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方法論記事

ラットの経穴に対する再現性のある振動刺激のための機械的鍼治療器具

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DOI:

10.3791/72266

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2026年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1KM Science Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, 2Department of Acupuncture, Moxibustion and Acupoint, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Daegu, 3Department of Physiology, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、ラットのHT7（神門） acupuncture pointにおいて再現性のある針刺激を可能にする振動刺激装置を用いた、標準化された機械的鍼灸法について解説します。コカイン誘発性自発運動モデルで検証された本手法は、鍼灸による効果の背景にある末梢および中枢の神経生理学的メカニズムを調査するための、定量的かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。

要約

手技による鍼治療は実験的および臨床的研究で広く用いられていますが、鍼操作における施術者の習熟度や個体差に起因する再現性の低さがその適用上の制限となっています。この制限を克服するため、電流を使用せずに、刺入した鍼を通じて制御された振動刺激を与える機械的鍼刺激装置（MAI）が開発されました。本記事では、ラットのHT7（神門）経穴に対するMAI刺激の標準化プロトコルとして、動物の準備、経穴の特定、鍼の刺入、刺激パラメータの設定、および行動評価について提示します。代表的な検証研究では、HT7へのMAI刺激がコカイン誘発性の自発運動量を減少させ、メカノレセプターに関連するA線維経路を選択的に活性化することが示されました。さらなる研究により、これらの効果の媒介に末梢尺骨神経求心路、後索路、および中脳辺縁系報酬回路が関与していることが確認されました。本記事で提示する代表的な結果は、MAIプラットフォームを用いた既報の検証研究に基づいています。本プロトコルは、実験動物モデルにおける鍼刺激の神経生理学的メカニズムを調査するための、再現可能かつ定量的な手法を提供します。

概要

手技鍼治療は、針を直接操作することで末梢組織に動的な機械的入力を与える伝統的な針刺激法であり、臨床および実験の両方の場面で広く用いられています1,2。電気鍼（EA）とは異なり、手技鍼は挿入した針を物理的に操作することによって、組織の変形や末梢メカノレセプターの活性化を含む複雑な機械的刺激を発生させます2。これらの機械的構成要素は、鍼治療に特徴的な生理学的効果に重要な寄与をすると考えられており、電気刺激とは異なる体性感覚求心性経路を関与させると考えられています3,4。

手技による鍼治療は、生理学的な重要性と幅広い利用があるにもかかわらず、その実験的な適用は再現性の低さによって制限されています2。手技鍼の治療効果は、刺鍼の操作技術、刺激強度、頻度、持続時間など、術者に依存する要因に大きく左右され、これらは施術者や実験条件によって大幅に異なる可能性があります1。このような変動性は、鍼刺激と神経生理学的アウトカムとの間の因果関係を明らかにしようとするメカニズム研究において、大きな障害となっています。

これらの制限を克服するため、周波数、振幅、持続時間などの刺激パラメータを正確に制御できる電気鍼（EA）が代替法として頻繁に採用されてきました。しかし、EAは電気的入力を伴うため、手動の刺鍼では活性化されない別の神経経路を動員する可能性があります5。その結果、伝統的な手動鍼治療の基本要素である機械的刺激の特異的な寄与を単離して評価することは依然として困難です。したがって、メカニズムを解明する鍼灸研究には、電気的な混同を伴わずに制御された機械的刺激を提供できる再現可能な手法が必要です。

この制限に対処するため、刺激パラメータの定量的制御を可能にしつつ、振動ベースの機械的刺激を再現する機械的鍼治療器具（MAI）が2013年に開発されました3,5。この装置は、刺入した鍼に制御された振動刺激を直接的に与えることで、組織に適用される機械的入力を標準化します。このアプローチを用いて、機械的鍼治療が複数の実験モデルにわたり、体性感覚、報酬関連、および自律神経回路を調節することが先行研究で示されています4,6,7,8。例えば、HT7経穴への機械的刺激は、中脳辺縁系ドーパミン回路、内因性オピオイド経路、および体性感覚中継回路の調節を通じて、コカイン誘発性の行動反応およびアルコール依存症を軽減させました6,7。さらに、神経原性スポットに適用された機械的刺激と電気的刺激の併用は、中枢自律神経領域におけるオピオイド介在性メカニズムを通じて高血圧を抑制しました5。総合的に、このプラットフォームを用いた約30件の研究が、依存症、自律神経調節、およびその他の実験的条件下における鍼治療のメカニズムの理解に寄与しています。

