方法論記事

EDTAを用いた脱灰による、空間的トランスクリプトーム解析のためのホルマリン固定パラフィン包埋骨髄サンプルの調製

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DOI：

10.3791/72474

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2026年8月28日

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

この記事について

サマリー

空間トランスクリプトーム解析に向けたホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）骨サンプルの調製の標準的なワークフローには、RNAの完全性を維持するための10日間のEDTA脱灰工程が含まれます。主要な品質管理チェックポイントを設けることで、サンプルが後続の空間的遺伝子発現解析の要件を満たしているかを確認できます。

要約

骨髄（BM）は、空間的な関係性が細胞の挙動、シグナリング、および機能に影響を与える、複雑でダイナミックな構造体です。そのため、細胞間相互作用の全容を理解するには、細胞集団のアーキテクチャをin situで保持しマッピングできる補完的な空間技術が必要となります。単一細胞技術の大幅な進歩により、正常および疾患状態のBM組織における転写の不均一性の理解が進んでいますが、異なる細胞型の空間的配置やニッチ特異的な調節プログラム、およびそれらの相互作用については、さらなる研究が必要です。近年の空間トランスクリプトーム解析の発展により、さまざまな組織において空間的なコンテキストを維持したまま、バイアスのない遺伝子発現解析が可能となり、これらの技術は空間解像度を欠く単一細胞手法を補完するものとなっています。空間トランスクリプトーム解析は軟組織で広く利用されていますが、骨組織の処理に伴う困難があるため、BMのような石灰化組織への適用は限定的です。本プロトコルは、正常および疾患状態のマウスおよびヒト組織から、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルを調製するために使用されてきました。RNAの完全性を維持し、長管骨サンプルで空間トランスクリプトーム解析を可能にするため、10日間のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いた脱灰工程が含まれています。本プロトコルでは、組織処理、保存、切片作成を含むBMサンプルの空間トランスクリプトーム解析に向けた調製方法に加え、切片の完全性、組織形態、およびRNA品質の評価といった不可欠な品質評価ステップについて説明します。また、このワークフローは、細胞型の同定および単一細胞トランスクリプトームデータとの統合をサポートしており、細胞組成の特徴付け、細胞間相互作用の定義、ならびに正常および疾患状態における転写的に不均一な細胞の空間分布の可視化を可能にします。総じて、このワークフローは、BMのアーキテクチャを維持しつつ、完全に石灰化した正常組織および悪性組織を空間トランスクリプトーム解析に向けて調製するものです。

概要

骨髄（BM）は、造血および免疫細胞の成熟の主要な部位として機能する、非常に複雑で区分化された器官である1,2。この不均一な組織は、高度に専門化され組織化された三次元的なニッチにおいて共存する、造血系、間葉系、内皮系、および免疫細胞系の多様な配列で構成されている3,4。このニッチ内では、各細胞集団が異なる解剖学的領域を占めており、空間的なコンテキストが細胞の挙動、シグナル伝達、および機能を調節する上で根本的な役割を果たしている4,5。海綿骨や血管ネットワークなどの特定の構造への物理的な近接性は、造血幹細胞（HSC）の静止状態の維持や骨リモデリングを含む重要な生理学的プロセスを制御している6,7。その結果、この動的な微小環境と、その細胞成分およびストロマ成分間の厳密に調節された相互作用が、恒常性を維持し、血液悪性腫瘍の進行に影響を与える調節ネットワークを形成している8,9,10,11,12,13。

単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）の進歩により、骨髄（BM）の細胞多様性に関する理解が劇的に変わり、これまで認識されていなかった細胞サブタイプや、ニッチ内におけるそれらの予測される相互作用の発見が可能になりました3,10,11,12,14,15,16。しかし、単一細胞トランスクリプトーム解析は、造血ニッチの個々の構成要素に関する高解像度な情報を提供する一方で、組織消化プロセスによって細胞が本来の環境から解離し、本来の状態が変化する可能性があること17、および骨組織の構成を定義する空間的コンテキストが欠如していること4,18という固有の限界があります。この位置情報の喪失により、転写的に異なる特定の細胞集団がどこに存在するか、あるいは隣接する細胞とどのように相互作用しているかを決定的にマッピングすることは不可能です19。さらに、高密度の骨組織はしばしば部分的にしか解離されず、その結果、scRNA-seqデータセットにおいて骨細胞や脂肪細胞などの重要な細胞集団が過小評価され、組織の不均一性の表現に偏りが生じます20,21。空間トランスクリプトミクスでは、空間的に保存された組織切片内で遺伝子発現を in situ で解析できるため、コンテキスト情報を回復し、単一細胞技術の限界を克服することができます8,19,22,23,24,25,26。この技術は、BMを構成する異なる細胞集団の正確な空間的配置と構造的組織化を可能にするため、この分野における不可欠な進歩であり、本来の微小環境における相互作用や機能的役割を理解する上で不可欠です8,26。さらに、疾患の文脈において、空間トランスクリプトミクスは研究者や臨床医が従来の病理学とハイスループットゲノミクスの隔たりを埋めることを可能にし、分子データを形態学的画像に重ね合わせることができます1,8。空間トランスクリプトミクス技術は、大きく分けて、シーケンシングベースの手法とイメージングベースの手法の2つのグループに分類されます17,24。Visium、Curio Seeker、GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP)、Stereo-seq、Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq)、およびオープンソースのOpen-STなどのシーケンシングベースのプラットフォームは、次世代シーケンシングの前に、空間的にバーコード化されたアレイまたはビーズ上でmRNAをキャプチャします。Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH)、Molecular Cartography、RNAscope、CosMX、Xeniumを含むイメージングベースの手法は、マルチプレックスハイブリダイゼーションまたはパッドロックプローブ化学を用いて、転写物を in situ で直接可視化します27,28。あるいは、プローブベースの検出を必要とするかどうかに応じて、プラットフォームをターゲット型または非ターゲット型に分類することもできます17,24。

空間的トランスクリプトーム解析法は、脳、心臓、肝臓などの軟組織には容易に適用されており、これらの組織では無傷の組織切片を簡単に作製できます29,30,31。対照的に、骨への空間的トランスクリプトーム解析の導入は、その石灰化された性質のため considerably より困難です。そのためには、リン酸カルシウムを制御しながら除去し、組織を切片作成やその後の組織学的・分子分析が可能な柔らかさにまで処理する脱灰工程が必要となります32,338,20,23,34。臨床現場で日常的に用いられている従来の脱灰法は、通常、塩酸、硝酸、ギ酸、またはリン酸などの強力な酸性溶液に依存しており、これらはRNAの完全性を著しく低下させ、細胞形態を破壊します35,36。このような分子レベルの分解は、空間的アッセイにおけるS/N比を低下させ、軟組織と比較して遺伝子検出率が許容できないほど低くなることが頻繁にあります8,10。この制限は、シーケンスベースの空間的分析に向けて、石灰化サンプルにおいてmRNAの完全性を確実に保持できる標準化された脱灰ワークフローが必要であることを強調しています8,20。

