本プロトコルでは、慢性予測不能軽度ストレス誘発性うつ病マウスモデルを用い、行動学的評価、組織学的評価、および神経細胞ネクロプトーシスの分子生物学的評価によるModified Xiaoyao Sanの評価方法を実演します。
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この記事について
サマリー
要約
神経細胞の喪失と損傷はうつ病の重要な病理学的特徴であり、ネクロプトーシスが神経細胞死の潜在的なメカニズムとして提案されています。Gene Expression Omnibus (GEO) データセット（GSE54565、GSE54566、およびGSE54568）の解析により、うつ病とネクロプトーシスとの関連が特定され、この経路の抑制が潜在的な治療戦略となる可能性が示唆されました。伝統的な中薬である逍遙散の修正処方である加味逍遙散 (MXYS) は、治療効果を向上させるために、清熱、涼血、認知機能改善、および救急促進の生薬を配合して開発されました。しかし、神経細胞のネクロプトーシスに対するその効果や、脳組織に到達する有効成分については依然として不明です。超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析 (UHPLC-HRMS) を用いて、脳組織で検出されたMXYSの成分を暫定的に同定しました。治療効果は、行動評価、組織学的検査、免疫蛍光染色、ウェスタンブロッティング、およびバイオインフォマティクス解析を用いて、慢性不可予測軽度ストレス (CUMS) によるうつ病マウスモデルで評価しました。MXYSの投与は、うつ様行動の改善、病理的な脳損傷の軽減、およびreceptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) とmixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) のリン酸化の抑制に関連していました。これらの知見は、MXYSが神経細胞のネクロプトーシスマーカーの減少に関連した抗うつ様効果を発揮することを示唆しており、うつ病の潜在的な治療戦略としてのMXYSのさらなる研究に対する実験的な根拠を提供します。
概要
気分障害のスペクトラムにおける深刻な精神疾患であるうつ病は、主に持続的な気分の落ち込みを特徴とし、複数の要因に影響されます1。臨床的に、うつ病患者は一般に、抑うつ気分、認知機能の低下、言語的コミュニケーションや身体活動の減少、そして重症の場合には自傷行為や自殺念慮などの症状を示します2。高い有病率、再発率、障害率、および自殺率のため、うつ病は世界的に主要な障害原因となっており、多大な社会的・経済的負担を強いています3。世界保健機関（WHO）によれば、うつ病は2030年までに、がんや心血管・脳血管疾患を上回り、世界の疾病負荷の最大の要因になると予測されています3。加えて、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックは、大うつ病性障害の世界的な有病率を27.6%増加させました4。中国におけるうつ病の年間有病率は3.6%であり、生涯有病率は6.8%です5。うつ病の病態生理は、その複雑な病因と複数の寄与要因のため、完全には解明されていません。その結果、治療の選択肢は限られたままであり、現在利用可能な抗うつ薬への反応が不十分であるため、患者の約30%～40%に治療抵抗性うつ病が発症します6。さらに、既存の抗うつ薬に伴う効果発現の遅れ、残留症状、神経毒性、および副作用が、引き続き重大な治療上の課題となっています7。
プログラム細胞死は、長年にわたり生物医学研究の主要な焦点となってきました。うつ病がネクロプトーシスに関連していることを示す証拠が増えています8,9,10,11。ネクロプトーシスは、アポトーシスと同様にプログラム細胞死の一形態ですが、アポトーシスとは異なり、顕著な免疫応答および炎症反応を誘発します12。caspase-8の活性がない状態で、腫瘍壊死因子-α (TNF-α) が腫瘍壊死因子受容体1 (TNFR1) に結合すると、受容体相互作用性プロテインキナーゼ1 (RIPK1) が活性化されます13。活性化されたRIPK1は、受容体相互作用性プロテインキナーゼ3 (RIPK3) と相互作用してネクロソーム複合体を形成し、続いて混合リネージキナーゼドメイン様タンパク質 (MLKL) を活性化します14。オリゴマー形成後、MLKLは細胞質から細胞膜へと移行し、細胞小器官の腫脹15,16、細胞膜の完全性の喪失、およびダメージ関連分子パターン (DAMPs) やTNF-α、インターロイキン (IL)-1、IL-6などの炎症性メディエーターを含む細胞内物質の放出を引き起こし、それによって炎症反応を悪化させます17。ネクロプトーシスは、多発性硬化症、うつ病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む多くの炎症性および神経変性疾患に関与しているとされています18,19,20。プロテオーム解析により、慢性予測不能軽度ストレス (CUMS) 誘発性のうつ病は、RIPK3およびMLKLの発現増加とネクロプトーシス経路の活性化に関連していることが示されています2。別のCUMSうつ病マウスモデルにおいて、フルオキセチンはRIPK1媒介性ネクロプトーシスの抑制に関連する抗うつ様効果を示しました10。さらに、ネクロプトーシス阻害剤であるNec-1sは、リポポリサッカライド (LPS) 誘発性のうつ様行動を改善することが示されています21。神経損傷はうつ病の重要な病理学的特徴であるため、ネクロプトーシスを標的とすることは、うつ病治療のための有望な治療戦略となる可能性があります。
