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研究記事

拡張型心筋症における老化およびミトコンドリア関連ハブ遺伝子の同定

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DOI:

10.3791/72286

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2026年8月25日

1Henan University of Chinese Medicine, 2The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、多次元トランスクリプトームデータと機械学習を統合し、拡張型心筋症における老化およびミトコンドリア関連遺伝子を特定することで、バイオマーカーの探索および分子サブタイピングを行います。

要約

拡張型心筋症（DCM）は、左室拡大と収縮不全を特徴とし、ミトコンドリア機能不全および免疫炎症活性化に関連しています。しかし、DCMにおける加齢に関連した分子シグネチャーやミトコンドリア調節経路については、まだ十分に解明されていません。本研究では、Gene Expression Omnibusデータベースから6つのバルクトランスクリプトームデータセットと1つの単一細胞RNAシーケンシングデータセットを解析しました。データの正規化、バッチ補正、および細胞型アノテーションの後、差異発現解析、加重遺伝子共発現ネットワーク解析、およびタンパク質相互作用ネットワーク構築を用いて、加齢およびミトコンドリアに関連する候補遺伝子を同定しました。さらに、Lasso回帰（least absolute shrinkage and selection operator regression）、ランダムフォレスト、およびサポートベクターマシン再帰的特徴消去法を用いて、コア遺伝子のスクリーニングを行いました。また、DCMにおける心臓免疫微小環境を特徴づけるため、免疫細胞浸潤、細胞間相互作用、および分子サブタイプ解析を実施しました。その結果、合計66個の加齢関連遺伝子と16個のミトコンドリア関連遺伝子がDCMに関連しており、主に低酸素誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1）シグナリング、酸化還元リン酸化、および一酸化窒素合成酵素関連パスウェイに濃縮していることが分かりました。機械学習および単一細胞RNAシーケンシング解析により、SERPINE1、TGFB2、CYBB、およびTLR2がコア遺伝子として同定されました。CYBBとTLR2は単球およびマクロファージで高発現しており、一方でSERPINE1とTGFB2は主にストロマ細胞で発現していました。免疫ランドスケープ解析では、DCMサンプルにおいて炎症性マクロファージの活性化の増加と細胞間相互作用の変化が認められました。コア遺伝子の発現に基づき、DCMサンプルは血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor）シグナリングおよび一次胆汁酸生合成にそれぞれ関連する2つの分子サブタイプに分類されました。本プロトコルは、DCMにおける候補バイオマーカーおよび分子サブタイプを同定するための統合的な枠組みを提供するものです。

概要

拡張型心筋症（DCM）は、左室拡大と収縮機能不全を特徴とする心筋疾患です。これは心不全の原因として世界で3番目に多く、心臓移植の最大の適応疾患となっています1。人口ベースの研究では、成人約250人に1人の割合で発症すると推定されており、男性でより高い有病率を示し、症例の相当数が単一遺伝子変異に起因しています2。これらの知見は、遺伝的感受性と環境因子の両方がDCMの発症および進展に関与していることを示唆しています。

DCMの病態生理には、炎症性活性化、酸化ストレス、心筋細胞のアポトーシス、および線維化促進シグナルの調節不全を含む、相互に関連したプロセスが関与しています。腫瘍壊死因子-α（tumor necrosis factor-α）のプロモーター変異を含む炎症性遺伝子多型は、ウイルス性DCMへの感受性と関連していることが報告されています3。また、酸化ストレスの増大は、ヒトDCMのサブタイプにおける心筋細胞死および左室機能不全と関連しています4。さらに、Wnt/β-cateninおよびカルシニューリン/活性化T細胞核因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells）シグナルの異常活性化は、心筋肥大と間質性線維化を促進し、それによって疾患の進行に寄与します5,6。心筋細胞はエネルギー需要が高いため、ミトコンドリア機能不全もDCMの重要な構成要素となります。ミトコンドリアのバイオジェネシス、カルシウム恒常性、ミトファジー、およびミトコンドリアDNAの完全性の崩壊は、酸化的にリン酸化を損ない、進行性の心機能不全に寄与する可能性があります7,8,9,10。