本プロトコルでは、Muiños-Lopezらによって以前に適用された、空間トランスクリプトーム解析に向けたホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）骨髄（BM）サンプルの調製に関する標準化されたワークフローを提示します8。このワークフローには、制御されたpH条件下でエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いた10日間の脱灰ステップが含まれています。強力な酸とは異なり、EDTAは穏やかなキレート剤として機能し、微細構造を維持しながら核酸の品質を保持するため、分子生物学的アプリケーションへの利用に適しています8,20,33,36,37。概念実証として、本プロトコルを健常および多発性骨髄腫（MM）マウスモデルの骨組織サンプル、ならびに健常者および疾患患者のヒトBM検体に適用し、その後Visium Spatial Gene Expressionプラットフォームを用いてシーケンシングを行いました38。このワークフローには、ヒトおよびマウスの骨サンプルからの組織採取、固定、脱灰、脱水、パラフィン包埋、および切片作成の標準化された手順が含まれており、それに続いて、切片の完全性の評価、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色、RNA品質評価（DV200）、および細胞型確認のためのオプションの免疫蛍光（IF）染色を含む包括的な品質管理パイプラインが行われます。これらの調製ステップにより、高品質な切片のみが、組織切片の前処理、ライブラリ構築、シーケンシング、およびその後のデータ品質管理と解析を含む下流の空間トランスクリプトーム・ワークフローへと進むことが保証されます。

この標準化された手順は、空間トランスクリプトーム解析に向けたヒトおよびマウスのBMサンプルの調製と品質評価をサポートするものです。本手法は、血液疾患および骨格疾患におけるニッチ特異的な制御プログラムの研究を促進することを目的としています。

プロトコル

すべての動物実験は、科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令 2010/63/EU に準拠して実施され、ナバラ大学動物倫理委員会（Comité de Ética para la Experimentación Animal；プロトコル CEEA082-20 および CEEA039-20）の承認を得て行われました。動物の飼育、取り扱い、および安楽死は、痛みと苦痛を最小限に抑えるため、スペインの法律に従って実施されました。

本ヒト研究は、ナバラ大学医学部研究倫理委員会（Comisión de Ética de Investigación, CEI; プロジェクト 2022.100mod1 および 2023.172）およびナバラ保健局研究倫理委員会（CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1）の承認を得て実施されました。ヒト参加者が関与するすべての手順は、ヘルシンキ宣言の倫理原則に従って行われました。個人データは、個人データ保護およびデジタル権利保障に関するスペイン有機法3/2018および生物医学研究に関するスペイン法14/2007を遵守し、機密として取り扱われました。

注：本研究で使用した試薬および機器の詳細なリストは、以下に記載されています。 使用材料一覧骨組織に空間トランスクリプトーム解析を導入するための包括的な実験パイプラインを、以下に模式的に示します。 図1 そして、サンプル採取、品質管理（QC）、および空間トランスクリプトームプロファイリングの3つの運用フェーズに構成されています。サンプル採取には、ヒトまたはマウスの骨片の採取が含まれ、続いて固定、EDTAによる脱灰、脱水、パラフィン包埋、そして切片作成およびスライド調製が行われます。QCフェーズでは、組織学的完全性とRNAの保存状態を評価します。検証済みの骨切片に対して、スライド上での組織透過処理、ライブラリ調製、シーケンシング、およびデータ解析を実施します。

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図1: マウスおよびヒト骨組織におけるサンプル採取およびEDTAを用いた調製ワークフロー。マウス大腿骨およびヒト骨サンプルを採取し、固定、EDTAによる脱灰、脱水、パラフィン埋没、および切片作成を行う。H&E染色およびRNA完全性（DV200）評価によってサンプルの品質を評価し、続いて空間トランスクリプトーム組織の前処理、ライブラリ調製、シーケンシング、およびデータ品質管理を行う。略称：BM = 骨髄；DV200 = 200ヌクレオチドより長いRNA断片の割合；EDTA = エチレンジアミン四酢酸；H&E = ヘマトキシリン・エオジン；QC = 品質管理。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