中医学（TCM）には、うつ病を治療してきた長い歴史があります。中医学の理論によれば、肝は気の自由な流れを司っており、したがって、うつ病は主に情動的なストレスによる肝気鬱結に起因するとされます。そのため、主たる治療戦略は肝を疎通させ、鬱を解消することです。逍遥散（XYS）はこの目的で広く用いられている古典的な漢方処方であり、うつ病の治療における適用を支持する広範なエビデンスが存在します22。さらに、XYSは抗ネクロプトーシス特性を有することが報告されています23,24。「肝鬱化火」および「清陽上行」という中医学の概念に基づき、清熱涼血を目的として牡丹皮（Mudan Pi）と栀子（Zhizi）を加え、さらに認知機能の促進と精神の覚醒を目的として石菖蒲（Shi Changpu）と遠志（Yuan Zhi）を加えることで、XYSを改良しました。この処方は加味逍遥散（MXYS）と命名され、中医学の原則に基づき治療効果を高めるために開発されました。ただし、本研究では元のXYS処方との直接的な比較は行っていません25。臨床研究により、MXYSの抗うつ効果が実証されており26,27,28、その治療効果は視床下部-下垂体-副腎（HPA）系の調節および神経炎症の抑制に関連している可能性があります29,30,31。しかしながら、MXYSがニューロンのネクロプトーシスの抑制に関連しているかどうかは依然として不明です。
本研究では、超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析（UHPLC-HRMS）を用い、脳組織で検出されたMXYS由来化合物の暫定的な同定を行った。公開されているGene Expression Omnibus（GEO）データセットおよび、加重遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA）、発現変動解析、濃縮解析を含むバイオインフォマティクス解析を用い、MXYS、うつ病、およびネクロプトーシスの間の関連性を調査した。これらの知見に基づき、我々はMXYSが神経細胞のネクロプトーシスマーカーの減少に関連した抗うつ様効果を及ぼし、その相関メカニズムの候補としてactivating transcription factor 4 (ATF4)/cAMP response element-binding protein (CREB)/brain-derived neurotrophic factor (BDNF)経路が関与しているという仮説を立てた。この仮説を検証するため、UHPLC-HRMSを用いて脳組織で検出された化合物を暫定的に同定し、バイオインフォマティクス解析により潜在的な治療標的を特定し、さらにin vivo実験によってMXYS投与がネクロプトーシスマーカーおよびATF4/CREB/BDNF経路の変化に関連しているかを確認した。これらの結果は、元のXYS処方との比較研究および用量反応性の検証が必要であることを認めつつ、うつ病に対するMXYSの潜在的な治療応用の可能性を支持する予備的な根拠を提供するものである。
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プロトコル
動物実験は、河南省中医学大学の動物倫理委員会（承認番号：DWLLGZR2022023）の承認を得て実施されました。すべての手順は、動物福祉に関する機関および国のガイドラインに従い、ARRIVEガイドラインに準拠して行われました。雄のSprague–Dawley (SD)ラットを認可された実験動物供給業者から入手しました。動物は、温度と湿度が制御された環境下で12時間の明暗サイクルで飼育し、標準的な飼料と水を自由摂取させました。
MXYSに含まれる脳組織含有成分の同定
凍結乾燥MXYS粉末の調製：
MXYSの1種類の生薬を蒸留水の10倍量に2時間浸漬した後、40分間煮出した。ペパーミントは煎出の最後の5分間に添加した。同様に、蒸留水の8倍量を用いて2回目の煎出を行った。これら2回の煎出液を合わせ、ガーゼでろ過し、減圧濃縮して濃度を1 g/mL（原薬換算）にし、真空下で48時間凍結乾燥させて、凍結乾燥MXYS粉末を得た。抽出収率は21.7% (w/w)25,29,31であった。
動物およびMXYSの投与：
