方法論記事

マウス心筋梗塞モデルにおける解剖学的指標を用いた左前下行枝の精密結紮

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DOI：

10.3791/72336

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2026年8月18日

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1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、前室間溝を正確な縫合位置の再現可能な表面指標として用いた左前下行枝冠動脈の永久結紮により、マウスに心筋梗塞を誘発します。梗塞の成立は、心電図、心エコー図、組織学的染色、および血清バイオマーカー分析によって検証されます。

要約

左前下降（LAD）冠動脈の永久結紮は、前臨床心血管研究において心筋梗塞（MI）マウスモデルを確立するために最も広く用いられている手法です。しかし、従来のプロトコルでは、結紮部位は通常、左心房耳の1–2 mm下に設定されますが、この指標は手術中に確実に特定することが困難な場合が多くあります。マウスの冠動脈解剖における個体間の著しい多様性と相まって、このことはしばしば不正確なLADの特定や結紮部位の不一致を招き、術者間での再現性を低下させます。これらの限界を解消するため、本プロトコルではLAD結紮のガイド指標として前室間溝（AIS）を導入します。AISは顕微鏡下で直接観察可能な浅い表面の溝であり、その直下にLADが走行しています。従来の手法とは異なり、AISは安定した解剖学的基準を提供するため、結紮部位をより一貫して選択することができ、経験の浅い術者にとっても特定が容易です。本プロトコルでは、標準化されたイソフルラン吸入麻酔と非侵襲的な気管挿管を組み合わせ、心電図、心エコー図、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、組織病理学的染色、および三次元冠動脈イメージングを用いてMIを検証します。本プロトコルは、MI後の病態生理学的および免疫学的変化を調査するために、マウスにMIを誘発させる信頼性と再現性の高い実験的手法を提供します。

概要

心筋梗塞（MI）は、世界的に心血管疾患による罹患および死亡の主要な原因の一つであり、人類の健康に対する重大な脅威となっています1。突発的な発症、危機的な臨床経過、および高い致死率を特徴とするMIは、主に冠動脈の血栓性閉塞によって引き起こされ、深刻な心筋虚血、それに続く心筋細胞の壊死、ならびに不整脈、心不全、心源性突然死を含む一連の合併症を誘発する可能性があります2。臨床心臓病学における著しい進歩にもかかわらず、ヒト心筋組織へのアクセスが制限されていることが、MIの根底にある病態生理学的メカニズムの解明や効果的な治療戦略の開発を妨げる要因となっています3。したがって、MIの臨床的特徴と進行を忠実に再現し、信頼性と再現性があり、かつ臨床的に関連性の高いin vivo動物モデルは、メカニズムの研究および前臨床的な治療評価において依然として不可欠です。

1954年にJohnsとOlsonがマウスMIモデルを初めて確立して以来、マウスにおけるMI誘発の手法は絶えず改良されてきました4。顕微鏡下での直接視認による左前下行（LAD）冠動脈の永久結紮は、局所的な心筋虚血、心筋壊死、および梗塞後の心室リモデリングを含むヒトMIの主要な病理学的特徴を再現するため、最も広く採用されている手法となっています5。しかし、従来のLAD結紮には相当な顕微鏡外科的技術が必要であり、通常は広範なトレーニングを通じてのみ習得されるため、術者や研究室間での手技の整合性と再現性が制限されます6。さらに、出血、肺損傷または虚脱、結紮位置の誤り、不適切な換気に起因する機械的な組織損傷などの術中および術後の合併症が、周術期死亡率を相対的に高くし、このモデルの広範な適用をさらに制限しています7。これらの制限に対応し、Gaoらは心臓を反転させてLAD結紮を行う改良法を導入しました。これにより、外科的手順が簡略化され、モデル確立への技術的なハードルが低くなりました8。また、冠動脈凍結損傷や薬理学的な心筋損傷誘発など、特定の研究目的に向けた追加的な実験的アプローチも開発されています9,10。それにもかかわらず、直接視認下での永久LAD結紮は、梗塞のサイズと位置を制御して誘発できると同時に、ヒトMIの主要な病態生理学的特徴を最も忠実に再現できるため、依然として好ましい手法とされています。

従来の方法によるLAD結紮は広く用いられていますが、結紮部位の特定が不安定であること、手技の不整合、周術期の死亡率が比較的高いこと、そして研究室間での再現性のばらつきといった制限があり、これらすべてが実験結果の信頼性と比較可能性に影響を及ぼす可能性があります11。本プロトコルの全体的な目的は、血管の位置を特定するための外部解剖学的指標として前室間溝（AIS）を用いることにより、マウスにおける永久的なLAD結紮のための、より標準化され再現性の高い手法を確立することです。左心耳から固定距離の下方に結紮部位を推定するのではなく、本プロトコルでは、顕微鏡下で直接視認できLADの上方に位置する浅い表面の溝であるAISを、結紮を導くための安定した解剖学的参照点として特定します。従来の指標に基づいた推定と比較して、このアプローチは、結紮部位のより一貫した選択を容易にし、術者の習熟度によるばらつきを減少させ、標準的なマウスMI処置との互換性を維持しつつ、経験の浅い外科医にとっても操作性を向上させることを意図しています。したがって、本プロトコルは、心筋損傷、心室リマデリング、炎症、および関連する心血管疾患メカニズムの研究のための永久的なMIモデルを作成するための、再現性のある外科的手法を求める研究者に適しています。

プロトコル

動物を用いたすべての実験は、Southwest Medical University動物実験センター倫理委員会の承認を得て実施されました（承認番号：SWMU20240146）。本研究では、週齢8～10週、体重20.0 ± 3.0 gの雄性C57BL/6Jマウス（特定病原体未感染 [SPF]）を使用しました。実験開始前に、マウスを標準的な飼育条件下（22°C ± 2°C、12時間明期/12時間暗期サイクル）で1週間順化させます。

1. 手術前準備

  1. 手術当日に、ピンセット、眼科用剪刀、持針器、マイクロ蚊鉗子、V字型眼瞼開瞼器、針付き3/8円 7-0ナイロン縫合糸、6-0ナイロン縫合糸、および5-0ナイロン縫合糸を含むすべての手術器具を準備し、滅菌する。すべての金属器具は処置前に121°Cで20分間オートクレーブ滅菌し、動物間の使用時にはガラスビーズ滅菌器（250°Cで15秒間）を用いて再滅菌した後、滅菌パッドの上で冷却する。縫合糸は密封された滅菌パッケージのものを使用する。
  2. 無菌操作を維持するため、2つの独立した作業エリアを設ける。一方のエリアにはピンセット、マウス気管挿管キット、および麻酔機を準備し、もう一方の滅菌手術エリアには滅菌済み器具、綿棒、ポビドンヨード、および滅菌ガーゼを準備する。
  3. 胸部領域に除毛クリームを1分間塗布する。滅菌水または生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼを用いて、クリームと毛を優しく取り除く。
    1. 除毛のみでは手術における皮膚準備とはなならない。確定的な無菌的皮膚消毒および滅菌ドレーピングは、マウスを麻酔し、挿管して手術台に固定した後、皮膚切開（ステップ2.6）の直前に行う。
  4. 手術の1時間前にセファゾリン（300 mg/kg）を腹腔内投与する。注射用セファゾリンナトリウムを滅菌0.9%生理食塩水で調製し、作業濃度を30 mg/mLとし、目標用量を達成するために体重20 gあたり約0.2 mLを投与する。術後5日間、1日1回の投与を継続する。
    注意：本プロトコルでは、全身的または局所的な薬理学的止血剤を投与しない。術中の止血は、滅菌綿棒で10～30秒間、あるいは出血が止まるまで、優しく持続的に圧迫することで行う。