これらのメカニズムに関する知見があるものの、依然として重要な知識の空白が存在します。特に、DCMの発症および進行過程におけるミトコンドリアの構造的リモデリングとバイオエナジェティクス機能不全との間の時間的および因果関係は、十分に定義されていません11。これまで、いくつかの治療戦略が研究されてきました。幹細胞治療は、パラクリン効果、細胞保護効果、および免疫調節効果を通じて再生能力を示していますが、細胞源、投与経路、および移植後の生存率の最適化が依然として必要です12。アデノ随伴ウイルスを用いたデリバリーやCRISPRベースのゲノム編集を含む遺伝子治療アプローチも、潜在的な精密治療戦略となります。しかし、心臓への向性、ベクターの免疫原性、および長期的な安全性に関する制限は未解決のままです13。

Gene Expression Omnibus (GEO) などのリポジトリから得られる公開トランスクリプトームデータセットは、DCM のバイオマーカー探索に広く利用されています。これらのリソースは、多施設共同臨床コホートへのアクセスを可能にし、費用対効果が高く再現性のある調査を支援し、データセット間の統合を通じて統計的パワーを向上させることができます14。また、トランスクリプトームプロファイリングにより、ゲノムワイドな候補遺伝子のスクリーニング、分子サブタイピング、およびパスウェイレベルの解析が可能になります15。しかし、公開データセットには、技術的なバッチ効果、臨床的および病因的な不均一性、因果推論能力の限界、ならびに不完全な縦断的または予後情報といった固有の制限があります16。したがって、公開トランスクリプトームデータセットから得られた知見は、仮説の生成や候補バイオマーカーの優先順位付けに最も適しており、独立したコホートや実験モデルを用いた検証が必要となります。

DCMに関する多くのバイオインフォマティクス研究は、主に差次的発現解析に依存していますが、これは偽陽性の結果を生成する可能性があり、心臓組織内の遺伝子共発現ネットワークや細胞の不均一性を十分に特徴付けることはできません。これらの制限に対処するため、本研究では相補的な手法を組み合わせた統合的解析戦略を採用しました。バルクトランスクリプトーム解析により、症例対照比較に適した組織レベルの発現プロファイルを得ることができます。加重遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA）は、表現型形質に関連する遺伝子モジュールを特定し、個々の差次的発現遺伝子ではなく、機能的に関連する遺伝子セットの優先順位付けを可能にします。タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）ネットワーク解析は、ネットワークトポロジーに基づいて接続性の高い遺伝子を特定します。統合データセット全体から候補バイオマーカーを特定するために、最小絶対収縮選択演算子（LASSO）回帰、ランダムフォレスト、およびサポートベクターマシン-再帰的特徴消去という3つの機械学習アルゴリズムが用いられました¹⁷。その後、単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）を用いて、細胞型特異的な発現パターンおよび細胞間相互作用ネットワークを検討しました18。

拡張型心筋症（DCM）において、ミトコンドリア機能不全と加齢に伴う分子変化はそれぞれ個別に研究されてきましたが、疾患に関連する転写変化における両者の複合的な関連性は十分に解明されていません。本研究では、複数のバルクトランスクリプトームおよびscRNA-seqデータセットを統合し、DCMにおける加齢およびミトコンドリア関連のハブ遺伝子を同定し、心臓の免疫微小環境を特性化し、同定された遺伝子に基づいた分子サブタイプを検討しました。この統合的なアプローチを用いることで、候補バイオマーカーの優先順位を決定し、その後のメカニズム解明および検証研究の基礎を提供しました。

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プロトコル

すべての動物実験の手順は、河南省中医学大学第二附属病院の実験動物倫理委員会によって審査および承認されました（承認番号：HNSZYYYJS2023011150）。すべての手順は、「実験動物福祉の倫理審査指針（GB/T 35892-2018）」および、代替（Replacement）、削減（Reduction）、洗練（Refinement）の3R原則に従って実施されました。本研究で使用した試薬、データベース、ソフトウェア、および機器は、以下の通りです。 材料一覧表. 

