械学習アルゴリズムが適用されました。その後、これらの遺伝子に基づいて診断モデルが構築・評価されました。さらに、HFと健康対照群の免疫微小環境はCIBERSORT、MCP-counter、ssGSEAを用いて評価されました。HFと健康対照群の免疫浸潤の違いを分析しました。薬物予測と分子ドッキングを行い、これらの遺伝子を標的とする潜在的な薬剤候補を特定しました。最後に、qPCRを用いて臨床サンプルの遺伝子発現レベルを検証しました。ミトコンドリア調節において顕著な富集を持つ共通遺伝子は合計113個同定されました。NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1、FKBP4の5つの主要遺伝子が3つの機械学習アルゴリズムによって同定されました。機能豊か解析により、これらの遺伝子は免疫応答、RNA処理、細胞周期調節と関連していることが示されました。さらに、免疫浸潤プロファイリングでは好中球浸潤がHFにおける免疫応答の調節不全に寄与していることが明らかになりました。分子ドッキングにより、小分子薬物IMX-942はSQSTM1と良好な結合親和性(-5.8 kcal/mol)であることが明らかになりました。qPCRの検証はバイオインフォマティクスの結果を支持しています。NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1、FKBP4は、HFにおけるSUMOイレーションとミトコンドリア機能を結びつける重要な遺伝子として同定されました。これらの発見はHFの病態生理に新たな知見をもたらし、新しい診断および治療戦略の開発に寄与する可能性があります。

概要

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心不全(HF)は、さまざまな心血管疾患の末期段階であり、心臓機能障害が体の代謝要求を満たせない状態を特徴とします。この衰弱性疾患は患者の健康に重大な脅威をもたらし、生活の質の低下や死亡率の上昇を引き起こします。HFの現在の診断方法として主に生化学的マーカー検出3,4、心エコー、放射線画像5があります。利用可能な治療法には薬理学的薬剤、デバイスを用いた介入、外科的手技が含まれますが、臨床結果は依然として満足のいくものではありません。副作用、デバイスの適用範囲の制限、免疫拒絶反応、その他の合併症などの制限が治療効果をしばしば妨げます(7,8,9,10,11)。したがって、HFの根本的なメカニズムの解明、早期かつ正確な診断バイオマーカーの特定、より効果的で安全な治療戦略の開発が緊急に求められています。

小型ユビキチン様修飾因子(SUMO)タンパク質は、動的かつ可逆的な過程で基底タンパク質のリジン残基に共有共役し、基質タンパク質の構造と機能を調節します12。SUMOylationは重要な翻訳後修飾であり、さまざまな細胞プロセスの重要な調節因子として機能します13,14。ミトコンドリアは細胞のエネルギー代謝中心として、HFの病因に重要な役割を果たしています。HFの病理学的過程では、ATP産生不足、活性酸素種(ROS)の破裂、Ca2+恒常性の不均衡などのミトコンドリア機能障害が進行に大きく寄与します。15、16、17、18。特に、新たな証拠はSUM酸化とミトコンドリア機能の間に潜在的な相互作用があることを示唆しています。ミトコンドリアストレスはSUMOylation関連経路を誘発し、SUMOタンパク質およびその特異的プロテアーゼはミトコンドリア恒常性を維持するために不可欠です。最近の研究では、心血管疾患およびHF進行におけるミトコンドリア品質管理およびミトコンドリア動態の重要性がさらに強調されています22,23。しかし、SUMOイレーションとミトコンドリア調節がHF発生に与える相乗効果は、特に遺伝子レベルでは依然として不明です。

本研究では、HFにおけるSUM酸化とミトコンドリア機能障害の交差点にある遺伝子を体系的に調査しました。これらはHFに個別に関与しているものの、まだ包括的に統合されていない2つの重要な生物学的プロセスです。重なり合う遺伝子は、HF関連の差異発現遺伝子、SUMOYylation関連遺伝子、ミトコンドリア関連遺伝子の交差によって同定されました。主要な遺伝子は機械学習アルゴリズムでスクリーニングされ、診断モデルを構築しました。機能的濃縮および免疫浸潤解析も行われ、HFにおけるこれらの生物学的役割の可能性を探りました。この統合的アプローチは、HFにおけるSUMoylationとミトコンドリア機能障害のクロストークを探るための体系的な枠組みを提供する可能性があります。

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プロトコル

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この研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、プロトコルは2024年11月に河北医科大学第三病院倫理委員会(W2025-065-1)によって承認されました。研究に関与したすべての被験者からインフォームド・コンセントが得られました。