2. 麻酔導入および気管挿管

  1. マウスを麻酔機に接続された導入チャンバー（16 × 10 × 11 cm）に入れる。キャリアガスの流量を 0.5 L/min に設定し、3.5%–4.0% のイソフルランで導入麻酔を行う。
    注：足踏み反射（pedal withdrawal reflex）の消失により、十分な麻酔状態にあることを確認する。これらの設定では、通常 2–4 min 以内に外科的麻酔面（surgical plane of anesthesia）に達する。
  2. 麻酔をかけたマウスをマウス気管挿管プラットフォームの上に背臥位で配置する。マウスの上顎切歯をプラットフォームのラバーバンドに引っ掛けて固定し、頭部と頸部が約 45° の角度で伸展するようにする。口腔、咽頭、喉頭の軸を一直線に揃え、声門が直接見えるようにする。
  3. 経口気管挿管を行う
    1. 制御された機械換気を確立するため、気管切開を行わずに直接喉頭鏡視下で経口気管挿管を行う。気管内チューブとして 20 G 静脈留置カテーテル（外径 約 0.9 mm、長さ 約 15 mm）を使用する。
    2. 口を開け、ピンセットを用いて舌を優しく側方に寄せる。小動物用喉頭鏡のブレードを舌背に沿って挿入し、舌根を押し下げる。
    3. 会蓋が見えるまで喉頭鏡を進める。喉頭鏡をハンドルの軸に沿って上前方へ持ち上げ、会蓋を挙上させて、V字型の声門開口部と淡色の声帯を露出させる。
    4. 声帯を直接視認しながら、吸気時に開いた声門を通してカテーテルを進める。カテーテルが声門を通過した後、喉頭鏡を抜去する。
    5. カテーテルを約 5–7 mm の深さまで進める。スタイレットを抜き、カテーテルを人工呼吸器に接続する。
      注：人工呼吸器と同期した左右対称の胸壁運動を確認し、気管内チューブが正しく配置されていることを確認する。胸壁の動きが最小限で、代わりにリズムのある腹壁運動が起こり、同時に麻酔が浅くなっている場合は、食道からカテーテルを抜き、挿管をやり直す。
    6. 声門が視認できない場合は、喉頭鏡を抜き、頭部と頸部を約 45° に伸展させた状態でマウスを挿管プラットフォーム上に再配置する。口腔、咽頭、喉頭の軸を再度揃え、滅菌綿棒で口腔咽頭の分泌物を除去し、喉頭鏡視下での確認を繰り返す。マウスに麻酔覚醒の兆候が見られる場合は、導入チャンバーに戻して麻酔を深くしてから、再度挿管を試みる。
    7. マウスにチアノーゼ、喉頭出血、または持続的な無呼吸が現れた場合は、処置を中止する。イソフルランの投与を中止し、完全に回復するまで温度調節可能なヒーティングパッド（37°C）の上にマウスを置く。
    8. 気管挿管に失敗した場合は、開胸術に進んではならない。処置を後日に延期するか、その個体を研究から除外し、処置失敗として記録する。
      注：挿管を繰り返すと喉頭浮腫を引き起こし、術後の呼吸困難のリスクが高まる可能性がある。多くの場合、声門を直接視認した後、2回以内の試行で挿管に成功する。経口気管挿管に習熟するには、練習と手技への習熟が必要である。
  4. キャリアガスとして空気を 0.5 L/min の流量で供給し、1.5%–2.0% のイソフルランで麻酔を維持する。人工呼吸器を、呼吸数 130 breaths/min、一回換気量 2 mL、吸気・呼気比 5:4 に設定する。
    注：人工呼吸器に設定する一回換気量は、人工呼吸器回路の圧縮可能容量と気管内チューブの死腔を補正するため、体重から推定される理論値を上回る。処置中は、チアノーゼや、気胸および皮下気腫を含むバロトラウマ（圧外傷）の兆候を監視し、換気状態を評価する。
    1. 処置の間、継続的に麻酔深度をモニタリングする。2 min ごとに呼吸パターンと足踏み反射を評価する。心電図（ECG）を用いて心拍数を継続的にモニタリングし、心拍数が 400–500 beats/min に維持されるようにイソフルラン濃度を調整する。一般に 1.5%–2.0% のイソフルラン濃度で十分である。処置全体を通して、人工呼吸器に対する自発呼吸の努力、ひげの動き、および粘膜色の変化を観察する。
    2. 足踏み反射が再現した、ひげの動きが観察された、または人工呼吸器に対する自発呼吸の努力が見られた場合は、イソフルラン濃度を 0.5% 刻みで最大 3.0% まで上げる。心拍数が 350 beats/min を下回った場合は、イソフルラン濃度を 0.5% 刻みで最小 1.0% まで下げる。これらの兆候が観察されたときは常に外科的処置を一時中断し、心拍数、呼吸パターン、粘膜色、およびひげの動きのモニタリングを継続し、生理学的パラメータが安定した後にのみ処置を再開する。
  5. 左胸壁を露出させるため、マウスを左側が上になるように右側へ傾ける。4 本の肢と尾を粘着テープでプラットフォームに固定する。
  6. ポビドンヨードを用いて、手術部位を 3 回連続で消毒する。各回、新しい滅菌綿棒を使用し、予定切開部位から開始して、全方向に向けて予定切開線の約 1 cm 外側まで同心円状に外側へ向かって拭く。各回の使用後、綿棒は廃棄し、使用済みの綿棒を手術野の中心に戻してはならない。最後の消毒後、完全に自然乾燥させ、滅菌ドレープをかけ、皮膚切開を行う直前に手術野のみを露出させる。

3. 開胸術および心臓の露出

注：動物のポジショニング、開胸、心臓の露出、左前下降枝（LAD）冠動脈結紮、胸腔閉鎖、および術後回復を含む外科的手順全体のワークフローは、以下に示されています。 図1 および 図2.

結紮部位と冠状動脈を示す心臓解剖図、および手術部位の画像。
図 1: 前室間溝を用いた左前下降冠状動脈結紮部位の解剖学的位置。 (A) 結紮前の露出したマウス心臓の腹側像。前室間溝 (AIS) を示す。(B) 左前下降 (LAD) 冠状動脈の結紮後の同一領域の像。円で囲まれた領域が結紮部位を示す。(C) AISと冠状動脈の空間的関係を示す模式図。LADはAISに沿って走行しており、結紮部位は溝の上部3分の1に位置する。RCA：右冠状動脈、LCA：左冠状動脈、LCX：左回旋枝。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

