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研究記事

柳威帝煌湾はNF-κBシグナル伝達を抑制することで、破骨細胞形成および卵巣摘出術による骨減少を抑制します

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DOI:

10.3791/72270

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2026年7月28日

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、柳尾帝煌湾(LWDHW)がNF-κBシグナル伝達経路を阻害することで破骨細胞分化および卵巣摘出術による骨減少を抑制することが示されました。これはLC-MS/MS解析、ネットワーク薬理学、in vivoおよびin vitroの検証を通じて明らかになりました。

要約

柳威帝皇湾(LWDHW)は伝統的な中医の古典的な処方であり、腎欠乏に関連するさまざまな疾患の治療に広く用いられており、閉経後骨粗鬆症(PMOP)において満足のいく臨床効果を示しています。しかし、その薬理学的メカニズムは依然として明確ではありません。これに対処するため、まずLC-MS/MSを用いてLWDHWの化学成分を解析し、1,615成分を特定しました。ネットワーク薬理学は、炎症とNF-κBシグナル伝達経路がLWDHWのPMOP効果の潜在的な治療メカニズムであると予測しました。その後、27頭の雌のC57BL/6JマウスをSham、Model、LWDHWグループに無作為に割り当てました。後者2群のマウスは両側卵巣摘出術(OVX)を受け、LWDHW群のマウスは8週間にわたり9.75 g/kg/日の経口LWDHWを受けました。血清および大腿骨サンプルは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)、組織学的検査、免疫組織化学(IHC)のために採取されました。一次骨髄由来マクロファージ(BMM)はLWDHWで処理され、その後TRAP染色およびqRT-PCRを施しました。OVXマウスでは、LWDHWは骨の減少と骨の微細構造の悪化を有意に緩和し、血清β-CTXレベルの低下と大腿骨組織の破骨細胞数の減少を伴いました。IHC染色により、LWDHW処理マウスの大腿組織におけるTNF-α、IL-1β、p-P65の発現がモデル群と比較して著しく低いことが明らかになりました。in vitroでは、TRAP染色によりLWDHWがBMMsのRANKL/M-CSF誘発性破骨細胞分化を抑制し、 Ctsk、 MMP9、 Nfatc1の発現をダウンレギュレーションすることが示されました。さらにウェスタンブロット解析により、LWDHW処理後のBMMsでP65、p-P65、P-P65、IκBα、p-IκBαのタンパク質レベルが有意に低下していることが示されました。総じて、LWDHWは閉経後の骨粗鬆症を緩和し、おそらくNF-κBシグナル伝達による破骨形成を抑制する効果があります。

概要

閉経後骨粗鬆症(PMOP)は、骨量の減少と骨の微小構造の悪化を特徴とする、広く見られる代謝性骨疾患です。高齢化人口の増加に伴い、PMOPの発生率は世界的な公衆衛生問題となり、閉経後の女性の健康を深刻に脅かしています。中国では、PMOPの全体的な有病率は最高32.1%に達します。患者は慢性的な腰痛、脊椎変形、脆弱性骨折などの重篤な合併症にかかりやすい傾向があります。現在、FDA承認の骨粗鬆症治療薬にはビスホスホネート6、副甲状腺ホルモン6、デノスマブ8が含まれており、臨床で広く使用されています。しかし、長期的な適用は様々な副作用によって制限されることが多い9.したがって、PMOPに対してより安全で効果的な治療薬の開発が緊急に求められています。代替案としては、その有効性と安全性の高さから注目を集めている中国漢方薬があります。

柳為帝皇(LWDHW)は、宋代の古代文献『小児疾患治療の鍵』に初めて記録された、伝統中国医学(TCM)の古典的な処方です。何千年もの間、LWDHWは腎欠乏症に関連するさまざまな疾患の治療に臨床で広く利用されてきました。11、12、13、14。中医学の「腎臓が骨を支配する」理論によれば、PMOP患者の骨量減少や骨の劣化は主に腎臓エッセンスからの栄養不足によって引き起こされます。したがって、LWDHWはPMOPの臨床管理に一般的に適用されており、明確な治療効果が示されています16,17。しかし、動物および臨床研究でLWDHWが抗酸化作用、抗炎症作用19、抗線維活性14など複数の薬理学的効果を発揮することが明らかになったものの、PMOPに対するその根本的なメカニズムはほとんど解明されていません。