12匹のオスSDラットをランダムに2群に分け、MXYSまたは精製水を1日2回、経口投与した。1日の2回の投与は、午前8時と午後8時（12時間間隔）に実施した。MXYS粉末を精製水に溶解し、24.4 g/kg（ラットにおける臨床用量の約2倍）で投与した25。対照群には、同量の精製水（10 mL/kg）を投与した。
MXYS含有脳組織の調製：
14日後、最終回のMXYS投与から2時間後に、すべてのラットをペントバルビタールナトリウム（40 mg/kg、腹腔内投与）で麻酔した。生理食塩水による経心腔灌流後、脳組織を採取した。全脳を直ちに摘出し、氷上に置いて、ブランクの脳組織およびMXYS処理脳組織のサンプルを得た。
クロマトグラフィー/質量分析条件およびデータベース：
凍結乾燥MXYS粉末、MXYS粉末を添加したブランク脳組織、ブランク脳組織、およびMXYS含有脳組織抽出物を、35°Cに維持したHSS-T3カラム（10 × 2.1 mm, 1.8 μm）を備えた超高性能液体クロマトグラフィーシステムを用いて分析した。移動相は、0.1%ギ酸含有水（移動相A）および0.1%ギ酸含有アセトニトリル（移動相B）で構成した。サンプルは、0.3 mL/minの流速で、5% Bを1分間、16分かけて98% Bまで増加、0.5分で5% Bに戻し、5% Bで2.5分間保持するグラジエントを用いて分離した。
質量スペクトルは、データ依存性解析（data-dependent acquisition）を用い、m/z 範囲 90–1,300 で、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードの両方で取得した。MS/MS スペクトルは、強度の高い上位 10 個の前駆イオンから、20、40、および 60 eV の段階的高エネルギー衝突解離（stepped higher-energy collisional dissociation）を用いて生成した。キャピラリー温度は 320°C に維持し、プローブヒーター温度は 350°C に設定した。
化合物の同定は、正確な質量、同位体分布、およびMS/MSスペクトルを、自社の中薬データベースならびに、公開データベースであるGNPS32、ReSpect3、MassBank34と照合することで行った。信頼性の高いMS/MSマッチングが得られ、クロマトグラムのピーク形状が一致した化合物を採用した。暫定的に同定された化合物の全リストは、補足表1に記載している。
バイオインフォマティクス
GEOデータベースからのデータセット選択および前処理：
うつ病の病理におけるネクロプトーシスの関与の可能性を調べるため、「depression（うつ病）」というキーワードを用いてGEOデータベースを検索した。選択基準に基づき、さらなる解析のために3つのデータセット（GSE5456、GSE54565、およびGSE54568）を特定した。これらのデータセットは異なる脳領域に由来しており、GSE54565は前帯状皮質、GSE5456は扁桃体、GSE54568は背外側前頭前皮質（BA9）である。すべてのデータセットはAffymetrix Human Genome U13 Plus 2.0 Arrayプラットフォーム（GPL570）を用いて作成され、大うつ病性障害（MDD）患者および非精神疾患対照群の死後脳組織サンプルで構成されていた。各データセットの詳細なサンプル特性は、付録表2にまとめられている。これらのデータセットは、うつ病に関与する3つの脳領域からのトランスクリプトームデータで構成されていた。各データセットについてMDD群と対照群の間で遺伝子発現変動解析を行い、一貫して発現が上昇または低下している遺伝子をRobust Rank Aggregation（RRA）Rパッケージを用いて統合した。
すべてのデータセットは、バックグラウンド補正および正規化のために、robust multi-array average（RMA）アルゴリズムを用いて前処理されました。RMA正規化の後、データセット間のバッチ効果を調整するために、sva Rパッケージに実装されているComBatアルゴリズムを適用し、データセットの由来をバッチ共変量として扱いました。この手順により、データセット間の技術的変動が軽減され、下流解析における比較可能性が向上しました。
バイオインフォマティクス解析は、Rソフトウェア（バージョン 4.2.1）を用いて実施した。主なRパッケージとして、Gene Ontology (GO) および Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) の濃縮解析用のClusterProfiler（バージョン 4.8.2）、加重遺伝子共発現ネットワーク解析用のWGCNA（バージョン 1.72）、差分発現遺伝子の統合用のRRA、およびComBatバッチ補正用のsva（バージョン 3.48.0）を使用した。解析ワークフローは、データの取得、RMA正規化、ComBatバッチ補正、RRA統合を用いた差分発現解析、WGCNAモジュールの構築、偽発見率 (FDR) < 0.05 でのGOおよびKEGG濃縮解析、ならびにタンパク質-タンパク質相互作用 (PPI) ネットワーク解析を用いたターゲット予測で構成した。