1. 骨組織サンプルの採取および処理

  1. マウス骨の採取
    1. 5%イソフルランで動物を麻酔し、反射の消失を確認する。
    2. 完全に麻酔がかかった後、施設および規制のガイドラインに従い、頸脱骨により安楽死させる。
      ​注意：安楽死は訓練を受けた職員が行い、組織採取に進む前に死亡を確認しなければならない。
    3. マウスの背面に70%エタノールをスプレーして皮膚を消毒し、外科用鋏を用いて小さな切開を加え、慎重に皮膚を取り除いて後肢を露出させる。
    4. 股関節より上方で切断して後肢を摘出し、10 mLの冷 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)を含む50 mLチューブに移す。チューブを氷上に置く。
    5. 滅菌ピンセットとメスを用いて、付着している筋肉と結合組織を除去する。
    6. 骨を、清浄な冷DPBSがあらかじめ満たされた50 mL滅菌容器に移し、容器を氷上に置く。
    7. 組織の完全性を維持するため、直ちにサンプル組織の固定を行う。
  2. ヒト骨サンプルの取り扱い
    1. 100 mL滅菌容器に入った骨芯生検検体または外科的骨断片を受領する。
    2. 骨断片を、冷DPBSがあらかじめ満たされた清浄な滅菌100 mL容器に移し、氷上に置く。
    3. 組織の完全性を維持するため、直ちにサンプル固定を行う。
      警告：ヒトサンプルはBSL 2条件下で取り扱わなければならない。
  3. 骨組織の固定
    1. 骨サンプルが入った50 mLまたは100 mL容器を取り、DPBSを捨てる。
    2. プラスチックカセットにラベルを貼り、骨サンプルを個別のカセットに入れる。その後の処理中に組織が紛失しないよう、蓋をしっかりと閉じる。
      ​注意：マウスサンプルの場合は、カセット1枚につき骨1本を入れる。ヒト骨サンプルの場合、必要に応じて滅菌メスを使用して組織を標準カセットに収まる十分な小ささの断片に切り、カセット1枚につき断片1つを入れる。この段階でヒト骨サンプルの切断が困難な場合は、そのまま脱灰液に移してもよい。脱灰されて組織が軟化した後、適切なサイズの断片に切断してラベル付きカセットに入れる。
    3. サンプルと固定液の比率が1:20になるように4%緩衝ホルムアルデヒド溶液を加え、4 °Cで24時間インキュベートする。
      警告：固定液は毒性と揮発性蒸気があるため、化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。
      注意：過固定（>48時間）は、FFPEワークフローにおいてRNAの完全性を低下させるため避けること39。
  4. 石灰化した骨組織の脱灰
    1. ホルマリンを捨て、骨サンプルを超純水で洗浄する。水ですすぎ、短時間撹拌して、残存するホルマリン残留物を完全に除去する。
    2. 超純水で0.25 M EDTA溶液を調製し、pHを6.95に調整する。
      注意：従来の脱灰プロトコルではEDTAはしばしばpH 8.0に調整されるが、本ワークフローでは組織形態とRNA品質を維持しながら効率的なキレート作用をサポートするため、約pH 6.95のEDTAを使用する8。
    3. 骨サンプルが入った容器にEDTA溶液を加え、4 °Cで緩やかに撹拌しながら10日間インキュベートする。
      ​注意：マウスサンプルの場合、通常は約50 mLのEDTA溶液で十分である。ヒト骨サンプルの場合、通常は約100 mLを使用する。ただし、完全な浸漬と効果的な脱灰を確実にするため、骨のサイズに基づいてこの容量を調整できる。
    4. 脱灰開始から5 日後、キレート能が時間とともに飽和するため、EDTA溶液を捨て、同量の新しいEDTA溶液と交換する。同じ条件下でインキュベーションを継続する。
    5. 10日間のインキュベーション後、EDTA溶液を捨て、脱灰が完了したか評価する。
      1. 滅菌メスで小さく切るか、滅菌細針を組織の隅や周辺領域に刺入する。その際、関心領域を損なわないよう、常に分析的な重要性の低い領域を選択する。切断や針の刺入時にサンプルを安定させるため、骨を滅菌シャーレの上に置く。組織が容易に切断できるか、または針が最小限の抵抗で通過する場合、サンプルは十分に脱灰されている。
      2. マウス大腿骨の場合は、ピンセットで骨を軽く曲げて柔軟性を評価する。これは完全なミネラル除去の信頼できる指標となる。
        注意：脱灰ステップの期間は、骨サンプルのサイズと厚さ、および使用したEDTAの量に依存する。最初のインキュベーション期間後も骨が硬い場合は、組織が容易に切断できる程度に軟化するまで脱灰を継続する。過度に延長すると組織品質やRNAの完全性が損なわれる可能性があるため、延長は十分な軟化を達成するために必要な最小限の時間に留めるべきである20。
  5. 脱水
    1. 骨サンプルが入った容器に超純水を加え、4 °Cで5分間撹拌しながら洗浄する。
    2. 水を捨て、70%エタノール溶液に交換する。4 °Cで1時間インキュベートする。
      注意：このステップを一時停止点として利用できる。次のステップに進む前に、サンプルを70%エタノール中で4 °Cで保存可能である。本プロトコルでは最大保存期間の実験的検証は行われていないため、ユーザーは各自のラボの標準的な慣行に従って進めること。
    3. エタノール濃度を段階的に上げ（70%、80%、96%に各1 時間、4 °C）、その後100%エタノールで4 °Cにて一晩脱水する。
    4. 100%エタノールを捨て、キシレンに交換する。室温（RT）で4時間インキュベートする。
    5. キシレンを捨て、サンプルカセットを溶融した清浄なパラフィンが入ったガラス容器に入れる。60 °Cで一晩、溶融パラフィン中でインキュベートする。
      注意：真空支援処理システムが利用可能な場合は、パラフィンの浸透がより効率的に行われるため、浸透時間を短縮できる40,41,42。
      警告：キシレンおよび段階的なエタノール溶液を用いるすべてのステップは、適切な換気を確保し、毒性および可燃性蒸気への暴露を最小限に抑えるため、必ず化学薬品用ドラフトチャンバー内で行わなければならない。
  6. パラフィン包埋
    ​注意：RNAの分解を防ぐため、包埋ステーションの表面をRNase除染溶液で清掃すること。
    1. 包埋ステーションの電源を入れ、パラフィンリザーバー、カセットパラフィンバス、モールドパラフィンバス、およびモールドウォーミングプレートを60 °Cに予熱する。包埋前に冷却させるため、コールドプレートを起動させる。
    2. パラフィンを完全に溶かした後、パラフィン浸透させたサンプルが入ったカセットをカセットパラフィンバスに入れる。包埋前にキシレンを完全に除去するため、2時間インキュベートする。
    3. 必要なすべてのモールドをモールドパラフィンバスに入れる。
      注意：ヒトサンプルの場合は、標準的な金属製包埋モールドを使用する。マウスサンプルの場合は、Visiumスライドへの適切な切片配置に適した寸法の正方形の空洞を持つ、Visiumプラットフォーム互換のプラスチック製包埋モールドを使用する。マウスの骨全体はこれらのモールドの正方形の空洞に完全には収まらないため、包埋直前に滅菌メスで骨を切断し、適切なサイズの断片にする。断片の大きさに応じて、1つのモールドに1つまたは2つの骨断片を包埋できる。
    4. 包埋ステーションの中央出口から溶融パラフィンを注入し、薄いベース層を作る。
    5. カセットを開け、温めたピンセットを用いて組織をカセットからモールドへ慎重に移す。
    6. パラフィンが入ったモールドをモールドウォーミングプレートに置き、パラフィンが液状である間に、温めたピンセットで組織を希望の切断面に方向付けする。
    7. モールドを包埋ステーションの冷たい表面に置き、骨断片の位置を短時間固定する。
    8. ディスペンサーから溶融パラフィンをモールドいっぱいに満たし、組織が完全に覆われ、大きな気泡が残っていないことを確認する。
    9. ラベル付きカセットをモールドの上に配置し、パラフィンブロックの底面とする。
    10. カセットが付いたモールドを包埋ステーションのコールドプレートに移す。ブロックが不透明で硬くなるまで、10分間完全に凝固させる。
    11. 凝固後、パラフィンブロックをモールドから取り出し、切断まで4 °Cで保存する。
      注意：このステップを一時停止点として利用できる。パラフィンブロックは4 °Cで保存可能である。ただし、保存中のRNA分解を最小限に抑えるため、可能な限り包埋後速やかに組織切断および後続の空間的トランスクリプトーム解析を行うべきである43,44。
  7. 切断およびスライド作成
    注意：RNAの分解を防ぐため、ミクロトームとウォーターバスをRNase除染溶液で清掃すること。
    1. ウォーターバスに蒸留水を満たし、42 °Cに予熱する。ミクロトームの電源を入れ、新しい刃を取り付ける。顕微鏡スライドに鉛筆でラベルを貼る。
    2. 希望する縦断切断面に沿ってカセットが方向付けられていることを確認し、パラフィンブロックを試料ホルダーに固定する。
      ​注意：氷を満たしたプラスチック袋を用意し、パラフィンが柔らかいために切断が困難になった場合は、ミクロトームに固定したままのブロックの上に氷袋を直接置き、ゴムバンドで数分間固定してパラフィンを硬くし、切片の品質を向上させる。
    3. ミクロトームの厚さを20 µmに設定し、トリミング切断を行う。
    4. ミクロトームの設定を5 µmに変更する。5 µmの切片4枚を、ラベル付きのRNaseフリー1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収する。チューブをドライアイス上に置き、-80 °Cで保存する。
    5. 5 µmで切断を続け、リボン状の切片をウォーターバスに浮かべる。切片が完全に広がり、しわがなくなったところで、ラベル付きスライドで拾い上げる。
      1. 一定枚数ごと（例：組織サイズに応じて5〜10リボンごと）に、追加の5 µm切片4枚を新しいラベル付き1.5 mLチューブに回収する。5 µm切片を含む1.5 mLチューブが計3本になるまでこのプロセスを繰り返す。
        注意：組織にひびが入ったり、破損したり、連続切片が得られない場合は、サンプルが十分に脱灰されていないため、追加の脱灰時間が必要である。脱灰フェーズに到達するまでワークフローのステップを逆戻りさせてサンプルを回収する。具体的には、パラフィンブロックを60 °Cで約2時間溶かし、検体をキシレン（2時間）に移す。段階的なエタノール溶液（100%、96%、80%、70%）、続いて蒸留水を用いてサンプルを再水和させる。再水和させたサンプルを新しい0.25 M EDTA (pH 6.95) に戻し、必要に応じて脱灰期間を延長した後、脱水、再包埋、切断を行う。FFPE処理を逆戻りさせるとRNAの完全性が損なわれる可能性があるため、この回収手順は厳格に最終手段としてのみ使用すること。
    6. スライドを37 °Cのオーブンに一晩置き、残留水分を蒸発させた後、4 °Cで保存する。
    7. 組織の接着性を高めるために、オプションとして、37 °Cで一晩インキュベートする前に、42 °Cで3時間スライドを焼成する。
      注意：材料表に記載されているガラススライドを使用する場合、これらのスライドは強力な接着性を提供し、通常、処理を通じて組織がしっかりと付着しているため、このステップは一般に不要である。このステップを一時停止点として利用できる。スライドは4 °Cで保存可能である。ただし、可能な限り、保存中のRNA分解を最小限に抑えるため、包埋後速やかに後続の空間的トランスクリプトーム解析を行うべきである43,44。