骨恒常性は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスに依存しています。このバランスは、炎症状態下で破骨細胞の分化と活動が強化されると崩れ、骨吸収の加速を引き起こします。この過程で、NF-κB経路は中核的な調節因子として機能します。TNF-αやIL-1βなどの炎症因子はIκBαのリン酸化および分解を誘発し、リン酸化されたp65(p-P65)の核内転座を引き起こす22。その結果、Ctsk、Mmp9、Nfatc1などの下流破骨特異的遺伝子が活性化され、破骨形成を促進する23,24。

ネットワーク薬理学は、コンピュータサイエンス、薬理学、バイオインフォマティクスを統合した学際的な分野です。中国漢薬の治療効果の薬理学的メカニズムを包括的に探求する上で、明確な利点を示します。本研究では、ネットワーク薬理学を用いてLWDHWの抗骨粗鬆症効果に関与する生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を予測しました。同時に、LWDHWの化学成分はLC-MS/MSを用いて分析されました。さらに、OVXマウスモデルを用いた in vivo 検証および一次骨髄由来マクロファージ(BMM)を用いた in vitro 実験も実施し、LWDHWのPMOPに対する薬理学的メカニズムをさらに調査しました。ワークフローは 図1に示されています。

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プロトコル

すべての動物実験は浙江中国医科大学動物倫理委員会(IACUC-202402-07)によって承認されました。

LWDHWの調製およびLC-MS/MS解析

LWDHWの配合は6種類の中国漢本で構成されています: レフマニア・グルティノサ (Gaertn.)、 コルヌス・オフフィシナリス (Sieb.)、パエオニア・サフルティコサ(Andr.)、 ディオスコレアエ(対向 )、ポ リアココス (シュワル)、ア リスマオリエンタレ (サム)。これらのハーブに関する詳細な情報は 表1に記載されています。すべての生薬は浙江中国医科大学第一附属病院(杭州、中国)から供給され、浄化水で0.1 kg/Lの漢薬水比で煮沸されました。得られた水抽出物はろ過され、0.5 g/mLの作業溶液に濃縮され、その後のLC-MS/MS分析および動物実験に用いられました。さらに、作業中の溶液は細胞実験用の凍結乾燥粉末に加工されました。

LC-MS/MS解析において、液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りで、流動相A(水)および移動相B(有機物)は、それぞれ正イオンモードで0.1%の甲酸、アセトニトリルが水に、負イオンモードでは5 mMのアンモニウム・アーマテ、アセトニトリルであった。総稼働時間は8分で、流量は0.3 mL/min、カラム温度は40°C、注入容量は2 μLでした。質量分析では、完全なMS-ddMS2モードでデータを取得し、スプレー電圧は+3.50 kV(正)および–2.50 kV(負)に設定されました。

LWDHWのバイオアクティブ成分とターゲット予測

6種類の成分薬の個別名が中医体系薬理学(TCMSP)データベースに入力され、LWDHWの全成分リストが取得されました。その後、経口バイオアラビリティ(OB)≥30%、薬剤類似度(DL≥)0.18、27、28、29、30という薬理動態パラメータを用いてスクリーニングされました。生物活性成分の対応するタンパク質が同定され、UniProtに提出され、標準化された遺伝子名が取得されました。これらはLWDHWの最終的な遺伝子標的として定義されました。

LWDHWとPMOPの重複目標

PMOPに関連する遺伝子標的は、2024年10月2日にGeneCardsおよびDisGeNETデータベースの両方で「postmenopausal osteoporosis」キーワード検索によって取得されました。ターゲットはDisGeNETで>0.1、GeneCardsで>10のスコア閾値を用いてフィルタリングし、重複したエントリは除去して冗長でないPMOP関連遺伝子のセットを得ました。その後、LWDHWのハーブ由来標的およびPMOP関連標的をVennyオンラインツールに取り込み、LWDHWとPMOPの重なり合う標的を示すベン図を作成しました。

遺伝子オントロジー(GO)およびシグナル伝達経路の濃縮解析

LWDHWとPMOPの重複標的はDAVIDデータベースを用いたGo濃縮解析の対象となりました。回収されたGO用語は、細胞成分、分子機能、生物学的過程(BP)の3つのカテゴリーに分類されました。FDR<0.01をフィルタリングした後、上位30のBP項が褶曲濃縮の降順にバブル図で示されました。

次に、重複する標的を京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)およびMetascapeデータベースに登録し、シグナル伝達経路の濃縮解析を行いました。KEGGおよびMetascapeデータベースからの強化経路は、対応するターゲット数で降順にランク付けされ、各データベースの上位25の経路が棒グラフで表示されました。

