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研究記事

CCL4を、機械学習および単細胞トランスクリプトミクスによる急性心筋梗塞における潜在的な免疫代謝バイオマーカーとして

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DOI:

10.3791/72480

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2026年8月11日

 ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 2Anhui Public Health Clinical Center

この記事について

サマリー

本研究は、バルクおよび単一細胞トランスクリプトミクスを機械学習と統合し、CCL4および他の5つの遺伝子を急性心筋梗塞の潜在的な診断バイオマーカーとして特定し、免疫-代謝のクロストークおよび細胞型特異的発現パターンを明らかにします。

要約

急性心筋梗塞(AMI)は世界的に発症率と死亡率の主要な原因であり、新しい補完的バイオマーカーの必要性を浮き彫りにしています。バルクおよび単細胞トランスクリプトミックデータを機械学習手法と統合することで、AMIに関連するカルモジュリン関連遺伝子を特定し、その免疫代謝的特徴を探求しました。差異発現および加重共発現解析により、60のカルモジュリン関連遺伝子が明らかになり、そのうち6つの主要遺伝子(SOCS3、GBP4、ST14、KPNA5、STAB1、CCL4)が複数の機械学習アルゴリズムを用いてスクリーニングされ、独立したデータセットで検証されました。機能解析では、免疫、炎症、代謝経路の富が示されました。免疫浸透および単一細胞トランスクリプトミクスでは、細胞型特異的な発現パターンが認められ、CCL4は主にT細胞およびNK細胞で発現し、AMIサンプルでは著しく減少しました。qPCR検証により、局所コホートの6つの遺伝子のうち4つで有意な発現変化が確認されました。薬物-遺伝子相互作用およびドッキング解析により、さらなる研究のための候補化合物が示唆されました。総合的に見て、CCL4はAMIの診断バイオマーカーとして機能する可能性を示唆し、観察された免疫-代謝関連は将来の機構的および翻訳的研究の基盤を提供します。

概要

急性心筋梗塞(AMI)は、持続的な心筋虚血によって引き起こされ、世界で最も致死性の高い心血管疾患の一つです。その病因は多因子的であり、主な要因には動脈硬化、血栓症、冠動脈痙攣、不整脈3˒4が含まれます。高血圧、糖尿病、高脂血症、喫煙、肥満、心理的ストレスも重要なリスク要因として認識されています5.介入技術、抗血小板療法、血栓溶解戦略の進歩により短期生存率は著しく改善されましたが、特に若年層でAMIの全体的な発生率は上昇し続けています6。心臓トロポニン(cTn)は現在、AMI診断のゴールドスタンダードバイオマーカーです。これは心筋細胞壊死後に循環中に放出される構造タンパク質であり、高い感度と特異性を示します。しかし、cTnレベルは腎機能やサンプル採取のタイミングによって影響を受けることがあります。したがって、新たな補完的バイオマーカーの開発の必要性は依然として存在します。

カルモジュリン(CaM)は、小さく、広く発現し、非常に保存されたカルシウム結合タンパク質であり、細胞内でカルシウム信号の重要な伝達体として機能し、生物学的プロセス9˒10に幅広い関与しています。細胞内のCa2⁺濃度の変化を感知することで、CaMはキナーゼ、リンファターゼ、イオンチャネルなど多数の標的タンパク質と相互作用し、細胞増殖、アポトーシス、代謝、筋肉収縮、炎症反応を調節します11。心血管系において、CaMは心筋細胞の収縮力、心拍数、電気的安定性、血管平滑筋緊張度12˒13の制御において中心的な役割を果たします。蓄積された証拠によれば、CaMの機能障害やCaM関連シグナル伝達経路の調節障害が、不整脈、心不全、高血圧、心肥大(14˒15)など、いくつかの心血管疾患に寄与していることが示されています。さらに、CaMは虚血、酸化ストレス、炎症刺激に対する心筋細胞の応答にも関与しており、AMI16の病理進行に関与している可能性を示唆しています。したがって、心血管疾患の文脈でCaMを研究することは、科学的かつ臨床的に非常に重要な関心を持っています。