一般的な振動のみの刺激システムとは異なり、本プロトコルでは、覚醒状態のラットに対する針結合型の非電気的振動ベースの機械的鍼治療のための統合的なワークフローを提供します。これには、装置の組み立て、針とモーターの結合、刺入深さの標準化、加速度計による校正、ツボの定位、およびラットのコカイン誘発性自発運動量モデルにおけるHT7刺激を用いた代表的な行動学的検証が含まれます。したがって、本記事は新しい治療デバイスを提示するのではなく、制御された機械的鍼刺激のための再現可能な実験プロトコルを提供するものです。

MAIの標準化され定量的に制御された出力は、データ駆動型解析アプローチとの将来的な統合に向けた有用なプラットフォームとなり得ます。振動数、加速度、挿入深さ、刺激時間などの刺激パラメータを正確に定義し再現できるため、これらの変数を計算モデリングの構造化された入力として利用できる可能性があります。近年の研究では、機械学習、ディープラーニング、および転移学習のアプローチが、複雑な生物医学的画像や振動ベースの信号データセットにおける特徴抽出、信号分類、パターン認識、および最適化を向上させることが示されています9,10,11,12。同様のアプローチをMAIベースの鍼灸研究に適用し、刺激パラメータを行動データ、神経生理学的データ、および振動出力データと統合することで、信号分析、行動分類、刺激パラメータの最適化、および鍼灸に関連する反応の予測をサポートできる可能性があります。したがって、MAIベースの刺激と機械学習の手法を組み合わせた今後の研究により、鍼灸研究の精度、再現性、およびメカニズム的な解釈がさらに向上することが期待されます。

重要な点として、本記事で提示されている代表的な検証データは、MAIプラットフォームを用いた既報の研究から再現、翻案、または要約したものです。本記事の主目的は、新たな実験結果を報告することではなく、実験動物モデルにおける標準化された機械的鍼刺激を再現性高く適用するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することにあります。

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プロトコル

本記事に記載されているすべての動物実験プロトコルは、大邱韓薬大学（DHU2012-008, DHU2022-12）および延世大学医科大学院（# 2023-0006）の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認され、米国国立衛生研究所（NIH）の実験動物の飼育および使用に関するガイドラインに従って実施されました。