2. サンプルの品質評価

  1. 切片品質の評価
    1. 標準的な明視野光学顕微鏡（4×–10×各スライドを検査して、切片に断片化がないことを確認し、各切片の品質を記録する。
      ​注：折り畳み、しわ、圧縮、またはチャタリングマーク（線状の跡）がないか確認してください。これらは、パラフィンの硬度、刃の鋭利さ、または脱灰不十分などの問題を示している可能性があります。また、切片作成時やウォーターバスへの移行時に組織が剥離し、欠損している箇所がないかを確認してください。
    2. 空間トランスクリプトーム解析のために、最も保存状態の良いセクション（最も完全で形態保持が良好なもの）を選択してください。
    3. 選択したセクションに隣接する連続したセクションを特定し、それらをH用に確保します。&E染色および免疫蛍光染色（IF）を行い、染色画像がシーケンシングに供される組織と可能な限り正確に一致するようにします。
  2. H&組織の完全性評価のためのE染色
    1. スライドをガラス製スライド染色ラックに入れ、15分間、以下の条件でインキュベートします。 60 °C.
    2. ラックをキシレンの入ったガラス染色瓶に移し、15分間置く。 分
    3. ラックを100%、96%、80%、70%のエタノールを含む染色瓶に順に移動させ、5分間静置して切片を親水化します。 各溶液あたり〇〇分。
      ​注意：キシレンおよび段階希釈エタノール溶液を用いるすべての工程は、適切な換気を確保し、毒性および可燃性蒸気への曝露を最小限に抑えるため、必ず化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。
    4. スライドを5分間洗浄する。 水を満たした染色瓶の中で〇〇分間。
    5. ラックをヘマトキシリンに10分間浸し、その後、洗浄液が透明になるまで流水で洗浄する。
    6. 濃塩酸を5滴加えた水にラックを浸し、赤みが現れるまでゆっくりと撹拌する。
    7. ラックを炭酸リチウム飽和水溶液に浸し、安定した青色を呈するまで保持した後、水で短時間すすぎます。
    8. 切片を1% (w/v) エオシンで5分間染色し、その後、再び水で洗浄する。
    9. ラックを水、70%、80%、96%、100%エタノールを含む染色瓶に順に移動させ、各溶液で5分間静置して、スライドを脱水する。
    10. キシレンを用いて15分間、スライドの透徹を行う。 分
    11. 各スライドの裏面をそっと乾かし、カバーガラスに封入剤を塗布して、切片を封入します。スライドを以下の条件で乾燥させます。 24時間の室温保存 イメージングのh前に。
    12. 高解像度顕微鏡を用い、20倍の倍率で組織イメージングを行う。
      注：Hを遂行してください&空間トランスクリプトーム解析へのサンプルの適合性を評価する品質管理ステップとして、まず隣接切片でH&E染色を行います。選択後、2回目のH&空間的トランスクリプトーム解析に使用する切片に直接染色を行います。その際、使用する空間的遺伝子発現プラットフォームについて、製造元の組織標本作製ガイドラインに従ってください。 材料表.
  3. RNA完全性評価 (DV200)
    ​注：空間的遺伝子発現解析プロトコルにおいて、従来のRNA完全性番号（RIN）は、固定組織では通常18Sおよび28SリボソームRNAのピークが消失するため、有効ではありません。したがって、200ヌクレオチドを超えるRNA断片の割合として定義されるDV200指標が、RINよりも有用な品質パラメータとして一般的に用いられています。 分解が進んだ臨床検体向け。Visium v2において、10x Genomics社は、効率的なプローブハイブリダイゼーションと最適なアッセイ性能を確保するため、DV200値が30%以上のFFPEブロックの使用を推奨しています。利用可能なブロックの中で最も高いDV200値を持つ組織ブロックを選択することで、シーケンシングのドロップアウトを防ぎ、スポットの感度を最大化することができます。
    1. ～が入った1.5 mLチューブを取り出す。 5 µm 組織切片作成ステップで回収したセクションを氷上に置き、RNAを抽出する。
    2. 全RNAを抽出します。この標準化された手順には、サンプルの脱パラフィン処理、ホルマリンによる架橋を解除するためのプロテイナーゼK消化、DNase I処理によるゲノムDNAの除去、および精製したRNAのRNaseフリー水への最終溶出が含まれます。
    3. 高感度RNAアッセイを用いたキャピラリー電気泳動システムにより、RNAの完全性を評価する。ワークフローの概要を以下に示す。 補足ファイル 142,45,46,47,48.
  4. 細胞種の確認のための任意的な免疫蛍光染色
    1. FFPEスライドをガラス製染色ラックに入れ、15分間、以下の条件でインキュベートします。 60 °C.
    2. ラックをキシレンを含むガラス製染色瓶に移し、15分間置く。 分
    3. ラックを100%、96%、80%、70%のエタノールに順に2分間ずつ浸し、続いて水に5分間、PBS-Tween（0.1% Tween-20を添加した1x PBS）に5分間浸して、切片を再水和させる。
      注意：キシレンおよびエタノールを使用するすべての工程は、必ず化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。
    4. 一次抗体の製造元の推奨に従って抗原賦活化を行い、賦活化バッファー、pH、および加熱条件が抗体のデータシートと一致していることを確認してください。注：本ワークフローでは、10 mM Trisおよび1 mM EDTA（pH 9.0）を用い、電気ポット加熱システムにて30分間、以下の温度で抗原賦活化を行います。 95 °Cその後、室温で20分間冷却した。
    5. スライドをPBS-Tweenで10分間ずつ2回洗浄する。
    6. 疎水性バリアペンを用いて組織の周囲に疎水性バリアを描き、1x DPBSで調製した5% BSAを組織切片に少なくとも40分間適用して、非特異的結合をブロックします。 加湿チャンバー内にて室温で〇分間保持する。
      注：加湿チャンバーは、プラスチック製のスライド染色ボックスにフィルターペーパーを敷き、そこに蒸留水を十分に染み込ませて作製します。これにより、抗体反応中に安定した湿度環境が維持されます。
    7. 各抗体の推奨希釈倍率に従い、1x DPBSを用いて一次抗体溶液を調製してください。
      注：本ワークフローでは、製造元のプロトコルに従い、マウスのECおよびMSCの同定にはそれぞれEmcn (V.7C7)およびCd271 (ME20.4)に対する一次抗体を使用し、ヒトの対応細胞の同定にはCD31 (JC70A)またはPRRX1 (ポリクローナル)に対する抗体を使用した。
    8. スライドの端を吸収紙で軽く叩いて残留した液滴を取り除き、ブロッキング溶液を除去した後、一次抗体ミックスを塗布し、スライドを overnight（一晩）で以下でインキュベートします。 4 °C 加湿チャンバー内で。
    9. スライドをPBS-Tweenで5分間2回洗浄し、メーカー推奨の希釈倍率で二次抗体溶液を調製する。その際、蛍光色素がスペクトル的に適合し、重複しないことを確認すること。
      注：本ワークフローでは、1:200に希釈したAlexa Fluor標識二次抗体を使用した。
    10. 二次抗体ミックスを適用し、30分間インキュベートする。 室温で、遮光し、加湿チャンバー内で〇〇分間。
    11. スライドをPBS-Tweenで5分間、2回洗浄する。
    12. 1:1のPBS-グリセロール溶液で調製したDAPI含有封入剤（材料表を参照）を10倍に希釈して適用し、サンプルを5分間インキュベートする。
    13. 切片をカバーガラスで封入し、乾燥を防ぐために周囲をマニキュアで密封します。
    14. マルチスペクトルイメージングプラットフォームを用いて、染色した組織を可視化します。

