クリティカルサイズ皮膚創傷における治療薬を検討するためのラット切除創モデル

サマリー

本プロトコルでは、湿潤チャンバーを組み込んだラット皮膚切除創モデルについて説明します。このシステムにより、外用液体製剤、細胞懸濁液、バイオマテリアル、およびその他の創傷治療薬の評価が可能になります。

要約

皮膚創傷は世界的なヘルスケアにおける大きな課題となっており、相当な罹患率と経済的負担をもたらしています。組織修復のメカニズムを調査し、新たな治療戦略を評価するためには、信頼性があり臨床的に関連性の高い動物モデルが不可欠です。しかし、従来のげっ歯類を用いた切除創モデルは、皮筋（panniculus carnosus）による急速な創傷収縮が起こるため、ヒトの創傷治癒とは大きく異なり、限界があります。後者の 主に肉芽組織の形成と再上皮化を通じて起こります。本研究では、創傷収縮を制限しつつ、繊細な治療介入を試験するための保護環境を提供するラット切除創モデルについて記述します。Sprague Dawleyラットの背部に10 mmの全層切除創を作成し、結節縫合で固定したニトリルブタジエンゴム（NBR）Oリングを用いて安定化させました。湿潤な創傷環境を維持するため、Eakin cohesive sealと透明粘着フィルムを適用して、細胞、バイオマテリアル、または薬化合物の局所投与に適したチャンバーを形成しました。動物によるドレッシング材の除去を防ぐため、フォームドレッシング、粘着テープ、管状包帯、およびダブルショルダー固定システムからなる追加の保護層を用いました。創傷治癒は、デジタルプランニメトリおよびヘマトキシリン・エオシン染色を用いた組織学的評価により、14日間にわたってモニタリングされました。この手順は1匹あたり約30分を要し、一貫した創傷治癒結果が得られました。NBR Oリングは、創傷収縮を制限するための副子として使用されました。治癒は主に肉芽組織の形成と再上皮化を通じて起こりました。ドレッシング材は、感染の兆候なく最大7日間維持されました。組織学的解析により、表皮の再生と炎症細胞の浸潤を特徴とする活発な組織修復が示されました。本モデルは、創傷治療薬および高度な再生治療の前臨床評価のためのプラットフォームを提供します。

概要

治りにくい創傷を含む皮膚創傷は、世界中で4,000万人以上の患者に影響を及ぼしており、ヘルスケアシステムに多大な負担をかけており、2024年までに年間コストは220億ドルに達するとされています。ヨーロッパだけでも、毎年400万人の患者が治りにくい創傷に苦しんでおり、急性期入院枠の最大半分を占めています¹。外科的手法や術中管理の向上、高度な創傷被覆材の普及にもかかわらず、一部の創傷は難治性であり、最終的に合併症が発症する場合もあります。したがって、広範な外用剤を試験するために、皮膚創傷の実験的 動物モデルを必要とする新しい治療アプローチの開発が不可欠です。

実験的な皮膚創傷動物モデルの中で、皮膚切除は創傷治癒モデルを作成するために最も適用可能な手法である²。このようなモデルは、出血、炎症反応、肉芽形成、再上皮化、血管新生、および組織リモデリングの調査に有用である³。切除創は、主に動物の背部において、定義された皮膚領域を外科的に除去することによって作成される。自然治癒を避けるため、創傷は臨界サイズである必要がある。この臨界サイズの切除創により、さまざまな化学物質、細胞、またはバイオマテリアルの局所適用と、それらが治癒過程にどのように関与するかを直接的に調査することが可能となる^4,5。

齧歯類とヒトの皮膚は、止血、炎症、増殖、および再構築を含む、創傷治癒の 細胞および分子レベルの段階 において類似しています。ラットとマウスは、入手可能性、小型であること、遺伝子操作が比較的容易であること、およびハンドリングが容易であることから、創傷モデルにおいて最も広く用いられている種です。ラットはマウスに比べて、体サイズが大きく皮膚が厚い（マウスよりも多くのケラチノサイト層で構成されている）という、いくつかの実用的な利点があります。マウスの創傷は通常7日以内に治癒しますが、ラットでは治癒過程を約12〜14日かけて評価することが可能です⁶。