データソースと前処理

HFに関連するRNA-seqデータが得られ、Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)からの2つのマイクロアレイデータセットも含まれます。2つの末梢血液マイクロアレイデータセットが選ばれました。GSE59867(HFサンプル34件と対照群30件)をトレーニングデータセットとして使用しました。検証データセットとしてGSE57338(HFサンプル177件と対照群136件)が使用されました。年齢、性別、疾患状態などのGSE57338の臨床情報はGEOから取得され、 補足表1にまとめられています。さらに、dbPTMデータベースから合計3,893件のSUMOylation関連遺伝子(SRG)が取得されました(https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php)(補足表2)、また過去の研究に基づく 2,030件のミトコンドリア関連遺伝子(MRG)が収集されました(補足表3)。次に、RパッケージGEOquery(v 2.72.0)25 を用いてGEOデータベースからデータセットをダウンロードし、表現行列を抽出し、サンプル表現型情報を取得しました。注釈は注釈ファイルをマッピングし、遺伝子IDを照合することで行われました。無効な遺伝子IDは除去され、最も発現率の高いプローブが保持されました。

機械学習による主要遺伝子選択

HF、SUMOylation、ミトコンドリアに関連する遺伝子を選択するために多段階アプローチが用いられました。まず、訓練データセット、SRGs、MRG間の共通遺伝子を交差解析を用いて特定しました。共通遺伝子の潜在的機能は、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)によるRパッケージClusterProfiler(v 4.12.6)26を用いた濃縮解析によって特定されました。その後、LASSO回帰、XGBoost、ランダムフォレスト(RF)という3つの機械学習手法が用いられ、遺伝子のさらなるフィルタリングが行われました。LASSO回帰では、最適な正則化パラメータλが交差検証によって選択され、最も予測価値の高い遺伝的特徴を特定しました。非ゼロ係数遺伝子が選定され、その後の解析が行われました。その後、XGBoostおよびRFアルゴリズムを用いて特徴重要度スコアを計算し、上位20遺伝子をスクリーニングしました。

診断モデルの構築と評価

GSE59867データセットに基づくロジスティック回帰を用いて診断モデルを構築しました。その後、このモデルを適用して疾患の状況を予測し、確率スコアを算出しました。モデルの検証のために、同じ主要な遺伝子をGSE57338データセットから抽出し、トレーニングデータセットに合わせて正規化し、外部予測に使用しました。モデルの性能は、受信機動作特性(ROC)曲線、混乱行列、キャリブレーション曲線、意思決定曲線解析(DCA)を用いて評価されました。

遺伝子セット豊富解析(GSEA)と細胞内局在化

スピアマン相関解析を用いて、各主要遺伝子の相関遺伝子を特定しました。GSEA解析は、RパッケージのClusterProfiler(v 4.12.6)を用いて主要な遺伝子の関連遺伝子に対して実施されました。一方、細胞内の主要な遺伝子の正確な細胞内局在を特定するために、GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)を用いて細胞内局在を特定しました。

遺伝子疾患関連および薬剤予測

特定された主要遺伝子の臨床的関連性を評価するため、系統的な疾患関連解析および薬物相互作用解析が行われました。疾患と遺伝子の関連性は比較毒性ゲノミクスデータベース(CTD; https://ctdbase.org/)を用いて調査され、結果は推論スコアと参照数(報告された上位10の関連)の両方でランク付けされました。主要遺伝子の遺伝子-薬物相互作用データは薬物-遺伝子相互作用データベース(DGIdb)から取得され、相互作用スコア0.5に基づいて薬物は除外<。その後、PDBデータベース(https://www.rcsb.org/)から主要遺伝子に対応するタンパク質の3D構造、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)から潜在的薬剤の分子構造をダウンロードしました。次に、CB-Dock227 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)を用いて分子ドッキング解析を行い、潜在的な薬物とタンパク質間の結合スコアを算出しました。結合自由エネルギーが低いほど相互作用が安定していることを示し、化合物がより高い標的化能力を持つ可能性を示唆しています。

免疫浸潤解析

免疫細胞浸透は、3つの補完的な方法で評価されました。すなわち、微小環境細胞集団計数(MCP-counter)28、RNA転写本の相対サブセット推定による細胞型同定(CIBERSORT)29 、および単一サンプル濃縮解析(ssGSEA)30。MCPカウンタおよびCIBERSORT解析はRパッケージIOBR(v 0.99.0)31を使用して実施されました。MCPカウンターは免疫細胞および間質細胞の存在比を推定するために用いられ、CIBERSORTは22種類の免疫細胞の相対的な割合を定量化するために用いられました。ssGSEAはGSVAパッケージ(v1.52.3)32 を用いて免疫細胞サブタイプのサンプルレベルの濃縮を評価するために実施されました。