バルクRNA-seqおよび単一細胞RNA-seqデータセットを統合し、CaMスコアと有意に関連する差異発現遺伝子(DEG)を体系的に特定しました。加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)を用いて、AMIに関与するCaM関連候補遺伝子をさらに同定しました。その後、複数の機械学習アルゴリズムを用いて主要な遺伝子をスクリーニングし、個々のAMIリスクを評価する予測モデルを構築しました。トランスクリプトミクスの特徴、免疫浸潤プロファイル、競合する内因性RNA(ceRNA)調節ネットワークも統合され、これらの主要遺伝子が免疫調節や潜在的な薬物標的相互作用にどのように寄与するかを調査しました。これらの発見は、いくつかのコア遺伝子が免疫代謝のクロストーク経路に関与し、予測価値と治療の可能性を示すことを示しています。この統合的アプローチはAMIの分子理解を洗練させ、バイオマーカー開発と標的的介入の根拠を提供します。

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プロトコル

この調査はヘルシンキ宣言に従って実施されました。このプロトコルは2025年9月19日に安徽省公衆衛生臨床センター倫理委員会により承認されました(承認番号:PJ-YX2025-062)。採血前に全参加者から書面によるインフォームド・コンセントが取得されました。現地コホートには急性心筋梗塞(AMI)患者8名と健康な対照群8名が含まれていました。プロトコルで使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. データソースと処理

心筋梗塞に関連するバルクRNAシーケンシングデータセットはGene Expression Omnibus(GEO)から取得されました。GSE59867およびGSE48060データセットはバルクトランスクリプトミクス解析に使用され、GSE269269細胞RNAシーケンシングデータセットは細胞レベルの解析に使用されました(表1)。ヒトプロテインアトラスから255個のカルモジュリン関連遺伝子が取得され、その後の遺伝子解析が行われました。

データセットサンプルタイプサンプル(対照)サンプル(患者)シーケンスプラットフォーム
GSE59867バルクRNA-seq(バルクRNA-seq)46111GPL6244
GSE48060バルクRNA-seq(バルクRNA-seq)2131GPL570
GSE269269scRNA-seq(末梢血)10GPL24676

表1:研究で使用されたデータセットの特徴。 この表は、バルクRNAおよび単一細胞RNAシーケンシングデータセットのデータセットのアクセス番号、サンプルタイプ、対照および患者サンプル数、シーケンスプラットフォームを一覧にしています。RNAシークエンス、RNAシーケンシング;scRNA-seq、単一細胞RNAシーケンシング。

大量トランスクリプトミックデータセットのサンプル間変動は、limmaパッケージバージョン3.60.6のnormalizeBetweenArrays関数を用いて補正されました。その後、リマを用いた差異遺伝子発現解析が行われました。差分発現遺伝子(DEGs)は、閾値 P <0.05および|log₂フォールド変化|> 0.5。得られたDEGは火山プロットとヒートマップを用いて可視化され、有意に上位化された、有意に下位化されている、または有意に変化しないと分類されました。

2. 単一サンプル遺伝子セットの濃縮解析および加重遺伝子共発現ネットワーク解析

255個のカルモジュリン関連遺伝子を用いて単一サンプル遺伝子セット濃縮解析(ssGSEA)を実施しました。GSVAパッケージは、各AMIおよび対照サンプルに対してカルモジュリン関連遺伝子スコア(Calmodulin_score)を算出するために使用されました。AMI群と対照群間のCalmodulin_scoreの違いはウィルコクソンランク和検定を用いて評価されました。

加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)は、AMI患者のバルクトランスクリプトミックデータを用いて実施されました。100万回のマッピングリードあたりの平均断片数が転写本1キロベースあたり≤0.5の遺伝子は除外しました。サンプルをクラスタリングして異常値を特定し除去しました。

スケールフリートポロジーフィットR² >0.8を達成したソフト閾値検出力が選ばれました。その後、位相的重複行列が構築されました。遺伝子モジュールは動的木切りアルゴリズムを用いて、最小モジュールサイズは200で特定されました。非常に類似した固有遺伝子を持つモジュールは、相関閾値>0.75、加群マージ閾値0.25に対応してマージされました。