ネットワーク建設

Cytoscapeでは「Formula-Herbs-Ingredients-Targets-Disease」および「Targets-Pathways」ネットワークを構築し、コンポーネント間の相互関係を可視化しました。重なり合う標的をSTRINGデータベースに入力することで、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークが生成されました。ネットワーク内のハブターゲットは、次数中心性(DC)、ビトウィネス中心性(BC)、近さ中心性(CC)などの位相的特徴に基づくスクリーニングによって特定されました。

動物のグループ分け、OVX誘発性骨粗鬆症モデルおよび薬物介入

浙江中国医科大学動物実験センター(浙江省杭州)から、合計27頭の雌のC57BL/6Jマウス(生後2か月、体重22 ± 2 g)が提供されました。すべての動物は、特定の病原体フリー(SPF)環境下で飼育され、12時間の明暗サイクル、周囲温度は25°C、湿度は40%から60%の範囲で、食物と水は自由に利用されました。適応給餌を1週間行った後、マウスはランダムな数表を用いて3つのグループ(n=9群)にランダムに割り当てられました:Sham、Model、LWDHW。モデル群およびLWDHW群のマウスはPMOPモデルを構築するために両側卵巣摘出術(OVX)を受け、シャム群は同量の骨膜脂肪組織を切除する偽手術を受けました。手術から2日後から、LWDHW群のマウスは、1日9.75 g/kg/日(ヒト相当量から体表面積に基づく換算)の経口経口漏圧液を受け、モデル群とシャム群は同量の生理食塩水を受けました。血清および大腿組織を含む生物学的標本は投与後8週間後に採取され、その後の分析が行われました。実験期間中、いずれのグループでも予期せぬ死亡や死亡は発生しませんでした。

血清酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)

後眼窩神経叢から全血を採取し、1000 x g で4°Cで15分間遠心分離して血清を得ました。オステオカルシン(OCN)およびタイプIコラーゲンβのβ C末端テロペプチドの血清濃度は、製造元のプロトコルに従い対応するELISAキットを用いて測定されました。

μCTと生体力学解析

大腿骨サンプルは高解像度マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)装置を用いて10μmの等方性分解能でスキャンされました。NReconソフトウェアを用いて、取得した画像から遠位大腿骨の三次元(3D)微細構造を再構築しました。その後、骨ミネラル密度(BMD, g/mm3)、骨容積比(BV/TV, %)、小梁厚(Tb.Th, mm)、小梁数(Tb.N, 1/mm)などの骨微細構造パラメータが遠位大腿骨の関心領域(ROI)内で定量化されました。

大腿骨サンプル(グループあたりn=3個)の生体力学的特性は、軸捻り疲労試験システムを用いた三点曲げ試験で評価されました。中間骨幹部には、構造破壊まで毎分2mmの一定変位率で圧縮荷重が加えられました。最大負荷(N)はシステムのソフトウェアによって自動的に記録されました。

組織形態学、免疫組織化学(IHC)、および免疫蛍光(IF)染色

4%パラホルムアルデヒドで固定し、14%EDTA溶液で脱灰し、段階エタノール系列による脱水を経て、大腿動脈サンプルは前述の31番のように厚さ3μmのパラフィン断片に処理されました。切片は形態評価のためにアルシアンブルーヘマトキシリン(ABH)/オレンジGで染色されました。OsteoMetricsソフトウェアを用いて、遠位大腿骨幹端の小梁骨領域の定量解析を実施しました。

肝臓と腎臓の標本は固定され、パラフィンに埋め込まれ、4μmの断片に切り分けられました。通常の脱硫黄と再水和の後、切片はヘマトキシリンとエオシンで染色されました。組織学的検査は光学顕微鏡下で行われました。

IHCおよびIFアッセイは、確立された手順に従ってパラフィン埋め込み切片に対して実施されました。簡単に言えば、抗原回収は60°Cの0.01 Mシトレートバッファーで4時間インキュベートすることで行われました。切片は4°Cで一晩、ALP(1:300)、IL-1β(1:500)、TNF-α(1:500)、p-P65(1:300)と共にインキュベートされました。対応する二次抗体と20分間インキュベートした後、切片をIHCのためにジアミノベンジジン(DAB)溶液およびヘマトキシリンカウンテル染色、または断食における核標識のためにDAPI染色を施しました。正の染色定量化のために、各サンプルあたり3つの組織切片からランダムに選ばれた4つのフィールドを取得しました。IHC染色において、平均光密度はImage-Pro Plusソフトウェアを用いて測定された集積光密度(IOD)と対応する空洞面積の比率として定義されました。IF染色では、正の染色面積をフィールド面積に正規化し、パーセンテージで表し、定量は同じソフトウェアで行われました。