マウスにおける手術手順のシーケンス、心臓の露出、実験的研究、ステップバイステップ図。
図 2: マウスにおける前室間溝ガイド下左前降枝冠動脈結紮の手術手順。 (A) 左胸部を脱毛させた麻酔下のマウスを配置し、固定する。(B) 左胸壁に皮膚切開を行う。(C) 胸筋を分離し、開胸術に適した肋間腔を特定する。(D,E) 胸壁開創器を挿入・配置して肋間腔を広げ、術野を露出させる。(F) 露出した心臓を観察し、前室間溝（AIS）を特定する。(G) 7-0ナイロン縫合糸をAISを横切り、左前降枝（LAD）冠動脈の下に通す。(H) 縫合糸を固定し、永続的なLAD結紮を行う。(I) 胸壁開創器を取り除き、胸壁を閉鎖する。(J,K) 筋肉層と皮膚層を順次閉鎖する。(L) 手術後、保温状態でマウスを回復させる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 眼科用剪刀を用いて、胸骨の長軸に平行で左胸骨縁から約 2 mm 外側に、左胸壁に 1 cm の縦方向の皮膚切開を加える。下層の大胸筋を露出させる。
  2. 精密ピンセットを用い、大胸筋および小胸筋を筋線維の方向に沿って鈍的に分離する。筋肉を外側に牽引して肋骨と肋間腔を露出し、出血を最小限に抑えるため筋肉の切断を避ける。
  3. 胸腔を開く前に、適切な肋間腔を確認する。肋骨に平行に肋間腔内を走行する内胸動脈の分枝である前肋間動脈を特定し、第 4 肋間腔で最も一貫して視認できる動脈のすぐ頭側にある第 3 肋間腔を特定する。
  4. 前肋間動脈が明確に視認できない場合は、第 1 肋骨を触診し、尾側に向かって数え、第 3 肋骨と第 4 肋骨の間の腔を特定する。次に進む前に、選択した肋間腔から左心耳および左心室前壁が直接、遮るものなく視認できることを確認する。
    注：不適切な開胸部位では心臓の視認性が低下し、手順に支障をきたす可能性があるため、第 3 肋間腔を正確に特定することが不可欠である。
  5. 左第 3 肋間腔から開胸を行う。V字型の眼瞼開創器を用いて肋間腔を緩やかに広げ、術野に左心耳と左心室の上部 1/3 が明確に露出するようにする。
    注：この段階では心臓は心膜に覆われているため、AIS を確実に特定することはできない。手順 4.2–4.3 に記載されている通り、心膜を切開した後（ステップ 3.6）にのみ AIS を特定すること。
  6. 心膜を精密ピンセットでそっと掴み、心筋から持ち上げる。もう1本目の精密ピンセットを用いて心膜をゆっくりと裂いて開き、心臓を完全に露出させる。

4. ランドマークに基づいた左前降枝冠動脈の結紮

  1. 6-0ナイロン縫合糸を胸壁に通し、緩やかに牽引して術野を広げる。結紮部位を特定する前に、AISを完全に露出させる(Figure 1A)。
  2. 心基部から心尖部に向かって斜めに走り、左心室と右心室の表面境界を示す浅い溝としてAISを特定する（Figure 1C）。顕微鏡下で、左心耳の下縁から約1–2 mm下に位置する準円形の陥没としてそれを特定する。
  3. AISの特定が困難な場合は、温生理食塩水で湿らせた綿棒で心外膜表面を軽く拭う。顕微鏡下で術野を再確認し、溝をより明確に特定する。
    注：解剖顕微鏡下において、AISは心室間境界を解剖学的に区別する容易に識別可能な浅い溝であり、その直下をLAD冠状動脈が走行している。拭った後もAISが不明瞭な場合は、まず開胸部位が十分に露出しているかを確認する。その後、既報の方法に従ってLADを直接特定する。随伴する心静脈と比較して、動脈は色がよりピンク色で、口径が小さく、明らかな拍動が認められる12。
    1. AISまたはLAD冠状動脈を特定できない場合は、まず開胸が左第3肋間で行われたかを確認する。必要に応じて、ステップ3.3–3.5に記載の方法で開胸部位を調整し、その後、ステップ4.1–4.3に記載の方法でAISおよびLADの特定を繰り返す。
    2. 10分間の慎重な観察後もAISまたはLADを特定できない場合、制御不能な出血が発生した場合、開胸処置の合計時間が20 minを超えた場合、または麻酔深度を調整しても心拍数が300 beats/min未満のままである場合は、処置を終了する。マウスを5% isofluraneで深く麻酔し、頸脱骨により安楽死させ、外科的アウトカム解析に含めるため、この個体を処置失敗として記録する。
  4. AISの上方3分の1の溝をまたぐように7-0ナイロン縫合糸を通す（Figure 1B）。針を心外膜表面に対して垂直に、約0.5–1 mmの深さまで刺入し、刺入点と刺出点を溝の反対側に配置し、ほぼ最大幅をまたぐようにする。
  5. 外科結節を用いて結紮を固定する。最初の結紮後、局所の組織に顕著な陥没が生じることなく、結紮部位より遠位の心筋に即座に白濁（blanching）が認められるまで結紮を調整する。
    注：冠血流を遮断するのに十分な程度にのみ縫合糸を締め付ける。過度な緊張は、隣接する心筋を損傷させたり、縫合糸が血管や周囲組織を切断したりする可能性がある。
  6. 結紮後1 min以内に、結紮部位より遠位の心筋に斑状の虚血性白濁が観察されることで、冠血流の遮断が成功したことを確認する12。さらに、ECGでST上昇を確認し、遮断を確定させる。
  7. 虚血領域が極端に小さいか、または白濁が認められない場合は、結紮を解除し、結紮手順を繰り返す。

5. 閉鎖および術後回復

  1. V字型の眼瞼開瞼器を慎重に除去する。針を隣接する第3肋骨および第4肋骨の周囲に通して第3肋間腔を再近似させ、5-0ナイロン縫合糸を用いた単結節縫合で開胸部を閉鎖する。肋間神経血管束への損傷を避けるため、針は肋骨表面に近い位置に保つ。縫合糸を結ぶ前に、呼気終末に胸部を軽く圧迫して胸腔内の残存空気を排出し、圧迫を維持したままサージョンノットで縫合糸を固定する。
  2. 5-0ナイロン縫合糸を用いて、皮膚切開部を層別に閉鎖する。次に進む前に、創縁が完全に密着していることを確認する。
  3. マウスを温度制御されたヒーターパッド（37°C）の上に置き、イソフルランの投与を中止し、自発呼吸が再開するまで機械換気を継続する。尾やひげの動き、および約150回/minの規則的な呼吸パターンの回復など、麻酔からの覚醒状態を観察する。
  4. 規則的な自発呼吸、ベンチレーターのサイクルに同期した胸壁の動き、および四肢やひげの意図的な動きを確認し、抜管の準備が整っていることを確認する。呼気相に合わせて気管内チューブをゆっくりと抜去し、その後、ヒーターパッド上でマウスを3～5分間継続してモニタリングし、呼吸困難がないことを確認する。
    注意：抜管後の呼吸困難は、肋間腔の閉鎖不全による気胸が最も一般的な原因である。呼吸困難が発生した場合は、一時的にマウスを再麻酔して換気を行い、皮膚の縫合線を再度開き、肋間の閉鎖状態を点検し、空気漏れがある部位に追加の縫合を行った後、再度抜管処置を行う。
  5. 麻酔から回復後、マウスをホームケージに戻す。手術直後およびその後48時間は4～6時間ごとに、ブプレノルフィン（0.1 mg/kg、皮下投与）を投与する。
  6. 術後3日間は1日少なくとも2回、その後は1日1回、各マウスをモニタリングする。体重、姿勢、活動性、呼吸パターン、および手術創を評価し、持続的な呼吸困難、餌や水へのアクセス不能、または刺激に反応しない背中の丸まった不動姿勢など、あらかじめ定義された人道的なエンドポイントに該当する動物は安楽死させる。

6. 心電図（ECG）評価

  1. ECGアンプを備えた多チャンネル生理学的記録システムを用いて、心電図信号を記録する。マウスに3本の皮下肢誘導電極を挿入し、正入力（VIN+）を左後肢に、負入力（VIN−）を右前肢に、そして接地（GND）を右後肢に接続する。
  2. ECGアンプモジュールをデータ収集ユニットに接続する。ノッチフィルタを50 Hz（または地域の商用電源周波数に応じて60 Hz）に設定し、収集ソフトウェアを開いて、アナログチャンネル設定で新しいECGアンプモジュールを追加する。
    1. アンプを以下のパラメータで設定する：ゲイン = 2000、モード = normal、ローパスフィルタ = 150 Hz、ハイパスフィルタ = 0.05 Hz。収集設定を開き、サンプリングレートを1 kHzに設定して、セットアップウィンドウを閉じる。
    2. 電極を配置した後、Startをクリックして記録を開始する。表示タイムベースを1大区分あたり0.5 sに、垂直スケールを1大区分あたり0.25 mVに設定し、ECGを少なくとも30 sの間連続して記録する。解析および代表的な提示のために、安定しておりアーティファクトのないセグメントを選択する。
  3. マウスを1.5%イソフルラン麻酔下で維持し、ウォーミングパッドで正常体温を保持した状態で、結紮直後にECGを記録する。MI群と正常対照（NC）群の両方から、同等の麻酔条件下で同じタイムポイントにECGを記録する。