モジュール固有遺伝子と臨床特性(Calmodulin_scoreを含む)との関係は、ピアソン相関解析を用いて評価されました。得られたモジュール-特性関係は、相関係数と対応するP値で注釈付きヒートマップに表示されました。各遺伝子ごとにモジュールメンバーシップおよび遺伝子有意性が計算されました。モジュール所属と遺伝子有意性の散布図を作成し、高いモジュール内連結性と形質関連性を持つ遺伝子を特定しました。

3. AMI関連カルモジュリン関連遺伝子の同定

AMI関連カルモジュリン関連遺伝子は、DEGsとWGCNAモジュールの遺伝子を交差させることで同定され、Calmodulin_scoreと有意に相関しました。重なり合う遺伝子は下流解析のために保持されました。

機能的濃縮解析はclusterProfilerパッケージを使用して実施されました。遺伝子オントロジーと京都遺伝子・ゲノム百科事典の注釈を用いて、重なり合う遺伝子に関連する生物学的プロセス、分子機能、細胞構成要素、シグナル伝達経路を特定しました。

4. 機械学習を用いた主要遺伝子の同定と検証

重複遺伝子を用いて単変量ロジスティック回帰解析を実施しました。その後、ランダムフォレスト、XGBoost、サポートベクターマシンの3つの機械学習アルゴリズムを独立して適用しました。

各アルゴリズムはAMIの予測値を持つ遺伝子を優先順位付けするために用いられました。候補キー遺伝子は、3つのアルゴリズムすべてによって特定された遺伝子として定義されました。GSE59867訓練データセットおよびGSE48060外部検証データセットの両方で有意かつ方向性一貫した差異発現を示す遺伝子は最終的なキー遺伝子として保持されました。

5. 診断モデルの構築と評価

同定された主要遺伝子とLRM関数を用いてロジスティック回帰モデルを構築しました。レグプロット関数を用いて、各特徴遺伝子がAMIの予測確率にどれだけ寄与するかを示すノモグラムが作成されました。

モデルの識別力は、pROCパッケージを用いた受信者の動作特性解析によって評価されました。受信者の動作特性曲線下の面積を計算し、AMIと対照サンプルを区別する能力を評価するために行われました。

予測確率と観察結果を比較するためにキャリブレーション曲線を作成しました。意思決定曲線解析を用いて、閾値確率の範囲にわたるモデルの純臨床的利益を推定しました。

6. 遺伝子セットの濃縮解析と競合する内因性RNAネットワーク構築

遺伝子セットの濃縮解析は、各キー遺伝子に対して、遺伝子相関行列とclusterProfilerパッケージを用いて別々に実施されました。京都遺伝子・ゲノム百科事典経路の濃縮結果は、絶対正規化濃縮スコアでランク付けされました。各遺伝子ごとに5つの最上位の経路が表示されました。

機能的連合および遺伝子相互作用ネットワークはGeneMANIAを用いて調査されました。主要遺伝子の潜在的なmicroRNA調節因子はmiRanda、miRTarBase、TargetScan、miRDBを用いて予測されました。候補マイクロRNA-mRNA相互作用は、4つのデータベースからの予測を交差させることで同定されました。

spongeScanから長く非コード化されたRNA-microRNA相互作用が得られました。その後、長い非コードRNA-microRNAおよびmicroRNA-mRNAの関係を統合し、競合する内因性RNA調節ネットワークを構築しました。ネットワークはggalluviaパッケージを用いてサンキー図として可視化されました。

7. 薬物予測と分子ドッキング

薬物-遺伝子相互作用は薬物-遺伝子相互作用データベースを用いて予測されました。得られたインタラクションネットワークはネットワーク解析ソフトウェアを用いて可視化されました。