WGCNAを用いた共発現遺伝子ネットワークの構築、およびうつ病とネクロプトーシスに有意に関連するモジュールの同定：
WGCNAでは、スケールフリートポロジーを近似するためにソフトしきい値パワー（β値）を適用し、重み付き遺伝子共発現ネットワークを構築します。β値は、log(k)とlog(p(k))の相関係数が少なくとも0.9に達した時点で選択しました。β値の選択後、ダイナミックツリーカット法を用いて遺伝子モジュールを同定しました。その他のパラメータは、minModuleSize = 30、cutHeight = 0.25、deepSplit = 2と設定しました。β値は、log(k)とlog(p(k))の相関係数が少なくとも0.9に達した時点で選択しました。ネットワーク構築には、ソフトしきい値パワー β = 7 を使用しました。各モジュールの遺伝子発現パターンを要約し、生物学的特性との関連性を評価するために、モジュール固有遺伝子（ME）を算出しました。続いて遺伝子有意性（GS）およびモジュールメンバーシップ（MM）を算出し、相関係数（cor）および対応するp値を用いて、モジュールと特性の相関関係を評価しました。相関係数が高く、p値が低いほど、遺伝子モジュールと生物学的特性との関連性が強いことを示します。
機能濃縮解析およびPPIネットワークの構築：
KEGGパスウェイ濃縮解析にはClusterProfilerを使用した。多重検定補正にはBenjamini–Hochberg FDR法を適用し、補正後p値（FDR）< 0.05を統計的に有意とみなした。ターゲットモジュールを特定した後、モジュール内の主要遺伝子と、MXYSおよびネクロトーシスに関連する遺伝子との交差抽出を行った。その後、STRINGデータベースを用いてPPIネットワークを構築した。
脳組織で検出された化合物の標的予測：
MXYS投与後のラット脳組織において暫定的に同定された143個の化合物を用いて、ターゲット予測を行った。各化合物について、GeneCardsデータベースのRelated Targets機能を用い、関連性スコアに基づき潜在的なターゲットを抽出した。 > 5. 重複するターゲットを統合し、公式のジーンシンボルを持つヒト遺伝子のみを抽出した結果、3,164個のユニークなターゲットが得られた。これらのターゲットに対して、ClusterProfiler Rパッケージを用いてGOおよびKEGG濃縮分析を行い、FDR（偽発見率）を < 0.05を統計的に有意と見なした。背景遺伝子セットは、KEGGデータベースにアノテーションされているすべてのヒトタンパク質コード遺伝子で構成した。
実験的検証
細胞培養：
HT-2細胞はProcell Life Science & Technology Co., Ltd.（CL-0697, RRID: CVCL_0321）から入手し、10% 胎児ウシ血清（FBS）および 10 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した増殖培地で培養した。細胞は、37°C、5% CO₂ の加湿インキュベーター内で維持した。
MXYSの抗ネクロプトーシス活性：
凍結乾燥したMXYS粉末を細胞増殖培地で1.0 g/mLの濃度に再構成し、0.2 μmメンブレンフィルターで滅菌後、使用まで−20°Cで保存した。HT-2細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり8,0個の密度で播種し、1群あたり3ウェルとした。MXYSを増殖培地で希釈し、最終濃度を2, 4, および 6 mg/mLとした。12時間培養後、細胞をSM-164 hydrochloride (10 nM) およびカスパーゼ阻害剤z-VAD-fmk (20 μM) で30分間処理し、続いてヒト腫瘍壊死因子-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) でさらに12時間刺激した。細胞生存率は、製造者の指示に従い、ルミネッセンス細胞生存率アッセイを用いて評価した。ルミネッセンスはマイクロプレートリーダーで測定した。細胞形態を倒立顕微鏡下で観察し、解析用に代表的な画像を取得した。
動物：
動物実験は、河南省中医学大学の動物倫理委員会の承認（承認番号：DWLLGZR202023）を得て実施した。すべての手順は、動物福祉に関する施設内および国家のガイドラインに従い、ARRIVEガイドラインを遵守して行われた。CUMSモデルの構築には、6～8週齢の雄性BALB/cマウスのみを使用した。動物は、温度と湿度が制御された環境下で、12時間の明暗サイクルにて飼育し、標準的な飼料と水を自由摂取させた。
CUMS誘発うつ病モデル：