一次骨髄マクロファージ(BMM)培養および細胞計数アッセイ

2か月齢のC57BL/6マウスの大腿骨および脛骨からリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて骨髄細胞を洗浄しました。得られたセル懸濁液は70μmのストレーナーでろ過され、200 x g で5分間遠心分離されました。細胞ペレットは10%胎児用牛血清を含むα-MEM完全培地に再懸濁されました。5%のCO₂大気中で37°Cで24時間の培養後、非接着細胞を除去しました。マクロファージ分化を誘導するため、50 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)と40 ng/mLのRANKLを含む培地で、成熟したBMMが観察されるまで5〜7日間、付着細胞を培養しました。

BMMは96ウェルプレートに3×104 セル/ウェルでメッキされていました。LWDHWの勾配濃度で24時間処理した後、BMMsは10%細胞計数キット-8(CCK-8)作動溶液と37°Cで1時間インキュベートしました。各ウェルの吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。

原発BMMsにおける定量的遺伝子発現解析

BMMは6cmの皿に種付けされ、1皿あたり3×10、6 細胞の密度で行われました。500および1,000 μg/mLのLWDHWで24時間処理した後、製造元の指示に従いRNA-クイックピリファイションキットを用いてBMMから総RNAを抽出しました。分光光度測定による定量後、総RNAの500 ngがcDNAに逆転写されました。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)は遺伝子特異的プライマーを用いて実施され(表2)、PCRサイクル条件は以下の通りです:95°Cで30秒の初期変性、その後95°Cで5秒、60°Cで30秒の40サイクル。遺伝子発現レベルは2ΔΔCt 法を用いて解析され、内部参照遺伝子としてGAPDHが使用されました。

一次BMMに対するウェスタンブロット解析

6cm皿に3×10、6 細胞ずつプレートを施した後、BMMは様々な介入処理を受け、その後RIPA溶解バッファーで氷上溶解されました。総タンパク質はBCAタンパク質アッセイキットで収集・定量されました。タンパク質サンプル(1レーンあたり30μg)はSDS-PAGEによって12.5%ポリアクリルアミドゲル上で分離され、0.2μmのPVDF膜に移されました。20分間ブロッキング後、膜は4°Cで一晩、P65(1:1000)、p-P65(1:1000)、IκBα(1:1000)、p-IκBα(1:1000)、βアクチン(1:1000)とともにインキュベートされました。翌日、膜は室温で1時間、二次抗体とともにインキュベートされました。タンパク質バンドはECL化学発光検出キットを用いて可視化され、自動化学発光画像解析システムでキャプチャされました。

大腿骨組織およびBMMのTRAP染色

大腿組織切片およびBMMsは、1 x 105 細胞/ウェルの24ウェルプレートで染色され、製造元のプロトコルに従い酒石酸性ホスファターゼ(TRAP)染色キットを使用して染色されました。破骨細胞被覆された小梁骨表面(Oc.S/BS)とBMM培養における破骨細胞形成領域は、Image-Pro Plusソフトウェアを用いて定量化しました。

統計解析

すべてのデータは平均±標準偏差として提示されました。SPSSでは一元ANOVAに続いてダネット検定を用いました。 *p < 0.05および **p < 0.01は統計的に有意とされました。

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結果

LC-MS/MSによるLWDHWの化学成分

LWDHW水溶液の化学プロファイルはLC-MS/MS分析によって特徴付けられました。 合計1615個の成分が特定され、そのうち968個が正イオン化モードで検出され、647個が負イオン化モードで検出されました(図2A)。各イオン化モードの上位10成分の詳細は 図2B、Cに示されています。

ネットワーク薬理学を用いたLWDHWのPMOPに対する治療標的予測

LWDHWのPMOPに対する治療標的を予測するために、ネットワーク薬理学的手法が用いられました。当初、LWDHWの69種類の生物活性成分がTCMSPデータベース...

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ディスカッション

世界的な人口高齢化に伴い、PMOPは深刻な世界的な健康問題となり、毎年36万人の女性に影響を及ぼしています。現在の抗骨粗鬆症薬に伴う副作用を考慮すると、より安全で効果的な治療戦略の開発が不可欠です。LWDHWは中医学における典型的な腎臓強化処方であり、さまざまな骨疾患の治療のための代替医療として機能しています(37,38)。臨床的証拠では、PMOP患者の骨量増加に効果があることが示されていますが、その正確な作用機序は不明です。本研究では、LWDHWがOVXマウスにおける骨保護効果を確認し、ネットワーク薬理学と動物・細胞検証を統合したアプローチを用いて、NF-κBシグナル伝達を抑制することでLWDHWが破骨細胞介在骨吸収を抑制することを明らかにしました。

骨芽細胞と破骨細胞の協調した活動は、骨の恒常性に不可...