CCL4のUniProtタンパク質識別子はP13236として取得されました。対応する三次元タンパク質構造は、1HUM(ヒトMIP-1β、X線回折構造)の登録番号1HUM(PDB)で取得され、ドッキングのために選ばれました。生物学的に重要なモノマーを表す鎖Aがドッキングのために選ばれました。タンパク質の調製はCB-Dock2のPrepare Proteinモジュールを用いて行われ、水分子の除去、極性水素の添加、ガスタイガー電荷の割り当てが含まれます。候補化合物(クロドロン酸およびエポエチン・アルファ)の三次元化学構造は、PubChemデータベースから構造データファイル(SDF)形式で取得されました。ドッキングシミュレーションは、AutoDock Vinaアルゴリズムを用いたブラインドドッキング用のCB-Dock2オンラインプラットフォームを使用して実施されました。ドッキング部位はタンパク質表面全体を覆うように設定され、潜在的な結合ポケットを偏りなく同定できるようになった。結合親和度は予測自由結合エネルギー(ΔG)をkcal/mol単位で計算しました。最終ドッキングポーズやタンパク質-リガンド相互作用(例:水素結合、疎水性接触)は、PyMOLおよびCB-Dock2内蔵のインタラクションビューアを用いて可視化されました。

8. 単細胞RNAシーケンシングデータ前処理

品質管理は、下流の単一細胞RNAシーケンシング解析の前に実施されました。検出された遺伝子の数が200から10,000の間、一意分子識別子の総数が≥1,000、ミトコンドリア転写産物の割合が≤20%であった場合、細胞は保持されました。
200個未満の遺伝子発現細胞や3つ未満の細胞で検出された遺伝子は除外されました。これらのフィルターは、低品質セルや技術的なノイズの含有を減らすために適用されました。遺伝子発現値はSeuratパッケージ内のNormalizeData関数を用いて正規化されました。FindVariableFeatures 関数を用いて高変異遺伝子が同定されました。高度に変動する遺伝子の発現値はScaleData関数を用いて中央化・標準化されました。

実験的またはシーケンスの変動に関連するバッチ効果は、Harmony積分フレームワークのRunHarmony関数を用いて補正しました。

9. 単一セルの次元削減、クラスタリング、注釈

主成分解析は、単細胞RNAシーケンシングデータセットの次元性を下げるために初めて適用されました。その後、一様多様体近似と射影、そしてt分布確率的近傍埋め込みを用いて細胞内の異質性を可視化しました。

転写的に類似した細胞は、SeuratのFindNeighborsおよびFindClusters関数を用いてグループ化しました。各クラスターの差異発現マーカー遺伝子は、FindAllMarkers関数を用いて、各クラスターと残りのすべてのクラスターを比較することで同定しました。

細胞型は、出版文献や確立された細胞マーカーデータベースから得られた標準的なマーカー遺伝子を用いて割り当てられました。主要遺伝子の空間分布および発現レベルはFeaturePlot関数18を用いて可視化されました。

10. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析

安徽省公衆衛生臨床センターで、AMI患者8名と健康対照8名から末梢血液サンプルを採取しました。AMI群には、心筋梗塞の第四普遍定義に基づき診断され、心筋虚血と一致する症状と99パーセンタイルの上限を超えた心トロポニンIレベルが上昇した患者が含まれていました。対照群は、心血管疾患の既往がなく、心電図も正常で、通常の血液検査、肝機能、腎機能に異常がない年齢および性別が一致した健康な個人で構成されていました。AMI患者については、入院後24時間以内にエチレンジアミネテトラ酢酸抗凝固血液3mLを採取しました。同じ量は、対応する研究期間中の健康対照群からも収集されました。

血液RNA分離キットに付属していたプロトコルに従い、末梢血から総RNAを単離しました。RNA濃度と純度はナノドロップ分光光度計を用いて評価され、アガロースゲル電気泳動によってRNAの完全性が検証されました。その後の解析には、A260/A280比率が1.8から2.1のサンプルのみが使用されました。合計500 ngのRNAが第一鎖相補DNA合成試薬を用いて補完的なDNAに逆転写されました。得られた相補的なDNAは希釈され、最終濃度は150 ng/mLにされました。定量ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、受動的参照染料なしのSYBR Greenベースのマスターミックスを用いて、総反応体積10μLで実施されました。すべてのqPCR反応は技術的重複で2回実施され、その後の計算は平均Ct値に基づいて行われました。