7. 心エコー検査

  1. 撮像の1日前に、除毛クリームを用いて前胸部の被毛を除去する。検査の間、マウスを1.5%のイソフルランで麻酔させる。
  2. マウスを加熱プラットフォームの上に仰臥位で配置し、四肢をECG電極で固定し、前胸壁に超音波ジェルを塗布する。心拍数が400 beats/min以上に維持されるよう、必要に応じてイソフルラン濃度を調整する。
  3. 超音波プローブを、左胸骨縁に沿った第3〜第4肋間腔に配置する。プローブのマーカーを右前肢方向へ約30°の角度で向け、プローブを心臓の長軸に合わせる。
  4. 中心送信周波数30 MHz、帯域幅20–46 MHz、軸方向分解能50 μmのリニアアレイトランスデューサを用いてすべての撮像を行う。送信出力を100%、画像深度を13 mm、画像幅を11 mm、ダイナミックレンジを60 dB、2次元ゲインを40 dBに設定する。フレームレート210 frames/sでBモードのシネループを取得する。
  5. これらの取得パラメータをシステムプリセットとして保存する。すべての個体およびすべての撮像セッションにおいて、同一のトランスデューサ、プリセット、送信出力、ダイナミックレンジ、画像深度、および画像幅を使用し、NC群とMI群の間で画像深度を変更してはならない。
  6. 同一の長軸像において、Mモードのサンプリングラインを、室間中隔および左心室後壁に対して垂直になるよう心室中間レベルに配置し、サンプリングゲートが左心室の前後径全体をカバーするようにする。後の解析のためにMモードのトレースを記録する。
  7. 左心室、左心房、および大動脈根が明確に可視化されているBモード画像を取得し、後の解析のためにシネループを記録する。同じ撮像面で対応するMモード画像を取得する。
  8. 取得した画像から、左心室拡張末期内径（Dd）、左心室収縮末期内径（Ds）、および室間中隔厚を測定する。5心拍連続で取得し、その平均値を報告する。
    注：左心室拡張末期容積（LVEDV）および左心室収縮末期容積（LVESV）は、撮像ソフトウェアを用いて自動的に算出する。短縮率（FS）はFS = (Dd − Ds) / Dd × 100%として、駆出率（EF）はEF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100%として算出する。

8. 組織採取、組織学的染色およびELISA

  1. 組織の採取
    1. MI誘導後7日目に、各マウスに超音波心エコー検査を行う。4%イソフルランでマウスを麻酔し、後眼窩出血により約1.5 mLの血液を採取した後、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ、心臓を摘出する。
    2. 血液サンプルを4°Cで一晩静置して凝固させる。サンプルを4°Cで2000 × gで10分間遠心分離し、血清を回収して分析まで−80°Cで保存する。
  2. 酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)
    1. ELISAキットを用いて、血清中のB型ナトリウム利尿ペプチド (BNP)、インターロイキン-1β (IL-1β)、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、および核因子-κB p65 (NF-κB p65) を定量する。
      1. すべての試薬と血清サンプルを室温に戻し、キットの説明書に従って作業溶液を調製する。血清サンプルをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で1:5に希釈する（すなわち、血清1量に対しPBS 4量を加える）。
      2. 標準品、PBS、および希釈血清サンプルを、それぞれ標準ウェル、ゼロウェル、サンプルウェルに50 μLずつ加え、ブランクウェルは空のままにする。ブランク以外のすべてのウェルに100 μLの horseradish peroxidase (HRP) 結合検出抗体を加え、プレートを密封し、37°Cの暗所で60分間インキュベートする。
      3. 各ウェルの内容物を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを5回洗浄する。各洗浄サイクルにおいて、バッファーを各ウェルに20秒間保持させる。リントフリーペーパーでプレートの水分を吸い取る。
      4. 調製直後の基質（溶液AとBを容量比1:1で混合したもの）を各ウェルに100 μLずつ加える。密封したプレートを37°Cの暗所で15分間インキュベートし、50 μLの停止液を加えて、450 nmで吸光度を測定する。
    2. 各測定値からブランクの吸光度を差し引き、4パラメータロジスティック (4PL) 回帰モデルを用いて標準曲線を作成する。適合曲線から各サンプルの濃度を算出し、その値に希釈倍率の5を乗じ、2つのウェルの平均値を報告する。
  3. 組織処理、包埋、および切片作成
    1. 摘出した各心臓を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で軽くすすぎ、残留血液を除去する。組織を4%パラホルムアルデヒドで室温で少なくとも24時間固定する。
    2. 各心臓をトリミングして短軸方向の平坦な面を出し、ラベル付きの組織カセットに入れる。段階的なエタノール系列（75%エタノールで4時間、85%エタノールで2時間、90%エタノールで2時間、95%エタノールで1時間、および無水エタノールを2回各30分）を用いて組織を脱水する。組織をエタノール-キシレン混合液に5〜10分間浸し、キシレンを2回各10分間用いて透徹し、溶融パラフィンを3回各1時間用いて浸透させる。
    3. 短軸がブロック表面に向くように各心臓を包埋する。乳頭筋中間レベルで3 μmの連続切片を作成し、切片を40°Cの水槽に浮かべてガラススライドに貼付し、60°Cで乾燥させる。
    4. キシレンを2回（各15分）用いて切片を脱パラフィンし、続いて無水エタノールを3回（各5分）、75%エタノール（5分）、および逆浸透 (RO) 水（5分）で親水化させる。
      注意：パラホルムアルデヒドは発がん性の疑いがあり、呼吸器および皮膚への刺激性がある。また、キシレンは可燃性であり神経毒性がある。これらの試薬は、滅菌医療用手袋、白衣、および保護メガネを着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱い、施設の有害廃棄物処理手順に従って廃棄すること。エタノールおよびn-ブタノールは可燃性であるため、火気から遠ざけて保管すること。
  4. 組織学的染色
    1. ヘマトキシリン・エオジン染色
      1. 脱パラフィンおよび親水化させた切片をヘマトキシリンに3〜5分間浸す。切片を水で洗う。
      2. 1%酸性アルコールで切片を分化させ、水で洗う。0.5%アンモニア水で切片を青染し、再度洗う。
      3. 切片を85%エタノール、95%エタノール、無水エタノールの順に各5分間浸す。エオジンで切片を3〜5分間対比染色する。
      4. 無水エタノールを3回（各5分）、次いでn-ブタノールで5分間浸して切片を脱水する。キシレンを3回（各5分）用いて切片を透徹し、中性樹脂で封入する。
        注：核は青色に、細胞質および細胞外マトリックスは赤色に染まる。
    2. マッソン・トリクローム染色
      1. 脱パラフィンおよび親水化させた切片を2.5%重クロム酸カリウム溶液に室温で一晩（約15時間）浸して媒染する。黄色みが消えるまで、切片を流水下で約30秒間洗う。
      2. 組織が鮮紅色になるまで、ポンソー・酸フクシン溶液で6分間染色する。色が薄い場合は染色時間を延長し、流出液が無色になるまで切片を流水下で洗う。
      3. 切片を乾燥させないように余分な水気を切る。コラーゲンが淡色になり、筋線維が赤く残るまで、水性ホスホモリブデン酸で1〜2分間分化させる。
      4. すすがずに、切片を直接アニリンブルー溶液に移す。切片を6〜30秒間インキュベートする。
      5. 1%酢酸を3〜5回（1回あたり約8秒）用いて切片を分化させる。無水エタノールを3回（それぞれ約3、5、5秒）用いて速やかに脱水する。
      6. n-ブタノールで5分間、次いでキシレンで5分間切片を透徹させる。中性樹脂で切片を封入する。
        注：コラーゲン線維は青色に、筋線維、フィブリン、および赤血球は赤色に染まる。
    3. シリウスレッド染色
      1. 脱パラフィンおよび親水化させた切片をシリウスレッド溶液Aに入れ、65°Cのオーブンで30分間インキュベートする。黄色みが消えるまで切片を流水下で洗う。
      2. 余分な液体を吸い取り、切片をシリウスレッド溶液Bに2分間浸す。切片を短時間洗浄し、余分な液体を吸い取る。
      3. 切片をシリウスレッド溶液Cに30分間浸す。1〜2秒間短時間すすぐ。
      4. 無水エタノールを3回（各約3秒）用いて切片を脱水する。キシレンを3回（各5分）用いて透徹させ、中性樹脂で封入する。
        注：明視野照明下では、コラーゲン線維が黄色い背景に対して赤色に染まって見える。
  5. 画像取得および定量化
    1. デジタルスライドスキャナーを用いてすべての組織学的画像を取得する。すべての群のすべての切片に対して同一の照明、ホワイトバランス、露出、および倍率設定を使用し、すべての画像にキャリブレーション用のスケールバーを含める。
    2. 画像解析の前に空間スケールのキャリブレーションを行う。解析画像と同じ解像度およびピクセル寸法で取得した、スケールバーを含む参照画像を読み込む。[Measure] > [Calibration] > [Set System] で新しい空間キャリブレーションを作成し、単位をμmに設定し、キャリブレーションポイントをスケールバーに合わせてピクセルからマイクロメートルへの変換を定義し、キャリブレーションを保存してすべての画像に適用する。
    3. マッソン・トリクローム染色された切片を読み込み、不規則関心領域 (AOI) ツールを用いて左心室の外郭を描く。心室腔、右心室、および組織処理によるアーチファクトを除外し、左心室の総面積を記録する。
    4. [Measure] > [Count/Size] を開き、[Select Colors] を選択してセグメンテーションダイアログを開く。[Color Cube Based] セグメンテーションを選択し、パラメータを次のように設定する：sensitivity = 4、expand selection by 1 color index、minimum color size = 1 pixel、kernel size = 3 × 3。すべての切片に同一のセグメンテーション設定を適用する。
    5. スポイトツールを用いて、青色のコラーゲン陽性ピクセルをシードポイントとして選択する。明らかにコラーゲン陽性である領域のみをサンプリングしてプレビュー画像を生成し、マスクが赤染された心筋、心室腔、および背景を除外してコラーゲン陽性領域を含んでいることを確認する。必要に応じて、マスクを適用する前にシードポイントを調整する。
      注：切片間のわずかな染色強度の違いを考慮し、切片ごとにシードピクセルを再選択する。すべての画像で同一のセグメンテーションパラメータ（感度、拡張度、最小色サイズ、カーネルサイズ）を維持し、プレビューでコラーゲン陽性領域が完全にカバーされ、非コラーゲン構造が除外されている場合にのみセグメンテーションを確定させる。
    6. セグメンテーションマスクを適用し、ダイアログを閉じる。[Measure] > [Select Measurements] で [Area] を選択し、[Count] をクリックして [View] > [Statistics] を開き、合計コラーゲン陽性面積を記録する。
    7. コラーゲン陽性面積を左心室の総面積で割ってコラーゲン体積分率 (CVF) を算出し、結果をパーセンテージで表す。