皮膚の緩い齧歯類を使用する場合の大きな課題は、創傷収縮である³。齧歯類の皮膚にはpanniculus carnosus（皮下筋層）があり、これが損傷後に収縮して露出面積を減少させる。対照的に、ヒトの創傷は収縮能力が限られており、修復は肉芽形成と再上皮化に依存している⁷。動物モデルの限界を克服する一つのアプローチは、創傷領域周囲の皮膚を物理的に固定または副子固定することである⁸。チタン製創傷チャンバーは、創傷収縮を防ぐために開発され成功を収めたデバイスの一つであったが⁹、チャンバーの重量による動物への高いストレス、複雑な外科的配置、デバイス脱落の可能性、感染の可能性、および高コストなどの欠点があった。副子固定創傷モデルの概念は、2004年にGalianoらによって、創傷縁の周囲に硬いシリコンリングを縫合することで導入された¹⁰。この手法は創傷収縮を著しく減少させるが¹¹、主に軟組織損傷の可能性、高い副子脱落率、および不均一な創傷治癒といういくつかの欠点と限界がある 。副子（硬いシリコンリングなど）は、特に不適切に適用された場合に周囲の皮膚に過度な圧力をかけ、虚血、刺激、および壊死を引き起こす可能性がある。シリコン製副子は、動物の動きやグルーミングによって、しばしば損傷、破損、または脱落する^8,11。また、縫合が不均一であると創傷周囲に不均等な張力が生じ、治癒にばらつきが出ることが多い。本モデルでは、ニトリルブタジエンゴム（NBR）製Oリングを、リング周囲に8〜12本の単純結節ポリアミド縫合糸を均等に配置して皮膚創縁に縫い付ける。この手法により、前述のリスクを最小限に抑え、創傷収縮を十分に制限することが期待され、ヒトの創傷治癒過程と同様に、肉芽組織の形成と再上皮化を通じて創傷が治癒することが可能となる。この治癒メカニズムにより、動物モデルからの知見を臨床応用へと橋渡しすることが容易になると考えられる。

湿潤創傷治癒理論は、創傷ケア製品設計のコンセプトとして1962年にGeorge D. Winterによって提唱されました¹²。この理論に基づき、ガーゼ、透明フィルム、フォーム、ハイドロゲルなど、さまざまな創傷被覆材がここ数十年の間に開発されてきました¹³。一方で、漏出の防止と保護を目的として、成形可能なハイドロコロイド製ストマ装具バリアリングシールが1974年に設計・開発されました。これらは、特にストマケアへの応用において、創傷の縁に合わせて容易に形状を整え、成形することが可能です。本モデルでは、創傷の外側に凝集性のシールを適用し、滅菌済みの透明フィルムと併用することで、治療を受けている皮膚創傷患者の臨床状況を模した湿潤環境を構築し、創傷の上皮化を促進させるとともに、局所投与剤（細胞、バイオマテリアル、化合物など）の漏出を防ぎます。

創傷被覆材は、創傷部位を物理的な外傷や微生物感染から保護するために不可欠です。ラットにおける創傷被覆は、彼らの許容度が低いため、常に困難を極めてきました。ラットは麻酔から回復してすぐに、被覆材を噛んだり引き裂いたりして取り除いたり破壊したりすることが頻繁にあります。これにより、細胞や薬剤などの局所投与剤の保持が非常に困難になり、外部の病原体や汚染物質から創傷を保護することが不可能になります。これは、特に生物学的製剤の試験、細胞療法、高度治療用医薬品など、無菌環境を必要とする研究において、げっ歯類モデルで対処すべきもう一つの課題です。本モデルでは、フォームドレッシングと粘着テープを使用してモイストチャンバーを覆いました。その後、伸縮性チューブ状包帯、固定用包帯、およびマイクロポア手術用テープを用いて、ラットが包帯を取り除いたり損傷させたりするのを防ぐため、ダブルショルダークロス法による固定を行いました。