1. 機械的鍼治療器具の準備

  1. メカニカル鍼刺激装置（MAI）を組み立てる（図1）。
    1. カスタムメイドの制御ユニットと、鍼に接続されたメカニカル振動器からなるメカニカル鍼刺激装置（MAI）を用意する（図1D）。制御ユニットを用いて、刺激強度、振動周波数、および刺激時間を調整する3,4,13。
    2. 直径0.10 mm、針身10 mm、ハンドル10 mmの滅菌済みの鍼を使用する。刺入深さを標準化するため、針先から3 mmの距離にゴムストッパーを針身に固定する。
    3. 安定したクリップ型コネクタを用いて、振動モーターを鍼に取り付ける。振動中に鍼が滑らないこと、および刺激中にストッパーが固定されたままであることを確認する。
  2. 刺激パラメータを設定する。
    1. 刺激条件を、85 Hz、1.3 m/s2での20秒間の連続振動に設定する。これにより、刺激中に安定した加速度波形が生成される（図1E）。
      ​注：先行する検証実験13において、手技による鍼刺激では約70–90 Hzの振動周波数と、平均約1.3 m/s2の加速度値が生成されることが示された（図1A、B）。これらの測定に基づき、MAIは85 Hzおよび1.3 m/s2で振動刺激を行うよう構成されており、これにより手技による鍼刺激の機械的特性に密接に近似させつつ、安定し再現性のある出力を提供している。20秒の刺激時間は、ラットのコカイン誘発自発運動量モデルにおける既報のパラメータ最適化研究13から採用したものであり、そこでは有効で耐容性の高い刺激条件を特定するために、異なる刺激時間と加速度強度が比較された。本プロトコルにおいて、「周波数」とは、加速度計の信号から測定された鍼先の振動の主周波数を指す。この値は、操作者による繰り返しの手の動きという緩やかなリズムではなく、ハンドルのフリッキング操作中に鍼先に伝達される振動を反映している。
    2. 85 Hz、1.3 m/s2の条件を適用し、手技による鍼操作に匹敵する安定し再現性のある振動パターンを生成させる（図1E）。
  3. 振動出力を検証する。
    1. 安定した振動出力を検証するため、モーターからの機械的振動が鍼からセンサーに直接伝達されるよう、鍼先を加速度計にしっかりと取り付ける。
    2. データ収集システムを用いて刺激期間中の加速度信号を記録し、LabVIEWまたは同等のソフトウェアで信号を分析する。
    3. 加速度値を、初期過渡応答後の刺激プラトー相で測定された安定した鍼先加速度と定義し、加速度信号から主振動周波数を算出する。
    4. 各実験セッションの前、およびモーター、コネクタ、鍼、または鍼とモーターの接合部を交換または調整した際に、校正を行う。
    5. 測定された主周波数と加速度がプラトー相で安定しており、目標刺激パラメータの許容範囲内（例えば85 Hzおよび1.3 m/s2の約±10%以内）である場合にのみ、動物実験に進む。
      注：手技による鍼刺激およびMAI刺激中に生成された代表的な加速度波形を図1B、Eに示す。

2. 動物の準備およびコカイン誘発自発運動モデル

  1. 実験動物の準備を行う。
    1. コカイン誘発自発運動量実験には、体重 270–320 g の雄性 Sprague-Dawley ラットを用いる3,4,5。動物は、餌と水が自由に摂取可能な状態で、12 時間明暗サイクル条件下で飼育する。
    2. 特に指定がない限り、各実験群に 6–8 匹の動物を割り当てる。
  2. 動物の馴化を行う。
    1. テストの 1 日前に、各ラットを実験手順に馴化させる。優しいハンドリングを行い、針を刺入しない擬似鍼操作を 2–3 分間実施する。
    2. 覚醒刺激処置中のストレス関連の行動反応を軽減するため、動物を自発運動量測定チャンバーに 90 分間入れる。
    3. 鍼実験の前に、計画している鍼処置と同じ時間、毎日掴みハンドリングと軽い手動固定にラットを馴化させる。
    4. 刺激中は、過度な圧力をかけずに、身体と前肢を安定させるように手で優しく保持する。固定ストレスによる全般的な影響を制御するため、非鍼コントロール動物に対しても同様の方法および時間で、針を刺入せずに軽く固定する。
      注意：操作者は、固定、刺針、および刺激を一定に実施できるよう訓練される必要がある。
    5. 激しい抵抗、発声、逃避試行、またはその他の過度なストレス反応が観察された場合は、処置を中止し、テスト前にさらなる馴化を行う。
      注意：すべての鍼刺激処置は、軽い手動固定下での覚醒動物に対して行う。

3. acupunctureポイントの定位

  1. HT7およびLI5の経穴を特定する。
    1. ヒトの経穴位置を動物の対応する解剖学的部位にマッピングする転移法を用いて、経穴を特定する。
    2. 前肢手首の横紋において、尺側手根屈筋腱の橈側に位置するHT7（神門）を特定する3,4,5,8。
      ​注：この部位は、解剖学的に尺骨神経付近の尺骨管／ギヨン管領域に対応する。対照的に、LI5は手首背側の橈側端に位置し、長母指伸筋腱と短母指伸筋腱の間にある。LI5はHT7の反対側に位置し、距離は約5 mmである（図1F）。これらの解剖学的指標を用いることで、経穴の再現性のある特定を確実にした14。
  2. 対照経穴を特定する。
    1. 手首付近の対照点としてLI5を使用する。HT7から約5 mm離れた橈骨遠端付近の、長掌筋腱と橈側手根屈筋腱の間にLI5を特定する。

