自発的なグループ飼育適合性マウスの便サンプル採取:カスタムケージシステムを用いる

サマリー

このプロトコルは、グループハウスマウスから自主的で福祉に配慮した同時進行の個別便サンプル採取のためのカスタムケージシステムを説明しています。

要約

糞便中のコルチコステロン代謝物の信頼できる測定には、個々の動物に割り当てられ、定められた時間内に採取できる糞便サンプルが必要です。これはグループ飼育マウスでは困難であり、プールされた自宅ケージのサンプルでは個別の割り当てができず、一時的な分離が動物福祉や研究結果に支障をきたす可能性があります。このプロトコルの目的は、グループハウスに飼われたマウスから自発的かつ同時、個別に糞便サンプルを採取できる、シンプルで安価なケージシステムを提示することです。このシステムは、ワイヤートップのポリカーボネート製ホームケージが3つの個別の収集ボックスに接続された構造です。慣れと訓練の後、ネズミは自発的に箱に入り、小さなご褒美を得ます。その後、ドアは追いかけたり、取り扱いしたり、強制移動したりせずに閉めることができます。糞便ペレットは各箱から別々に採取され、サンプルを個別の動物に割り当てつつ、サンプリング期間外の社会住宅を維持します。このプロトコルは非侵襲的な縦断サンプリングをサポートし、糞便コルチコステロン代謝物やその他の便バイオマーカーの測定に適しています。設計は標準的なケージ素材とアクリルガラスから簡単に組み立てられ、分解して清掃でき、複数のケージを並行してサンプリングできます。取り扱いに伴う乱を減らし、サンプリングウィンドウの標準化を改善することで、この方法は群居マウスにおける内分泌モニタリングの実用的な洗練を提供します。

概要

血漿コルチコステロン濃度を評価する際の大きな課題は、サンプリング自体が急性のコルチコステロン増加を引き起こし、測定を混乱させ、^{研究結果の}解釈に影響を与える可能性があることです。糞便コルチコステロン代謝物(FCMs)の測定は非侵襲的な代替手段を提供します。なぜなら、FCM濃度は菌種、株、性別、腸^{内通過時間}に応じて、採集数時間前の循環中のグルココルチコイドレベルを反映^{しているからです}。しかし、群居マウスでの信頼できるFCM解析は依然として困難です。自宅ケージから採取されたプールされた糞便サンプルは個体ごとに割り当てることができず、個体間でグルココルチコイド分泌の違いや正確なサンプリングウィンドウの不確実性により大きな変動を示すことがあります。動物を長期間分離することは研究目的の妨げになる可能性があり、個別のサンプル採取のための短期間の分離は労働集約的で、スループットを制限し、ストレスを引き起こす可能性があります^。

最小限の扱いでグループ内飼育マウスから個別の糞便サンプル採取を可能にするため、特注の糞便採取ケージが開発されました(図1A-E)。この設計は、以前に記載されたトゲマウス用の糞便収集ケージを^応用し、 実験用マウス用に改良されたものです。このシステムは、標準的なポリカーボネートタイプIIIケージが3つの個別の収集ボックスに接続されており、動物は自発的にアクセスし、スライドドアで閉めることができます。この仕組みにより、採取期間中に直接取り扱うことなく個々のマウスから糞便サンプルを採取でき、複数の動物を同時に採取することが可能です。したがって、このケージはグループハウスマウスにおける非侵襲的で個別に帰属可能なFCMサンプリングに実用的なアプローチを提供します。

以下のプロトコルは、個別のマウスから糞便サンプルを収集・識別しつつ、集団居住環境を維持し、非接触の糞便採取用のカスタムケージを用いるシステムを示しています。

プロトコル

ウィーン医科大学の責任動物倫理委員会は研究実施前に相談を受け、正式な動物実験許可は不要であると助言されました。したがって、承認番号やプロトコル番号は存在しません。この研究は確立された育種および飼育慣行のみを対象とし、非侵襲的な糞便サンプル採取を含みました。侵襲的な処置は行われていません。指令2010/63/EUに従い、動物への予想負担は、良好な獣医の慣行に従い、針の導入と同等かそれ以上の痛み、苦しみ、苦痛、または持続的な害の閾値を下回るものと評価されました。すべての動物は施設の動物福祉基準に従って飼育され、ケアされていました。