本報告のモデルは、異なるプロトコルからの複数の要素を組み合わせたものであり、数年かけて開発されました。その目的は、動物への負担が少なく、特に液状の感作性外用剤の試験を容易にする、湿潤チャンバーを用いたラットの切除創モデルを確立することでした。

プロトコル

以下に示すすべての動物実験の手順は、スウェーデンのリンシェーピング倫理委員会（Dnr 5163-2023）の承認を得て実施されました。使用した試薬および機器は材料表に記載されています。

1. 実験​精神を持つ動物

1. 生後8～14週のオスSprague Dawleyラットを使用する。
2. 実験前に、標準的な飼料を与え、12時間明期/暗期サイクルの中でラットを少なくとも1週間馴化させる。

2. 術前準備

1. 1.0–1.5 L/minの酸素に1.5%–2.5%のイソフルラン（導入時は4.5%）を混合して動物を麻酔します。動物を保温マットの上に腹臥位で安置し、体温を維持します。眼を保護するために眼用潤滑剤を塗布し、術後の疼痛緩和のため、生理食塩水で希釈したブプレノルフィン 0.05 mg/kg（体重あたり）を動物の背中に皮下投与します。
   注：動物とマットの間に、使い捨てのアンダーレイを薄く敷いて隔離することが重要です。
   注意：イソフルランは中枢神経抑制剤であり、呼吸器刺激物です。蒸気への曝露を防ぐため、有効な排気回収システムを備えた校正済み気化器を使用してください。
2. 電気バリカンを使用し、首の付け根から下方約10 cmまで背部を剃毛します。剃毛した部位をクロルヘキシジンと70%エタノールで2回十分に洗浄し、その後、洗浄した部位のみを露出させる開窓式手術用ドレープで動物を覆います。

3. 切除創の作製

1. ハサミやピンセットなどの適切な滅菌済み手術器具を使用する。
2. テンプレートを用い、外科用油性マジックで、頚部基部から尾側に約4 cmの位置に直径10 mmの円を描く。
3. マークした皮膚の中心をピンセットでつまみ、ハサミでマークした皮膚組織を切除する。創傷の深さは浅筋膜までとする。これは、皮膚の全層を剥離し、筋肉を覆う半透明の筋膜を確認することで判断できる。
4. 皮膚創の縁にNBR Oリングを当て、8〜12針の縫合で固定する。リングを固定する目的は、皮膚の収縮を防ぐことである。まず12時方向、次に6時方向、3時方向、そして9時方向の順に一次縫合を行う。8針で縫合する場合は、一次縫合の間の中心にそれぞれ縫合を行う（Figure 1A）。
5. NBR O-ringの外側に、凝集性シールをその接着性を利用して貼り付け、滅菌済みの透明粘着フィルムと共に湿潤チャンバーを構築する（Figure 1B）。この段階で、創傷はNBR O-ringで固定され、適用チャンバーの側壁は皮膚の縁と凝集性シールによって形成され、底面は創傷表面、天井面は透明フィルムによって形成される。
6. フィルムを1層重ねて創傷を覆い、その後、フィルムを通して治療溶液（細胞溶液または化合物溶液）を創傷表面に投与する。上述のサイズのチャンバーであれば、100 µLを容易に収容できる。
7. 治療薬の漏出を防ぐため、注入部位をさらに別のフィルム層で覆う（Figure 1C）。
8. フィルムを保護するため、ソフトシリコン包帯でフィルムを覆う（Figure 1D）。
9. 粘着テープを貼り（Figure 1E）、次に固定用包帯とマイクロポア外科用テープを用いて、ラットの周囲にダブルショルダー構成で弾性チューブ包帯を巻く（Figure 1F–H）。
10. ラットによってドレッシングが剥がされるのを防ぐため、ラットの爪を切り揃える。
11. 麻酔から覚醒させる前に、生理食塩水で希釈したカルプロフェン（5 mg/kg 体重）を動物に皮下投与する。