1. データリソースおよび実験材料
自発的に拡張型心筋症（DCM）表現型を示す体重 25 ± 2 g のSPFグレードのCTNTR141Wトランスジェニック雄マウスをモデル群として使用した。対照群として、体重 25 ± 2 g の同週齢のSPFグレードのC57BL/6J雄マウスを使用した。各群のマウス数は12匹とした。すべての動物は、有効な実験動物生産ライセンスを有する施設から入手し、温度 22 ± 2 °C、相対湿度 40%–60%、12時間の明暗周期のSPFグレードのバリア環境下で飼育し、滅菌済みのフードと水に自由にアクセスできるようにした。1週間の馴化期間の後、すべてのマウスをさらに4週間同じ条件下で維持し、その後、心機能評価およびサンプル採取を行った。実験開始時のマウスの週齢は6～8週であった。マウスは深い麻酔をかけた後、頸椎脱臼により安楽死させた。

DCM患者の左室心筋組織に関する7つの公開トランスクリプトームデータセットをGene Expression Omnibus (GEO)19データベースから取得した。これらのデータセットには、6つのバルクトランスクリプトームデータセットと、1つの単一細胞RNAシーケンシング (scRNA-seq) データセットであるGSE145154が含まれていた。分析にはCD45陽性画分とCD45陰性画分の両方が含まれた。また、クラスタリングの前にCD45陽性細胞画分とCD45陰性細胞画分を統合した。Harmony統合における主要なバッチ変数としてサンプルIDを使用した。GSE145154からは、正常左室およびDCM左室のサンプル、具体的にはGSM4307515、GSM4307516、GSM4307520、およびGSM4307521を含めた。本研究で使用したデータセットは、GSE145154、GSE5406、GSE42955、GSE57338、GSE79962、GSE116250、およびGSE141910であった。DCM以外のすべてのサンプルを除外し、対照サンプル (Control group) とDCMサンプル (DCM group) のみを採用した。品質管理後に削除されたサンプルはなかった。組み込まれたGEOデータセットのサンプル情報は以下の通りである：GSE5406は102サンプル（対照16、DCM 86）、GSE42955は17サンプル（対照5、DCM 12）、GSE57338は231サンプル（対照136、DCM 95）、GSE79962は20サンプル（対照11、DCM 9）、GSE116250は51サンプル（対照14、DCM 37）、GSE141910は322サンプル（対照161、DCM 161）であった。

2. バルクトランスクリプトームデータの前処理
6つのバルクデータセットの未処理の発現マトリックスおよび臨床アノテーションファイルを、GEOqueryパッケージ20を用いてダウンロードした。Affymetrixマイクロアレイデータセットについては未処理のCELファイルを、RNA-seqデータセットについては未処理のカウントマトリックスを取得した。マイクロアレイデータの背景補正、クオンタイル正規化、および発現量の算出は、affyパッケージ21に実装されているRobust Multi-array Average（RMA）アルゴリズムを用いて行った。

RNA-seqのカウントデータは、edgeRパッケージ22のTMM（trimmed mean of M-values）法を用いて正規化し、log₂変換したCPM（counts per million）値に変換しました。プローブ識別子は、プラットフォーム固有のアノテーションファイルを使用して公式の遺伝子シンボルに変換しました。複数のプローブが同一の遺伝子にマッピングされた場合は、発現量の平均値を算出しました。

svaパッケージ23のComBatアルゴリズムを用いて、データセット間の技術的なバッチ効果を除去した。データセットのソースおよび検出プラットフォームをバッチ要因として指定した。バッチ効果除去の有効性を評価するため、バッチ補正の前後に主成分分析を行った。

3. 単一細胞トランスクリプトームデータの前処理および細胞アノテーション
GSE145154の遺伝子発現マトリックスをSeuratにインポートし、Seurat version 524を用いてSeuratオブジェクトを構築した。以下の閾値を用いて低品質の細胞を除外した：1細胞あたりの検出遺伝子数が200～6,000個、総固有分子識別子（UMI）数が500超、およびミトコンドリア遺伝子の割合が25%未満。これらの品質管理閾値から外れた細胞は、低品質または破裂した細胞として除外した。我々は、上述の品質管理閾のみを用いて低品質細胞を除外した。

NormalizeData関数を用い、スケール因子10,000でログ正規化を行った。vst法を用いたFindVariableFeatures関数により、変動性の高い上位3,000個の遺伝子を選択した。ScaleDataを用いてデータをスケーリングし、次いで線形次元削減のために主成分分析を実施した。

バッチ効果の補正は、RunHarmony関数を用いてHarmonyアルゴリズム25により行い、グループ化変数としてサンプル識別子を指定した。FindNeighborsおよびFindClusters関数を用いて、上位15個の主成分に基づき細胞のクラスタリングを行った。クラスタリングには、解像度0.15のLeidenアルゴリズムを使用した。非線形次元圧縮および可視化には、t-SNE（uniform manifold approximation and projection）を用いた。