1. 檻の建設(材料リスト参照)

1. 図2A-Cに示されたテンプレートに従って、5mmのプレキシガラス/アクリルガラスから部品1〜4を切断します。
   注:正確な寸法のテンプレートはDIN A3形式で印刷可能です(補足図1 および 補足図2)。
2. 図2Dに示されたように、ポリカーボネートタイプII(PTII)ケージの底を切り取る。この部分は後に糞便収集箱の上部カバーとして使われます。
3. 図2Dに示された通り、PTIIケージの元の底に穴とスロットを開けます。
   注:正確な寸法は 補足図3に示されています。
4. 図2Eに示されているように、PTIIIケージの前面と短辺に穴を開けます。
   注:正確な寸法は 補足図4に記載されています。
5. パート2をテンプレートとして使い、PTIIIケージの短い側と長い側に対応する穴をマークしてください。
6. マークされた穴を開け、PTIIIケージ、PTIIケージ、パーツ2を図 2Fに示すねじで取り付けます。
7. パート1をPTIIケージの底に挿入します。パート4aと4bをパーツ1を固定するように位置し、サンプリングケージを別々の収集箱に分けてください。ホットグルーガンで固定します。
8. パート4aと4bの下部突起をパート1のスロットに滑り込ませます。これらの突起が収集箱の脚を形成しています。
9. パーツ4aと4bの上部突起を、PTIIケージの元底である上部カバーを通して滑り込ませて固定します。
10. 突起の穴に木製の箸や棒を通し、上部に1本、下に2本の棒を使って構造を安定させ固定します。
    注意:木製素材は使い捨ての場合のみ使用してください。洗浄ができないためです。もしそうでない場合は、代替組成のロッドを使うべきです。
11. ホットグルーガンを使って、残った隙間や小さな誤差を埋めましょう。3a、3b、3c(図2B)をケージと収集箱の間のスライドドアとして使用してください。
    注意:鋭利な刃や接着剤の残留物、突起した物が動物の手の届かない状態にしないようにしてください。この試作機で使用されたアクリルガラス/プレキシガラスの部品は、蒸気オートクレーブ滅菌には適していません。したがって、滅菌ケージ関連材料を必要とするSPF施設で使用される場合は、機関承認のオートクレーブ非消毒手順を用いるか、アクリル部品を同じ寸法を保ちながらオークレーブ可能な材料に置き換えるべきです。

2. 動物の準備と飼育

1. 研究に適した株のマウス数を確保。
   注:代表的なデータは、20匹の雌と10匹の雄からなる30匹の生後8週齢のC57BL/6Jマウスから取得されました。これらのマウスはFELASA基準に基づき特異的病原体が存在せず、ドイツ・ズルツフェルトのCharles River Laboratoriesから取得されました。
2. 従来の条件下で家庭動物を適応されたポリカーボネートタイプIIIケージに入れ、1ケージに最大3匹の成マウスを飼育します。
   注:本研究では、分離されたオスは標準的なポリカーボネートタイプIIケージに収容されました。
3. 動物室の温度は22±2°C、相対湿度55度±相対湿度10%に保ち、12時間の明暗サイクルで午前6時に照明を点灯します。
4. 標準的な維持食と水を 自由に提供しましょう。
5. 各ケージにはアスペンの木製寝具、紙製のトイレットペーパー、赤い透明プラスチックの家、ペーパータオルを巣材として入れます。
6. ネズミは主に自然な尾の模様で識別します。必要に応じて、尾の模様が似ている動物には一時的にペンマーキングを付けてください。

3. 動物の慣れと訓練

注:完成したケージは、ホームケージPTIIIとサンプリングケージ、3つの別々の収集箱PTIIで構成されています。家庭用ケージは、寝床、ケージの充実、外部留め具のないワイヤー蓋、餌や水の提供など、従来のケージのように使用できます。このシステムは洗浄のために分解可能で、サンプリング期間中のみ使用可能です。サンプリングがない数週間は、動物を標準的なPTIIIケージに収容することができます。