マウスをコントロール群またはCUMS群にランダムに割り付けた。1週間の馴化後、CUMS群のマウスには間欠的かつ予測不能な軽度ストレスを負荷し、コントロール群のマウスはそのまま維持した。ストレスパラダイムは、ケージの傾斜、ケージの揺動、ケージの交換、濡れた敷材、水制限、ストロボ照明、騒音曝露、持続光、持続暗黒、間欠照明、冷水泳(4°C)、温水泳泳(40°C)、拘束ストレス、およびその他の軽度ストレスを含む13種類の異なるストレス要因で構成した。予測不能性を維持するため、各ストレス要因をランダムな順序で1セッションあたり2–6 h適用した。マウスには、ランダムなスケジュールに従い、毎日1つまたは2つの異なるストレス要因を曝露させた。
群分けおよび薬剤投与：
6週間のCUMS曝露後、マウスをCUMS群、MXYS群、パロキセチン群、またはNec-1投与群にランダムに割り当てた。MXYS群には、凍結乾燥MXYS粉末を35.2 g/kg/dayの用量で経口投与した。パロキセチン群にはパロキセチン（20 mg/kg）を経口投与し、Nec-1群にはNec-1（10 mg/kg）を腹腔内投与した。これらの投与を4週間連続で実施した。同時期に、対照群およびCUMS群には、同量の生理食塩水を経口投与した。
行動実験：
薬剤投与の開始前に、コンピュータで生成された乱数を用いて、マウスをランダムに実験群に割り付けた。このランダム化シークエンスは、その後の実験やデータ解析に関与しない独立した研究者によって作成された。
行動テストは、処置群について盲検化された研究者によって実施されました。主観的なバイアスを最小限に抑えるため、同一の研究者が自動トラッキングソフトウェアを用いて、ビデオベースの行動スコアリング（不動時間、移動距離、および中央領域での滞在時間）を行いました。盲検化された研究者は、すべての行動データが収集および記録されるまで、群割り当てコードへのアクセスを禁止されていました。
免疫蛍光解析は、実験グループについて盲検化された別の研究者によって実施されました。サンプルにはコード化された識別子が割り当てられ、グループの割り当ては、デンシトメトリーまたは蛍光強度の測定が完了した後にのみ開示されました。統計解析は、すべての定量データが集計されるまで、グループの割り当ておよび対応する実験結果の両方について盲検化された第三の研究者によって行われました。
ショ糖嗜好性テスト（SPT）： 最終的な薬剤投与後に、行動試験を実施した。試験前に、マウスに1%スクロース溶液を投与して順化させた。まず、1%スクロース溶液を入れた2本のボトルを12時間提供し、続いて1%スクロース溶液を入れたボトル1本と飲料水を入れたボトル1本をさらに12時間提供した。その後、正式な試験前に、マウスを12時間絶食・絶水させた。試験中、各マウスに1%スクロース溶液を入れたボトル1本と飲料水を入れたボトル1本を提供した。12時間後、各ボトルから消費された液量を測定した。スクロース嗜好性は以下のように算出した。
尾部懸垂試験（TST）： 各マウスの尾を粘着テープを用いて試験装置の上部に固定した。行動ビデオ録画・解析ソフトウェアを用いて、マウスの行動を6分間記録した。試験の最後の4分間における不動時間の計測を行った。
オープンフィールド試験 (OFT): 各マウスをオープンフィールド装置の中央に個別に配置した。行動追跡ソフトウェアを用いて、移動距離および活動量を含む行動活性を5分間記録し、解析した。各試験後、装置を75% ethanolで清浄した。
検体採取：
CUMS手順中に死亡したマウス、または重度の疾患の徴候（例： >20%以上の体重減少、目視で確認できる感染、または運動不能が認められた個体は、研究から除外した。安楽死は、認定職員がペントバルビタールナトリウム（150 mg/kg、腹腔内投与）を過剰投与することで実施した。意識消失後、確実に死亡させるための二次的手法として頸椎脱臼を行った。ニッスル染色および免疫蛍光分析のため、各群から3匹のマウスをランダムに選出した。ウェスタンブロット分析用の海馬組織は、直ちに氷上で摘出し、液体窒素で急冷した。
ニッスル染色：
ニッスル染色および免疫蛍光分析のため、マウスをナトリウムペントバルビタール（150 mg/kg、腹腔内投与）で深く麻酔し、経心腔灌流を行わずに断頭した。脳を速やかに摘出し、パラフィン埋設前に4%パラホルムアルデヒドで24〜48時間固定した。パラフィン切片を厚さ3 μmで作成した。パラフィン切片は、脱パラフィン剤、無水エタノール、75%エタノールの順に順次浸漬し、流水で洗浄して脱パラフィン化した。凍結切片を用いる場合は、室温に戻した後、組織固定液で15分間固定し、流水で洗浄した。組織切片をニッスル染色液で2〜5分間染色し、水で洗浄した後、0.1%氷酢酸で分化させ、洗浄して反応を停止させた。顕微鏡下で分化状態を確認しながら調整し、乾燥させ、キシレンで10分間透明化した後、中性封入剤で封入した。
免疫蛍光染色：