9. 組織透明化および冠動脈の三次元イメージング

  1. 冠状血管の蛍光標識
    1. 注入する 200 µL 冠状血管を標識するため、2% Evans Blue溶液を尾側尾静脈に注入する。染料が全身的に循環するよう、マウスをケージに戻して60分間待機させる。
    2. マウスを麻酔機に接続された導入チャンバー（16 × 10 × 11 cm）に入れ、4%イソフルランで導入麻酔を行う。頚脱によりマウスを安楽死させ、胸腔を開いて無傷の心臓を摘出する。それをPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）中で24時間、以下の温度で固定する。 4°C.
      注意：PFAは発がん性の疑いがあり、呼吸器および皮膚への刺激性があります。PFAを取り扱う際は、化学薬品用ドラフトチャンバー内で、滅菌医療用手袋、白衣、および眼保護具を着用し、機関の有害廃棄物処理手順に従って廃棄してください。
    3. RO水で3%アガロース溶液を調製し、結紮部位が撮像に適した方向になるように固定した心臓を埋没させます。注入します。 1 µL マイクロリッターシリンジを用いて、結紮部位を囲む8箇所にDAPI溶液を注入し、試料を室温で2日間インキュベートする。
  2. 組織透明化
    1. メーカーの指示に従い、FDISCO（優れた蛍光保存能力を備えた溶媒透明化臓器の三次元イメージング）組織透明化キットを用いて組織透明化を行う。本キットは6種類の試薬（A～F）で構成されている。試薬A、B、C、DおよびEは、それぞれ水中で50%、70%、80%、100%および100%のテトラヒドロフラン（THF）を含有し、試薬Fはジベンジルエーテルである。
      注意：THFは極めて可燃性が高く、保存中に爆発性の過酸化物を生成し、呼吸器および皮膚への刺激性があります。ジベンジルエーテルは皮膚および眼への刺激性があります。すべての試薬は、無菌医療用手袋、白衣、および保護眼鏡を含む適切な個人用保護具を着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱ってください。廃棄物は、機関の有害廃棄物処理手順に従って廃棄してください。
    2. 各心臓を、試薬A、B、C、D、およびEの順に、各試薬につき6時間ずつインキュベートする。心臓1個あたり各試薬を10 mL使用し、試料対試薬の体積比を最低1:5とする。
    3. サンプルを試薬Fに移し、組織が光学的に透明になるまで（通常は約1時間）インキュベーションを継続します。
    4. すべての透明化工程を〜で実施してください 6°C–8°C 緩やかに撹拌しながら行う。蛍光を維持するため、サンプルはアルミホイルで包んだガラス容器に入れ、手順全体を通して遮光する。
  3. ライトシート蛍光イメージング
    1. 透明化したサンプルをサンプルホルダーに固定する。4倍対物レンズ（開口数 = 0.28、作動距離 = 20.0 mm）を備えたライトシート蛍光顕微鏡を使用する。
    2. マウントしたサンプルをイメージングチャンバー内のジベンジルエーテルに浸します。検体を両側から照明し、405 nmでDAPIを、続いて647 nmでエバンスブルーを順次励起させます。
    3. 取得パラメータを次のように設定する。405 nmチャンネルでは、レーザー強度を3,000任意単位、露光時間を30 msとし、647 nmチャンネルでは、レーザー強度を4,000任意単位、露光時間を30 msとする。zステップサイズを［以下に続く］として、すべての画像を撮影する。 6 μm および1,024 × 1,024ピクセルの画像解像度。
    4. カメラの取得モードをXYCZTに設定してください。このモードでは、イメージングソフトウェアの設定に従い、まず側方（XY）画像が取得され、続いてチャネル（C）、軸方向ステップ（Z）、およびタイムポイント（T）の順に逐次取得が行われます。
  4. 画像データ処理および三次元再構成
    1. 顕微鏡に付属の画像処理ソフトウェアを使用して、RAWのTIFF画像ファイルをスティッチしてください。「ファイル」を選択し、スティッチ済みの画像ファイルをIMS形式に変換します。 > Imarisに変換する。
    2. 変換後のIMSファイルを3次元解析ソフトウェアにインポートします。デフォルトのレンダリング設定を用いてボリュームレンダリング再構成を行い、Snapshotモジュールを使用して代表的な画像をエクスポートします。
      注意：3次元再構成は、ソフトウェアのデフォルトのレンダリングパイプラインを用いて、変更を加えずに行われています。画像セグメンテーション、閾値処理、ノイズ除去、背景減算、その他の前処理は適用されていません。再構成画像は冠状血管の定性的な可視化に使用されるものであり、定量的な解析を目的としたものではありません。