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開示事項

すべての著者は、競合する金融的または非財務的利益を一切主張していないと述べています。

謝辞

この研究は浙江省自然科学基金(ZCLQN25H2701)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.01 Mクエン酸緩衝液SolarbioC1010IHCおよびIF染色のProtocol Step 10における大腿部切片の抗原回収用
0.2 μm PVDF膜BioRad1620177Protocol Step 13におけるSDS-PAGEから膜へのタンパク質の電気移行用
12.5%ポリアクリルアミドゲルEpizyme BiotechPG113Protocol Step 13におけるSDS-PAGEによるタンパク質の分離用
ALP抗体ARIGOARG57422Protocol Step 10における大腿部切片のIHC検出用
自動化化学発光イメージ解析システムTanon5200Protocol Step 13におけるWestern blotバンドの可視化用
軸-ねじり疲労試験システムInstronmodel 5569R1412Protocol Step 9における大腿サンプルの生体力学的試験用
BCAタンパク質アッセイキットBeyotimeP0010SProtocol Step 13におけるWestern blot前のタンパク質定量用
CCK-8BeyotimeC0039Protocol Step 11におけるBMMの細胞生存率測定用
Cytoscape該当なし該当なしバージョン3.8.0
DAVIDデータベース該当なし該当なしバージョン6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNETデータベース該当なし該当なしhttps://www.disgenet.org/
ECL化学発光検出キットVazymeE411-04Protocol Step 13におけるWestern blotシグナルの化学発光検出用
OCNのELISAキットMEIMIANMM-0551M1Protocol Step 8における血清オステオカルシンレベルの測定用
β-CTXのELISAキットMEIMIANMM-44858M1Protocol Step 8における血清β-CTXレベルの測定用
GeneCardsデータベース該当なし該当なしhttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830AProtocol Step 12におけるqRT-PCR増幅用
高解像度マイクロCT（μCT）機器BrukerSkyscan 1176Protocol Step 9における大腿骨の微細構造の高解像度μCT撮像用
IL-1β抗体BIOSSbs6319RProtocol Step 10における大腿部切片のIHC検出用
IκBα抗体CST4812Protocol Step 13におけるWestern blot検出用
京都遺伝子とゲノム百科事典（KEGG）データベース該当なし該当なしhttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Protocol Step 11におけるBMMの分化誘導用
Metascapeデータベース該当なし該当なしhttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120Thermo Fisher ScientificBRE725531Protocol Step 2におけるLWDHWのLC-MS/MS分析用
P65抗体CST8242Protocol Step 13におけるWestern blot検出用
p-IκBα抗体CST2859Protocol Step 13におけるWestern blot検出用
p-P65抗体CST3033SProtocol Step 13におけるWestern blot検出用
p-P65抗体Suzhou RuiyingRLP0187Protocol Step 10における大腿部切片のIHC検出用
PrimeScript RT ReagentキットTakaraRR047AProtocol Step 12におけるBMMの全RNAの逆転写用
QuantStudio 5システムApplied BiosystemsA28573Protocol Step 12における破骨細胞マーカー遺伝子のqRT-PCR分析用
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Protocol Step 11におけるBMMの分化誘導用
RIPA溶解バッファーEpizyme BiotechPC101Protocol Step 13におけるBMMからのタンパク質全抽出用
RNA-Quick精製キットTransGen BiotechER501-01-V2Protocol Step 12におけるBMMの全RNA抽出用
SPSSソフトウェアIBMバージョン26Protocol Step 15における実験データの統計解析用
STRINGデータベース該当なし該当なしhttps://string-db.org/
酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色キットAMIZONAAMK1001-S1Protocol Step 14における破骨細胞の同定と定量用のTRAP染色用
Thermo Vanquish UPLCシステムThermo Fisher ScientificTSLC-002Protocol Step 2におけるLWDHWのLC-MS/MS分析用
TNF-α抗体Suzhou RuiyingRLM3472Protocol Step 10における大腿部切片のIHC検出用
伝統的中国医学システム薬理学（TCMSP）データベース該当なし該当なしhttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProtデータベース該当なし該当なしhttps://www.uniprot.org/
UPLCカラムWatersACQUITY HSS T3Protocol Step 2におけるLWDHWのLC-MS/MS分析用
Vennyオンラインツール該当なし該当なしhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-アクチン抗体Abcamab8227Protocol Step 13におけるWestern blot検出用

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