4. 術後処置

1. 動物が麻酔から覚めるまで、ブランケットで覆い、ヒートパッドの上に置いておく。動物同士の噛み合いやドレッシングの除去を防ぐため、個別のケージに入れるか、仕切りのある単一のケージに入れる。
2. 術後疼痛を管理するため、翌朝にカルプロフェン（生理食塩水で希釈した5 mg/kg 体重）を皮下投与する。ラットに術後疼痛や体重減少がないか毎日観察し、必要に応じて鎮痛剤を追加投与する。

5. 創傷の計測およびドレッシング材の交換

1. 創傷手術後の最初の1週間は、毎日各動物を観察してください 。動物の動きに支障がある場合や不快感を示している場合は、ドレッシングを確認し、適切に処置してください。
2. 7日目に、ステップ 2.1に記載されている方法で動物を麻酔下に置き、ドレッシングを交換します。
3. 皮膚からドレッシングカバーを静かに取り除きます。定規をスケールとして添え、創傷部位の写真を撮影します。これらの画像は、Fiji/ImageJソフトウェアを用いて解析し、創傷表面積を評価しました。
4. 研究者の必要に応じて、測定またはその他の処置を行います。
5. ステップ 3.8–3.11に従って清潔なドレッシングを適用し、ステップ 4.1に記載されている方法で動物を回復させます。

6. 創傷部位の採取および安楽死

1. 14日目に、項目2.1に記載の方法で麻酔を施すか、あるいは個別の実験計画に従って麻酔を行う。ドレッシング材を取り除き、創傷部位の写真を撮影する。
2. ドレッシング材を取り除き、創傷部位の写真を撮影する。
3. 創傷皮膚組織を採取する。メスを用いて、一部の健常組織を含めて創傷周囲の皮膚を切り出す。
4. 切り出した組織を2 mLチューブに入れ、後日の分子解析のために液体窒素で急凍結させるか、組織学的解析のために室温で4%緩衝ホルムアルデヒドに保存する。あるいは、切り出した組織を2つに分割して両方の解析を行う。
5. 創傷組織を採取した後、CO₂吸入または倫理承認に基づいた代替方法により動物を安楽死させる。
   注意：CO₂は、意識を失う前に痛み、苦痛、および粘膜の急速な酸性化を引き起こす。流量計を使用して、チャンバー内の空気を適切に置換すること。

7. 組織化学的染色：創傷の固定、包埋および切片作成

1. 創傷組織の生検試料を4%ホルムアルデヒド溶液中で室温で3時間固定し、その後4 °Cで一晩保存する。
   注意：ホルムアルデヒドは毒性があり、強力な感作物質であり、既知のヒト発がん性物質である。個人用保護具を着用し、化学薬品用フード内で溶液を扱うこと。
2. 生検試料をPBSで2回、各30分間洗浄する。
3. PBSをエタノール(70%)に交換し、4 °Cで保存する。
4. 抗原の消失を防ぐため、処理前に生検試料を最大24–48時間保存するか、単純な組織学的特性評価の場合は1–2週間保存する。
5. 生検試料を流水で十分に洗浄し、残留ホルムアルデヒドを除去する。
6. 以下の順序のエタノール浴で組織を脱水する：70%エタノールで20分、95%エタノールを2回各20分、100%エタノールを2回各20分。
7. 生検試料を65 °Cのパラフィン浴に保持する。
8. 溶融パラフィンを指定の型に注ぎ、生検試料を中央に配置して、冷却し凝固させる。切片作成時にすべての皮膚層を可視化できるように、生検試料は型の表面に対して垂直に配置する必要がある。
9. パラフィン包埋した組織ブロックをミクロトームで5 μmの厚さに切片し、脱イオン水を含む39 °Cの水浴に浮かせる。
10. 切片をスライドグラスに移し、組織がスライド表面に接着するように乾燥させる。スライドは後で使用するために4 °Cで保存するか、直ちに組織化学染色に供することができる。

8. ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色

1. ホットプレートを用いて60 °Cで30分間脱パラフィンを行い、次にキシレン（または代替品）を3回、各5分間交換しながら処理し、最後にPBSを1回、2分間処理する。
   注意：キシレンは毒性があり、非常に引火しやすい。標準的な個人用保護具を着用し、ドラフトチャンバー内で溶液を扱うこと。
2. 100%エタノール、96%エタノール、次いでdH₂Oの順で、それぞれ5分間ずつ親水化処理を行う。
3. ヘマトキシリン染色を5分間行い、その後、流水で5分間洗浄する。
4. 0.3%酸性アルコール（70%エタノール中の0.3%塩酸）に数回浸して分化させ、その後、流水で5分間洗浄する。
5. エオシンY（0.2%）で30秒間染色し、その後、流水で5分間洗浄する。
6. 96%エタノールで1分間、100%エタノールで1分間脱水する。
7. 封入剤を数滴滴下し、カバーグラスを被せる。
8. 光学顕微鏡でスライドを観察し、デジタル写真を撮影する。

結果

ラット切除創モデルの手術は、効率的に行えば1匹あたり約30分で完了します。モデルの作製、Oリングの固定、およびドレッシングの各手順を図1に示します。

図2は、7日目および14日目における創傷治癒の経過を示しています。創傷半径をmmで測定し、表面積を公式（面積 = πr²）を用いて算出しました。ここで、0日目のr = 5 mmとします。創傷閉鎖の進行度は、14日目における非被覆領域の誘導創傷領域に対する割合（%）として的に表しました。Fiji/ImageJソフトウェアを用いて創傷領域のデジタル画像を解析し、画像内に含まれる定規を使用してスケールを10 mmに校正しました（図2D）。創傷領域の輪郭を抽出して測定した後、その面積をmm²で表示しました。14日目の残存創傷面積（29.4% ± 10.1%; n = 7）を図3に示します。

14日目の皮膚創傷のHE染色の結果を図4に示す。切片からは、生検部位が周辺部から中心部に向かって皮膚創傷の自然治癒過程を辿っていることが示された。創傷治癒は不完全なままであり、中心部では薄い表皮層を伴う通常の古典的な多層構造が認められなかった。真皮には炎症細胞の浸潤が豊富に見られたが、これは生理的な治癒過程において重要である。全体として、本モデルは動物によく耐容され、皮膚の収縮が抑制されつつも、不完全ながら生理的な治癒が認められた。

図1: 切除創の作製およびドレッシングの手順。 (A) ラットの背面に切除創を作製し、創縁の周囲にOリングを縫合した状態。 (B) Oリングの周囲に成形可能なハイドロコロイドバリアリングを適用した状態。 (C) ハイドロコロイドバリアリングの上に透明粘着フィルムドレッシングを2層適用した状態。 (D) 透明粘着フィルムドレッシングの上にフォームドレッシングを配置した状態。 (E) ドレッシングを固定するために弾性粘着テープを適用した状態。 (F–H) ラットの周囲に管状固定包帯を適用し、続いて固定包帯とサージカルテープをダブルショルダー構成で配置してドレッシングを固定した状態。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図2創傷治癒の代表的な画像. (A) 7日目に得られた代表的な創傷画像。(B–D) 14日目に得られた代表的な創傷画像。Oリングが装着された状態の創傷を示している（B) および Oリングの取り外し後（C, D). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図314日目における創傷面積の定量化14日目の残存創傷面積の割合であり、創傷サイズの縮小を示している。データは平均値として提示されている。 ± 標準偏差（SD）（n = 7）。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 14日目における創傷治癒の組織学的評価. 10×、20×、および 40× 倍率での創傷組織の代表的なヘマトキシリン・エオジン（HE）染色切片。創傷中心部では再上皮化が不十分であったが、創傷縁では生理的な表皮治癒が認められた。真皮には、通常の創傷治癒反応と一致する豊富な炎症細胞が含まれていた。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