10. 統計解析

  1. すべてのデータは平均値 ± 標準誤差（SEM）として表記する。統計解析にはGraphPad Prismソフトウェア（バージョン5.0）を使用する。
  2. 実験単位を個々の動物と定義する。すべての機能的評価項目、バイオマーカー、および組織形態計測学的エンドポイントについて、1群あたりn = 8匹のマウスを用いて解析を行う。
  3. グループ割り付けに対する研究者の盲検化を維持しつつ、コード化されたサンプル識別子を用いてデータ収集および解析を行う。すべての定量解析が完了した後にのみ、グループ割り付けを公開する。
  4. 適切な統計検定を選択する前に、GraphPad Prism（バージョン5.0）を用いて、シャピロ–ウィルク検定でデータの正規性を、ルベーヌ検定で分散の均一性を評価する。
  5. 両側非対応Student's t検定を用いて2群間を比較する t正規性と等分散性の仮定が満たされている場合はt検定を行い、そうでない場合はマン・ホイットニー検定を行う。 U テスト
  6. 検討してください P < 0.05で統計的に有意である。統計的有意性を次のように示す。 P < 0.05, P < 0.01、および P < 0.001.

結果

AISは、LAD冠状動脈の局在化および結紮部位の特定のための解剖学的指標として利用した（Figure 1A–C）。AISの特定後、胸壁切開、心臓の露出、LAD結紮、胸腔閉鎖、および術後回復を含むMI誘発の一連の手術ワークフローを、Figure 2A–Lに示す通りに実施した。この簡略化されたプロトコールにより、マウスにおいて迅速かつ再現性のあるMI誘発が可能となった。本プロトコールを確実に遂行するためには、長期間の実技トレーニングが必要である。特に気管挿管とAISガイド下の結紮の2つのステップは、習得までの学習曲線が非常に急である。トレーニングの初期段階では、術後7日以内の周術期死亡率が50%以上に達することがあり、モデル誘発の成功率は30%以下に低下する場合がある。これらの技術を習得すれば、手術成功率は安定して90%を超える。本研究では、術後7日以内に周術期死亡は認められなかった。すべてのトレーニング手順は、承認済みの同一の施設内動物実験プロトコールに基づいて実施された。

LAD結紮後、顕著なQ波の深化、上凸形態を伴うST上昇、超急性T波の尖鋭化（通常、亜急性期にT波逆転へと移行する）、振幅の拡大を伴うQRS波電圧の上昇、および顕著な頻脈を含む、特徴的な心電図異常が観察された（Figure 3A）。肉眼的な検査では、NC群と比較してMI群において、結紮部位の末梢側で局所的な心筋の白濁および心室の拡大が認められた（Figure 3B）。組織病理学的検査では、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色、マッソン・トリクローム染色、およびシリウスレッド染色により示されたように、MI群において心筋線維の乱れ、細胞間隙の拡大、炎症細胞の浸潤、コラーゲン沈着、および心筋構造の破壊が認められた（Figure 3C）。マッソン・トリクローム染色切片の定量分析では、MI群のCVFがNC群よりも有意に高いことが示された（18.24% ± 1.67% vs. 0.05% ± 0.01%; P < 0.001; Figure 3D）。

心線維化解析：ECGグラフ、心臓組織画像、組織学的スライド、線維化定量化チャート。
図 3: マウスにおける左前下降冠動脈結紮後の心電図的、肉眼的解剖学的、および組織病理学的変化。 (A) 正常対照（NC）群および心筋梗塞（MI）群において、手術直後に記録した代表的な心電図（ECG）。 (B) NC群およびMI群の心臓の代表的な肉眼画像。スケールバー = 1 mm。 (C) NC群およびMI群の代表的な心臓横断面において、ヘマトキシリン・エオジン（H&E; 左）、マッソン・トリクローム（中央）、およびシリウスレッド（右）で染色したもの。マッソン・トリクローム染色切片ではコラーゲンが青色に、心筋が赤色に染まり、シリウスレッド染色切片では黄色の背景に対してコラーゲンが赤色に染まっている。スケールバー = 1,000 µm。 (D) NC群およびMI群におけるコラーゲン体積分率（CVF）。コラーゲン陽性面積を左室総面積で除し、パーセンテージで算出した。データは平均値 ± 標準誤差（SEM）で示されており、n = 各群 8匹。NC群に対する統計的有意性は **P < 0.001 で示している。こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。

心機能障害は超音波検査によって確認された。代表的なMモード画像では、MI群において左室収縮能の低下が認められた（図 4A）。定量分析の結果、NC群と比較してMI群では左室EFおよびFSが有意に低下していた（図 4B、C）。ELISAにより、MI群においてBNP、TNF-α、NF-κB p65、およびIL-1βの血清濃度が有意に上昇していることが示され（図 4D–G）、これは心機能障害および炎症反応と一致していた。

棒グラフを伴う心エコー画像。NC群とMI群におけるEF、FS、BNP、TNFα、p65、IL-1βレベル。
図 4: 左前下降冠動脈結紮後の心機能変化および血清バイオマーカーレベル。 (A) 正常対照（NC）群および心筋梗塞（MI）群の代表的なMモード心エコー画像。(B) 左室駆出率（EF）。(C) 左室短縮率（FS）。(D–G) 酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）により測定した血清中の(D) B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、(E) 腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、(F) 核内因子-κB p65（NF-κB p65）、および(G) インターロイキン-1β（IL-1β）濃度。EFおよびFSはパーセントで、BNP、TNF-α、およびIL-1βはpg/mLで、NF-κB p65はng/mLで表記している。データは平均値 ± 標準誤差（SEM）として提示し、n = 各群 8 匹とした。NC群に対する統計学的有意性は *P < 0.01 および **P < 0.001 で示した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

組織透明化心臓の3次元蛍光イメージングにより、AIS下方のLADの走行が実証され、解剖学的に定義された部位での結紮が冠動脈閉塞を引き起こすことが示されました（図 5A–F）。総じて、これらの知見は、左室機能不全、心筋線維化、および全身性炎症を特徴とするMI表現型が、各群8匹という今回の初期シリーズにおいて正常に誘導されたことを示しています。本研究は、サンプルサイズの包括的な検証や、モデルの長期的な安定性、あるいはAISとLADの解剖学的一致を提示することよりも、AISガイド下MIモデルの確立およびその実現可能性を実証することを目的として設計されました。したがって、これらの点は本研究の限界として認められ、「考察」セクションで論じられています。具体的には、機能的および生化学的な評価はMI後の急性期に限定されており、AISとLADの関係は定性的に示されましたが、十分に大きなコホートによる定量化はまだ行われていません。

心臓解剖の蛍光イメージング；DAPI、エバンスブルー染色；顕微鏡観察、細胞構造解析。
図 5: 透明化されたマウス冠状血管の3次元蛍光イメージング。 透明化された心臓全組織をエバンスブルーで標識して冠状血管を可視化し、4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) で核を可視化した後、ライトシート蛍光イメージングおよび3次元再構築を行った。(A–C) 心臓全組織の再構築像で、(A) DAPIチャネル、(B) エバンスブルーチャネル、(C) マージ像を示す。スケールバー = 1,000 µm。(D–F) 冠状血管領域の拡大像で、(D) DAPIチャネル、(E) エバンスブルーチャネル、(F) マージ像を示す。スケールバー = 400 µm。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