細胞型の注釈付けは、カノニカルマーカー遺伝子およびSingleRパッケージ26を用いた自動注釈付けにより行われました。マーカー遺伝子は以下の通りです：B細胞：IGKC、MS4A1、CD79A；心筋細胞：TNNI3、MYL2、ACTC1；血管内皮細胞：VWF、PECAM1、EGFL7；マクロファージ：C1QC, C1QB、C1QA；単球：S100A8、S100A9、G0S2；ナチュラルキラー細胞：NKG7、GNLY、CCL5；平滑筋細胞：MYL9、TAGLN、ACTA2；ストローマ細胞：FBLN1、LUM、DCN；およびT細胞：CD3E、CD3G、CD3D。

4. 発現変動解析および遺伝子セット濃縮スコアリング
limmaパッケージを用いて線形モデルを構築した。27 DCM群と健康対照群の間で遺伝子発現を比較するため。P値が < 0.05であり、かつ1.5倍を超える絶対的なフォールド変化（これは絶対的なlogに相当する）₂ フォールドチェンジが0.58より大きいものを、有意に差次的に発現していると定義した。

各サンプルにおける老化関連およびミトコンドリア関連の遺伝子セットの濃縮スコアを算出するため、シングルサンプル遺伝子セット濃縮解析（ssGSEA）を実施した28。DCM群と健康対照群の間の濃縮スコアの差はウィルコクソン順位和検定を用いて評価し、P値 < 0.05 を統計的に有意とみなした。

単一細胞レベルにおいて、加齢関連およびミトコンドリアのモジュールスコアをSeuratのAddModuleScore関数を用いて算出した。群間のモジュールスコアの差は、Wilcoxon順位和検定を用いて評価した。

加齢関連遺伝子シグネチャーをCellAgeデータベース（https://genomics.senescence.info/cells/）から取得し、ミトコンドリア関連遺伝子セットをGeneCards（https://www.genecards.org/）から取得した。スコアリングに使用した完全な遺伝子リストは、Supplementary File 1に記載している。

5. 重み付き遺伝子共発現ネットワークの構築
バルクトランスクリプトームデータにおいて発現分散が最も高い上位5,000個のタンパク質コード遺伝子を、ネットワーク構築のために保持した。複数のソフトしきい値べき（soft-thresholding powers）におけるスケールフリー・トポロジー適合指数を算出するため、pickSoftThreshold関数を適用した。最適なしきい値は、R値が2 0.9を超える値。したがって、ソフトしきい値処理のべき乗は β 後続のネットワーク解析には、= 5 が採用された。

最小モジュールサイズを30として、blockwiseModules関数を用いて符号付き重み付き共発現ネットワークを構築した。各モジュールの固有遺伝子（eigengene）と、老化関連またはミトコンドリア濃縮スコアとの間でピアソン相関係数を算出した。絶対相関係数が0.4を超え、P < 0.001であるモジュールを、有意に関連するモジュールとみなした。

有意に関連するモジュール内の遺伝子を、発現変動遺伝子と交差させ、DCM関連の老化候補遺伝子およびDCM関連のミトコンドリア候補遺伝子を同定しました。

6. 機能濃縮分析
clusterProfilerパッケージ29を用いて、候補遺伝子に対してGene Ontology (GO)およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイ分析を含む機能濃縮分析を行った。GO濃縮分析では、生物学的プロセス、細胞成分、分子機能の3つの標準カテゴリーを対象とした。

すべての解析は、ヒト種のアノテーション、P値補正のための偽発見率（FDR）、および0.05のq値しきい値を用いて行われた。遺伝子セットは10〜500遺伝子のサイズ範囲に制限され、FDRが < 0.05を統計的に有意であると定義した。最後に、GOエンリッチメントの結果を可視化した。 〜経由で グループ棒グラフを用い、一方でKEGGエンリッチメントの結果はバブルプロットを用いて表示した。

7. PPIネットワークの構築とハブ遺伝子のスクリーニング
候補遺伝子をSTRINGデータベース（バージョン11.5）30に入力し、生物種をHomo sapiensに、相互作用の信頼度閾値を複合スコア0.7超に設定した。切り離されたノードは非表示にし、相互作用データをタブ区切り値形式でエクスポートした。