1. 最初の予定されたサンプリングセッションの少なくとも2週間前には、動物をケージシステムに入れてください。
2. 一晩だけ引き戸を外して、動物たちが自由に箱を探索できるようにして、動物たちを収集箱に慣れさせましょう。
3. 最初のサンプリングセッションの前に3回のトレーニングセッションを実施してください。同じ光条件で同じ時間帯で訓練を行い、理想的には暗い段階の開始直後に赤色光の下でサンプリングを行う予定です。
4. 各収集箱の入り口の向かいの壁に、ヘーゼルナッツクリーム、ピーナッツバター、モルトペーストなど、似たような食べやすい食べ物などの少量のご褒美を塗りましょう。
5. 初日のトレーニング日にはドアを開けたままにし、動物たちが自発的に報酬を見つけて食べられるようにしてください。
6. 2日目の訓練日には、動物が収集箱に入って報酬を舐め始めるのを待ちます。動物の後ろでスライドドアを慎重に閉め、10分後に放します。
7. 3日目の訓練日には同じ手順を繰り返し、動物が収集箱に留まる時間を徐々に延ばしていきましょう。
   注意:トレーニングは落ち着いて一貫性のあるものであるべきです。動物を箱の中に追いかけて入るのは避けてください。ストレスが増し、後のサンプリングでの自主的な参加が減る恐れがあります。

4. 糞便サンプルの採取

1. サンプル採取のタイミング
   1. 生物学的な問題と血漿コルチコステロンと糞便中のコルチコステロン代謝物の排出の間の予想される遅延に基づいてサンプリング時間を計画してください。マウスでは、糞便中のコルチコステロン代謝物は通常、サンプリングの約8〜10時間前に循環中のグルココルチコイドレベルを反映します。
      注意:正確なタイミングが重要な場合は、特定の株、性別、実験条件におけるFCM排出の時間経過を決定するためのパイロットスタディを実施してください。このパイロットはトレーニングセッションと組み合わせて行うことができます。
   2. 糞便量が多い期間中にサンプリングをスケジュールすること。サンプリングは通常、暗期および活性期の初期に最も効率的です。
   3. 研究期間中、すべてのサンプリングセッションを同じ時間帯に実施し、FCMレベルの昼夜リズムによる変動を減らしましょう。
      注:私たちの経験では、午前10時頃に起こった出来事は、動物室の明るさによりますが、サンプリングが午後6時から8時の間に予定されている場合によく反映されます。
2. サンプリング手順と実践的なアドバイス
   1. サンプリング前に動物を個別にマークしてください。耳印や尾のマークを個別に付けてください。
      注意:赤信号の下では、箱の中でトゥマークや色分けが見づらい場合があります。
   2. 光のフェーズ中に、報酬を各ボックスの裏壁に貼って準備します。
      注意:日中に箱を準備することで実験者の視界が良くなり、動物たちはサンプリング前に報酬の匂いを嗅げます。
   3. 予定のサンプリング時間に、採集箱を開けて動物が自発的に入ってくるのを待ちます。
   4. ネズミが収集箱に入ったら、慎重に後ろの引き戸を閉めます。
   5. すべての動物が箱に入れたら、各ネズミの識別と位置を用意したサンプリングシートに記録します。
   6. 1回のセッションで10個以上のケージが採取された場合は、動物の識別、ドアの取り扱い、記録を支援するためにもう一人の実験者を巻き込みましょう。
   7. 動物は、予想される糞便量や研究の設計によりますが、通常30分から2時間の予定されたサンプリング期間を採取ボックス内に保管してください。
      注意:個体の特定が確実でない場合、糞ペレットが尿、寝具、または他の動物の糞便で汚染されている場合、サンプリング時間が予定時間枠から大きく逸脱した場合、または糞便量がFCM分析に不十分な場合など、サンプルは除外してください。
      注:50mgの使用は標準プロトコルであり、この量はすべての検証および5^、7、8の論文で使用されています。通常、それは簡単に手に入れられます。
   8. サンプリング期間終了時にスライドドアを開けてネズミをケージに戻します。
   9. ネズミが去った直後に採取ボックスを閉めて、再侵入やサンプルの交差汚染を防ぎましょう。
   10. 各採取箱から長い鉗子を使って糞便のペレットを取り出し、個別にラベル付けされた採取管に移します。
   11. サンプルはFCMアッセイのさらなる準備まで-20°Cで保存します。
       注意:箱がしっかり閉じられていてネズミが再侵入できない場合、糞便ペレットの採取は次の光の段階まで延期できます。ただし、これは研究内で一貫して行うべきです。
   12. 次のケージ交換まで、動物はホームケージ部分(PTIII)に置いておきましょう。その後、分解して通常のケージウォッシャーで洗うことができます。