難治性皮膚創傷とは、想定される期間内に正常な治癒段階を辿らない創傷のことであり、血管不全、糖尿病、肥満などの多くの健康問題に起因するほか、外科的手術、外傷、アレルギー反応の結果として生じることがあります¹⁴。いくつかの管理方法が利用可能であるにもかかわらず、多くの患者において適切な治癒が得られません。細胞ベースの治療法、化学物質、植物抽出物、および新しく発見された化合物などの新しい治療手段の調査は、斬新な管理戦略を特定するために不可欠です。本モデルは、幅広い創傷治癒研究に応用可能です。薬剤、細胞、および生物学的治療をテストするための標準化されたプロトコルの確立は、前臨床の創傷治癒研究を促進させる可能性があります。ここに記載する切除創モデルおよびプロトコルは、研究におけるラット皮膚創傷モデルの主な限界である皮膚の収縮および創傷被覆の問題に対処しています。

チタン製スプリントは、マウスの切除創モデルにおいて創傷収縮を抑制するために一般的に用いられていますが、その適用には制限も伴います。スプリントの剛性は、創傷部および周辺組織の機械的環境を変化させ、それが細胞応答、炎症、およびマトリックスの再構築に影響を及ぼす可能性があります。その結果、治癒は未処置のげっ歯類の皮膚とは異なる条件下で進行します。収縮を制限することでヒトの創傷閉鎖との比較可能性は向上しますが、スプリントによる機械的な制約が治癒過程に影響を与えるアーティファクトを導入する可能性もあり、実験結果を解釈する際に考慮する必要があります¹⁵。

この目的のため、皮膚の収縮を制限するためにNBR Oリングをモデルに使用し、元の創傷縁に固定しました。これらのリングは動物に良好に許容され、14日間の実験期間中、位置が固定されていました。いずれの動物においても、定性的に顕著な創傷収縮は観察されませんでしたが、創傷縁へのタトゥー入れやその他の定量的な手法を用いれば、今後の研究において創傷収縮の評価をより強化できると考えられます。したがって、タトゥー入れは本プロトコルにおけるオプションのステップとして検討可能です。

ドレッシングの貼付は、創傷部位での治療を維持しながら、汚染や感染から創傷を保護することができ、これは皮膚創傷治癒モデルにおいて極めて重要である。しかし、一部の動物がさまざまな種類のドレッシングを剥がしてしまうことは珍しくない。ラットは頻繁に創傷部位をグルーミングしたり弄ったりするため、粘着フィルムや二次固定法を用いても、ドレッシングのずれや完全な脱落を招くことがある。ドレッシングによる被覆が失われると、創傷環境が変化し、治療剤の送達に影響を及ぼし、個体間のばらつきが増大する可能性がある¹⁶。本モデルでは、ドレッシングは最長7日間損なわれず、動物による除去や損傷は見られなかった。また、どの実験動物においても皮膚創傷感染の兆候は認められなかった。動物の成長に伴い体重が増加し、適合性がきつくなるため、ドレッシングは毎週交換することが推奨される。動物の可動性と確実な固定のバランスを考慮し、ドレッシングが緩すぎて動物に外されないように注意する必要がある。

本プロトコルは柔軟であり、カスタマイズが可能です。回復が速く安全性が高いためイソフルラン吸入麻酔を推奨しますが、イソフルラン気化器が利用できない場合は、ケタミン/キシラジンなどの注射麻酔を代わりに使用することも可能です。本研究では雄ラットのみを使用しましたが、本プロトコルは雌ラットにも同様に適用できます。