免疫蛍光染色は標準的な手法を用いて行った。脳組織を4%パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色のためにパラフィン包埋した。組織切片を、NeuN (1:20)、MLKL (1:30)、ATF4 (1:500)、およびCREB (1:100)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。一次抗体によるインキュベーション後、切片をPBSで4回洗浄し、対応する蛍光二次抗体を用いて暗所で1時間インキュベートした。使用した二次抗体は、マウス抗ATF4用としてCY3標識ヤギ抗マウスIgG (1:30, Servicebio, GB21301)、マウス抗MLKL用としてAlexa Fluor 48標識ヤギ抗マウスIgG (1:40, Servicebio, GB25301)、ウサギ抗NeuN用としてCY3標識ヤギ抗ウサギIgG (1:30, Servicebio, GB21303)、およびウサギ抗CREB用としてAlexa Fluor 48標識ヤギ抗ウサギIgG (1:40, Servicebio, GB25303)である。その後、切片を室温で10分間DAPIで染色し、PBSで洗浄して退色防止封入剤で封入し、共焦点顕微鏡を用いて蛍光画像を取得した。
ウェスタンブロッティング：
脳組織をラジオ免疫沈降アッセイ（RIPA）溶解バッファーでホモジナイズした。タンパク質濃度を測定し、1レーンあたり20 μgの全タンパク質を10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離した後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。ブロッキング後、膜を一次抗体（1:100）とともに4°Cで一晩インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体で1時間インキュベートした。タンパク質バンドを化学発光イメージングシステムで可視化し、バンド強度をImageJソフトウェアを用いて定量化した。海馬組織のウェスタンブロット解析では、1群あたり2匹のマウスを解析し、代表的な免疫ブロット図を示す。HT-2細胞の実験では、代表的な実験としてウェスタンブロット解析を1回実施した。これらのデータは、統計的に定量化された結果ではなく、定性的な傾向の観察として提示している。
統計解析：
群間の差は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を用いて分析した。データは平均値 ± 標準偏差（SD）として的に示す。 p 値 < 0.05を統計的有意水準とした。
データの可用性：
本研究で生成および分析されたデータセットは、本論文およびその補足資料に含まれています。UHPLC-HRMSによる化合物同定の結果は補足表1に提示されており、バイオインフォマティクス解析に使用したGEOデータセットの特性は補足表2にまとめられています。GFAP免疫蛍光染色（補足図1）、p-RIPK3およびp-MLKLの免疫蛍光染色（補足図2）、実験デザインおよび動物割り付けのタイムライン（補足図3）、および未切断のウェスタンブロット原画像（補足図4）を含む追加の支援データは、補足資料で利用可能です。
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結果
WGCNAにより、ネクロプトーシス経路が濃縮されたうつ病関連遺伝子モジュールを同定
RRAパッケージを用いて、GSE5456、GSE54565、およびGSE54568のデータセット間で一貫して発現上昇または低下している変動発現遺伝子を統合し、2,513個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のヒートマップを図1Aに示す。これら3つのデータセットは、前帯状皮質、扁桃体、および背外側前頭前皮質という異なる脳領域から得られたものであり、MDD患者および非精神疾患コントロールのサンプルが含まれている。RRA法により、独立したデータセット間で一貫して変動発現遺伝子の最上位にランクされる遺伝子を同定することで、データセット特有のばらつきを低減させた。統合された遺伝子プロファイルは、その後WGCNAを用いて解析された。
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ディスカッション
異常な神経細胞死は、うつの病態生理において重要な役割を果たしています8。プログラム細胞死の一形態であるネクロトーシスは、広範に研究されており、この経路を標的とする阻害剤の開発において大きな進展がありました39。2005年にネクロトーシス阻害剤であるNec-1が同定されて以来40、ネクロトーシス・シグナル伝達経路の主要構成要素を標的とする化合物の開発が著しく進展しました。Nec-1は、神経系、心血管系、および腎疾患のモデルにおいて、ネクロトーシスに対する保護効果を示しています41。さらに、中枢神経系を標的とするネクロトーシス阻害剤であるSAR443060が臨床試験に入りました42。しかし、これらの試験は開発中に認められた前臨床毒性のため中止されました42。神経疾患におけるネクロトーシス阻害剤の広範な研究にもかかわらず、うつ病への潜在的な適用については、ほと...
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開示事項
利益相反：
著者は開示すべき事項はありません。
謝辞