競合する内因性RNA(ceRNA)調節ネットワークの構築

既に特定された主要遺伝子に関連するmiRNA–lncRNA調節の役割の可能性を調査するために、ceRNA調節ネットワークを構築しました。RパッケージのmultiMiR(v 1.26.0)33 は、PITA(https://omictools.com/pita-tool/)とmiRDBデータベース(https://mirdb.org/)のデータを統合し、主要遺伝子の潜在的なmicroRNA(miRNA)–mRNA相互作用を予測するために用いられました。高い信頼度と一貫性を持つmiRNA–mRNAペアが選択されました。その後、lncRNA–miRNAの相互作用をStarBaseデータベース(https://rnasysu.com/encori/)から取得し、10件のCLIP-seq実験で支持された相互作用をフィルタリング≥、lincRNAとして分類しました。cRNAネットワークはlncRNA-miRNA-mRNA相互作用を統合して構築されました。

qPCR検証

主要遺伝子の発現を検証するため、HF患者および健康対照群の血液サンプルを、承認済みのプロトコルおよびインフォームドコンセントのもと、河北医科大学第三病院の臨床コホート(n=6件)から採取しました(W2025-065-1)。TRIzol試薬とクロロホルムおよびイソプロパノールを組み合わせて総RNAを単離しました。抽出後、RNAはDEPC処理水に溶解され、その濃度と純度はナノドロップ分光光度計で評価されました。転写解析のために、RT用Fast First-Sand cDNA合成ミックス(dsDNase使用)を用いてRNAを逆転写してcDNAに転写しました。その後、Fast Taq qPCR SYBR Green Mixを用いて定量PCRが実施されました。具体的なプライマー配列は 材料表に詳述されています。相対的な遺伝子発現レベルは、適切な正規化を用いて2-ΔΔCT 法を用いて計算されました。

統計解析

すべての統計解析はRソフトウェアとGraphPad Prismを用いて実施されました。2つの独立したグループ間の統計比較は、データ分布に応じてStudentのt検定またはMann-Whitney U検定のいずれかを用いて行われました。p値が0.05未満であれば、統計的有意性を示すと考えられました。

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結果

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交差遺伝子の同定と機能豊化

HFにおけるSUM酸化およびミトコンドリア機能に関与する遺伝子を特定するために、まずトレーニングセットGSE59867で品質管理が行われました(補足図1A)。訓練セット内の全遺伝子、SRG、MRGの三者交差解析が行われ、113の重複遺伝子を特定しました(図1A)。これらの遺伝子の生物学的機能の可能性を探るために、GOおよびKEGG経路の濃縮解析が行われました。 図1Bに示されているように、GO濃縮はこれらの遺伝子が主にミトコンドリアのオートファジー調節、ミトファジー、ヌクレオシド三リン酸代謝、そして紡錘体や有糸分裂紡錘体構造を含む細胞周期関連の構成要素に関与していることを明らかにしました。主要な分子機能には、ユビキチンタンパク質リガーゼ結合と転写因子活性が含まれていました。KEGG経路解析はさらに、神経...

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ディスカッション

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HFは、さまざまな心血管疾患の進行性かつ末期期の病態生理学的メカニズムを特徴とし、非常に複雑で多因子的な病態生理学的メカニズムを特徴としています(17,34)。SUMOylationおよびミトコンドリア機能障害はそれぞれHFに関与していることが個別に示されていますが、それらの潜在的な相乗効果は特に遺伝子レベルで十分に探求されていません。本研究では、NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1、FKBP4の5つの主要遺伝子を特定し、複数の機械学習手法を用いてHFの診断モデルを構築しました。さらにバイオインフォマティクス解析を通じて、その生物学的機能の可能性を明らかにしました。

臨床診断における機械学習の予測力を活用し、LASSO回帰、XGBoost、RFアルゴリズムを用いて、SUMOylation関連遺伝子およびミトコンドリア関連遺伝子の共通遺伝子、さらにNFKB1、MYEF2、NSUN2、SQS...

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開示事項

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この研究は河北省医学科学研究プロジェクト(助成金番号:20250084)の支援を受けました。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には利益相反を申告するものはありません。

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材料

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この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クロロホルム代替品ServicebioG3014-02qPCR試薬
DEPC処理水 BiosharpBL510AqPCR試薬
Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix for RT (dsDNase付き)Albatross Biology500-101qPCR試薬
Fast Taq qPCR SYBR Green MixAlbatross Biology500-102qPCR試薬
FKBP4プライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’
リバース: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
イソプロパノールHushi80109218qPCR試薬
MYEF2プライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’
リバース: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
NanoDrop分光光度計Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000CqPCR試薬
NFKB1プライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’
リバース: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
NSUN2プライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’
リバース: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
SQSTM1プライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’
リバース: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
TRIzol試薬VazymeR401-01qPCR試薬
β-アクチンプライマーTsingkeN/Aフォワード: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’
リバース: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’
```

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