相互作用データは可視化のためにCytoscape version 3.9.1にインポートされた31。ノードのトポロジカルスコアは、CytoHubbaプラグイン32を用い、Degree、最大近傍成分（maximum neighborhood component）、および最大クリーク中心性（maximal clique centrality）の3つのアルゴリズムを使用して算出された。

ネットワーク内のコア機能モジュールは、MCODEプラグイン33を用い、次数カットオフ 2、k-core 2、ノードスコアカットオフ 0.2、最大深度 100というデフォルトパラメータで特定した。3つのトポロジーアルゴリズムすべてで上位10位以内にランクされた遺伝子と、MCODEコアサブネットワーク内の遺伝子を共通抽出することで、最終的なタンパク質相互作用ハブ遺伝子を特定した。

8. 機械学習に基づくコア遺伝子の選別と診断モデルの構築
再現性と表現のバランスを確保するため、統合されたバルク転写液データセットを、固定ランダムシード（seed = 123456）を用いて、トレーニングセットと検証セットに7:3の比率でランダムに分割した。この分割は、両セット間でクラス比率を一定に保つため、疾患グループ（DCM vs. コントロール）による層化抽出を行った。分割に先立ち、異なるデータセットソースに由来するバッチ効果をsvaパッケージを用いて補正し、統合されたサンプルを単一のコホートとしてランダム割り当てに用いた。

候補遺伝子をスクリーニングするために、3つの機械学習アルゴリズムを適用した。まず、LASSOロジスティック回帰を実施した。 〜経由で glmnetパッケージのcv.glmnet関数345分割交差検証による二値分類モデルを構築し、評価指標としてAUCを採用した。lambda.minにおいて係数が非ゼロであった遺伝子を候補遺伝子として抽出した。

次に、randomForestパッケージ35を用いて、500本の決定木を持つランダムフォレスト分類モデルを構築した。各分割時にサンプリングされる変数の数は、全特徴量の数の平方根に設定した。ジニ係数に基づいて遺伝子の重要度を定量化し、重要度スコアの高い上位10遺伝子を保持した。

第三に、caretパッケージ36のrfe関数を用いてSVM-RFE解析を実施した。特徴量数は1〜10の範囲で設定し、モデルのトレーニングには5分割交差検証を採用した。最終的に、交差検証における精度が最適であった遺伝子サブセットを選択した。

3つすべてのアルゴリズムによって特定された遺伝子を、DCMにおける最終的なコア加齢およびミトコンドリア関連遺伝子として定義しました。その後、決定木、勾配ブースティングマシン、ブースト一般化線形モデル、k近傍法、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、部分的最小二乗法、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および極端な勾配ブースティングの10種類の分類アルゴリズムを用いて、診断モデルを構築しました。

pROCパッケージ37を用いて、受信者動作特性（ROC）曲線を作成した。トレーニングセットおよび検証セットにおける診断性能を評価するため、曲線下面積（AUC）、正診率、感度、および特異度を算出した。

各コア遺伝子がモデルの予測に与える寄与度を算出するため、SHapley Additive exPlanations（SHAP）解析を実施した38。サマリープロットおよびサンプルごとのウォーターフォールプロットを作成した。検証セットにおいて曲線下面積（AUC）が0.8を超える最終的な診断モデルを、診断性能が良好であると定義した。

9. 細胞間コミュニケーションの推論
心臓微小環境における細胞間コミュニケーションネットワークをCellChatパッケージ39を用いて推論した。CellChatDB.humanデータベースを使用してCellChatオブジェクトを構築した。identifyOverExpressedGenesを用いて発現変動リガンドおよび受容体を同定し、identifyOverExpressedInteractionsを用いて有意な相互作用ペアをフィルタリングした。

細胞型間の通信確率はcomputeCommunProbを用いて算出した。全細胞型レベルの通信ネットワークはaggregateNetを用いて集約した。各細胞型のペア間の相互作用数および通信強度は、ヒートマップと棒グラフを用いて定量化および可視化した。

10. 免疫細胞浸潤の定量化
single-sample gene set enrichment analysis28および免疫細胞シグネチャー遺伝子セット40を用いて、各バルクサンプルの28種類の免疫細胞タイプの濃縮スコアを算出した。DCM群と健康対照群の間で免疫細胞濃縮スコアを比較するために、Wilcoxon順位和検定を用いた。P < 0.05を統計的に有意とみなした。