本研究は、中国河南省高等教育機関重点科学研究プロジェクト（No. 26A360008）、河南省中医学科学研究プロジェクト（No. 2025ZY3152）、中国国家自然科学基金（No. 82274496）、河南省科学技術研究プロジェクト（No. 232301420018）、および国家中医学管理局科学技術部張仲景継承・創新プロジェクト（No. GZY-KJS-2022-044-1）の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu） | 北京同仁堂有限公司、中国・鄭州 | 231001 | 生薬成分（12 g） |
| 粘着テープ | 該当なし | 該当なし | 尾懸垂試験 |
| 当帰 (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; dang gui) | 北京同仁堂有限公司、中国、鄭州 | G01230507-16 | 生薬成分（10 g） |
| 抗ATF4抗体（免疫蛍光染色） | Servicebio | GB111137 | 一次抗体 |
| 抗ATF4抗体（ウェスタンブロッティング） | MedChemExpress | HY-P80486 | 一次抗体 |
| 抗BDNF抗体 | MedChemExpress | HY-P80567 | ウェスタンブロット用一次抗体 |
| 抗CREB抗体 | Beyotime | AF1018 | ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光染色用一次抗体 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | ローディングコントロール |
| 抗MLKL抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光染色用一次抗体 |
| 抗NeuN抗体 | Servicebio | GB11138 | 免疫蛍光染色用一次抗体 |
| 抗リン酸化CREB抗体 | Beyotime | AF5785 | 一次抗体 |
| 抗リン酸化MLKL抗体 | Bioss | bsm-54104R | 一次抗体 |
| 抗リン酸化RIPK1抗体 | Biolynx | BX60008 | 一次抗体 |
| 抗リン酸化RIPK3抗体 | Abcam | ab195117 | 一次抗体 |
| 抗RIPK1抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 3493S | 一次抗体 |
| 抗RIPK3抗体 | Proteintech | 17563-1-AP | 一次抗体 |
| Atractylodes macrocephala（Atractylodes macrocephala Koidz.；白朮） | 北京同仁堂有限公司、中国、鄭州 | 230801 | 生薬成分 (10 g) |
| 自動行動追跡ソフトウェア | Panlab (Harvard Apparatus) | 該当事項なし | オープンフィールド試験および尾懸垂試験用SMART 3.0ビデオトラッキングソフトウェア |
| BCAタンパク質定量キット | CWBIO | CW0014S | タンパク質定量 |
| 行動記録システム | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | オープンフィールド試験および尾部懸垂試験 |
| Bio-Rad化学発光イメージングシステム | Bio-Rad | 12003154 | 化学発光ウェスタンブロット検出用ChemiDoc MPイメージングシステム |
| CellTiter-Lumi II ルミネッセンス細胞生存率測定キット | Beyotime | C0056XL | 細胞生存率アッセイ |
| 共焦点顕微鏡 | Nikon Eclipse C1 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する原文をご提示ください。 | 免疫蛍光イメージング |
| DAPI | Servicebio | G1012 | 核染色 |
| 環境配慮型脱ロウ溶液 | Servicebio | G1128 | パラフィン脱パラフィン処理 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | BI | C04001-500 | 細胞培養サプリメント |
| 梔子果（Gardenia jasminoides J. Ellis；梔子） | 北京同仁堂有限公司、中国 鄭州 | 22102109 | 生薬成分（12 g） |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.; 甘草） | 北京同仁堂有限公司、中国・鄭州 | 230301 | 生薬成分（3 g） |
| Cy3標識ヤギ抗マウスIgG | Servicebio | GB21301 | マウス抗ATF4用蛍光二次抗体 (IF, CY3, 1:300) |