疼痛緩和を強化するため、ブプレノルフィンとカルプロフェンを併用して鎮痛剤を投与することを推奨します。ブプレノルフィンは作用時間が比較的長いため、単独でも術後の十分な鎮痛効果が得られる場合があります。この薬剤は他のオピオイドと比較して免疫機能への影響が最小限であり、炎症プロセスに従った創傷治癒において有利に働きます¹⁷。炎症を抑制し疼痛を軽減する非ステロイド性抗炎症薬は、炎症を調査する場合には避けるべきです。本研究では1匹につき1つの創傷を作成しましたが、研究者は倫理承認および実験計画に従い、同一のプロトコルを用いて追加の創傷を作成することができます。動物福祉への配慮および3Rの原則を慎重に検討する必要があります。研究者は動物モデルを使用する際、3R原則（代替、削減、改善）を遵守し、動物福祉を尊重しなければなりません。外科的手術はガイドラインに準拠し、承認された動物実験プロトコルに厳格に従う必要があります。本研究では、創傷面積の測定と組織学的評価によって創傷治癒を評価し、再上皮化を治癒反応の一成分としました。リング固定に関連して縫合糸が存在することで、局所的な治癒が妨げられる可能性があります。縫合糸の数は個体間で統一させる必要があります。創傷面積の評価には、縫合部位を含むすべての露出領域を含めるべきです¹⁸。このモデルは、虚血、糖尿病、老化など、皮膚創傷に関連するさまざまな基礎疾患を含むように発展させることが可能です。本研究の主な限界は、スプリントを用いない対照群がなかったこと、創傷収縮の定量的評価が不足していたこと、および創傷面積の評価と記述的組織学以外の定量的な生物学的アウトカム指標が限定的であったことです。このモデルの開発過程では、さまざまな技術的課題とトラブルシューティングが見られました。動物福祉と創傷治癒を成功させるためには、保護用ベストまたはドレッシングを適切に適合させることが不可欠です。ドレッシングが緩いと、麻酔からの覚醒後に動物によって取り除かれる可能性があり、一方で締め付けすぎると、動きが制限され、血流が妨げられたり、呼吸に影響したりすることがあります。ドレッシングと皮膚の間には、指1本分（小柄なラットの場合は小指1本分）の十分な隙間を確保してください。動物を毎日観察し、不快感、可動性の低下、または異常な姿勢の兆候が観察された場合は、ドレッシングを調整してください。術後の疼痛管理は、鎮痛剤への感受性の違いにより、個体間で異なる場合があります。背中を丸める動作、活動性の低下、食欲減退、体重減少など、疼痛に関連する兆候を定期的に評価してください。必要に応じて、施設ガイドラインに従い追加の鎮痛剤を投与してください。創傷収縮を防ぐには、リングを安定して固定することが極めて重要です。8～12本の単純結節縫合をリングの周囲に均等に配置し、張力を均一に分散させ、浮き上がりや変形を防ぎます。回復中の緩みを最小限に抑えるため、各縫合は外科結びで固定してください。最後に、個体差を最小限に抑えるため、同一研究内では同じ系統、週齢、体重、性別のラットを使用することを推奨します。また、すべての外科的手術を同一の経験豊富な研究者が行うことが望ましいです。バイアスを避けるため、組織学的および分子生物学的解析には二重盲検法を用いることを推奨します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブプレノルフィン	Salfarm Scandinavia	451790	濃度 0.3 mg/mL
カルプロフェン	Zoetis Animal Health	191380	Rimadyl 50 mg/mL
イーキンシール	Swemed	2076152	厚さ 3 mm
包埋装置	Leica Biosystems	EG1150 H&C
エオシン	組織学研究室	1650	0.2% 着色溶液
無水エタノール	Solveco	1015	分析グレード
固定用包帯	Swemed	2048934	4cm x 4m PA/ビスコース
ホルムアルデヒド	ヒストラボ	2176	4% PBS（pH 7.2-7.4）
ヘアカッター	Swevet	F95000	切断長：0.5 mm
ヘマトキシリン	ヒストラボ	1800	Harris HTX
Histolab-Clear	組織学ラボ	14250	キシレン代替品
イソフルラン	VM Pharma	448210	Attane vet 1000 mg/g
Lekotape	Swemed	2056774
Mepilex	Swemed	2059125	7.5x8.5cm
メポアフィルム	Swemed	2057753	フレーム込みで6x7cm
マイクロポアサージカルテープ	Swemed	2063856	1.2cm x 9.1m
ミクロトーム	Thermo Fisher Scientific	387861	Microm HM355S
封入剤	ヒストラボ	00840-05	パーテックス
Oリング	Ruilogod	B0B1TRQBRT	内径11mm 幅1mm
縫合糸（Ethilon 4-0）	Scandivet	21274-A	非吸収性ポリアミド
組織の脱水	Leica Biosystems	Leica TP1020
Tubifast 2方向ストレッチ	Swemed	2069292	7.5cm x 10m PES/PA