補足ファイル 1：RNA完全性評価およびVisium空間トランスクリプトームワークフローのプロトコル手順の概要。この補足ファイルは、製造元の指示に従って実施された手順の詳細な要約を提供します。内容には以下が含まれます：(i) メインプロトコルのステップ 2.3.3 に記載されている、RNA完全性 (DV200) の評価に使用した High Sensitivity RNA ScreenTape Assay、および (ii) 組織の前処理、ライブラリ調製、およびシーケンシングを含む Visium CytAssist 空間遺伝子発現ワークフローの概要（メインプロトコルのステップ 3.1–3.3）。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

3. 空間トランスクリプトーム解析

注意：空間トランスクリプトーム解析のワークフローは、材料表（Table of Materials）に記載されたプラットフォームおよび試薬を使用し、対応するユーザーガイド42,45,46に従って実施してください。補足ファイル1（Supplementary File 1）に、主要な組織の前処理、ライブラリ調製、およびシーケンシングの手順がまとめられています。

  1. 空間トランスクリプトームデータの品質管理
    1. Visiumデータセット用の標準パイプラインを使用して、空間トランスクリプトームデータをデマルチプレクスする（材料表を参照）。
    2. リードを適切なEnsembl 105リファレンスゲノムにマッピングする。
      注：ヒトサンプルにはGRCh38を、マウスサンプルにはmm10を使用した。
    3. 同一のパイプラインを用いてフィルタリング済みフィーチャー・バーコードマトリックスを生成し、ダウンストリームのシングルセル/空間解析環境にインポートする（材料表を参照）。
    4. 空間トランスクリプトームパイプライン（材料表を参照）で提供される可視化インターフェースでH&E染色画像を確認し、データセットに応じて皮質骨領域または骨組織と重複するスポットを手動で削除する。
    5. シングルセル解析ワークフローで一般的に適用される分散安定化変換法を用いて、データセットを正規化する（材料表を参照）。

結果

このEDTAベースのワークフローの種および疾患コンテキストにおける適用性を評価するため、本プロトコルを4つの骨髄（BM）サンプル（マウスの大腿骨2検体、および健康な状態と多発性骨髄腫（MM）の状態を表すヒト骨標本2検体）に適用した（表1および図1）。

検体識別種性別年齢疾患
YFPcγ1マウス雌210日健全な
mMMマウスオス314日MM
ヒト脳モデル（hHBM）人間オス76歳健康な
hMMヒト雌性50年MM

表1：本研究に含まれるマウスおよびヒトの骨サンプル。 各サンプルについて、種、性別、年齢、および健康状態を記載する。略語：hHBM = 健康なヒト骨髄；hMM = ヒト多発性骨髄腫；mMM = マウス多発性骨髄腫；MM = 多発性骨髄腫；YFPcγ1 = 健康対照マウス。

本研究で使用したサンプルは、MMマウスサンプルを除き、研究グループによる先行論文（具体的にはMuiños-LopezらおよびCenzanoらによる研究）において、すでに特性評価および報告がなされています。以前に報告された検体については、空間トランスクリプトームデータおよび結果がそれらの研究8,10に提示されています。したがって、本資料に含まれる材料は、新たな生物学的知見を提示するためではなく、空間トランスクリプトームに対するプロトコルの技術的な適合性を評価するために使用されています。

MM患者の臨床的および免疫学的特性を再現する遺伝子組換えMMマウスモデルであるBIC (BIcγ1) および、それに対応する健康な対照マウス (YFPcγ1) からマウスの大腿骨サンプルを入手した8,49。各個体から大腿骨を1本ずつ採取し、標準的なプロトコルに従って洗浄および処理を行った（図 2A）。これらの解析に大腿骨を採用したのは、利用可能な骨髄が豊富であり、ニッチの品質が優れていること、および再現性のある処理が容易であるためであり、これによりシーケンシングベースの空間トランスクリプトームプラットフォームへの適用に適しているためである8,10。対照マウスの大腿骨の脱灰が成功したことは、ピンセットによる手動操作時に組織の柔軟性が著しく向上したことで肉眼的に確認された（図 2B）。その後、後続の分子解析に向けてRNAの完全性と組織構造を維持するため、空間トランスクリプトーム解析に対応した専用の型を用いて、この骨片をパラフィンに効率的に包埋した（図 2C）。