| Alexa Fluor 488標識ヤギ抗マウスIgG | Servicebio | GB25301 | マウス抗MLKL用蛍光二次抗体（IF、Alexa Fluor 488、1:400） |
| Cy3標識ヤギ抗ウサギIgG | Servicebio | GB21303 | ウサギ抗NeuN用蛍光二次抗体（IF, Cy3, 1:300） |
| Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG | Servicebio | GB25303 | ウサギ抗CREB抗体用蛍光二次抗体（免疫蛍光染色、Alexa Fluor 488、1:400） |
| HRP標識ヤギ抗ウサギIgG | アブシン | abs20040 | ウェスタンブロッティング用二次抗体 |
| HRP標識マウス抗ウサギIgG軽鎖抗体 | ABclonal | AS061 | ウェスタンブロッティング用二次抗体 |
| ヒトTNF-α | Novoprotein | C008 | ネクロトーシス誘導剤 |
| HT-22細胞 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| HyClone 培地 | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | 細胞培養培地 |
| ImageJ | 国立衛生研究所 (NIH) | フリーソフトウェア | バンドの定量化 |
| 倒立顕微鏡 | Nikon | Eclipse Ti-SR | 細胞形態 |
| 液体窒素 | 河南吉来新能源科技有限公司 | 翻訳するテキストが提供されておりません。翻訳対象の原文をご提示ください。 | 組織保存 |
| Molecular Devices マイクロプレートリーダー | Molecular Devices | SpectraMax M5 | ルミネッセンス測定 |
| 牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andr.） | 北京同仁堂有限公司、中国鄭州 | 22121714 | 生薬成分（12 g） |
| ネクロスタチン-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | RIPK1阻害剤 |
| パラホルムアルデヒド | Servicebio | G1101-500ML | 組織固定 |
| パロキセチン塩酸塩水和物 | アラジン | P129711 | 陽性対照 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Servicebio | G4202-500ML | 洗浄バッファー |
| ペパーミント（Mentha haplocalyx Briq.; 薄荷） | 北京同仁堂有限公司、中国 鄭州 | 230101 | 生薬成分（6 g） |
| ペニシリン–ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | 細胞培養用抗生物質 |
| 遠志（Polygala tenuifolia Willd.） | 北京同仁堂有限公司、中国・鄭州 | 20221101 | 生薬成分（12 g） |
| ポリフッ化ビニリデン (PVDF) メンブレン | Merck Millipore | ISEQ00010 | ウェスタンブロット |
| ブクリコ（Wolfiporia cocos；茯苓） | 北京同仁堂有限公司、中国鄭州市 | D23070601 | 生薬成分（15 g） |
| 放射免疫沈降アッセイ（RIPA）溶解バッファー | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | タンパク質抽出 |
| 柴胡（Bupleurum chinense DC.） | 北京同仁堂有限公司、中国鄭州 | 230801 | 生薬成分 (12 g) |
| SDS-PAGE試薬 | Solarbio; Servicebio; 上海源叶生物科技有限公司 | 該当なし | 院内で調製したアクリルアミド、ビス-アクリルアミド、Tris、SDS、APS、およびTEMED |
| ペントバルビタールナトリウム | 国药集团化学试剂有限公司 | 69020181 | 麻酔薬 |
| 超高速液体クロマトグラフィーシステム | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLCシステム | LC-MS分析 |
| UHPLC HSS-T3カラム (100 × 2.1 mm, 1.8 μm) | Waters | 186003539 | クロマトグラフィー分離 |
| z-VAD-fmk | 標的分子 | T6013 | パンカスパーゼ阻害剤 |
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