増幅はリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応装置を用いて行われました。サイクル条件は、95°Cで5分間の初期変性、その後95°Cで10秒間の変性40サイクル、60°Cで30秒のアニーリング、72°Cで30秒の伸長で構成されていました。増幅後に溶融曲線解析が行われました。

遺伝子発現レベルはβアクチンに正規化されました。相対発現は2−ΔΔCt 法を用いて計算されました。

11. 統計解析

統計解析はRで行われ、ネットワーク可視化はネットワーク解析ソフトウェアを用いて生成されました。特に指定がない限り、2つのグループ間の差異はウィルコクソン検定を用いて評価されました。正規分布を持つ連続変数はStudentのt検定を用いて比較されました。正規分布でない連続変数は、ウィルコクソンランク和検定とも呼ばれるマン・ホイットニーU検定を用いて比較されました。すべての統計検定は両側のものでした。P値は<0.05と統計的に有意とされました。

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結果

AMIに関連するカルモジュリン関連遺伝子の同定および濃縮解析
GSE59867データセットに対しては、クロスサンプル比較性を確保するためにバッチ効果補正が最初に実施されました(図1A)。その後、合計168の差異発現遺伝子(DEGs)が同定され、そのうち77は上位化、91はダウンレギュレーション(下位化)遺伝子で、対照群と比較して含まれます(図1B)。単一標本遺伝子セット濃縮解析では、Calmodulin_scoreがAMI群と対照群間で有意に異なることが示されました(図1C)。

加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)を用いて共発現ネットワークを構築しました。ソフトしきい値の検出力は、スケールフリー位相の基準(R² ≈ 0.8)に基づいてβ = 17に設定されました(図1D)。モジュールは固有...

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ディスカッション

急性心筋梗塞(AMI)は急性冠動脈閉塞によって引き起こされ、心筋虚血壊死や世界的に高い罹患率および死亡率を引き起こします。カルモジュリンはカルシウム依存性調節タンパク質で、細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たします。過去の研究では、カルモジュリンが心筋細胞のアポトーシス、炎症反応、カルシウム恒常性をAMI中に調節することが示されており、AMIの病因に重要な分子である可能性が示唆されています。本研究では、3つの独立したデータセットで60のカルモジュリン関連差異発現遺伝子が同定され、加重遺伝子共発現ネットワーク解析を用いてAMI関連遺伝子モジュールを特定し、最終的に候補遺伝子セットを6つの主要遺伝子に絞り込みました。複数の機械学習モデルがその診断価値を確認し、さらにGSE48060データセットの発現傾向によって支持されました。遺伝子セットの濃縮解析により、これらの遺伝子は主に免疫および代謝関連経路に富集していることが明らかになりました。免疫浸潤解析では、AMI患者の免疫細胞群、特にT細胞や自然殺菌細胞に顕著な異常が認めら...