4. 機械的刺激の手順

  1. 自発的活動量の測定実験を行う。
    1. ラットをオープンフィールドチャンバーに入れ、60分間の順化させる。ベースラインの自発的活動量を30分間記録する。
    2. 自発的活動量を亢進させるため、コカインを15 mg/kgで腹腔内投与する3,4,5。コカイン投与の1分後に、動物を軽く保定する。
    3. 刺入深さを標準化するため、針先から3 mmの地点にラバーストッパーを針シャフトに取り付ける（Figure 1D）。刺入時および振動時にストッパーが安定して保持されるよう、しっかりと固定されていることを確認する。
    4. 針を刺入する際は、実効的な刺入深さを変化させる可能性のある過度な皮膚圧縮を避けながら、ストッパーが皮膚表面に軽く接触するまで針を進める。
  2. 機械的刺激を適用する。
    1. パラメータ検証実験（Figure 2A–C）で特定された最適刺激条件である、85 Hz、1.3 m/s2の連続振動刺激を20秒間適用する。刺入後1分間は針を留置し、その後、針を抜去する。
    2. コカイン投与後、最大60分まで自発的活動量の記録を継続する。自発的活動量を10分間隔で、あるいは60分間の総移動距離として分析する（Figure 1C）。
    3. 以前の検証実験（Figure 2A–C）において、この持続時間でコカイン誘発自発的活動量の強力な抑制が得られたため、20秒間の刺激を標準条件として適用する。
      注：40秒間の連続刺激では、発声や回避反応などのストレス様行動が誘発されたため、標準刺激条件からは除外した。
  3. 刺激パラメータの検証実験を行う。
    1. 刺激パラメータを検証するため、刺激時間を0 s、10 s、20 s、40 sで比較するか、あるいは0.7および1.3 m/s2などの異なる加速度設定で比較する（Figure 2）。
    2. 既報4,8に従い、メカノレセプター関連の実験では、マイスナー小体優先条件として50-Hz刺激を、パチニ小体優先条件として200-Hz刺激を適用する。

5. データ収集および統計解析

  1. オーバーヘッドビデオトラッキングシステムを用いて、自発的な運動量を測定する。動物を正方形のオープンフィールドチャンバー（40 cm × 40 cm × 45 cm）に入れ、ビデオトラッキングソフトウェアを用いて総移動距離を定量化する。
  2. 振動キャリブレーション実験中の加速度計の出力から、加速度-時間波形を記録する。主周波数、加速度振幅、および安定した振動持続時間を報告する（図 1D,E）。
  3. パラメトリック統計解析を行う前に、データの分布に正規性があるかを確認する。データが正規性の仮定を満たしている場合は、一元配置または二元配置分散分析を用いて群間差を解析し、その後、適切な事後比較を行う。
  4. 可能な限り、実験群の割り当てについて盲検化した研究者が行動トラッキングおよび解析を行う。
  5. 行動データおよび生理学的データは、平均値 ± SEM で表示する。自発的な運動量は、一元配置または二元配置反復測定分散分析（ANOVA）を行い、続いて Tukey の事後検定を用いて解析する。
    注： サンプルサイズは、同一のラット・コカイン誘発自発性運動モデルおよび機械的鍼刺激プロトコルを用いた先行研究に基づいて決定した。十分な統計学的検出力を確保するため、1群あたり 6–8 匹のラットを使用した。鍼穴の定位不備、装置の故障、キャリブレーション中の不安定な振動出力、またはビデオトラッキングの失敗など、あらかじめ定義した技術的または手順上の問題が発生した場合にのみ、動物を解析から除外した。

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結果

再現性のある機械的刺激のバリデーション

図1に示す代表的なデバイス構成および振動出力の検証は、本稿のために作成されたものであり、手技鍼由来の振動パラメータの定量的基準範囲は、先行する検証研究からまとめられたものである。