コア遺伝子の発現レベルと免疫細胞の濃縮スコアとの関連性を評価するために、ピアソン相関分析を実施した。P < 0.05 のすべての相関を統計的に有意であると見なした。

11. 分子サブタイプ分類のためのコンセンサスクラスタリング
コア遺伝子の発現プロファイルを用いて、DCMサンプルの教師なしコンセンサスクラスター解析を行った。 経由で ConsensusClusterPlusパッケージ41クラスタリングパラメータは、最大クラスター数を6、リサンプリング回数を1,000回、リサンプリング比率を0.8に設定した。クラスタリングにはユークリッド距離を用いたPAM法（Partitioning Around Medoids）を採用し、再現性を確保するために固定の乱数シードを使用した。

デルタエリアプロットおよびコンセンサスクラスター安定性スコアに基づき、最適なサブタイプ数を決定した結果、最終的に K = 2 と特定された。さらに、主成分分析を行い、2つの分子サブタイプが明確に分離していることを検証した。

サンプル特異的なKEGGパスウェイの濃縮スコアを算出するために、遺伝子セット変動解析（Gene set variation analysis）42を適用した。サブタイプ間でのパスウェイ活性化の差を検出するためにlimmaパッケージ27を使用し、P値が0.05未満の場合を統計的に有意と定義した。

12. 超音波心エコーによる心機能評価
マウスを麻酔した。 〜経由で 1%ペントバルビタールナトリウム（30 mg/kg）を腹腔内投与し、恒温手術台の上で仰臥位に固定した。胸部の除毛後、前胸部に超音波用カップリングジェルを均一に塗布した。

小動物用超音波診断装置を用い、左室乳頭筋レベルにて2次元ガイド下Mモード心エコー検査を実施した。左室拡張末期径、収縮末期径、駆出率、および短軸的短縮率を測定するため、安定した心周期を3回連続でキャプチャした。すべての心エコー評価は、専門の超音波検査士によってブラインドで実施された。

各群から3匹のマウスをランダムに選択して心エコー検査を行い、その後、心筋組織の採取およびELISA測定のためにこれら計6匹を屠殺した。残りの実験動物については、別途並行してラボアッセイを実施したが、そのデータは本研究には含めていない。

13. 心筋組織の採取、タンパク質抽出、および酵素結合免疫吸着法（ELISA）
心エコー検査による評価の後、マウスを深い麻酔下で安楽死させた。続いて、心臓組織を迅速に採取した。 経由で 正中胸骨切開を行い、左心室心筋を氷上で摘出した。単離した組織は、心腔内に残存する血液を除去するため、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で十分に洗浄した。滅菌フィルターペーパーで余分な液体を吸い取った後、サンプルを直ちに液体窒素で急冷凍結し、−80 °C その後のタンパク質抽出に用いる。その際、凍結融解を繰り返すことは厳禁とする。

凍結した心筋組織を重量測定し、氷上で約1 mm3の断片に細切した。組織を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む氷冷RIPA溶解バッファー中で、組織10 mgあたり100 µLの標準比率で溶解させた。サンプルを氷上で機械的に完全にホモジナイズし、完全な細胞溶解を行うため30分間インキュベートした。

溶解物を4 °Cで12,000 × gにて15分間遠心分離した。得られた上清を酵素フリーのチューブに回収し、製造元のプロトコルに従って bicinchoninic acid タンパク質定量キットを用いて全タンパク質濃度を定量した。すべてのサンプルを溶解バッファーを用いて同一のタンパク質濃度に標準化した。

心筋溶解液中における4つのハブ遺伝子のタンパク質発現レベルを、対応する酵素結合免疫吸着法（ELISA）キットを用いて測定した。段階希釈した標準試料および正規化した組織溶解液を、あらかじめコーティングされたマイクロプレートに、1ウェルあたり100 µLずつ、デュプリケート（2連）で添加した。プレートを室温で2時間インキュベートし、キット付属の洗浄バッファーで十分に洗浄した。

各ウェルに酵素標識抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした後、十分に洗浄した。次に基質発色溶液を加え、プレートを暗所、室温で20分間インキュベートした。停止液を用いて呈色反応を停止させ、全波長マイクロプレートリーダーを用いて450 nm（参照波長：570 nm）で吸光度を測定した。