処理履歴の異なる2つのヒト骨髄（BM）サンプルについても分析を行った8,10。血液学的に健康なヒトの新鮮BMサンプルは、Hospital Universitario de Navarraでの股関節全置換術の際の手術廃棄物から得られた（図 2D–F）。本プロトコルのトランスレーショナルな有用性を示すため、このサンプルをマウスサンプルと同様に処理した。マウス組織で観察された結果と同様に、ヒト骨のEDTA脱灰が成功したことは、組織が完全に軟化し、針が容易に貫通したことによって肉眼的に確認された（図 2E）。脱灰後のヒト骨断片は、標準的なメタルモールドを用いてパラフィンに正常に包埋され、後続の処理に供された（図 2F）。2つ目のヒトサンプルは、Clínica Universidad de Navarra（CUN）の病理学部で保管されていた、多発性骨髄腫（MM）患者の腸骨稜からのFFPE BM生検組織である。特筆すべき点として、このアーカイブされたMMサンプルは、強酸を用いた標準的な臨床プロトコルによって事前に脱灰されていた36。このサンプルは、EDTA処理された検体との定性的な対比となるが、組織の由来、固定履歴、保存状態、および脱灰方法が異なるため、観察された差異が脱灰剤のみに起因するとは限らない。

figure-results-1
図2EDTAを用いた調製過程におけるマウスおよびヒトの骨試料。 (A脱灰前の無処置の対照マウス大腿骨。B) 柔軟性の増加を示す脱灰コントロールマウス大腿骨（Cパラフィン包埋したコントロールマウス骨片。D脱灰前の股関節手術から得られた健康なヒト骨片。E) EDTA脱灰後の同一フラグメントであり、針の穿刺が確認できる。(F）パラフィンに包埋された、EDTA脱灰済み健康ヒト骨。スケールバー：（A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm。略称：EDTA = エチレンジアミン四酢酸。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

一般的な組織構造を解析するため、H&E染色を行った（Figure 3）。マウス切片で観察された形態保存状態の良好さは、種固有の特性というよりも、サンプルの取り扱いや処理方法の違いを反映している可能性がある。マウス大腿骨は空間トランスクリプトーム解析のために特別に採取され、そのままの骨として直ちに処理されたため、その構造が保持されていた（Figure 3A, B）。対照的に、ヒトサンプルは、股関節置換術中に得られた残余組織（Figure 3C) または診断目的のMM骨生検組織（Figure 3D)に由来しており、いずれも分析前の組織品質にばらつきがある可能性がある。その結果、EDTA脱灰したヒトサンプルと酸脱灰したMM生検組織の間の形態学的相違はわずかであった。これは、いずれのヒト検体においても、脱灰だけでなく一般的な組織処理によって導入されたベースラインの構造的な制限が既に認められるためである（Figure 3C, D). したがって、空間トランスクリプトーム解析のためのサンプル品質を包括的に評価するには、複数の異なるパラメータを検証する必要がある。第一に、構造の保存状態は使用した脱灰酸だけでなく、特定のサンプルタイプによって大きく変動するため、組織の完全性を注意深く監視しなければならない。第二に、脱灰条件がRNA品質に影響を及ぼす可能性があるため、RNA品質についても評価すべきである20,35,36。

figure-results-2
図 3: 組織品質評価に使用したH&E染色切片。連続FFPE切片は、それぞれ（A）健康なコントロールマウス10、（B）MM罹患マウス、（C）健康なヒト骨8,10、（D）ヒトMM生検組織8に対応している。スケールバー = 500 µm。略語：FFPE = ホルマリン固定パラフィン埋没；H&E = ヘマトキシリン・エジン染色；MM = 多発性骨髄腫。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

組織学的解析を補完するため、RNAの品質を評価した。H&E染色の結果では差異が曖昧であったが、RNAの完全性は2つの脱灰方法による影響を明確に区別した（Table 2）。マウス試料および健康なヒト骨標本からのDV200値は、いずれもVisium FFPEアッセイで推奨される閾値を超えており、プローブのハイブリダイゼーションおよびライブラリ調製に十分なRNA断片長分布であることが示された。YFP健康マウス試料のDV200は82.55%であり、健康なヒト骨（hHBM）試料は58%に達しており、どちらも10x Genomics社によって定義された許容閾値である30%を十分に上回っていた。MMマウス（mMM）試料のDV200は31.3%であり、許容下限値に近い値を示したが、これはサンプルの個体差などの要因に加え、切片作成前にパラフィンブロックを4 °Cで長期間保存したことが影響している可能性がある。対照的に、酸脱灰を施したヒトMM生検（hMM）のDV200はわずか8%であり、形態的な劣化がそれほど顕著でない場合でも、RNAの完全性が著しく低いことに関連していた。要約すると、ダウンストリームの空間解析への試料の適合性を評価するには、構造的評価と分子的な評価の両方を行うことが重要である。

サンプルの識別DV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200：全RNA断片の割合 > 200ヌクレオチド
2このサンプルは、強酸を用いた標準的な臨床プロトコルに従って脱灰されました。

表2：研究サンプルのRNA品質。 DV200は200ヌクレオチドより長いRNA断片の割合であり、30%以上の値が下流の空間トランスクリプトーム解析に適していると見なされた。略語：hHBM = 健康なヒト骨髄、hMM = ヒト多発性骨髄腫、mMM = マウス多発性骨髄腫。

追加の品質評価を行うことも可能です。EDTA脱灰後の組織の完全性をさらに検証し、特定の細胞コンパートメントの保存を確認するため、マウスおよびヒト組織の隣接するFFPE切片を用いて、オプションで免疫蛍光（IF）染色を実施しました。MMマウス試料において、内皮細胞（EC）および間葉系細胞（MSC）をそれぞれ可視化するために、Endomucin (Emcn) および Cd271 抗体を使用しました（図 4A）。この染色により、EDTA処理された組織において、連続的な Emcn 染色を伴う明確な血管構造と保存されたストローマネットワークが認められ、試験したマーカーが処理後も検出可能であることが示されました。さらに、自動マルチスペクトルイメージングシステムを用いた高解像度イメージングにより、試験した抗原が細胞型の検証のために検出可能であることが改めて証明され、空間トランスクリプトーム解析前の追加的な品質管理レイヤーとなりました。さらに、これらの所見は健康な高齢ヒト検体でも観察され、CD31 による EC 発現および PRRX1 (Paired Related Homeobox 1) 抗体による MSC の検出が認められ、試験したニッチマーカーが EDTA 脱灰後も識別可能であることが示されました（図 4B）。 対照的に、これらの所見は、さまざまな酸ベースの脱灰プロトコル subjected されたヒト MM 生検試料では再現されませんでした。前述のように、これらの試料における RNA の完全性は低く、ダウンストリームのトランスクリプトーム解析が制限されました。これらのヒト検体は分解が進んでいたため、その後の有用性はベースラインのトランスクリプトームプロファイリング8および悪性形質細胞（PC）の免疫組織化学（IHC）評価に限定されました（図 4C）。

figure-results-3
図4: 細胞型の確認のためのオプションの免疫蛍光染色および免疫組織化学染色。 (A) DAPIで標識された核（青）、CD271陽性MSC（緑）、およびEMCN陽性EC（赤）を示すマウスMM組織。(B) DAPIで標識された核（青）、PRRX1陽性MSC（緑）、およびCD31陽性EC（赤）を示す正常なヒト骨10。(C) CD138陽性の悪性PCを示すヒトMM生検組織8。スケールバー：(A) 250 µm（全体像）、20 µm（マージ拡大像）、50 µm（シングルチャンネル像）；(B) 500 µm（全体像）、20 µm（マージおよびシングルチャンネル拡大像）；(C) 500 µm。略語：DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole、EC = 内皮細胞、MM = 多発性骨髄腫、MSC = 間葉系ストローマ細胞、PC = 形質細胞。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