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究は安徽医科大学研究基金(助成金番号2022xkj059)および安徽省トランスレーショナル医学研究所(助成金番号2021zhyx-C71)の支援を受けました。著者たちは、この研究を支援してくださったすべての同僚に感謝の意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
β-actin primerTsingkeN/AForward: 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′
Reverse: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′
calibratermsN/AParameters: lrmModel, method = "boot", B = 1000
CB-Dock2CB-Dock2 ServerOnline toolhttps://cadd.labshare.cn/cb-dock2/
CCL4 primerTsingkeN/AForward: 5′-CTGTGCTGATCCCAGTGAATC-3′
Reverse: 5′-TCAGTTCAGTTCCAGGTCATACA-3′
CIBERSORTStanford UniversityOnline toolParameters: function(sig_matrix, mixture_file, perm = 0, QN = TRUE)Spearman correlation analysis was performed between immune-cell abundance and gene expression.
clusterProfilerBioconductor4.12.6https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
CytoscapeCytoscape Consortium3.9.1https://cytoscape.org/
Drug-Gene Interaction DatabaseDGIdbOnline databasehttps://www.dgidb.org/
Gene Expression OmnibusNCBIOnline databasehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Gene Ontology databaseGene Ontology ConsortiumOnline databasehttp://geneontology.org/
GeneMANIAUniversity of TorontoOnline toolhttps://genemania.org/
GBP4 primerTsingkeN/AForward: 5′-AGGCTGCTAAAACACAAGCTG-3′
Reverse: 5′-CCCCAGGTAGAGTGACAATCAT-3′
ggalluvialCRAN0.12.5Sankey diagram generation
GSVABioconductor1.52.3Parameter: P < 0.05
Harmony integration frameworkCRAN1.2.0https://github.com/immunogenomics/harmony
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMixYEASEN11141ES10Reverse-transcription reagent
Hieff qPCR SYBR Green Master MixYEASEN11201ESqPCR reagent
Human Protein AtlasHuman Protein Atlas ConsortiumOnline databasehttps://www.proteinatlas.org/
KPNA5 primerTsingkeN/AForward: 5′-TCAAGAGATGCGTAGACGAAGA-3′
Reverse: 5′-ACATTTCTGCGTTTGAACAACTG-3′
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes databaseKanehisa LaboratoriesOnline databasehttps://www.kegg.jp/
LightCycler 480 Instrument IIRocheLightCycler 480 IIReal-time PCR instrument
limmaBioconductor3.60.6Differentially expressed gene screening
lrmrmsN/AParameters: Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, maxit = 100
miRandaMicroRNA.orgOnline toolhttp://www.microrna.org/microrna/home.do
miRDBmiRDBOnline toolhttp://mirdb.org/
miRTarBaseNational Chiao Tung UniversityOnline databasehttps://mirtarbase.cuhk.edu.cn/
Protein Data BankRCSBOnline databasehttps://www.rcsb.org/
PubChemNCBIOnline databasehttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOLSchrödinger, LLC2.5.4Visualization of molecular docking results
pROCCRAN1.18.5Receiver operating characteristic curve generation and visualization
Random forest packageCRAN3.3.1Parameters: ntree = 100, seed = 200
R softwareR Foundation4.2.2Bioinformatics and statistical analyses
regplotCRAN1.1Parameters: glm(Status ~ gene, family = binomial(), data = merged_data)lrm(Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, maxit = 100)
rmdaCRAN1.6Parameters: decision_curve(Type ~ SOCS3 + GBP4 + ST14 + KPNA5 + STAB1 + CCL4, data = aSAH, family = binomial(link = "logit"), thresholds = seq(0, 1, by = 0.01), confidence.intervals = 0.95)
RNA isolater MolPure Blood RNA KitYEASEN19241ES50RNA isolation kit
SeuratSatija Lab5.1.0Marker genes used for cell annotation:Monocytes: FCN1, S100A9, S100A8B cells: CD79B, MS4A1T cells: LDHB, CD4, CD3DNK cells: FGFBP2, GZMB, NKG7, KLRD1Megakaryocytes: CD163, CD36, PF4, PPBPBlood cells: ALAS2, AHSP, CA1Plasma cells: IGHA1, CD79A, MZB1, JCHAINDendritic cells: HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DQB1Mast cells: FCER1A, MS4A2
SOCS3 primerTsingkeN/AForward: 5′-CCTGCGCCTCAAGACCTTC-3′
Reverse: 5′-GTCACTGCGCTCCAGTAGAA-3′
spongeScanspongeScanOnline toolhttp://spongescan.rc.ufl.edu/
ST14 primerTsingkeN/AForward: 5′-TTCCTGCCAGTCAACAACGTC-3′
Reverse: 5′-GGTACTGCAAATGCCACACC-3′
STAB1 primerTsingkeN/AForward: 5′-CCGGGAAATCCTTACCACAGC-3′
Reverse: 5′-ACCTTCGTGTTTGTTGGGTCC-3′
Support vector machine packageCRAN1.7-13Parameters: input, k = 10, halve.above = 100
survminerCRAN0.5.0Survival curve plotting
TargetScanTargetScanOnline toolhttp://www.targetscan.org/
UniProtUniProt ConsortiumOnline databasehttps://www.uniprot.org/
Weighted gene co-expression network analysis packageCRAN1.73Parameters: R² > 0.8, minModuleSize = 200
XGBoost packageCRAN1.7.8.1Parameters: nrounds = c(50, 200), max_depth = c(3, 8), eta = c(0.01, 0.3)

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