14. 統計解析
すべての統計解析およびデータの可視化は、R version 4.2.3を用いて行った。各標的遺伝子（TGFB2、SERPINE1、CYBB、TLR2）のELISA濃度測定について、まずShapiro-Wilk検定を適用し、Control群とDCM群のデータの正規性を個別に評価した。続いて、F検定を用いて2群間の分散の均質性を評価した。群間比較の方法は、分散の均質性検定の結果に基づいて決定した。分散が均質である場合（P ≥ 0.05）は、群間の平均値を比較するために対応のないStudent's t-testを採用し、分散が不均一である場合（P < 0.05）は、補正されたWelch's t-testを解析に利用した。すべての検定は両側検定とし、統計的有意性の閾値はP < 0.05に設定した。データは、個々のデータ点をジッター表示して重ね合わせたボックスプロットとして可視化した。すべての検定のP値および実施したt-testの種類は、各プロットに詳細に記載した。

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結果

データのプリプロセッシングおよび差分的発現解析
6つのバルクトランスクリプトームデータセットすべてに対し、ダウンストリーム解析の前に標準的なプリプロセッシングおよびバッチ効果の補正を行った。マイクロアレイデータはrobust multi-array averageアルゴリズムを用いて正規化し、RNA-seqカウントデータはtrimmed mean of M-values法を用いて正規化した。データセットのソースおよび検出プラットフォームに関連する技術的なバッチ効果を除去するために、ComBatアルゴリズムを適用した。主成分分析の結果、補正前はサンプルがデータセットソースごとにクラスター化していたが、補正後はバッチによる明確な分離は見られず、より均一に分布していることが示された。

拡張型心筋症（DCM）群と健康対照（HC）群との間の差分的発現解析をlimmaパッケージを用いて行った。最も有意に差分的に発現した上位20遺伝子のヒートマップでは、2群間で発現プロファイルが分離していることが示された（図1A...

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ディスカッション

統合的な多層ワークフローにより、バルクトランスクリプトームのメタ解析、重み付き遺伝子共発現ネットワーク構築、アンサンブル機械学習、シングルセル・トランスクリプトームによる検証、およびin vivo動物モデルによる検証を組み合わせた。老化およびミトコンドリアに関連する4つのハブ遺伝子CYBB、SERPINE1、TGFB2、TLR2が、拡張型心筋症（DCM）の診断バイオマーカー候補として特定された。マイクロアレイおよびRNAシーケンシングプラットフォームを含む、Gene Expression Omnibusリポジトリからの6つの独立した左心室トランスクリプトームデータセットを統合することで、単一データセットによるバイアスを軽減し、解析の統計的根拠を強化した43,44,45。事前定義された老化関連およびミトコンドリア遺伝子セットを組み合わせた重み付き遺伝子共発現ネットワーク解析により、単なる差分的発現解析への依存ではなく、形質に関連する機能...

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開示事項

著者は競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

Gene Expression Omnibusデータベースを通じて提供された公開データに感謝いたします。また、原稿に対する建設的なコメントをいただいた査読者および編集者に感謝いたします。本研究は、省級部門レベル科学研究プロジェクト（助成金番号：2021JDZX2026）「Yiqi Huoxue処方が動脈硬化性血管リモデリングを軽減するメカニズム」の支援を受けたものです。 経由で KLF2-Nrf2を介した炎症調節