組織形態とDV200の結果を総合すると、EDTA処理されたサンプルは、その後の空間トランスクリプトーム解析に適していることが裏付けられます。この調製ワークフローを用いた空間トランスクリプトームへの応用は、以前に報告されています8,10

ディスカッション

EDTAベースの制御脱灰、標準化されたFFPE処理、および厳格な品質管理チェックポイントを統合することで、本プロトコルは空間トランスクリプトーム解析のための骨組織標本作製において伝統的に伴っていた多くの制限、特に強酸ベースの脱灰法によって引き起こされるRNA分解や形態学的損傷に関連する制限を克服している8,10,20,33,36。空間トランスクリプトーム解析のために石灰化試料を処理する上で最も重要なステップは脱灰である。脱灰が不十分であると、骨が切片作成に耐えられないほど硬いままとなり、空間トランスクリプトーム解析に適した高品質な切片を物理的に得ることが不可能になる8,20,23,37,50。骨組織が硬すぎる場合、ミクロトームの刃に対して組織が砕けたりチャタリングが発生したりし、切片の断裂や穴が生じて、本来のBM構造を正確に反映しなくなる。重要な点として、脱灰の成功はミクロトームでの切削段階まで完全には確認できない。外見上は軟化したように見える試料であっても、薄いFFPE切片を作製しようとした際に初めて顕在化する残留ミネラルが含まれている可能性がある。このため、再現性のある結果を確保するには、脱灰の進行状況を注意深くモニタリングすることが不可欠である。

このワークフローでは、0.25 M EDTA（pH 6.95）を用い、絶えず撹拌しながら10日間処理し、5日目に溶液を交換します8,10。プロトコルの開発段階において、EDTA単独、ポリビニルピロリドンを添加したEDTA、および10%ギ酸を評価し、併せて脱灰期間と溶液交換スケジュールの異なる条件を検討しましたが、それらの比較データはここでは示しません。10日より短い期間では、マウスサンプルの薄切時に組織の破損が頻発した一方、ヒトサンプルでは個体によって挙動が異なる結果となりました。したがって、マウスの大腿骨には10日間の期間を用いますが、ヒトサンプルでは密度や骨梁の内容に応じて、より長期間の脱灰が必要な場合があります。パラフィン包埋の前に、物理的な品質管理チェックポイントを設ける必要があります。マイクロトミー中に脱灰不足が判明した場合、再処理手順は最終手段としてのみ使用してください。追加の加熱、溶剤への曝露、および再水和によってRNAの品質が低下する可能性があるためです。

本手法の主な制限は処理時間が長いことであり、これは臨床病理学で一般的に用いられる迅速な酸ベースのプロトコルとは対照的です20,36。研究環境では一般的に長い処理時間でも許容されますが、Morse溶液（22.5% formic acidおよび10% sodium citrate）を用いて24 h以内に脱灰させるMiaoらによるプロトコルなどの最近の研究は、空間解析に向けた骨標本作成の迅速化への関心が高まっていることを示しています20。しかしながら、酸ベースの手法は歴史的にRNA分解のリスクが非常に高く、DV200値を低下させ、最終的に空間トランスクリプトミクスとの互換性を制限します1,8,35,36。このEDTAベースのアプローチは、速度よりもRNAの保存を優先しており、Visiumなどのシーケンシングベースの空間プラットフォームとの互換性を確保しています。

BM空間的トランスクリプトーム解析における潜在的な限界は、形質細胞（PC）由来の免疫グロブリン転写産物の含有量が多く、低発現遺伝子の検出能が低下する可能性があることです。当研究グループの先行研究で適用された品質管理およびフィルタリング戦略と同様に、低品質スポットの除去を含む（<200個のUMIおよび <150個の検出遺伝子）、寄与度の低い細胞型のフィルタリング（<（1スポットあたり20%）をデコンボリューション解析時に設定し、空間トランスクリプトームデータセットで検出されたマーカー遺伝子の選択を行う。また、必要に応じて、ダウンストリーム解析において免疫グロブリン転写物を計算的にフィルタリングし、その影響を最小限に抑えることも可能である。8標的型空間トランスクリプトーム解析アプローチを用いることで、特定のアプリケーションにおいて低発現トランスクリプトの検出能をさらに向上させることができる可能性がある。

本手法の潜在的な応用範囲は広範にわたります。空間データとシングルセルデータの最近の統合により、ヒトの特殊化した骨形成ニッチや、海綿骨から放射状に広がる複雑なシグナル勾配が明らかにされています3,26。さらに、空間トランスクリプトーム解析により、加齢がECの空間的な組織化とコミュニケーションを変化させることでBM微小環境を再形成し、その結果、骨形成サポートの低下と、老化ニッチ内における炎症性シグナルネットワークの出現が引き起こされることが示されています10。また、マルチオミクスプロファイリングにより、初期の骨髄球系造血をサポートする動脈・内骨膜領域や、造血幹細胞および前駆細胞が豊富な脂肪細胞周囲帯などの、明確な微小環境近傍領域が特定されています3。MMにおいて、本プロトコルは空間的およびシングルセル的なトランスクリプトームの枠組みを統合し、疾患状態にあるマウスBMの組成および細胞間相互作用を特徴付けることを可能にします。先行研究では、悪性PCの空間的に異なる分布が明らかになり、NETosisやIL-17シグナルなど、腫瘍濃縮領域と逆相関する免疫および炎症プログラムが特定されました。加えて、悪性PC密度の増加は、エフェクターT細胞から疲弊T細胞状態への移行と相関していました。これらの知見はヒトのFFPE BMサンプルでも検証されており、疾患負荷の異なる状況におけるトランスレーショナルな関連性が実証されています8。最終的に、この調製ワークフローは、BMの石灰化構造内における複雑な細胞間相互作用を探索するための技術的基盤を提供します。

高精細な空間的遺伝子発現プラットフォームにより、ほぼ単一細胞レベルの解像度で全トランスクリプトームプロファイリングを行うことが可能です38,51,52。これらのアプローチを用いることで、本調製ワークフローを、空間的に構成された骨髄（BM）および血液腫瘍の高解像度解析へと拡張できる可能性があります。したがって、本ワークフローは、生理的および悪性造血に関する今後の研究のための技術的基盤を提供します。

開示事項

著者らは、競合する利益がないことを宣言します。MMのMIcγ1マウスモデルのノウハウおよび実験的利用に関する特許は、MIMO Biosciencesにライセンス供与されています（出願番号 PCT/EP2023/071025）。