すべての処置で最適なモデルが得られるわけではなく、不十分な結果を認識することはトラブルシューティングにおいて重要です。結紮部位が近位すぎた場合や、針を深く刺しすぎた場合は、過剰に大きな梗塞が生じ、深刻な心不全、不整脈、または心室破裂を伴って早期死亡に至る可能性があります。逆に、結紮部位が遠位すぎたり、浅すぎたりすると、梗塞が小規模にとどまるか、あるいは梗塞が誘導されないことがあります。したがって、モデル作製の成功は、複数の基準を用いて評価されるべきです。手術中、結紮部位より遠位の心筋の白濁は、冠動脈閉塞の即時的な指標となりますが、この所見は必ずしも容易に観察できるとは限りません。術後の心エコー検査および組織病理学的検査により、モデル作製の成功をさらに確認します。Supplementary Figure 1 では、組織病理学的検査で炎症細胞浸潤や線維化が認められなかった、モデル作製に失敗した代表的な例を示しています。

補足図1. 心筋梗塞モデルの作製に失敗した際の代表的な組織学的所見。 心筋梗塞の誘発に失敗したマウスの代表的な心臓横断切片を、(A) ヘマトキシリン・エオジン (H&E) 染色、(B) マッソン・トリクローム染色、および (C) Sirius Red 染色で染めたものである。心筋梗塞の誘発に成功した場合と比較して、これらの切片では左心室心筋に明らかな炎症細胞浸潤や線維化リモデリングは認められず、冠動脈閉塞が不十分であったことと一致している。スケールバー = 1,000 µm。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

近年、心筋梗塞（MI）の臨床的および実験的モデルは心血管研究においてますます重要になっていますが、MIの病態生理や治療戦略に関する多くの疑問が未解決のままです。本論文では、精緻化されたマウスMIモデルの確立方法について述べますが、その中でいくつかの重要な手技的ステップには特に注意が必要です。最初の重要なステップは気管挿管です。従来の一部のプロトコルでは、挿管前に頸部皮膚を切開し、組織を剥離して気管を露出させる気管切開によって気道を確保していました13。また、経口気管挿管を維持しつつ、手技中の視認性を高めるために頸部正中切開を推奨するものもあります14。これら両方のアプローチとは対照的に、本プロトコルでは喉頭鏡を用いて口咽頭を照らし、頸部切開を行わずに声門を直接視認しながら経口気管挿管を行います。この手法は術者の技術的な習熟度をより高く要求されますが、頸部組織への外傷を避け、感染リスクと術後疼痛を軽減し、手術時間を短縮することができます。挿管時に最も多い誤りは、誤って食道に挿入することです。換気中に胸郭が上がらず、呼気時に気管内チューブに結露が見られない場合は、直ちにチューブを抜き、挿管をやり直してください。左右対称の胸壁運動を確認した後にのみ、ベンチレーターを接続してください。

2番目の、そして最も重要なステップは、LAD冠動脈の同定と結紮糸の正確な配置です。この段階において、従来の方法ではいくつかの課題に直面します。マウスの安静時心拍数は約500–600 beats/minであり、LADはいくつかの随伴冠静脈に隣接しているため、術中にリアルタイムで動脈を同定することは本質的に困難です。さらに、最適な条件下であっても、かなりの割合のLADが解剖顕微鏡下で明確に視認できないことがあります15。このような背景から、左心耳から1–2 mm下の点を結紮部位と推定する初期のプロトコルは、この解剖学的基準の術中同定が不安定であるという制限があり12,14、また左冠動脈の複雑な分岐パターンが再現性をさらに低下させる可能性があります16。これらの課題を解決するため、本プロトコルでは結紮糸を配置するための解剖学的指標としてAISを使用します。解剖顕微鏡下では、AISは心臓の腹側に浅い溝として現れ、LADはその直下を走行しています。したがって、AISは術者の経験への依存度が低い、比較的安定した解剖学的基準となります。AISの上方3分の1に結紮糸を配置することで、冠動脈閉塞のための一定した解剖学的ターゲットが得られます。代表的な結果は、このアプローチによって、検討した動物において期待される急性MI表現型が正常に誘導されたことを示しています。

AISのランドマークは、あらゆる状況で信頼できるわけではありません。胸部の露出が制限されている場合や、心外膜からの出血により心臓表面が不鮮明になりAISの特定が困難な場合は、生理食塩水で湿らせた綿棒で術野をそっと拭き取り、結紮前に再び溝を確認してください。それでもAISを自信を持って特定できない場合は、プロトコルに記載されている通りにLADを直接特定し、AISに頼らず直接視認しながら結紮を行ってください。必要に応じて、第一肋骨から尾側に向かって数えて正しい肋間腔を確認し、左心耳と左室前壁が十分に露出していることを確実にしてください。

術後合併症の中で気胸が最も一般的であり、通常は抜管後の呼吸困難として現れます。気胸を防ぐための鍵は、肋間腔を閉じる前に胸腔内の残存空気を完全に排出することです。気胸が疑われる場合は、マウスを短時間再麻酔して換気を行い、皮膚の縫合線を再度開き、肋間の閉鎖状態を確認してください。閉鎖不全の箇所が1か所以上認められた場合は、抜管処置を繰り返す前に、空気漏れの部位に追加の縫合を行います。もう一つの潜在的な合併症は術中出血であり、結紮中に針が小さな心外膜血管やそれに随伴する冠静脈を穿刺した際に最も多く発生します。出血は一般的に限定的であり、通常は生理食塩水で湿らせた綿棒で数秒間軽く圧迫することで制御可能です。術後合併症を最小限に抑えるため、胸腔を閉じる前に、術野に活動性の出血が残っていないことを確認してください。さらに、処置中または処置直後に、心室性期外収縮や一過性心室細動を含む不整脈が発生することがあります。これらの不整脈は、体温の維持、麻酔深度の安定化、および心拍リズムの自然回復を待つための処置の一時中断によって改善されることが多いです。最後に、麻酔に関する合併症は、気管挿管の成功後にイソフルラン濃度を速やかに下げなかった場合に最も多く発生します。気管内チューブを人工呼吸器に接続した後、直ちにイソフルラン濃度を維持レベルまで下げ、処置全体を通じて呼吸数と心拍数を継続的にモニタリングしてください。

全体として、この手法には高度な微小外科的スキルが必要であり、他の永久的なLAD冠動脈結紮モデルと同様に、冠動脈の解剖学的差異や術者の経験による変動の影響を受けます。それでも、適切なトレーニングと一貫した手術手技を用いることで、手技の再現性と術後の生存率を向上させつつ、かなりの一貫性をもってMIモデルを構築することが可能です。

本手法にはいくつかの限界があることを認める必要がある。第一に、機能的および生化学的な評価はMI誘導後1週間以内に完了しており、したがってMIの急性相のみを反映しており、手術後4～8週間の心室リモデリングなどの長期的なアウトカムの体系的な評価は行われていない。第二に、非吸収性縫合糸を用いた他の永久結紮MIモデルと同様に、本プロトコルでは慢性的な心膜癒着が生じる可能性がある。これは結紮モデル固有の特性であり、AISガイドアプローチ特有の限界ではない。しかし、これらの癒着の重症度および長期的な心機能への影響は、本研究では定量化されていない。今後の研究において、吸収性縫合糸の使用を検討し、癒着形成およびモデルの性能への影響を評価することが考えられる。第三に、3次元冠動脈イメージングにより、LADがAISの下を走行することが定性的に示されたが、これらの構造間の解剖学的な一致度は、十分に大きなコホートにおいてまだ定量化されていない。第四に、本研究では雄のC57BL/6Jマウスのみを対象とした。AISは一貫した解剖学的指標になると期待されるが、雌のマウス、他のマウス系統、および他の種への適用性については、さらなる検証が必要である。最後に、結紮部位の一貫性と手技の再現性に関する本プロトコルの潜在的な利点は、単一の研究室での経験に基づいており、従来のLAD結紮法との直接的な比較や、複数の術者および施設間での評価は行われていない。したがって、本手法のより広範な汎用性を確立するためには、追加の検証研究が必要となる。