MAIの検証は、手動の鍼操作中に発生する機械的な出力と、デバイス駆動の刺激によって生成される出力を比較することで行われました（図1）。鍼の手動操作では、針先に急激で不規則な加速度ピークが生じ、操作者間で大きなばらつきが認められました13。元の検証研究では、手動の刺鍼操作中に、加速度値は0.1 m/s2から2.9 m/s2の範囲で、平均値は約1.3 m/s2であり、約70–90 Hzの支配的な振動周波数が検出されました（

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ディスカッション

本研究では、振動ベースの機械的刺激を再現性高く提供することを可能にする振動刺激装置を用いた、機械的鍼治療の標準化プロトコルを提示します。刺激周波数、加速強度、および持続時間を定量的に制御することで、本アプローチは、施術者の技術に依存し標準化が困難であるという、従来の徒手鍼治療の大きな制限を解消します。

このプロトコルの主な利点の一つは、鍼刺激の機械的構成要素を単離し、標準化できることです。施術者によって大幅に異なる手動鍼とは異なり、MAIは挿入された鍼を通じて、安定し再現性のある振動刺激を直接的に生成します。この再現性は、鍼の効果の神経学的および生理学的根拠を調べるメカニズム研究において特に重要です。

電気針（EA）と比較して、本プロトコルでは外部電流を導入することなく機械的刺激を検討することが可能です。電気刺激は、電気的興奮性、電極構成、電流強度、および組織インピーダンスに応じて、末梢神経線維を直接脱分極させる可能性があるため、この区別は重要です16,

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開示事項

著者らは、本研究に関連して、競合する経済的利益または利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、韓国韓医学研究院（KIOM）の助成金（Grant No. KSN2512011）および、韓国保健産業振興院（KHIDI）の...&保健福祉部より資金提供を受け、韓国保健産業振興院（KHIDI）を通じたDプロジェクト（#38）による支援を受けた & 大韓民国福祉部（RS-2024-00443893）、および韓国政府の助成による韓国研究財団（NRF）の助成金（RS-2024-00349070）に感謝いたします。また、機械的鍼治療器具の開発および検証に関連して、多大なるご支援と洞察に満ちた議論をいただいた韓国韓医学研究院の鍼穴研究チーム、大邱韓医大学の経絡鍼穴学教室、および延世大学大学院医学部の生理学教室に心より感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
加速度計PCB PiezotronicsPO-AXA-12-01振動測定に使用
鍼針 (0.10 mm) × 10 mm)Dongbang Acupuncture Inc.DB102滅菌使い捨て鍼
ワニ口クリップコネクタ該当なし該当なし振動機を鍼に接続するために使用する
塩酸ブピバカイン（0.5%）Huons Pharm（韓国）HIRAコード (199502333)局所麻酔実験に使用
塩酸コカインMacfarlan Smith Ltd 53-21-4 コカイン誘発自発的活動量実験に使用
制御ユニット特注の該当なし刺激周波数、加速度強度、および持続時間を調整するために使用される
データ収集ソフトウェアLabVIEWLabVIEW 7 Express (7.0)振動信号解析に使用
データ収集システムNational InstrumentsDAQ-NI USB-6200信号のデジタル化に使用されます
機械式鍼治療器具 (MAI)特注の該当なし制御ユニット、振動モーター、クリップ型コネクター、鍼、およびゴムストッパーで構成されるカスタムメイド装置
オープンフィールド活動量測定装置特注の正方形オープンフィールドボックス
(40 cm × 40 cm× 45cm)
黒色アクリル製。 		自発的運動量解析に使用
ゴム栓該当なし該当なし挿入深度を標準化するため、針先から3 mmの位置に取り付けた。
Sprague-DawleyラットOrient BioCrl:CD(SD)IGS男性、270–320 g
振動モーターモーターバンクMB-0412V 機械的振動刺激に使用される
ビデオトラッキングソフトウェアEthoVision XTEthovision 3.1自発的活動量追跡に使用

参考文献

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