結果

便中コルチコステロン代謝物(FCM)は、恒久的に繁殖したマウスと間欠的に繁殖したマウスを比較した縦断的研究において、カスタムメイドの糞便サンプリングケージで採取したサンプルから成功裏に定量化されました。代表的なFCM分析には30頭の動物が含まれていました:恒久的に繁殖されたグループ、n = 5ケージに15頭;断続的に繁殖するグループ、n = 10頭の動物が5つのケージに入り、5頭のオスは単独飼育で、3回の繁殖時にはメスと同居されました。ケージ交換日および週末の隔週19の時間帯にサンプルが採取されました。ほとんどの動物が箱に入るまでの平均時間は7.5分(標準差=3.07)で、ほとんどの動物は平均27.6匹(標準差=1.44)で、合計30匹のマウスで構成されていました。すべてのマウスは平均11.69分後にボックスに入りました(標準差=3.29分)。すべてのマウスの平均閉じ込め時間は24.56分(標準差=15.51分)、最初のマウスが箱に入るまでの平均時間は43.14分(標準差=8.51分)でした。平均解放時間は14.86分(標準差=22.82秒)、手術全体の平均時間は68....

ディスカッション

このプロトコルは、グループハウスマウスから個別に割り当て可能な糞便サンプルを収集するためのシンプルなケージシステムを説明しています。この方法の主な利点は、個々のサンプルの帰属と、特にケージメイトとの視覚的・嗅覚的接触など、社会住宅の重要な側面の維持を組み合わせていることです。これは、動物福祉のためにグループ住宅がしばしば必要であり、^{実験デザインの一部}となることもあるため重要です。プール型ケージサンプリングとは異なり、このシステムはFCM値を個別の動物に割り当てることができ、サンプル採取前や採取中に長時間の個体飼育を避けています。

実験用マウスでの糞便採取に一般的に用いられる方法には、プール式ケージサンプリング、清潔なケージでの一時的な個別飼育、代謝ケージ、取り扱いや移動後の直接採取などがあります。プールされた自宅ケージサンプルは入手が容易で、非侵襲的、安価で、多くのケージの並行サンプリングと互換性がありますが、グループ飼育動物では個別の帰属は認められません。一時的な個...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ドリルビット 5 mm	Craftomat	22380487	直径5mm; 数量1
ドリルビット 60 mm	Bosch	32064647	直径60mm; 数量1
ドリルビット 7 mm	Craftomat	22380520	直径7mm; 数量1
ドリル盤	Makita	25730054	標準ハンドヘルドまたはベンチドリル; 数量1
ホットグルーガン	Einhell	29051207	ケージ組み立て用; 数量1
ホットグルースティック	Einhell	29049664	ホットグルーガンと互換性あり; 数量5-10
マクロロンケージ	Animalab	31200129	標準タイプIIケージ; 数量1
マクロロンケージ	Animalab	31200256	標準タイプIIIケージ; 数量1
プレキシガラス / アクリルガラス	Bauhaus	29122352	約0.25 m²合計; 厚さ5mm; 数量  2DIN A3シート
鋸またはフライス盤	Scheppach	32079641	小型バンドソー、ジグソー、またはCNCフライス盤; 数量1
ねじ付きねじ	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; 数量4
木製箸/棒	Ikea	903.429.71	丸い木製棒; 数量3