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Aquasonic Clear 超音波ジェルParker Laboratories, Inc.Mar-34小動物の心エコー図検査に使用。
BCA タンパク質定量アッセイキットThermo Fisher Scientific23227検出波長 562 nm、測定範囲 20–2,000 µg/mL。マウス心臓溶解液の総タンパク質定量に使用。
CellAge データベースHuman Ageing Genomic Resourceshttps://genomics.senescence.info/cells/老化関連遺伝子シグネチャーの情報源。
CytoHubba（Cytoscape プラグイン）Cytoscape App StoreVersion 0.1タンパク質相互作用ネットワークにおけるノードトポロジースコアリングに使用。
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.9.1タンパク質相互作用ネットワークの可視化に使用。
全波長マイクロプレートリーダーThermo Fisher ScientificMultiskan FCELISA アッセイにおける吸光度の測定に使用。
Gene Expression OmnibusNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/トランスクリプトームデータセット取得のための公共リポジトリ。
GeneCardsWeizmann Institute of Sciencehttps://www.genecards.org/ミトコンドリア関連遺伝子セットの情報源。
Halt プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル、100×、EDTAフリーThermo Fisher Scientific784414 °C で保存。使用直前に RIPA バッファーに 10 µL/mL の割合で添加。
液体窒素地域の研究用ガス供給業者該当なし心筋組織の急速凍結に使用。
SPF 級 C57BL/6J 雄マウス（6–8 週齢、25 ± 2 g）Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.該当なし動物生産ライセンス番号 SCXK (Jing) 2021-0006。正常対照として使用。
SPF 級 CTNTR141W トランスジェニック DCM 雄マウス（6–8 週齢、25 ± 2 g）Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences該当なし動物生産ライセンス番号 SCXK (Jing) 2021-0065。自然発症 DCM モデルとして使用。
MCODE（Cytoscape プラグイン）Cytoscape App StoreVersion 2.0.2タンパク質相互作用ネットワークにおけるコア機能サブネットワークの同定に使用。
マウス CYBB ELISA キットBiogradetechA-QEK09250-96wells本研究において、マウス心筋組織溶解液中の CYBB を測定するために使用。
マウス PAI-1 ELISA キットEK-BIOML30970本研究において、マウス心筋組織溶解液中の PAI-1（SERPINE1 由来タンパク質）を測定するために使用。
マウス TGF-β2 ELISA キットElaBoXSEKM-0036本研究において、マウス心筋組織溶解液中の TGF-β2 を測定するために使用。
マウス TLR-2 ELISA キットSolarbioSEKM-0163本研究において、マウス心筋組織溶解液中の TLR-2 を測定するために使用。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4、カルシウム・マグネシウムフリーBiological Industries02-024-1ACS滅菌済み 1× 溶液。4 °C で保存。組織の洗浄および希釈に使用。
R パッケージ: caretCRANVersion 6.0-94サポートベクターマシンを用いた再帰的特徴消去に使用。
R パッケージ: CellChatCellChat developersVersion 1.6.1シングルセル RNA シーケンシングデータからの細胞間コミュニケーション推論に使用。
R パッケージ: clusterProfilerBioconductorVersion 4.8.3機能濃縮解析に使用。
R パッケージ: ConsensusClusterPlusBioconductorVersion 1.64.0教師なしコンセンサスクラスター分析に使用。
R パッケージ: edgeRBioconductorVersion 3.42.4TMM（Trimmed Mean of M-values）法による RNA シーケンシングデータの正規化に使用。
R パッケージ: GEOqueryBioconductorVersion 2.68.0Gene Expression Omnibus からのデータダウンロードに使用。
R パッケージ: glmnetCRANVersion 4.1-8LASSO ロジスティック回帰に使用。
R パッケージ: limmaBioconductorVersion 3.56.2差分的発現解析および統計モデリングに使用。
R パッケージ: pROCCRANVersion 1.18.5ROC（受信者動作特性）曲線解析に使用。
R パッケージ: randomForestCRANVersion 4.7-1.2ランダムフォレスト機械学習に使用。
R パッケージ: SeuratCRANVersion 5.0.1シングルセル RNA シーケンシングデータ解析に使用。
R パッケージ: SingleRBioconductorVersion 2.2.0自動細胞型アノテーションに使用。
R パッケージ: svaBioconductorVersion 3.48.0ComBat によるバッチ効果補正に使用。
冷却遠心機Sigma-AldrichSIGMA 3-K心筋組織溶解液の遠心分離に使用。
RIPA 溶解・抽出バッファーThermo Fisher Scientific89900Ready-to-use 1× 溶液。4 °C で保存。使用前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加。
小動物超音波画像診断システムVINNO Technology Co., Ltd.VINN06LAB心機能の心エコー図評価に使用。
ペントバルビタールナトリウムSinopharm Chemical Reagent Co.20040428滅菌生理食塩水を用いて 1% 溶液（10 mg/mL）として調製。30 mg/kg で腹腔内投与し、麻酔に使用。
STRING データベースSTRING ConsortiumVersion 11.5タンパク質相互作用ネットワークの構築に使用。
TGrinder H24 組織ホモジナイザーTIANGENOSE-TH-01RIPA バッファー中で 6.0 m/s、30–60 秒間、2–3 サイクル行い、マウス心筋組織を均質化するために使用。
定温動物プラットフォーム／小動物用加温手術台Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.T-30350心エコー図検査中にマウスを 37 °C に維持するために使用。動作範囲：室温 ～ 50 °C。

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