謝辞

本研究は、Instituto de Salud Carlos IIIによる支援およびERDF A way of making Europe (PI22/00983) による共同出資、CIBERONC (CB16/12/00489)、RICORS TERAV (RD21/0017/0009) および RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010)、AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011、Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04)、Cancer Research UK [C355/A26819]、Accelerator Award Programに基づくFC AECCおよびAIRC、International Myeloma Foundation (Brian van Novis) および The Paula and Rodger Riney Foundation (FPへの支援) によって支援を受けました。IACは、欧州委員会のMarie Curie grant (H2020- MSCA-IF-837491)、AECC Talent grant (INVES258003CALV)、およびDepartamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03) の支援を受けました。MCは、Ministerio de Ciencia, Innovación y UniversidadesによるFPU fellowship (FPU22/03283) の支援を受けました。また、貴重な技術的および知的支援を提供いただいたCIMA Universidad de NavarraのAdvanced Genomics Laboratoryおよび動物施設のスタッフに感謝いたします。さらに、BMサンプルの提供および卓越した共同研究にご協力いただいたClínica Universidad de Navarra (CUN) およびHospital Universitario de Navarraの病理部門に感謝いたします。MMマウスモデルを提供いただいたJosé Ángel Martínez-ClimentおよびMarta Larrayozに特段の感謝を申し上げます。空間トランスクリプトミクスに向けたマウスおよびヒトBMサンプルの処理における技術最適化、プロトコル開発、およびトラブルシューティングにおいて多大なるサポートをいただいたPatxi San Martín-Uriz、Tania López、およびEduardo Larequiに感謝いたします。また、空間トランスクリプトミクスの計算解析に従事したBeñat AricetaおよびAsier Ullateに感謝いたします。最後に、本研究に寛大にご協力いただいた患者様および健康なドナーの方々に深く感謝申し上げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLチューブEppendorf15625367
100 mL滅菌済み容器 デルタラボ723-510
4200 TapeStationAgilentG2991Aキャピラリー電気泳動–RNA完全性評価のためのベースシステム
50 mL滅菌済み容器 IberoMedREOR001
50 mLチューブ FALCON352070
高度なPAPペンTed Pella 22309Z377821-1EA疎水性バリアペン 
ウサギで産生された抗PRRX1抗体Sigma-AldrichHPA051084
BSA（ウシ血清アルブミン）Sigma-AldrichA9418-50G
カセット KartellLABWARE2921
CD271 (NGF受容体) モノクローナル抗体 (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, 内皮細胞（濃縮液）クローン JC70AAgilent DakoM0823
カバーガラスFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (DAPI含有VECTASHIELD退色防止封入剤)Vector LaboratoriesH-1200-10
脱パラフィン溶液Qiagen19093
リン酸緩衝生理食塩水Thermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS, 1×）、ダルベッコ（Dulbecco）処方、カルシウム不含、マグネシウム不含
組織学的封入剤DPXSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.5 M溶液、分子生物学グレード、超純粋
包埋装置 Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn抗体 (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensemblリファレンスゲノム（GRCh38 / mm10、リリース105）EMBL-EBI翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストを入力してください。リードアライメントに使用したリファレンスゲノム。
エオシンMillipore SigmaHT110116
エタノールMillipore SigmaE7023-500ML外科用鋏
Falc Instruments B-I 組織学用ウォーターバスFalc610.1030.00
4% ホルマリン PanReac AppliChem25243113153.7% ホルムアルデヒド–臨床診断用（CE-IVD）として、pH=7に緩衝し、メタノールで安定化した4.0% w/v溶液
ガラススライド染色ラック WHEATONZ710970-3EA
ガラス製染色瓶 ブランドBR472200-10EAマスターサイクラー  50倍
グリセロールSigma-AldrichC3H8O3
ヤギ抗マウスIgG (H+L) クロス吸着二次抗体、Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 高度クロス吸着二次抗体、Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 高度クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
ヘマトキシリン Millipore SigmaMHS16
高感度RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA完全性の評価
高感度RNA ScreenTapeラダーAgilent5067-5581RNA完全性の評価
High Sensitivity RNA ScreenTape サンプルバッファーAgilent5067-5580RNA完全性評価
高解像度顕微鏡 Leica Biosystems翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。Aperio CS2スキャナー
塩酸 (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 プラットフォームIllumina20038897
Invitroge ヤギ抗ラット IgG (H+L) クロス吸着二次抗体, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
アイリス剪刀 - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009イソフルラン
炭酸リチウム Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x Genomics該当事項なしHE画像を可視化し、Visiumスポットをキュレーションするために使用されるソフトウェア。解析パイプラインによって生成された.cloupeファイルを開くことができます。
金属包埋モールドバイオオプティカ07-BM24256
顕微鏡スライドグラスアバントール631-0108Superfrost Plus マイクロスコープスライド
ミクロトーム刃羽毛**要約** 本ビデオでは、野生型および変異型Krasタンパク質を発現する細胞株を用いて、Krasタンパク質の活性状態を定量的に評価するための、プルダウンアッセイを用いた生化学的な手法を紹介します。Rasファミリータンパク質は、不活性なGDP結合型と活性なGTP結合型の間でスイッチすることで、細胞内のシグナル伝達を制御しています。本プロトコルでは、GTP結合型Rasに特異的に結合するRaf-1のRBD（Ras結合ドメイン）を利用して活性型Krasを捕捉し、ウェスタンブロッティングによってその量を定量します。これにより、Krasの活性化状態や、阻害剤による活性抑制効果を分析することが可能になります。 **キーワード** Kras, プルダウンアッセイ, GTP結合型, Ras活性化, Raf-1 RBD, ウェスタンブロッティング, シグナル伝達, 細胞溶解液
ミクロトーム HM 340EEpredia該当なしHM 340Eモデル
針BD301156BD Microlanc 3 針 21G 1インチ (25mm)
Nikon Optiphot-2ニコン71052明視野光学顕微鏡
パラフィン PanReac AppliChem256993パラフィン M.P. 55–58°C 臨床診断用可塑剤入りDMSOペレット(CE-IVD)
シャーレ CorningCLS430167-100EA
プラスチック包埋型 バイオ・オプティカ07-MP7070
ポッツ・スミス鉗子F.S.T 11012-18ピンセット
Qubit 3.0 フルオロメーターInvitrogen Q33216
QubitアッセイチューブInvitrogen Q32856
Qubit RNA HS Assay KitInvitrogen Q32855
RNaseフリー 1.5 mL マイクロ遠心チューブThermo Scientific AM12400
RNaseフリー水 メルクW4502
RNaseZap RNase除去剤Invitrogen AM9780除染溶液
RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504全RNA抽出
SCTransform (v0.3.5)Satija研究室入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。Seuratに実装されている分散安定化正規化法。
Seurat (v4.3.0.1) Satija研究室該当なしシングルセルおよび空間トランスクリプトーム解析に使用されるRパッケージ。
Space Ranger (v2.0.1)10x Genomics該当なしVisiumデータセットのデマルチプレクシング、アライメント、およびフィーチャー・バーコードマトリックスの生成に使用されるソフトウェア。
Stlimeスカルペル Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)バーゲン研究室該当なし空間トランスクリプトーム解析の可視化および統合に用いられるRパッケージ。
外科用メス刃 23番Swann-Morton210外科用メス刃
サーマルサイクラー Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455IF視覚化のためのマルチスペクトルイメージングプラットフォーム
Visium アクセサリーキット 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium 空間遺伝子発現スライドキット 4反応 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
キシレンPanreac214736キシレン、分析用異性体混合物、ACS、ISO

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