開示事項

著者に開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、四川省科学技術計画（No. 2026NSFSC1823および2022YFS0618）、四川省中医药管理局プロジェクト（四川省中医药管理局室 No. 7 [2024]）、四川省中西医結合学会プロジェクト（No. ZXY2025019）、および西南医科大学プロジェクト（助成金 No. 2023ZYYQ04および2023ZYYQ17）からの助成を受けて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 滅菌生理食塩水Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.–セファゾリンの再構成
3% アガロースSigma-AldrichA0169サンプルの包埋
4% パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127組織固定
絶対エタノールChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170A組織脱水；可燃性
酸性フクシンAladdinA104916-100gマッソンスリクローム染色のためのポンソー–酸性フクシン溶液の調製
AcqKnowledge ソフトウェアBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0心電図の収集および解析
アンモニア水 0.5%水溶液Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528Aヘマトキシリン・エオジン染色の青染
アニリンブルー（酸可溶性）AladdinA111200-100gマッソンスリクローム染色のためのアニリンブルー溶液の調製
滅菌医療用手袋Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.–化学的および生物学的保護
ブプレノルフィンQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181術後鎮痛
セファゾリンナトリウム注射用CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.–周術期抗菌薬予防投与
綿棒Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.–心外膜の拭き取りおよび無菌的な準備
DAPI 染色液Thermo FisherD1306核ラベル化
除毛クリームVeet–胸部の除毛
デジタルスライドスキャナー3DHISTECHPannoramic MIDI II全スライドイメージング
ECGアンプリファイアBIOPAC SystemsECG100C心電図増幅
心電図記録システムBIOPAC SystemsMP160心電図記録
ELISAキット（マウス B型ナトリウム利尿ペプチド）Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726M血清BNP定量
ELISAキット（マウス インターロイキン-1β）Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063M血清 IL-1β 定量
ELISAキット（マウス 核内因子-κB p65）Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879M血清 NF-κB p65 定量
ELISAキット（マウス 腫瘍壊死因子-α）Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412M血清 TNF-α 定量
包埋カセットJiangsu Shitai22022組織包埋
気管内カテーテル 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103経口挿管；外径 約 0.9–1.0 mm；使用前に約 15 mm にカット
エオシンY（アルコール可溶性）Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100Gヘマトキシリン・エオジン染色における細胞質対比染色
エバンズブルーJarvisbioA312001冠状血管のラベル化
微細ピンセットRWD Life ScienceF12011-10組織の取り扱いおよび心膜切開
微細ピンセット（マイクロサージャリー用）RWD Life ScienceFC12002T-08マイクロサージャリーにおける組織の取り扱い
微細剪刀RWD Life ScienceS12000-09皮膚切開および剥離用の眼科用剪刀
氷酢酸Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.–マッソンスリクローム分別のための 1% 酢酸の調製
ガラススライドJiangsu Shitai80312/80302切片の貼付
ガラスビーズ滅菌器RWD Life ScienceRS3002個体間の器具滅菌
GraphPad Prism ソフトウェアGraphPad SoftwareVersion 5.0統計解析
ヒータパッドRWD Life Science69020術後の体温調節
ヘマトキシリン染色液Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004ヘマトキシリン・エオジン染色における核染色
西洋わさびペルオキシダーゼ標識検出抗体Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISAキットに同梱ELISA検出
塩酸Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337Aヘマトキシリン分別のための酸性アルコールの調製
Image-Pro Plus ソフトウェアMedia CyberneticsVersion 6.0コラーゲン体積分率の定量
Imaris ソフトウェアBitplaneVersion 7.2.33次元再構成および解析
イソフルランRWD Life ScienceR510-22-10吸入麻酔薬
イソフルラン麻酔システムRWD Life ScienceTAIJI-IEイソフルラン投与
喉頭鏡（小動物用）Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MR挿管時の直接視覚化
ライトシート蛍光顕微鏡Light Innovation TechnologyLiToneXL3次元蛍光イメージング
LitScan ソフトウェアLight Innovation TechnologyVersion 3.31画像のステッチおよび変換
人工呼吸器Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101E人工呼吸；130 breaths/min；1回換気量 2 mL
マイクロ止血鉗子（蚊状）RWD Life ScienceFC21001R-12結紮および閉鎖時の針保持
マイクロリッターシリンジShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.–局所的なDAPI注入
マイクロプレートリーダーMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5450 nm での吸光度測定
解剖顕微鏡Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204術中の視覚化
正立光学顕微鏡LeicaDM500組織学的イメージング
ミクロトーム刃EprediaMX35 ULTRAパラフィン切片作成
改良シリウスレッド染色キットWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078コラーゲン染色；溶液A、B、Cを含む
n-ブタノールChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886A組織学的な脱水および透徹；可燃性
中性封入剤Shanghai YiyangYSQN41-91スライド封入
ナイロン縫合糸（3/8円 7-0 針付き）Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–左前下降枝冠状動脈の結紮
ナイロン縫合糸 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–胸腔および皮膚の閉鎖
ナイロン縫合糸 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–胸壁の露出および牽引
パラフィン包埋装置Wuhan Junjie ElectronicsJB-L5組織包埋
パラフィンワックスNANA組織浸透および包埋
リン酸緩衝生理食塩水Sigma-AldrichP3813組織の洗浄および試薬の希釈
ホスホモリブデン酸Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.–マッソンスリクローム分別
ポンソー 2RAladdinP104989-25gマッソンスリクローム染色のためのポンソー–酸性フクシン溶液の調製
重クロム酸カリウムZhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9マッソンスリクローム媒染剤
ポビドン–ヨードSingleLadyGB26368-2010皮膚消毒
逆浸透水ラボ精製該当なし溶液の調製
回転式ミクロトームLeica Instruments (Shanghai)RM2016パラフィン切片作成
サンプルホルダーアダプターLight Innovation TechnologyLiToneXLに付属ライトシートイメージング用の透徹サンプルの固定
皮膚用粘着テープQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.–肢および尾の固定
カバーグラスJiangsu Shitai80340-1630カバーガラスによる封入
スライド乾燥機Shaoxing Luyue101-3Bスライドの乾燥
停止液Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISAキットに同梱ELISA反応の停止
基質溶液 A および BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISAキットに同梱ELISA発色
組織展伸槽Wuhan Junjie ElectronicsJK-5/6切片の展伸
組織処理装置Wuhan Junjie ElectronicsJT-12S自動組織処理
組織透徹キット（試薬 A–F）JarvisbioJA11012溶媒ベースの組織透徹
気管挿管プラットフォームRWD Life ScienceRe20-M経口挿管のポジショニング
超音波解析ソフトウェアFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6超音波心エコーデータの解析
超音波ジェルTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100超音波心エコーのカップリング
超音波イメージングシステムFujifilm VisualSonicsVevo 3100超音波心エコー
V字型眼瞼牽引器Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009G肋間および肋骨の牽引
洗浄バッファーQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISAキットに同梱ELISAプレートの洗浄
水精製システムSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20T逆浸透水の製造
キシレンChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586A組織透徹および脱パラフィン；可燃性および神経毒性

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